Einführung

Apoptose – ein universeller biologischer Prozess

Die einzelne Zelle als Grundeinheit komplexer biologischer Systeme unterliegt viel-fältigen Kontrollmechanismen. Zellteilung, Zellwachstum, Differenzierung und letztlich Zelltod sind Prozesse, die eine Zelle während ihres Lebens durchläuft. Aufgrund ihrer Bedeutung für die Ausbildung intakter Zellen und Zellverbände unterliegen die genannten Prozesse einer besonders strengen Regulation. Die physiologisch Form des Zelltodes wird als Programmierter Zelltod (PCD) oder Apoptose bezeichnet, die patho-logische Form als Nekrose. Obwohl der Prozess eines physiologischen Zelltodes bereits seit dem Ende des 19. Jahrhunderts postuliert wurde (Rich et al.,1999), fehlte lange Zeit dessen genaue Definition. Erst 1972 erfolgte durch Kerr, Wyllie and Currie aufgrund elektronenmikroskopischer Aufnahmen eine morphologische Definition des physiologischen Zelltodes (Kerr et al.,1972). Gleichzeitig führten sie den Begriff Apoptose ein, der im Griechischen das Abfallen der Blätter vom Baum beschreibt. Apoptose ist essentiell für die Differenzierung und Homöostase von Geweben und findet während des gesamten Lebens eines Organismus‘ in unterschiedlichem Aus-mass statt. In der frühen Ontogenese ist Programmierter Zelltod an der Ausbildung von Gewebs- und Organstrukturen beteiligt, später u.a. an der Kontrolle der Zellzahl und der Eliminierung nichtfunktioneller oder maligner Zellen. So wird während der Entwicklung des Thymus dessen ursprüngliche Zellpopulation infolge apoptotischer Prozesse um 95% reduziert (Jacobson et al.,1997).

Programmierter Zelltod ist ein biologischer Vorgang, der genetisch fixiert ist und charak-teristische morphologische und biochemische Merkmale besitzt. Zelltyp und Dif-ferenzierungsstadium einer Zelle sind entscheidend für das Signal, das zur Auslösung des Programmierten Zelltodes führt. Apoptose wird ausgelöst über die Aktivierung membranständiger Rezeptoren (CD95-, TNF- und B-Zell-Rezeptor, s.u.), durch Entzug von Wachstumsfaktoren oder durch Verlust von Zell-Zell-Kontakten. Ebenso wird das apoptotische Programm über intrazelluläre Rezeptoren (Glucocorticode), DNA-Schädigung (UV- und Röntgenstrahlung, Zytostatika) oder Störungen des Zellmeta-bolismus (Nukleotidsynthese) initiiert. Alle genannten Aktivierungsmechanismen führen

zum Ablauf eines relativ einheitlichen, genetisch determinierten Programmes, welches mit dem Tod der Zelle endet.

Differenzierung von physiologischem und pathologischem Zelltod

Aufgrund ihrer Bedeutung für den Organismus sowie ihrer spezifischen Morphologie und Biochemie lassen sich zwei Arten von Zelltod unterscheiden: physiologischer Zell-tod (Apoptose oder Programmierter Zelltod) und pathologischer Zelltod (Nekrose). Nekrotischer Zelltod erfolgt nach starker Zellschädigung durch mechanische oder chemische Noxen. Im Verlauf der Nekrose bricht der osmotische Gradient über der Zell-membran zusammen, es kommt zum Ioneneinstrom, nachfolgendem Einstrom von Wasser und somit zur Volumenzunahme der Zelle und der Zellorganellen. Charak-teristisch ist ein ungeordneter Abbau von makromolekularen Strukturen, die Zelle wird irreversibel geschädigt und lysiert innerhalb kurzer Zeit. Zytoplasmatische Bestandteile und Membranfragmente führen zur Schädigung umliegender Zellen, die Folge ist bei stärkerem Gewebszerfall eine Zytokin-vermittelte Entzündungsreaktion.

Erste direkte Beweise für eine andere Art von Zelltod ergaben sich aufgrund histochemischer Studien, die in den sechziger Jahren von Kerr durchgeführt wurden (Kerr et al.,1965). Die untersuchten, postischämischen Hepatozyten zeigten Organellen, die sich eindeutig von denen nekrotischer Zellen unterschieden. Eine genaue Be-schreibung dieser spezifischen Merkmale erfolgte einige Jahre später mit Hilfe elektronenmikroskopischer Aufnahmen. Apoptotische Zellen zeigen eine typische Kondensation des Kernchromatins, die Kerne werden pyknotisch und fragmentieren. Die Zytoplasmamembran zieht sich zusammen, es entstehen Ausweitungen und Knospungen der Membran (membrane blebbing) und schliesslich apoptotische Körper, die Kernfragmente, Organellen und andere zytoplasmatische Bestandteile um-schliessen. Bedeutsam ist, dass es nicht zur unkontrollierten Abgabe von Zell-bestandteilen in die Umgebung der Zelle kommt und die Integrität der Organellen erhal-ten bleibt. Die apoptotischen Körper werden von Makrophagen, Histiozyten oder fakul-tativen Phagozyten aufgenommen (Kerr et al.,1972). Dadurch wird die Schädigung umliegenden Gewebes und eine mögliche Entzündungsreaktion verhindert. Die Erkennung apoptotischer Zellen erfolgt über membranassoziierte Moleküle apop-totischer Zellen und deren Interaktion mit entsprechenden Rezeptoren auf der Ober-fläche der Phagozyten (Hart et al.,1996; Savill and Fadok,2000). Phagozytose wird vermittelt über Phosphatidylserin (PS)-, Lectin-, Scavenger- und 61D3-Rezeptoren. Der jeweils aktive Mechanismus ist abhängig von den beteiligten Zelltypen, den Inter-aktionsbedingungen sowie von Korezeptoren (Fadok et al.,1992). Der physiologiche Zelltod epithelialer Zellen, ausgelöst durch den Verlust von Zell-Matrix-Kontakten, wird als Anoikis (griechisch: heimatlos) bezeichnet. In Abbildung 1 sind BL60-2-Zellen vor Induktion von Apoptose und 16 Stunden nach Induktion zu sehen.

Abbildung 1 Elektronenmikroskopische Aufnahmen. Links: Humaner B-Lymphozyt (BL60) vor Apoptose-Induktion.Rechts: BL60-Zelle 16 Stunden nach Induktion von Apoptose durch Inkubation mit anti-IgM. Deutlich zu sehen sind die Kondensation des Kernchromatins, die beginnende Fragmentierung sowie Schrumpfung der Zellmembran. N – Nukleus, C – Cytosol, M – Mitochondrien, EC – Endosomales Kompartment.

Apoptose: Signaltransduktion und Regulation Rezeptor-vermittelte Apoptose und Fas-/CD95-System
Apoptose kann durch eine Vielzahl von Signalen ausgelöst werden. Ein bedeutender Mechanismus zur Induktion des Programmierten Zelltodes ist die Interaktion spezi-fischer Liganden mit Rezeptoren der Zielzelle. Intensiv untersucht wurden vor allem die Cytokine TNF—α und Fas-Ligand (Fas-L, Synonyme: CD95, APO1) und ihre Rezeptoren (TNFR1, Fas-Rezeptor). FasL wird zur TNF-Familie von Cytokinen gerechnet und in membranständiger Form sowie als lösliches Cytokin synthetisiert (Krammer et al.,2000). Der membranständige FasL ist jedoch wesentlich potenter, so dass FasL-vermittelte Apoptose wahrscheinlich vorwiegend über Zell-Zell-Interaktion ausgelöst wird. Der ent-sprechende Fas-Rezeptor gehört zur TNF-Rezeptor-Familie und besitzt eine charak-teristische, intrazelluläre Domäne (Death domain). Die Aktivierung durch FasL induziert die Trimerisierung des Rezeptors und die nachfolgende Bindung weiterer Proteine über die Death domain. Der neuformierte Proteinkomplex, als DISC (Death inducing signalling complex) bezeichnet, führt letztlich zur Aktivierung von Proteasen (Caspase8 und Caspase3, s.u.) und damit zur Auslösung des apoptotischen Programmes in der Zelle.

Abbildung 2 Fas-Signaltransduktion. Cytotoxische T-Zellen exprimieren nach TCR-Aktivierung verstärkt membrangebundenes Fas (Fas-L bzw. CD95-L). Fas-L interagiert mit dem Fas-Rezeptor (Fas-R) der Zielzelle. Nach Oligomerisierung von Fas-R wird ein Proteinkomplex (DISC, Death Inducing Signalling Complex) gebildet: Via DD-Bindungsstelle (Death Domain) wird das Adaptermolekül FADD (Fas-associated Death Domain Protein) gebunden. FADD wiederum kann ProCaspase 8 binden, die Interaktion erfolgt über die DED-Bindungsstelle (Death Effector Domain). Nach Aktivierung kann Caspase 8 direkt Caspase 3 spalten, die Amplifikation des Signals erfolgt hier ohne Mitwirkung der Mitochondrien. In der Abbildung nicht gezeigt ist ein alternativer Weg der Fas-Signaltransduktion, der nach Aktivierung von Bid unter Einbeziehung der Mitochondrien abläuft und schliesslich ebenfalls zur Spaltung von Caspase 3 führt.

Die physiologische Rolle des Fas-Systems ist wahrscheinlich auf immunologische Prozesse beschränkt. Der Fas-Rezeptor wird ubiquitär exprimiert, die Expression des Fas-Liganden ist jedoch auf reife, aktivierte T-Zellen (CD4+/CD8+), cytotoxische T-Zellen (CTL), natürliche Killer-Zellen (NK-Zellen) sowie immunprivilegiertes Gewebe (Auge, Testis) beschränkt. Immunprivilegiertes Gewebe ist in der Lage, einwandernde, immunkompetente Zellen durch Induktion von Apoptose zu entfernen und somit jegliche zellvermittelte Immunreaktion, die potentiell gewebsschädigend ist, zu unterdrücken. Die Deregulation von Fas-assoziierten Effektormechanismen spielt eine Rolle bei der Pathogenese der fulminanten Hepatitis (abnormal aktivierte CTL's) und des Auto-

immunbedingten Lymphoproliferativen Syndroms (ALPS), dem ein Funktionsverlust des Fas-Rezeptors zugrunde liegt (Nagata et al.,1997; Matiba et al.,1997).
Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster
Untersuchungen unterschiedlicher Organismen haben gezeigt, dass Apoptose-ähnliche Prozesse weit verbreitet sind und sich die Entwicklung des in Vertebraten vorhandenen, komplexen apoptotischen Programms schrittweise vollzogen hat. Der progammierte Zelltod stellt somit ein evolutionär konserviertes, biologisches Prinzip dar. Sehr intensiv untersucht wurden vor allem Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster. C.elegans entwickelt im Verlauf seiner Ontogenese eine konstante Anzahl somatischer Zellen (1090), genau 131 dieser Zellen sterben durch Programmierten Zelltod. Durch Mutationsanalysen wurde eine Reihe von Genen charakterisiert, die den Program-mierten Zelltod in C.elegans beeinflussen und deshalb als ced-Gene (C. elegans death genes) bezeichnet werden (Ellis and Horvitz,1986). Weitere Untersuchungen ergaben, dass den Genprodukten CED3, CED4 und CED9 besondere Bedeutung bei der Regulation der Apoptose zukommt, wobei CED3 und CED4 proapoptotisch wirken, CED9 dagegen hemmend (Hengartner et al.,1992). Die Klonierung von ced3 und nachfolgende Sequenzanalysen zeigten, dass das Genprodukt von ced3 starke Homologien zur Familie der humanen ICE-Proteasen aufweist (Yuan et al.,1993). Es wurden weitere humane Proteasen identifiziert, die ced3 bzw. ICE-Proteinen strukturell und funktionell ähnlich sind und als eine neue Klasse unter dem Begriff Caspasen (Cysteinyl aspartate-specific proteinases, s.u.) zusammengefasst werden (Alnemri et al.,1996; Nicholson and Thornberry,1997).

Das humane Homologe zu CED9 ist das BCL2 (B cell lymphoma)-Protein (Hengartner and Horvitz,1994). Die Expression von humanem BCL2 verhindert in C.elegans voll-ständig und in ced9-negativen Mutanten teilweise Apoptose, was die Konservierung von Teilen des apoptotischen Programmes belegt. 1997 entdeckte die Gruppe von Zou, dass APAF1 (apoptosis protease-activating factor) das humane Äquivalent des CED4-Gen-Produkts ist (Zou et al.,1997). APAF1 wurde zusammen mit APAF2 und APAF3 aus humanen Zellextrakten isoliert. APAF2 wurde als Cytochrom c und APAF 3 als Caspase9 identifiziert (Liu et al.,1996).

In Drosophila melanogaster wurden die proapoptotischen Gene hid (head involution defektive), reaper und grim identifiziert. Reaper besitzt Sequenzhomologien zum intrazellulären Anteil des humanen CD95/FAS-Rezeptors und ist gemeinsam mit hid vor allem in der Embryonalphase von D. melanogaster aktiv. Bei Funktionsausfall der ent-sprechenden Proteine kommt es in einem frühen Stadium zum Absterben der Drosophila-Larven aufgrund deregulierten Wachstums (White et al.,1994).
Caspasen
Caspasen sind Proteasen, die spezifisch im Rahmen des Programmierten Zelltodes aktiviert werden und Hauptmediatoren apoptotischer Signale darstellen. Ihre Be-deutungen ergibt sich aus folgenden Beobachtungen:

Die Aktivierung von Caspasen korreliert mit der Ausbildung des apoptotischen Phänotyps.

Caspasen sind verantwortlich für die Proteolyse von Proteinen, die selektiv mit Beginn der Apoptose gespalten werden und in die Ausbildung des Phänotyps der apoptotischen Zelle involviert sind.

Die Herabsetzung der enzymatischen Aktivität von Caspasen durch spezifische Inhibitoren kann Apoptose verhindern.

Die Bedeutung proteolytischer Prozesse für die Apoptose wurde durch Untersuchungen der T-Zell-vermittelten Zytotoxizität erkannt. Hauptbestandteile der durch T-Zellen frei-gesetzten Granula sind Proteasen, die als Granzyme bezeichnet werden. Diese Granzyme sind in der Zielzelle für die Aktivierung des apoptotischen Programmes verantwortlich (Froelich et al.,1998). Die ähnliche Substratspezifität von Granzymen und der zytoplasmatischen ICE-Protease, die Identifizierung von ICE als CED3-Homologes sowie die Entdeckung der Caspasen verstärkten die Annahme, dass Proteasen wesentliche Bestandteile eines konservierten biologischen Mechanismus darstellen (Thornberry et al.,1992; Wilson et al.,1994). Caspasen spalten Substrate nach einem Aspartat-Rest, der sich an Position 1 einer aus 4 definierten Aminosäuren bestehenden Spaltsequenz befindet. Das Vorhandensein des Aspartat-Restes ist essentiell für die Proteolyse des Substrats: wird Aspartat durch eine beliebige andere Aminosäure ersetzt, kann das Substrat nicht gespalten werden. Diese Selektivität ist ein wesent-liches Merkmal aller Proteasen der Caspasen-Familie und entscheidend für ihre Rolle innerhalb des PCD. Aufgrund ihrer Sequenz wurden die Caspasen in zunächst 2 unter-schiedliche Subgrupen unterteilt, eine ICE/Caspase1-Gruppe und eine Caspase3-Gruppe. Funktionelle Analysen zeigten, dass Mitglieder der ICE-Gruppe vorwiegend in Entzündungsprozessen aktiv sind, während die Caspase3-ähnlichen Proteasen haupt-sächlich in den apoptotischen Prozess involviert sind. Verfeinert wurde die Einteilung der Caspasen in funktionelle Gruppen durch Screenings mit verschiedenen Peptid-substraten. Es wurden 3 Gruppen mit jeweils konservierter Substratspezifität differen-ziert, die in Tabelle 1 dargestellt sind (nach: Nicholson and Thornberry,1997; Wolf and Green,1999):

Caspasen-Gruppe, Funktion

Spaltsequenz

Name

Synonyme

Gruppe 1

Proteolytische Aktivierung proinflammatorischer Zytokine

WEHD

Caspase1

ICE

Caspase4

ICE-II

Caspase5

ICE-III

Caspase11, 12, 13, 14

Gruppe 2

Apoptose-ausführende Caspasen (executioners)

DExD

Caspase3

CPP32

Caspase7

Mch3

Caspase6

Mch2

Gruppe 3

Apoptose-auslösende Caspasen (initiators)

(IVL)ExD

Caspase2

ICH1

Caspase8

Mch5, FLICE

Caspase9

Mch6

Caspase10

Granzym B

Tabelle 1 : Einteilung der Caspasen

Struktur und biologische Aktivität der Caspasen
Caspasen bestehen aus einer N-terminalen Pro-Domäne, einer grossen Untereinheit (ca. 20kDa) sowie einer C-terminalen kleinen Untereinheit (10kDa). Nach proteo-lytischer Aktivierung bilden jeweils zwei grosse und kleine Untereinheiten ein Tetramer. Die Aktivität der Caspasen wird durch verschiedene reversible und irreversible Inhibi-toren herabgesetzt. Die Produktion von reversiblen Caspase-Inhibitoren durch Viren verhindert den apoptotischen Zelltod der infizierten Wirtszelle. CrmA (Cytokine response modifier A) wird von Kuhpockenviren produziert und inhibiert Apoptose, indem es an die aktiven Domänen der Caspasen 1 und 3 bindet (Gagliardini et al.,1994). Das vom Baculovirus gebildete Protein p35 hemmt irreversibel verschiedene Caspasen (Xue and Horwitz,1995), besonders effizient jedoch Caspase3. Ebenfalls viral codiert sind die IAP (Inhibitors of apoptosis)-Proteine, die vor allem Caspasen der Gruppe 2 hemmen und für die im Gegensatz zu zu den Inhibitoren CrmA und p35 humane Homologe identifiziert wurden. Neben den natürlichen Caspasen-Inhibitoren sind synthetische bzw. nicht-physiologische Inhibitoren beschrieben, durch die experimentell eine Gruppen-spezifische Hemmung der Caspasen möglich ist.
Caspase-negative Mausmodelle
Die biologische Bedeutung einzelner Caspasen wurde vor allem durch Experimente mit knock-out-Mäusen dargelegt: ICE/Caspase1-negative Mäuse zeigen Defekte in der Prozessierung von proIL1-beta und anderen Zytokinen (Kuida et al.,1995). Thymocyten dieser Tiere reagieren ex vivo adäquat auf diverse Apoptose-Stimuli (Ausnahme: Fas-Rezeptor vermittelte Apoptose). Da sich Caspase1-negative Mäuse normal entwickeln und kein weiterer pathologischer Phänotyp zu beobachten ist, scheint dieser Protease keine zentrale Bedeutung innerhalb des Programmierten Zelltodes zuzukommen. CPP32/Caspase3 wurde 1994 als ICE- bzw. CED3-Homologes beschrieben (Fernandes-Alnemri et al.,1994). Caspase3-negative Mäuse zeigen im Gegensatz zu ICE-defizienten Mäusen augeprägte Defekte in ihrer Embryonalentwicklung, werden unreif geboren und versterben früher als die Kontrolltiere. In Hirnarealen, die während der Ontogenese durch das Auftreten pyknotischer Cluster als Folge massiver Apoptose neuronaler Zellen gekennzeichnet sind, fehlen diese Cluster vollständig. Gleichzeitig vorhandene erhöhte Hirnmassen sowie ektope Zellformationen und atypische Struktur-duplikationen sind bezeichnend für einen defekten neuronalen Apoptose-Mechanismus. Auch in Caspase3-negativen Mäusen fehlen Anzeichen für Defekte der Thymocyten-Apoptose oder eine gestörte Entwicklung und Funktion anderer Organe. Aufgrund des ausgeprägten neuropathologischen Phänotyps scheint Caspase3 eine nichtredundante Rolle innerhalb des Programmierten Zelltodes von Neuronen zu spielen, jedoch für die Apoptose anderer Zelltypen nicht essentiell zu sein (Kuida et al.,1996). Caspase9- und APAF1-negative Mäusen verstarben perinatal und zeigten ebenfalls eine verminderte Apoptose-Rate innerhalb des ZNS. Zusammenfassend ergibt sich aus diesen Experimenten, dass Caspasen in Abhängigkeit von Zelltyp und Differenzierungsstadium exprimiert bzw. für die Ausführung des apoptotischen Programmes rekrutiert werden.
Aktivierung von Caspasen
Caspasen existieren als Proenzyme, die durch Autoaktivierung(1), Transaktivierung(2), spezifische Proteolyse(3) sowie durch Assoziation mit Cofaktoren(4) aktiviert werden (Hengartner,2000):

Inaktive Caspasen besitzen eine basale proteolytische Aktivität. Autoaktivierung kann erfolgen bei erhöhter lokaler Konzentration der Caspasen im Bereich von Rezeptoren der Zellmembran oder mitochondrialen Proteinen (induced proximity model). Diese Adaptermoleküle verfügen über spezifische Bindungsdomänen (death domain – DD, death effector domain – DED oder caspase recruitment domain - CARD), die auch in Caspasen mit langer Pro-Domäne vorkommen und über die eine Bindung und Konzentration der Caspasen erfolgt.

Nach initialer Aktivierung einer Caspase kann durch Bindung und Proteolyse die Aktivierung weiterer Procaspasen erfolgen (Transaktivierung), wodurch die Ampli-fikation des apoptotischen Signals erfolgt.

Die bereits geschilderte, T-Zell-getriggerte Aktivierung des PCD in einer Zielzelle durch Granzyme B ist ein Beispiel für proteolytische Aktivierung durch Nicht-Caspasen.

Caspase9 wird erst nach Assoziation mit APAF1, einem aus den Mitochondrien frei-gesetzten Cofaktor, vollständig enzymatisch aktiv. Voraussetzung für die Bildung dieses Holoenzyms, das auch als Apoptosom bezeichnet wird, ist die Aktivierung von APAF1 durch Cytchrom c.

Substrate der Caspasen
Substrate der Caspasen tragen in ihrer Gesamtheit zur Ausbildung des Phänotyps apoptotischer Zellen bei. Diese Substrate sind z.B. beteiligt an der Aufrechterhaltung der zellulären Stabilität und an intrazellulären Transportprozessen, sind in die Signal-transduktion involviert und besitzen Funktionen im Rahmen des DNA- und RNA-Meta-bolismus. Hier eine kurze Übersicht über bisher identifizierten Caspasen-Substrate (nach: Nicholson and Thornberry,1997; Tan and Wang,1998; Wolf and Green,1999):

Substrat

Konsequenz der Spaltung

Pro- und anti-apoptotische Proteine:

Procaspasen, BCL2, BCLX_L ^{, BID}

Signal-Amplifikation, Inaktivierung von Inhibitoren

Proteine, verantwortlich für den apoptotischen Phänotyp:

ICAD, gelsolin, PAK2, MEKK1, PKC-delta

Induktion des apoptotischen Phänotyps

Strukturproteine und assoziierte Moleküle:

Actin, Gas2, Fodrin, Keratine, Lamine, NuMa, SAF-A, Rabaptin, Catenin, FAK

Zytoskelett-Fragmentierung, Verpackung von Zellbestandteilen

Proteine, verantwortlich für die zelluläre Homöostase:

DNA-PK, PARP, U1-70kDa, RFC-140, HnRNPs, D4-GDI, Transkriptionsfaktoren

Unterbindung zellulärer Reparaturmechanis-men und der Biosynthese von Makromolekülen

Andere:

Huntingtin, Presenilin, Atrophin-1, Ataxin-3

unbekannt

Tabelle 2 : Substrate der Caspasen

Stark vereinfacht resultieren aus den Spaltungen folgende biologische Effekte:

Auflösung und Umordnung des Zytoskeletts und des Zellkerns

Inaktivierung von Reparaturmechanismen

Verhinderung weiterer Zellteilungen

Isolierung der apoptotischen Zelle innerhalb des Zellverbandes und

Kennzeichnung der Zelle zur Phagozytose.

Die aufgeführten Signalproteine lassen vermuten, dass Signaltransduktionswege, die in Bezug auf die Vermittlung apoptotischer Signale noch nicht näher charakterisiert wurden, neben den Caspasen von Bedeutung sind.
Die BCL2-Familie
Genrearrangements sind neben Mutationen die häufigste Ursache für die Entwicklung von Tumoren. Folge dieser Rearrangements können Gendeletionen, Fusionsgene oder deregulierte Gene sein. Lymphatische Tumoren sind vorwiegend mit Translokationen im Bereich der Immunglobulingene und der T-Zell-Rezeptorgene verbunden. Prädisponiert sind diese Gene durch die physiologische Umordnung, der sie während der B-und T-Zell-Differenzierung unterliegen. In follikulären B-Zell-Lymphomen sind in 80% der Fälle Translokationen zwischen den Chromosomen 14 und 18 (t(14;18)(q32;q21)) zu finden. Das in der Nähe der Bruchstelle auf Chromosom 18 liegende Gen bcl2 gerät durch die Translokation unter die transkriptionelle Kontrolle des Immunglobulin-Schwerketten-Promotors und ist in der Folge dauerhaft aktiviert (Bakshi et al.,1985; Cleary and Sclar,1986).

Bcl2-negative Mäuse zeigen ausgeprägte Immundefekte (Veis et al.,1993). Lymphozyten und neuronale Zellen bcl2-transgener Mäuse besitzen in vitro nach Wachstumsfaktorentzug eine erhöhte Lebensdauer. Das BCL2-Protein scheint somit essentiell zu sein für das Überleben von Zellen mit physiologisch langer Lebenszeit. Es wirkt jedoch nicht in allen Geweben protektiv, d.h. es existieren differenzierungs-abhängige Expressionmuster sowie Mechanismen, die trotz BCL2-Aktivität zum Zelltod führen.

Mehrere Proteine wurden entdeckt, die BCL2 strukturell ähneln und als BCL2-Protein-Familie zusammengefasst sind. Es werden proapoptotische (BAX, BCL-X short, BAD, BAK, BIK, BID u.a.) und antiapoptotische Proteine (BCL2,BCL-X long, BCL-w, u.a.) unterschieden, deren Ratio teilweise die Empfindlichkeit einer Zelle für Apoptosesignale definiert (Gross et al.,1999). Proteine der BCL2-Familie können Homo- und Hetero-dimere bilden und sind in der Lage, integrale Membranproteine zu bilden.

Wesentliches Merkmal dieser Protein-Familie ist das Vorhandensein von bis zu vier konservierten Domänen, BH1-BH4, die eine Interaktion der Proteine ermöglichen und für unterschied-liche Wirkungen verantwortlich sind. Die Domänen BH1-BH4 sind in den antiapop-totischen BCL2-Homologen vorhanden. Proapoptotisch wirkende Proteine sind dagegen gekennzeichnet durch eine fehlende BH4-Domäne. Die Bildung von Dimeren erfolgt durch Interaktion der BH3-Domäne eines Moleküls mit hydrophoben Resten eines weiteren Proteins der BCL2-Familie.
Interaktion von Caspasen, Proteinen der BCL2-Familie und Mitochondrien
Apoptose-induzierende Signale können über unterschiedliche Mechanismen zum Zelltod führen, die bedeutendsten sind:

die direkte Aktivierung von Caspasen über Rezeptoren (Fas-System, s.o.) und

die indirekte Aktivierung von Caspasen durch freigesetzte mitochondriale Moleküle.

Mitochondrien als Mediatoren apoptotischer Signale
Die mitochondriale Integrität und die Freisetzung Apoptose-assoziierter Moleküle wird wesentlich durch BCL2-Proteine kontrolliert. In intakten Zellen liegen die anti-apoptotischen BCL2-Proteine als integrale Membranproteine von Mitochondrien, Nucleus und ER vor. Pro-apoptotische Proteine wie BID und BIM dagegen sind vorwiegend cytosolisch lokalisiert. Letztere werden nach einem Apoptose-Signal modifiziert (Dephosphorylierung, Proteolyse), so dass eine Translokation zur mitochondrialen Membran möglich ist. Dort erfolgt eine direkte Interaktion mit anti-apoptotischen BCL2-Proteinen bzw. die Integration in die mitochondriale Membran. Wie beeinflussen BCL-2 Proteine mitochondriale Funktionen, wie erfolgt die Freisetzung mitochondrialer Proteine im Rahmen des Programmierten Zelltodes? Folgende Modelle werden diskutiert (Gross et al.,1999; Hengartner,2000):

BCL2-Proteine bilden Kanäle in der äusseren Membran der Mitochondrien aus, die eine geringe Leitfähigkeit für Ionen besitzen. Ob diese Kanäle auch für Cytochrom c und andere mitochondriale Proteine durchlässig sind, ist umstritten.

Proteine der BCL2-Familie interagieren mit Proteinen der mitochondrialen Membran, insbesondere VDAC (voltage dependend anion channel), und induzieren die Bildung von Membrankanälen. VDAC selbst ist nicht durchlässig für Proteine, möglicher-weise führt eine Konformationsänderung zur Ausbildung grösserer Kanäle.

Mitochondriale Kanäle, vor allem PT-Kanäle, werden durch BCL2-Proteine reguliert. PT-Kanäle bestehen aus unterschiedlichen Proteinen, die sowohl in der inneren wie auch in der äusseren Membran lokalisiert sind (Hexokinase, Creatin-Kinase, VDAC, Adenin-Nukleotid-Translokase). Vor allem für pro-apoptotische Proteine wird eine Interaktion mit diesem Proteinkomplex postuliert, die zur Öffnung der PT-Kanäle mit Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung, Depolarisation und Mitochondrien-Schwellung führen soll. Anti-apoptotische Proteine der BCL2-Familie dagegen sollen vorrangig eigenständige Ionenkanäle bilden.

Eine weitere Möglichkeit ist die initiale Änderung der Ionenleitfähigkeit, die zum Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials führt. Anschliessend erfolgt die Schwellung und Ruptur der Mitochondrien und die mitochondrialen Proteine können ins Cytosol diffundieren.

Der genaue Mechanismus, der letztlich zur Freisetzung von Cytochrom c und anderen Molekülen ins Cytosol führt, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Das freigesetzte Cytochrom c wirkt neben ATP als Cofaktor für Apaf1, das in der Lage ist, über die Oligomerisierung von Caspase9 dessen Autoaktivierung zu induzieren. Caspase9 schliesslich führt zur proteolytischen Aktivierung von Caspase3. Da Caspase3 auch in die Fas-Rezeptor-vermittelte Apoptose involviert ist, wird eine Konvergenz beider Signalwege angenommen. Auf dieser Stufe des apoptotischen Programms greift das ebenfalls aus den Mitochondrien stammende Protein SMAC/DIABLO ein. Durch die Hemmung der IAP-Proteine, die die Aktivität von Caspase3 herabsetzen, wirkt SMAC/DIABLO wie Cytochrom c proapoptotisch (Du et al.,2000; Verhagen et al.,2000). Mit der Aktivierung von Caspase3 erfolgt der Übergang zur gemeinsamen Endstrecke des apoptotischen

Programmes, d.h. vorwiegend zur Spaltung von weiteren Caspasen sowie von in Tabelle 2 aufgeführten Substraten. Die folgende Abbildung gibt einen Überblick:

Abbildung 3 Signaltransduktion Apoptose. Ein apoptotisches Signal, hier als Beispiel die Schädigung von DNA, führt zur Verlagerung des proapoptotischen Proteins Bax vom Cytosol zur äusseren mitochondrialen Membran. Proteine der Bcl-2-Familie regulieren die Freisetzung mitochondrialer Faktoren: Bei einem Übergewicht der proapoptotischen Proteine (hier Bax) gegenüber den antiapoptotischen (Bcl-2, Bcl-X _L) treten Cytochrom c und andere Moleküle ins Cytosol über. Cytochrom c bildet mit APAF1 einen Komplex, der Procaspase 9 bindet (Apoptosom). Aktivierte Caspase 9 spaltet Procaspase 3 und es folgt die Endstrecke des apoptotischen Programms mit Spaltung spezifischer Substrate.
Caspase-aktivierte DNAse und Abbau von DNA
Im Verlauf der Apoptose kommt es zur Degradation von DNA, die in drei Schritten erfolgt: Zu Beginn treten Einzelstrangbrüche auf, nächster Schritt ist die grobe DNA-Fragmentierung, bei der DNA-Stränge von 50-200 kbp enstehen. Schliesslich erfolgt die Zerlegung in DNA-Fragmente von 180-200 bp Länge, die durch internucleosomale Spaltung entstehen und durch ein spezifisches Bandenmuster im Agarosegel nach-weisbar sind (DNA-Leiter)(Gromkowski et al.,1986; Brown et al.,1993; Wyllie,1980). Durch Enari wurde die verantwortliche DNAse, bezeichnet als Caspase-aktivierte DNAse (CAD), und der über den CAD-spezifischen Inhibitor (ICAD) vermittelte Regulationsmechanismus identifiziert (Enari et al.,1998). Danach befindet sich ICAD im Komplex mit CAD im Cytosol, wird nach Auslösung des apoptischen Programmes durch Proteolyse inaktiviert und entlässt dadurch CAD aus seiner Bindung. CAD wandert aufgrund seiner NLS-Signalsequenz (nuclear localization sequence) in den Zellkern und degradiert dort internucleosomal die DNA. Untersuchungen an enucleierten Zellen und CAD-negativen Mäusen zeigten, dass die DNA-Fragmentation für den Programmierten Zelltod nicht notwendig ist. Die DNA-Spaltung macht jedoch den Prozess unumkehrbar und erleichtert zudem die Bildung apoptotischer Körper sowie die folgende Phagozytose.

Apoptose in B-Zellen
Eine herausragende Rolle spielen apoptotische Prozesse bei der Entwicklung und Differenzierung des Immunsystems von Vertebraten. Lymphatische Zellen gehen aus hämatopoetischen Stammzellen hervor, die sich innerhalb des Thymus zu T-Zellen und in der fetalen Leber sowie im adulten Organismus im Knochenmark zu B-Zellen entwickeln.
B-Zell Differenzierung und IgM-vermittelte Apoptose in B-Zellen
Die Differenzierung der B-Zellen verläuft über mehrere Stadien, die durch die Expression spezifischer Oberflächenmoleküle und Enzyme gekennzeichnet sind und mit dem schrittweisen Rearrangement der Immunglobulingene einhergehen. Die reife, naive B-Zelle ist mit einem funktionellen, membranständigen B-Zell-Rezeptor (BCR) ausgestattet und wandert in die sekundären lymphatischen Organe aus (Lymphknoten, Milz) aus. Dort wird nach Antigenkontakt durch somatische Mutation eine erhöhte Spezifität der B-Zell-Rezeptoren generiert (Keimzentrumsreaktion) und die B-Zelle differenziert weiter in B-Memory-Zellen oder Immunglobulin-sezernierende Plasmazellen (Burrows and Cooper,1997; Rajewsky,1996). In allen Stadien der Entwicklung sind strenge Kontrollmechanismen nötig, um die Entstehung defekter oder autoreaktiver B-Zellen zu verhindern. Positive Selektion erfolgt bei Vorhandensein funktioneller Rezeptoren (preBCR, BCR), negative Selektion wird ausgelöst durch eine überhöhte oder verminderte Affinität von preBCR und BCR zum Antigen. In beiden Fällen ist Programmierter Zelltod der Hauptmechanismus zur Elimination der Zellen und wird durch Entzug lebenswichtiger Signale oder durch Generierung Apoptose-induzierender Signale ausgelöst.

Der B-Zell-Rezeptor ist ein Komplex von membranständigem Immunglobulin (sIgM) und einem transmembranen Heterodimer, bestehend aus Ig-alpha und Ig-beta (DeFranco,1997). Die Vernetzung des BCR führt zur Aktivierung intracellulärer Tyrosinkinasen der Src-Familie (LYN, BLK, FYN), die die zytoplasmatische ITAM (immunoreceptor based activation motif)-Region von Ig-alpha und Ig-beta phosphorylieren und dadurch die Bindung und Aktivierung weiterer Kinasen (SYK, BTK) ermöglicht. Ausgehend von diesen Kinasen werden mindestens 3 Signaltrans-duktionswege benutzt (Phosphoinositol-Signalweg, RAS-MAP-Kinase-Weg und PI3-K-Signalweg). Die Integration der ins Zellinnere der B-Zelle weitergeleiteten Signale ist abhängig von der Interaktion mit anderen, ebenfalls membranassoziierten Molekülen (CD19, CD21), vom Differenzierungsstadium der Zelle, der Expression Apoptose-fördernder/-hemmender Gene (p53, bcl2) und von der Interaktion mit anderen Zellen (T-Zellen, Follikuläre Dendritische Zellen). So führt die alleinige Vernetzung des B-Zell-Rezeptors ohne weitere costimulatorische Signale in unreifen B-Zellen (IgM-positiv, IgD-negativ) zur Auslösung von Apoptose, andererseits wird bei Vernetzung und gleichzeitiger Aktivierung von CD40 in reifen B-Zellen (IgM-positiv, IgD-positiv) ein Überlebenssignal produziert (Liu et al.,1997; Osmond et al., 1998).

Kürzlich konnte in mehreren Arbeiten gezeigt werden, dass auch im Verlauf der sIgM-vermittelten Apoptose unreifer B-Zellen eine Änderung der mitochondrialen Permeabilität erfolgt, die eine Aktivierung von Caspase9 sowie anschliessend von Caspase3 induziert (Doi et al.,1999; Bouchon et al.,2000). Unklar ist derzeit, wie die Vermittlung des apoptotischen Signals vom BCR zu den Mitochondrien erfolgt und ob weitere Signaltransduktionswege ohne Einbeziehung der Mitochondrien existieren. Bindungsstellen des BCR für Caspasen oder Cofaktoren im Sinne der oben beschriebenen „death domain“ konnten bisher nicht identifiziert werden. Dagegen konnte gezeigt werden, dass Proteine der BCL2-Familie auch im Rahmen der sIgM-vermittelten Apoptose eine Rolle spielen (Bargou et al.,1995; Weinmann et al.,1997). Diskutiert wird neben der Rekrutierung und Aktivierung cytosolischer bzw. mitochondrialer Komponenten eine transkriptionelle Regulation des Prozesses.
Der geschilderte Mechanismus der sIgM-vermittelten Apoptose nach Vernetzung membranständiger IgM-Moleküle ist Grundlage der in der Arbeit eingesetzten Methode zur Auslösung von PCD in B-Zellen (BL60-2).

Genexpression im Rahmen des Programmierten Zelltodes
Welche Rolle spielt der Nucleus im Rahmen des Programmierten Zelltodes? Ist die Transkription bestimmter Gene erforderlich für den Ablauf apoptotischer Programme, insbesondere im Rahmen der B-Zell-Apoptose? Eine de novo-Transkription Apoptose-assoziierter Gene ist für unterschiedliche Organismen und Zelltypen gezeigt worden, so z.B. während der Morphogenese des Kaulquappenschwanzes oder im Rahmen der Dexamethason-induzierten Apoptose von Lymphozyten (Tata,1966; Scott,1995). In D. melanogaster erfolgt nach Induktion der Gene reaper, grim und hid die Aktivierung von Caspasen, auch das proapoptotische EGL1 von C.elegans wird auf Transkriptions-ebene reguliert. Dagegen benötigt der Fas-vermittelte Zelltod keine Transkription. Für die anti-IgM-induzierte Apoptose unreifer B-Zellen liegen noch keine einheitlichen Daten vor, eine transkriptionelle Regulation ist jedoch wahrscheinlich. (Bouchon et al., 2000). Durch unsere Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die IgM-induzierte Apoptose von B-Zellen durch Cyclohexamid auf der Ebene der Translation gehemmt wird. Ein weiterer Hinweis ist die Abnahme der Expression des Gens c-myc im Verlauf der B-Zell-Apoptose (A.Rickers, Promotion).

Das lysosomal-assoziierte Protein LAPTM5
Im Rahmen der Arbeit wurde LAPTM5, ein lysosomales Membranprotein (lysosomal-associated protein, 5 transmembranes), genauer untersucht. Die Sequenz des erst später als LAPTM5 bezeichneten Gens wurde 1995 im Rahmen von Screening-Untersuchungen in unreifen myeloischen Zellen (humane myeloische Linie, KG-1) erstmals beschrieben (Nagase et al.,1995). Das LAPTM5-Gen wurde ausführlich in einer Arbeit von Adra et. al. charakterisiert und auf Chromosom 1p34 lokalisiert (Adra et al.,1996). Gegenstand der Arbeit war die Identifikation von Genen, die eine Rolle in der Differenzierung von hämatopoetischen Zellen spielen. Subtraktive Hybridisierungen von hämatopoetischen Zellen (KG1, K562 und DU528) und nichthämatopoetischen Zellen (BS-1, Knochenmark-Stroma-Linie) ergaben eine verstärkte Expression des LAPTM5-Gens in den Zellen der hämatopoetischen Linien. Einen weiteren Hinweis auf eine spezifische Funktion des Gens im Rahmen der Hämatopoese ergab der Vergleich der LAPTM5-Expression in undifferenziertem Gewebe (Maus-Embryo, 9 Tage p.c.) und differenziertem, hämatopoetischem Gewebe (Maus-Embryo, 9 Tage p.c. und 2,5 Tage Zellkultur nach Induktion zur Differenzierung). In undifferenziertem Gewebe erfolgte noch keine Expression von LAPTM5, erst im differenzierten hämatopoetischen Gewebe wurde LAPTM5 exprimiert. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Expression von LAPTM5 zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung im Gegensatz zum adulten Organismus nicht ausschliesslich auf hämatopoetisches Gewebe beschränkt zu sein scheint. In einer weiteren Arbeit wurde gezeigt, dass die Expression von LAPTM5 (dort noch als Transkript E3 bezeichnet) während der Retinolsäure-induzierten Differenzierung von Promyelozyten ansteigt (Scott et al.,1996).

Vorarbeiten
Die Aufklärung apoptotischer Prozesse in B-Zellen ist eines der Schwerpunktthemen innerhalb der Forschungsgruppe. Als experimentelles System wurde eine B-Zell-Linie etabliert, die auf die Inkubation mit anti-IgM-Antikörpern mit Apoptose reagiert. Die Linie (BL60-2) wurde umfassend charakterisiert und wird aufgrund der reproduzierbaren Apoptoseraten, die nach 24 h zwischen 50% und 70% liegen (Spontanrate: 1-5%), für vielfältige Untersuchungen benutzt.

Die Identifikation von Genen bzw. Proteinen, die in den apoptotischen Prozess involviert sind, wird in der Gruppe mit unterschiedlichen Methoden angegangen. Dabei handelt es im wesentlichen um Ansätze, die auf dem Vergleich zwischen apoptotischen und nichtapoptotischen Zellpopulationen beruhen, wobei vor allem die Unterschiede auf mRNA-Level sowie Protein-Level untersucht werden. Zum Einsatz kamen bisher u.a.

die subtraktive Hybridisierung,

die differentielle Hybridisierung von cDNA-Banken sowie

die vergleichende, zweidimensionale Gelelektrophorese.

Eine weitere Möglichkeit ist die Anwendung der Differential-Display-RT-PCR, einer Methode, die 1992 von Liang und Pardee eingeführt wurde und sich, z.T. modifiziert, als Verfahren zur Identifikation von differentiell exprimierten Genen durchgesetzt hat (Liang and Pardee,1992). Die Methode wurde in der Arbeitsgruppe durch A. Laubersheimer etabliert und auf das BL60-2 System angewandt. Da das Verfahren die Grundlage der vorliegenden Arbeit darstellt, wird es im Methodenteil beschrieben und später diskutiert.

Zielstellung
Die Charakterisierung apoptotischer Abläufe in B-Zellen ist mit unterschiedlichen Verfahren möglich. Die in der Arbeitsgruppe zur Identifikation unterschiedlich stark exprimierter Gene angewandte Differential-Display-Methode ergab eine Reihe von Kandidatengenen.

Ziel der Arbeit war die Bestätigung der differentiellen Expression der Kandidatengene durch Hybridisierungsverfahren (Northern Blot). Da eine grössere Anzahl von Kandidatengenen zur Auswahl stand, sollte zu Beginn eine Eingrenzung der relevanten Gene, u.a. durch Sequenzanalysen, vorgenommen werden.

Nach Bestätigung einer differentiellen Hybridisierung sollte das Gen, seine Expression sowie das Genprodukt in Abhängigkeit vom jeweiligen wissenschaftlichen Kenntnisstand charakterisiert werden.

Da eine differentielle Genexpression während des PCD lediglich eine Momentaufnahme der Zelle darstellt und keine Aussage über die tatsächliche funktionelle Bedeutung des Genproduktes erlaubt, sind Experimente nötig, in denen der hypothetische Effekt auf die Zelle nachgewiesen wird. Dies ist zum Beispiel durch Ausschaltung des Genes oder durch Überexpression von Wildtyp bzw. Mutanten möglich. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher die Etablierung eines Systems, das eine Expression von Kandidatengenen in BL60-Zellen erlaubt.