Zusammenfassung

Programmierter Zelltod (PCD) oder Apoptose ist ein universeller biologischer Prozess, der in multizellulären Organismen essentiell ist für die Differenzierung und Homöostase von Geweben. Bei der Entwicklung eines funktionsfähigen zellulären Immunsystems können autoreaktive Zellen entstehen. Die negative Selektion von unreifen, autoreaktiven B-Zellen erfolgt durch IgM-vermittelte Apoptose und ist von de novo Transkription abhängig. Die genauen Mechanismen der IgM-vermittelten Apoptose und die involvierten Genprodukte sind nur unzureichend charakterisiert. Zur Identifikation Apoptose-assoziierter Gene in B-Zellen wurde die Differential Display-Analyse durchgeführt und die Expressionsmuster apoptotischer und nicht-apoptotischer BL60-Zellen untersucht. Es wurden 38 differentielle Fragmente identifiziert und kloniert. Sequenzanalysen ergaben Homologien eines Fragments mit LAPTM5, einem lysosomal-assoziierten Transmembran-Protein mit vorwiegender Expression in hämatopoetischem Gewebe. Northern Blot-Analysen zeigten 2 Stunden nach Inkubation von BL-60-Zellen mit anti-IgM einen Anstieg der Genexpression von LAPTM5. Das LAPTM5-Gen liegt auf Chromosom 1 (1p34), ist evolutionär konserviert und besitzt keine Homologien zu bekannten Genen. Die Untersuchung der gewebespezifischen Expression von LAPTM5 ergab neben der hohen Expressionsrate in hämatopoetischem Gewebe eine sehr starke Expression in Skelett- und Herzmuskelgewebe. Elektronenmikroskopisch zeigte sich eine Lokalisation des Proteins in späten Endosomen und Lysosomen. Daneben konnte LAPTM5 auch auf der Oberfläche von BL60-Zellen detektiert werden. Während des apoptotischen Prozesses bleibt die Menge an LAPTM5 auf der Zelloberfläche konstant. Zur weiteren Charakterisierung von LAPTM5 und anderen Kandidaten-Genen wurde ein episomales Expressions- und Selektionssystem entwickelt. Cotransfektionsanalysen unter Verwendung eines GFP (green fluorescent protein)-Konstrukts zeigten, dass die aufgereinigten Zellen zu 80% das interessierende Gen exprimieren und die Expression länger als vier Wochen anhält.

• 1  Einführung

  • 1.1 Apoptose – ein universeller biologischer Prozess

  • 1.2 Differenzierung von physiologischem und pathologischem Zelltod

  • 1.3 Apoptose: Signaltransduktion und Regulation

    • 1.3.1 Rezeptor-vermittelte Apoptose und Fas-/CD95-System

    • 1.3.2 Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster

    • 1.3.3 Caspasen

      • .1  Struktur und biologische Aktivität der Caspasen

      • .2 Caspase-negative Mausmodelle

      • .3 Aktivierung von Caspasen

      • .4  Substrate der Caspasen

    • 1.3.4 Die BCL2-Familie

    • 1.3.5 Interaktion von Caspasen, Proteinen der BCL2-Familie und Mitochondrien

      • .1 Mitochondrien als Mediatoren apoptotischer Signale

      • .2  Caspase-aktivierte DNAse und Abbau von DNA

  • 1.4 Apoptose in B-Zellen

    • 1.4.1 B-Zell Differenzierung und IgM-vermittelte Apoptose in B-Zellen

  • 1.5 Genexpression im Rahmen des Programmierten Zelltodes

  • 1.6 Das lysosomal-assoziierte Protein LAPTM5

  • 1.7 Vorarbeiten

  • 1.8 Zielstellung

• 2  Material und Methoden

  • 2.1 Material

    • 2.1.1 Chemikalien

    • 2.1.2 Radioaktivität

    • 2.1.3 Kits

    • 2.1.4  Enzyme, Molekulargewichtsmarker

    • 2.1.5 Antikörper, immunologische Produkte

    • 2.1.6 Zelllinien

    • 2.1.7  Zellkulturmedien

    • 2.1.8 Bakterienstämme

    • 2.1.9 Bakterienkulturmedien

    • 2.1.10 Vektoren

    • 2.1.11  DNA-Oligonukleotide

    • 2.1.12 Puffer und Lösungen

    • 2.1.13 Weitere Materialien

    • 2.1.14  Geräte

  • 2.2  Methoden

    • 2.2.1 Vorarbeiten

      • .1 Differential Display RT-PCR

    • 2.2.2 Zellkultur

    • 2.2.3 Induktion und Nachweis von Apoptose

    • 2.2.4 Magnetische Separation und Depletion

    • 2.2.5 Gesamt-RNA-Präparation mittels Dichtegradientenzentrifugation

    • 2.2.6  Messung der RNA-Konzentration

    • 2.2.7 Northern Blot

    • 2.2.8 Herstellung radioaktiv-markierter DNA- und RNA-Proben

    • 2.2.9  Bestimmung der Radioaktivität markierter DNA- und RNA-Sonden

    • 2.2.10 Northern-Blot-Hybridisierung

    • 2.2.11  Herstellung von polyA+ - mRNA

    • 2.2.12 Herstellung einzelsträngiger cDNA

    • 2.2.13 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

    • 2.2.14 Klonierung von PCR-Produkten

      • .1 Ligation

      • .2 Transformation von Escherichia coli durch Hitze-Schock; α-Komplementierung

      • .3  Minipräperation und Maxipräparation von Plasmid-DNA

    • 2.2.15 Messung der DNA-Konzentration

    • 2.2.16 Restriktionsverdau

    • 2.2.17  Elektrophoretische Auftrennung von DNA

    • 2.2.18 DNA - Sequenzierung

    • 2.2.19 Präparation von Gesamtprotein

    • 2.2.20  Protein-Konzentrationsbestimmung

    • 2.2.21 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

    • 2.2.22 Western Blot

    • 2.2.23 Membranpräparation aus BL60-2-Zellen

    • 2.2.24 Expression klonierter cDNA in BL60-2 - Zellen

    • 2.2.25 Ficoll-Aufreinigung

    • 2.2.26 Bestimmung der Transfektionseffizienz

    • 2.2.27 Anreicherung transfizierter Zellen

    • 2.2.28 Durchflusszytometrie / Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)

    • 2.2.29 Immunfluoreszenz

    • 2.2.30 Radioaktive Markierung von Proteinen

    • 2.2.31 Immunpräzipitation

    • 2.2.32  Autoradiographischer Nachweis 35S-haltiger Proteine

    • 2.2.33 Elektronenmikroskopie

    • 2.2.34 Massenspektrometrie

• 3  Ergebnisse

  • 3.1 Identifizierung Apoptose-assoziierter Gene und Charakterisierung des Genprodukts LAPTM5

    • 3.1.1 Differential Display RT-PCR

    • 3.1.2 Klonierung und Sequenzanalyse von RT-PCR-Produkten

    • 3.1.3 Northern Blot Hybridisierungen

    • 3.1.4  Western Blot von LAPTM5

    • 3.1.5 Expressionsmuster von LAPTM5

    • 3.1.6 Immunfluoreszenzmikroskopie LAPTM5

    • 3.1.7 FACS-Analyse von LAPTM5

    • 3.1.8  Membranständige Lokalisation von LAPTM5

    • 3.1.9 Protein-labeling und Immunpräzipitation von LAPTM5

    • 3.1.10 Elektronenmikroskopische Lokalisation von LAPTM5

  • 3.2  Episomale Genexpression in BL60-2-Zellen

    • 3.2.1 EGFP-Expression als Reportersystem und Elektroporation von B-Zellen

    • 3.2.2 Aufreinigung transfizierter Zellen

      • .1 Selektion über Resistenzmarker:

      • .2 Magnetische Separation über das Oberflächenantigen ΔCD4

• 4  Diskussion

  • 4.1 Identifizierung Apoptose-assoziierter Gene in BL60-Zellen

  • 4.2  LAPTM5: Struktur und Expressionsmuster

    • 4.2.1 Struktur des LAPTM5-Gens und potentielle Struktureigenschaften von LAPTM5

    • 4.2.2  Gewebespezifische Expression von LAPTM5

    • 4.2.3 Transkriptionelle Regulation von LAPTM5

  • 4.3 LAPTM5 – Subzelluläre Lokalisation

  • 4.4  Differential Display RT-PCR und alternative Methoden

  • 4.5  Episomal stabile Genexpression in B-Zellen

    • 4.5.1 Elektroporation von B-Zellen und Expression von EGFP

    • 4.5.2 Selektion transfizierter Zellen

• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Eidesstattliche Erklärung

• Tabelle 1 : Einteilung der Caspasen

• Tabelle 2 : Substrate der Caspasen

• Tabelle 3 Auswertung der Sequenzierungen ausgewählter DD RT-PCR-Fragmente

• Abbildung 1 Elektronenmikroskopische Aufnahmen. Links: Humaner B-Lymphozyt (BL60) vor Apoptose-Induktion.Rechts: BL60-Zelle 16 Stunden nach Induktion von Apoptose durch Inkubation mit anti-IgM. Deutlich zu sehen sind die Kondensation des Kernchromatins, die beginnende Fragmentierung sowie Schrumpfung der Zellmembran. N – Nukleus, C – Cytosol, M – Mitochondrien, EC – Endosomales Kompartment.

• Abbildung 2 Fas-Signaltransduktion. Cytotoxische T-Zellen exprimieren nach TCR-Aktivierung verstärkt membrangebundenes Fas (Fas-L bzw. CD95-L). Fas-L interagiert mit dem Fas-Rezeptor (Fas-R) der Zielzelle. Nach Oligomerisierung von Fas-R wird ein Proteinkomplex (DISC, Death Inducing Signalling Complex) gebildet: Via DD-Bindungsstelle (Death Domain) wird das Adaptermolekül FADD (Fas-associated Death Domain Protein) gebunden. FADD wiederum kann ProCaspase 8 binden, die Interaktion erfolgt über die DED-Bindungsstelle (Death Effector Domain). Nach Aktivierung kann Caspase 8 direkt Caspase 3 spalten, die Amplifikation des Signals erfolgt hier ohne Mitwirkung der Mitochondrien. In der Abbildung nicht gezeigt ist ein alternativer Weg der Fas-Signaltransduktion, der nach Aktivierung von Bid unter Einbeziehung der Mitochondrien abläuft und schliesslich ebenfalls zur Spaltung von Caspase 3 führt.

• Abbildung 3 Signaltransduktion Apoptose. Ein apoptotisches Signal, hier als Beispiel die Schädigung von DNA, führt zur Verlagerung des proapoptotischen Proteins Bax vom Cytosol zur äusseren mitochondrialen Membran. Proteine der Bcl-2-Familie regulieren die Freisetzung mitochondrialer Faktoren: Bei einem Übergewicht der proapoptotischen Proteine (hier Bax) gegenüber den antiapoptotischen (Bcl-2, Bcl-X L) treten Cytochrom c und andere Moleküle ins Cytosol über. Cytochrom c bildet mit APAF1 einen Komplex, der Procaspase 9 bindet (Apoptosom). Aktivierte Caspase 9 spaltet Procaspase 3 und es folgt die Endstrecke des apoptotischen Programms mit Spaltung spezifischer Substrate.

• Abbildung 4 Übersicht der Vorarbeiten

• Abbildung 5 Elektrophoretische Auftrennung von RNA. BL60-2-RNA aus Zellen ohne Inkubation ( 0 ) und nach Inkubation mit anti-IgM ( 2, 4, 8, 12, 24 Stunden Inkubation). RNA Blot.18S/28S: rRNA.

• Abbildung 6 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme, Dunkelfeld, Färbung mit Acridin-Orange. Links: BL60-2-Zellen vor Induktion von Apoptose. Rechts: 24 Stunden nach Induktion von Apoptose durch Inkubation mit anti-IgM. Acridin-Orange interkaliert in die DNA, wodurch die Zellkerne sichtbar werden. Im linken Bild sind intakte Zellen und Zellkerne zu sehen (nichtapoptische Population), rechts dagegen sind die Kerne deutlich fragmentiert (apoptotische Population).

• Abbildung 7 Elektrophporetische Auftrennung von DD RT–PCR-Fragmenten

• Abbildung 8 Beispiel für Kontrollverdau nach Klonierung von DD RT-PCR-Produkten. Die ursprüngliche PCR-Bande muss entsprechend dem inhomogenen Bandenmuster mindestens 3 unterschiedliche PCR-Produkte enthalten. M: DNA-Marker. 1-8: DNA selektierter Klone.

• Abbildung 9 Differentielle Hybridisierung von LAPTM5. A) Northern-Hybridisierung mit dem Fragment 0503HD (LAPTM5), sowie Gegenhybridisierung des Blots mit einer GAPDH-Sonde. Die Expression von LAPTM5 steigt nach 2 Stunden an. B) zeigt die im Agarose-Gel aufgetrennte RNA (nach Färbung mit Ethidium-Bromid), die für den Northern Blot benutzt wurde.

• Abbildung 10 Western Blot-Analyse LAPTM5. Proteinextrakt aus BL60-2-Zellen ohne Inkubation (0) und nach Inkubation mit anti-IgM (2,4,8,12 Stunden). Die Expression nimmt 2 Stunden nach Inkubation mit anti-IgM deutlich zu.

• Abbildung 11 Expressionsmuster von LAPTM5. Multiple Tissue Northern (2μg poly-A+-RNA), Blot humanes Gewebe (links) und Blot humanes Immunsystem (rechts). Hybridisiert wurden beide Blots mit einer LAPTM5-RNA-Sonde (Riboprobe) in einem Hybridisierungsansatz. Human: H=Herz, Hi=Hirngewebe, Pl=Placenta, Lu=Lunge, Le=Leber, SM=Skelettmuskulatur, Ni=Niere, P=Pankreas, Immunsystem: Sp=Milz, Lk=Lymphknoten, Th=Thymus, Ap=Appendix, L=Periphere Blut-Lymphozyten, Km=Knochenmark, FL=Fetale Leber.

• Abbildung 12 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen. BL60-2-Zellen nach Inkubation mit anti-LAPTM5 sowie anti-Rabbit-Cy3. A: Intakte Zellen mit punktförmigem Fluoreszenzmuster und Bereichen mit erhöhter Fluoreszenzdichte. B: Zellen 16 Stunden nach Inkubation mit anti-IgM. Leichte Zunahme der Fluoreszenzintensität nach Inkubation der Zellen mit anti-IgM in Bereichen, die auch ohne Inkubation eine erhöhte Fluoreszenz aufweisen.

• Abbildung 13 FACS-Analyse von LAPTM5. BL60-2-Zellen ohne Inkubation mit anti-IgM (0h) oder 4 Stunden nach Inkubation mit anti-IgM (4h) wurden mit anti-CD19-FITC (Becton Dickinson) oder anti-LAPTM5 (Rabbit) und Zweitantikörper (anti-Rabbit-FITC) inkubiert. K: Kontrolle: FACS-Analyse ohne Antikörper (CD19), nur Zweitantikörper anti-Rabbit-FITC (LAPTM5). LAPTM5 und CD19 können auf der Oberfläche von BL60-2-Zellen detektiert werden. Die LAPTM5-Expression bleibt im untersuchten Zeitraum (4 Stunden) konstant. der Expression von LAPTM5 in BL60-Zellen.

• Abbildung 14 Membranständige Lokalisation von LAPTM5. Auftrennung von BL60-2-Lysaten mit unterschiedlicher Proteinmenge (in µg) nach Fraktionierung in Membranbestandteile und Überstand. Inkubation mit anti-LAPTM5-AK und anti-Tubulin-AK. LAPTM5 liegt nur in der Membranfraktion vor, Tubulin vorwiegend im Überstand, wie der Vergleich beider Fraktionen zeigt.

• Abbildung 15 Immunpräzipitation von LAPTM5. Links: [35S]-haltige Lysate (BL60-2, Kontrolle: HEL) wurden mit anti-LAPTM5-gekoppelter Agarose A inkubiert, die Präzipitate wurden elektrophoretisch aufgetrennt und autoradiographisch detektiert. Das LAPTM5-Protein ist ca. 27 kDa gross. Die zweite Bande der BL60-2-Linie bei ca.45 kDa wurde als beta-Aktin identifiziert. Rechts:Inkubation von nichtmarkierten Lysaten (BL60-2, HEL) mit Agarose A, Auftrennung und Färbung des Blottes nach Coomassie. Die detektierte Bande bei ca. 45 kDa entspricht beta-Aktin, das unspezifisch an Agarose A bindet.

• Abbildung 16 Elektronenmikroskopische Lokalisation von LAPTM5 in BL60-2-Zellen (Immunogold staining). LAPTM5 befindet sich vorwiegend in späten Endosomen (Typ 4) und multivesikulären Lysosomen. N=Nukleus, C=Zytoplasma, M=Mitochondrien, 4=Typ-4-Kompartiment (multivesikuläre, späte Endosomen), 5=Typ-5-Kompartiment (multivesikuläre Lysosomen).

• Abbildung 17 Elektronenmikroskopische Lokalisation von LAPTM5 in BL60-2-Zellen nach Inkubation mit anti-IgM. N=Nukleus, C=Zytoplasma, L=Lysosomen.

• Abbildung 18 Expression von pRc/CMV-EGFP in BL-60-2-Zellen. Fluoreszenzmikroskopie. Links:Hellfeld-Aufnahme. Rechts: Dunkelfeld-Aufnahme. EGFP-produzierende Zellen emittieren grünes Licht.

• Abbildung 19 Expression von EGFP in BL60-2-Zellen. Die Zellen wurden mit dem Plasmid pRc/CMV-EGFP mittels Elektroporation transfiziert und über FICOLL-Dichtegradenten-Zentrifugation aufgereinigt. Links: Die Messung der EGFP-Expression erfolgt durch FACS-Analyse. A) Untersuchte Zellpopulation. B) Kontrolle: Elektroporierte Zellen ohne DNA im Transfektionsansatz. C) pRc/CMV-EGFP, 1µg. D) pRc/CMV-EGFP, 40µg. Rechts: Abhängigkeit der Transfektionsrate von der eingesetzten Plasmid-Menge.

• Abbildung 20 pREP9-EGFP-Konstrukt. Kontrollrestriktion.1-4: pREP9-EGFP, 5 EGFP-Insert, 6 pREP9

• Abbildung 21 Expression von pREP9-EGFP in BL60-2-Zellen. A) Untersuchte Zellpopulation. B) Kontrolle: 10 µg pREP9 ohne Insert. C) 10µg pREP9-EGFP. D) 60µg pREP9-EGFP.

• Abbildung 22 G418-Sensitivität von BL60-2-Zellen. Angegeben sind die Zellzahlen von Populationen mit G418-Zusatz im Vergleich mit der Kontrollpopulation ohne G418 im Medium.

• Abbildung 23 G418-Selektion von BL60-2-Zellen nach Transfektion mit pREP9-EGFP. FACS-Analyse der EGFP-Expression nach 3, 5 und 10 Tagen. Bei einem Selektionsdruck von 1 mg G418/ml kommt es zu einer Erhöhung des Anteils EGFP-positiver Zellen, ohne Selektionsdruck bleibt dieser Anteil konstant.

• Abbildung 24 Links: CD4-Expression in Lymphozyten: A, B: Positiv-Kontrolle: Periphere Blut-Lymphozyten (PBL). C, D: Negativ-Kontrolle: BL60-2-Zellen. Rechts: Expression von ΔCD4 in BL60-2-Zellen nach Transfektion des pMACS4-Vektors. FACS-Analyse. A: untersuchte Zellpopulation. B, C,D: BL60-2-Zellen transfiziert mit pMACS4-DNA (10, 20, 30 µg Plasmid-DNA).

• Abbildung 25 Expression von ΔCD4 in BL60-2-Zellen nach Transfektion des Vektors pREP9-ΔCD4. Oben: Periphere Blutlymphozyten. A: Zellpopulation. B: ohne Inkubation mit anti-CD4. C: nach Inkubation mit anti-CD4. Unten: BL60-2-Zellen. D: Transfizierte Zellpopulation. E: Transfizierte Zellen ohne Inkubation mit anti-CD4. F: Transfizierte BL60-2-Zellen nach Inkubation mit anti-CD4.

• Abbildung 26 DYNAL-Aufreinigung pREP9-ΔCD4-transfizierter Zellen. FACS-Analyse der ΔCD4-Expression nach Inkubation mit anti-CD4-AK. A: pREP9-Transfektanten. B: pREP9-ΔCD4 Transfektanten vor der Aufreinigung. C: pREP9-ΔCD4-Transfektanten nach Aufreinigung.

• Abbildung 27 Expression von EGFP in BL60-2-Zellen nach Cotransfektion von pREP9-EGFP und pREP9-ΔCD4. FACS-Analyse der EGFP-Expression. A: Kontrolle: Cotransfizierte Zellen (pREP9-ΔCD4, pREP9). B: Cotransfizierte Zellen (pREP9-ΔCD4, pREP9-GFP) vor Selektion. C: Cotransfizierte Zellen (pREP9-ΔCD4, pREP9-GFP) nach Selektion, ΔCD4-positive Fraktion.

• Abbildung 28 Modell für die Orientierung des C-Terminus von LAPTM5.Das C-terminale Ende des Proteins ist in der Plasmamembran nach extrazellulär gerichtet. Nach Endocytose und Fusion der Endosomen mit primären Lysosomen liegt der C-Terminus luminal. In der Membran der intralysosomalen Vesikel (ILV) ist der C-Terminus zur lysosomalen Matrix hin orientiert.