Schönemeyer, Annett: Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung eines Cysteinproteasen-Inhibitors der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Herstellung und funktionelle Charakterisierung von rekombinanten
O. volvulus Proteinen

3.1.1 Klonierung und prokaryotische Expression rekombinanter O. volvulus Proteine

3.1.1.1 Klonierung und Expression eines „full length“ O. volvulus Cystatins (rOv17)

Die DNA des O. volvulus Cystatins wurde mittels PCR und spezifischer Primer aus einer O. volvulus L3 cDNA Bank (Dr. S. Williams, Northhampton, USA) amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt des O. volvulus Cystatins, welches ohne Signalsequenz amplifiziert wurde, umfaßt 423 bp. Zur Schaffung von EcoRI-Schnittstellen wurde das PCR-Produkt in einen T-Überhangsvektor (pGEM T Easy vector) subkloniert. Durch die Klonierung des EcoRI-geschnittenen Inserts in das Expressionsplasmid pET28b wurde ein rekombinanten O. volvulus Cystatin (rOv17) mit 6 His am N-Terminus exprimiert. Die Expression von rOv17 erfolgte in BL21(DE3) pLysS-E. coli. Das rekombinante O. volvulus Cystatin wird von 177 Aminosäuren (141 Aminosäuren O. volvulus Cystatin + 26 Aminosäuren des pET Vektors) kodiert und hat ein theoretisches MW von 19,5 kD. Nach Induktion durch IPTG wurde im SDS-PAGE eine Expressionsbande mit einem MW von 21 kD identifiziert (Abb. 3), die im anschließenden Western Blot von einem anti-A.viteae Cystatin Kaninchenserum erkannt wurde. rOv17 wurde mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie nativ aufgereinigt, mehrmals gegen PBS dialysiert und sterilfiltriert (Abb. 3).

Abb. 3: Expression und Aufreinigung von rOv17. Spur 1: Molekulargewichtsmarker, Spur 2: Bakterienkultur ohne Induktion, Spur 3: Bakterienkultur nach 3 h Induktion mit IPTG, Spur 4: eluierte rOv17 Fraktion, Spur 5: dialysierte und sterilfiltrierte rOv17 Fraktion.


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3.1.1.2 Klonierung und Expression eines verkürzten O. volvulus Cystatins (trOv17)

Ein verkürztes O. volvulus Cystatins (trOv17), welches um den N-Terminus einschließlich des N-terminalen aktiven Bereich -LLG- verkürzt ist, wurde kloniert und in E. coli exprimiert, um ein O. volvulus Cystatin zu generieren, welches nicht oder nur noch begrenzt als Cysteinproteasen-Inhibitor aktiv ist. Die DNA des verkürzten O. volvulus Cystatin (kloniert in pMal) wurde uns freundlicherweise von Frau Dr. J. Bradley (Salford University, Manchester, GB) zur Verfügung gestellt. Das Insert, welches für das verkürzte O. volvulus Cystatin kodiert, wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI aus dem pMal-Vektor isoliert und in den Sequenzierungsvektor pBlueskript umkloniert. Die Sequenzierung der rekombinanten Plasmide bestätigte, daß das verkürzte O. volvulus Cystatin unmittelbar hinter dem N-terminalen konservierten, aktiven Bereich mit der Aminosäure 55 (Trp) beginnt. Das EcoRI verdaute Insert wurde in das 6His-Expressionsplasmid pET28a kloniert. Das verkürzte rekombinante O. volvulus Cystatin wird von 145 Aminosäuren (109 AS O. volvulus Cystatin + 36 AS vom pET-Vektor) kodiert und hat ein theoretisches MW von 15,5 kD. Die Expression von trOv17 erfolgte in BL21(DE3)-E. coli. Nach Induktion der Expression durch IPTG wurde im SDS-PAGE eine Induktionsbande mit einem MW von 16 kD identifiziert (Abb. 4), die im Western Blot von einem anti-A.viteae Cystatin Kaninchenserum erkannt wurde. Das verkürzte O. volvulus Cystatin wurde unter nativen Bedingungen mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt, gegen PBS dialysiert und sterilfiltriert.

Abb. 4: Expression und Aufreinigung von trOv17. Spur 1: Molekulargewichtsmarker, Spur 2: Bakterienkultur ohne Induktion, Spur 3: Bakterienkultur nach 3 h Induktion mit IPTG, Spur 4: eluierte trOv17 Fraktion, Spur 5: dialysierte und sterilfiltrierte trOv17 Fraktion.


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3.1.1.3 Klonierung und Expression eines O. volvulus Kontrollproteins (rOv33)

Als Negativkontrolle für alle weiteren Untersuchungen wurde ein O. volvulus Protein (Ov33) kloniert und exprimiert, welches Ähnlichkeit mit der Familie der Aspartylproteasen-Inhibitoren aufweist (Lucius et al. 1988, Willenbucher et al. 1993). Die Ov33-cDNA wurde mittels PCR und spezifischen Primern aus dem rekombinanten Ov33-pGEX Plasmid amplifiziert. Die Primer waren so konstruiert, daß die Amplifikate eine SacI Restriktionsschnittstelle am 5'-Terminus und eine SalI-Restriktionsschnittstelle am 3'-Terminus erhielten. Das PCR-Produkt umfaßt 666 Basenpaare und kodiert für Ov33 ohne Signalsequenz. Das SacI und SalI verdaute PCR-Produkt wurde in das 6His-Expressionsplasmid pET28b kloniert. Das rekombinante Ov33 (rOv33) wird von 271 Aminosäuren (222 AS rOv33 + 49 AS pET-Vektor) kodiert und hat ein theoretisches MW von 30 kD. Die Expression von rOv33 erfolgte in BL21(DE3)-E. coli (Abb. 5). Nach Induktion wurde im SDS-PAGE eine Expressionsbande mit einem MW von 30 kD identifiziert, die im Western Blot durch den anti-rOv33 monoklonalen Maus-Antikörper IVA7 erkannt wurde. rOv33 wurde unter denaturierenden Bedingungen mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt (Abb. 5). Die Dialyse erfolgte gegen Puffer mit absteigender Harnstoffkonzentration und abschließend mehrmals gegen PBS. Die gewonnenen rOv33 Fraktionen wurden sterilfiltriert.

Abb. 5: Expression und Aufreinigung von rOv33. Spur 1: Molekulargewichtsmarker, Spur 2: Bakterienkultur ohne Induktion, Spur 3: Bakterienkultur nach 3 h Induktion mit IPTG, Spur 4: dialysierte und sterilfiltrierte rOv33 Fraktion.


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In Tab. 1 sind die wichtigsten Klonierungsdaten und Eigenschaften der 3 rekombinant hergestellten Proteine abschließend noch einmal zusammengefaßt.

Tab. 1: Übersicht über die Klonierungs- und Expressionsdaten von rOv17, trOv17 und rOv33

 

rOv17

trOv17

rOv33

Template DNA

O. volvulus L3 cDNA Bank

trOv17-pMal

rOv33-pGex

Größe der DNA-Inserts

423 bp

ca. 600 bp

(poly-T am 3'-Ende)

666 bp

Expressionsplasmid

pET28b

pET28a

pET28b

Transformierte E. coli

BL21(DE3)pLysS

BL21(DE3)

BL21(DE3)

Theoretisches MW

19,5 kD

15,5 kD

30 kD

Tatsächliches MW

21 kD

16 kD

33 kD


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3.1.2 Sequenzanalyse von rOv17 und trOv17

3.1.2.1 Sequenzierung der klonierten DNA von rOv17 und trOv17

Zur Überprüfung der Nukleotidsequenz wurde die amplifizierte DNA von rOv17 und trOv17 nach der Methode von Sanger et al. (1977) von der Firma AGOWA (Berlin) sequenziert. Hierfür wurde die DNA über die EcoRI-Restriktionsschnittstelle in den Vektor pBlueskript kloniert. Die Nukleotidsequenz ist in Abb. 6 dargestellt. Die Aminosäuresequenz wurde mit Hilfe des HUSAR 5.0-Programms basierend auf dem GCG-Programm (Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA) abgeleitet.

Abb. 6: Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz von rOv17 und trOv17. Die Numerierung beginnt mit dem ersten Nukleotid bzw. mit der ersten Aminosäure von rOv17 ohne Signalsequenz. Der Pfeil markiert den Beginn von trOv17. Eingekästelt dargestellt ist in der Sequenz von rOv17 die AS Leucin, an deren Stelle sich in der Sequenz von trOv17 ein Serin befindet.


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3.1.2.2 Aminosäuresequenzvergleich von rOv17, trOv17 und Onchocystatin

Mit Hilfe des HUSAR 5.0-Programms wurden die Aminosäuresequenzen von rOv17 und trOv17 mit der Sequenz des von S. Lustigman beschriebenen Onchocystatins (Lustigman et al. 1991, 1992) verglichen. Der Aminosäureabgleich ist in Abb. 7 dargestellt. Die Aminosäuresequenz von rOv17 (ohne Signalsequenz) stimmt in allen AS mit der Sequenz des Onchocystatins überein. Die Sequenz des verkürzten trOv17 unterscheidet sich in einer AS von der Sequenz des Onchocystatins bzw. von rOv17. An Position 91 (Onchocystatin Numerierung) bzw. 70 (rOv17 Numerierung) befindet sich in der Sequenz von Onchocystatin bzw. von rOv17 ein Leucin, in der Sequenz von trOv17 ein Serin. Die Sequenzierung und der Aminosäuresequenzvergleich bestätigen, daß es sich bei dem klonierten und exprimierten rOv17 und trOv17 um das von S. Lustigman (1991, 1992) beschriebene Onchocystatin der Filarie O. volvulus handelt.

Abb. 7: Aminosäuresequenzvergleich von Onchocystatin, rOv17 und trOv17. Die Numerierung bezieht sich auf die Sequenz von Onchocystatin. Sterne (*) markieren identische AS. Eingekästelt dargestellt sind die konservierten, aktiven Bereiche, die an der Inhibition papainähnlicher Cysteinproteasen beteiligt sind. Grau unterlegt ist die AS, in der sich trOv17 von Onchocystatin und rOv17 unterscheidet. Anstelle des Leucins an Position 91 von Onchocystatin bzw. 70 von rOv17 befindet sich in der Sequenz von trOv17 ein Serin.


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3.1.3 Funktionelle Charakterisierung von rOv17 und trOv17

3.1.3.1 Charakterisierung des inhibitorischen Potentials von rOv17 und trOv17

3.1.3.1.1 Titration der aktiven Zentren von humanem Cathepsin B, L und S

Die Titration der aktiven Zentren wurde durchgeführt, um die wirksame Enzymkonzentration der Cysteinproteasen, die im Test eingesetzt werden sollten, zu bestimmen. Die Titration der Cysteinproteasen erfolgte mit einem E64- Standard und mit Eiweißcystatin (EwC). E64 und EwC binden die Proteasen in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1. E64 bindet dabei kovalent an den Cysteinrest im aktiven Zentrum der Protease. Die Titration mit E64 gibt daher Auskunft über die katalytische Wirksamkeit der Proteasen. Die Titration mit EwC, einem Inhibitor, der sich nichtkovalent in die Substratbindungstasche der Proteasen bindet, gibt Auskunft über die Konzentration an nativen Proteasemolekülen. Die Ergebnisse der Titration sind in Tab. 2 dargestellt.

Tab. 2: Titrierte Konzentrationen von Papain und Cathepsin B, L und S mit E64 und EwC.

 

E64-titrierte Konzentration

EwC-titrierte Konzentration

Verhältnis von

E64 zu EwC

Papain

0,88 µM

1,5 µM

53,3%

Cathepsin B

0,12 µM

n.d.

\|--\|

Cathepsin L

0,46 µM

0,85 µM

54,1%

Cathepsin S

0,42 µM

0,67 µM

61,5%

Die Ergebnisse der Titration zeigen, daß der Prozentsatz an wirksamer Enzymkonzentration bezogen auf die EwC-titrierte Gesamtkonzentration bei 50-60% liegt. Mit 50-60% ist für weitere Untersuchungen eine ausreichend große Anzahl an Proteasemolekülen katalytisch aktiv.

Aufgrund der Zugehörigkeit von rOv17 zu den Cystatinen, wird im weiteren Verlauf der Arbeit nur noch mit den EwC-titrierten Cathepsin-Konzentrationen gearbeitet.


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3.1.3.1.2 Sekundärtitration von rOv17 mit humanem Cathepsin L

Unter Verwendung der titrierten Cathepsin L-Charge wurde der Anteil an inhibitorisch wirksamen rOv17 bestimmt. Die Auswertung ergab, daß der Anteil aktiven Inhibitors der verwendeten rOv17-Fraktion 34,5% betrug. Die titrierte wirksame Inhibitorkonzentration von rOv17 wurde als Grundlage für die Berechnung der Ki-Werte verwendet. Für die übrigen Tests im weiteren Verlauf der Arbeit, wurde die im BCA-Test ermittelte Proteinkonzentration beibehalten.

3.1.3.1.3 Bestimmung der Km-Werte von Cathepsin L und B

Da Cystatine fest, aber trotzdem reversibel die Substratbindungsstellen der Protease besetzen, also kompetitive Inhibitoren sind, war die Bestimmung der Km-Werte Voraussetzung für die Berechnung der Dissoziationskonstanten Ki. Für die Bestimmung der Km-Werte wurde die Aktivität der Cysteinproteasen bei verschiedenen Substratkonzentrationen bestimmt. Die Geschwindigkeit der Reaktion wurde durch die Messung der Fluoreszenzänderung durch die Freisetzung des fluorogenen AMC-Produktes (P) in Abhängigkeit von der Zeit (t) ermittelt. Die für die Km-Berechnung notwendige Extrapolation der Reaktionsgeschwindigkeit auf den Startzeitpunkt (V0) erfolgte durch die nichtlineare Regression nach der Gleichung 1. Die Km-Werte (Tab. 3) wurden anschließend durch die nichtlineare Regression der Anfangsgeschwindigkeiten nach der Gleichung 2 berechnet.

Gleichung 1:

P=V0 t E B t + C

 

 

P

- Produktkonzentration

 

V0

- Anfangsgeschwindigkeit

 

E

- Enzymkonzentration

 

B

- Maß für die Krümmung der Kurve

 

C

- Korrekturwert für Abweichungen vom Startzeitpunkt

 

t

- Zeit

Gleichung 2:

V0=Vmax S0 / S0+Km

 

 

Vmax

- Maximalgeschwindigkeit

 

S0

- Anfangskonzentration des Substrates

 

Km

Michaelis Menten Konstante

 


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Tab. 3: KM-Werte für Papain und Cathepsin B, L, und S. Für die Bestimmung der KM-Werte wurde die Aktivität der Proteasen bei verschiedenen Substratkonzentration bestimmt. Die KM-Werte wurden durch Doppelbestimmungen ermittelt.

 

Substrat

Km-Wert

Papain

Z-Phe-Arg-AMC

650 µM

Cathepsin B

Z-Arg-Arg-AMC

82,92 ± 6,42 µM

Cathepsin L

Z-Phe-Arg-AMC

1,23 ± 0,13 µM

Cathepsin S

Z-Val-Val-Arg-AMC

13,13 ± 1,73 µM

3.1.3.1.4 Bestimmung der Dissoziationskonstanten Ki

Wie bereits beschrieben, binden Cystatine Cysteinproteasen fest, aber reversibel und konkurrieren dabei mit dem Substrat um das Enzym (Schema 1).

Für die Bestimmung der Dissoziationskonstanten Ki wurde die Änderung der Enzymaktivität nach Zusatz unterschiedlicher Konzentrationen an rOv17 und trOv17 als Funktion der Zeit (t) gemessen (Abb. 9A, 10A, 11A). Durch die nichtlineare Regression nach der Gleichung 3 lassen sich aus den Meßwerten die Sekundärdaten Vi, V0, und kobs ermitteln.

Gleichung 3:

P=Vi t + [(V0Vi) / kobs (1-E kobs t)]

 

Vi

- Geschwindigkeit der gehemmten Reaktion

 

kobs

- Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung


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Damit hat man die Möglichkeit, die Ki-Werte sowohl für die pre-steady-state Phase [Ki=f(kobs), Gleichung 4, Abb. 9B, 10B, 11B], als auch für die steady-state Phase [Ki=f(Vi), Gleichung 5, Abb. 8, 9B, 10B, 11B, 12] zu berechnen.

Gleichung 4:

kobs=Koff (1+I Km / Ki (Km+S0)

 

Koff

- Geschwindigkeitskonstante für der Zerfall von EI

Gleichung 5:

Vi=Vmax S0 / (Km(1+I/Ki)+S0)

In Tab. 4 sind jeweils die Ki-Werte der nichtlinearen Regression der steady state Phase mit dem vom Programm GraphPad Prism angegebenen Standardfehlern aufgeführt.

Tab. 4: Ki-Werte von rOv17 und trOv17 für Papain und Cathepsin B, L und S. Die Bestimmung der Ki-Werte erfolgte durch die Messung der Änderung der Proteasenaktivität in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33. Für die Bestimmung derKi-Werte wurden Doppelbestimmungen durchgeführt.

 

rOv17

trOv17

rOv33

Papain

0,038±0,005 nM

14,5±0,4 nM

673±1,1 nM

Cathepsin B

494,7±154,9 nM

n.d.

n.d.

Cathepsin L

0,038±0,004 nM

11,5±1,3 nM

n. d.

Cathepsin S

0,033±0,003 nM

29,6±3,6 nM

n. d.

Die Bestimmung der Ki-Werte verdeutlicht, daß rOv17 die Fähigkeit besitzt, die Aktivität von Cysteinproteasen der Papain-Superfamilie zu inhibieren. Die Stärke der Inhibition unterscheidet sich dabei in Abhängigkeit von der jeweiligen Cysteinprotease. Auch das verkürzte trOv17 inhibiert die Aktivität der Cysteinproteasen. Im Vergleich zum rOv17, bedingt das Fehlen des N-Terminus' von trOv17 in Abhängigkeit von der Protease eine um das 300-900 fache verminderte Affinität zu den Cysteinproteasen.

Im Vergleich zu rOv17 und trOv17 beeinflußt rOv33 die Aktivität papainähnlicher Cysteinproteasen nicht, was beispielhaft für die Cysteinprotease Papain gezeigt wurde (Abb.8).


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Abb. 8: Vergleich der inhibitorischen Wirksamkeit von rOv17, trOv17 und rOv33 gegenüber Papain. Die Messungen erfolgten bei 37°C. Als fluorogenes Substrat wurden Z-Phe-Arg-AMC in einer Konzentration von 25 µM eingesetzt. Dargestellt ist die normierte Geschwindigkeit der Produktbildung im steady state, die aus der nichtlinearen Regression der Sekundärdaten ermittelt wurde (Gleichung 5), als Funktion der Konzentration von rOv17, trOv17 und rOv33. Zur Normierung dienten entweder die Anfangsgeschwindigkeiten V0 (rOv17) oder die Kontrollmessungen ohne rekombinantes Protein (trOv17, rOv33).


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Abb. 9: Inhibition von Cathepsin B durch rOv17. A: Primärplot: Die Aktivität von Cathepsin B wurde fluorimetrisch in Anwesenheit verschiedener rOv17 Konzentrationen bestimmt. Die Messungen erfolgten bei 37°C. Als fluorogenes Substrat wurden Z-Arg-Arg-AMC in einer Konzentration von 40 µM eingesetzt. Dargestellt ist die gemessene Produktbildung in Fluoreszenzeinheiten [FE] in Abhängigkeit von der Zeit, zusammen mit den jeweils durch nichtlineare Regression ermittelten Kurvenverläufen nach Gleichung 3 zur Bestimmung der Sekundärdaten Vi, V0 und Kobs. B: Sekundärplot. Dargestellt ist die normierte steady state Geschwindigkeit der Produktbildung, die aus der nichtlinearen Regression der Sekundärdaten ermittelt wurde (Gleichung 5), in Abhängigkeit von der rOv17 Konzentration. Zur Normierung der Geschwindigkeit diente die Geschwindigkeit der Kontrollmessungen ohne Inhibitor.

A

B


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Abb. 10: Inhibition von humanem Cathepsin L durch rOv17. A: Primärplot. Die Aktivität von Cathepsin L wurde fluorimetrisch in Anwesenheit verschiedener rOv17 Konzentrationen (wie angegeben) bestimmt. Die Messungen erfolgten bei 37°C. Als fluorogenes Substrat wurden Z-Phe-Arg-AMC in einer Konzentration von 5 µM eingesetzt. Dargestellt ist die gemessene Produktbildung in Fluoreszenzeinheiten [FE] in Abhängigkeit von der Zeit, zusammen mit den jeweils durch nichtlineare Regression ermittelten Kurvenverläufen nach Gleichung 3 zur Bestimmung der Sekundärdaten Vi, V0 und Kobs. B: Sekundärplot. Dargestellt ist das Ergebnis der lineraren und nichtlinearen Regression der Sekundärdaten zur Ermittlung des Ki-Wertes. Y1 (blau): Normierte steady state Geschwindigkeit der Produktbildung in Abhängigkeit von der rOv17-Konzentration (Gleichung 5). Zur Normierung diente die Anfangsgeschwindigkeit V0. Y2 (rot): pre steady state Geschwindigkeitskonstante (Kobs) in Abhängigkeit von der rOv17-Konzentration (Gleichung 4).

A

B


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Abb. 11: Inhibition von humanem Cathepsin S durch rOv17. A: Primärplot. Die Aktivität von Cathepsin S wurde fluorimetrisch in Anwesenheit verschiedener rOv17 Konzentrationen (wie angegeben) bestimmt. Die Messungen erfolgten bei 37°C. Als fluorogenes Substrat wurden Z-Val-Val-Arg-AMC in einer Konzentration von 40 µM eingesetzt. Dargestellt ist die gemessene Produktbildung in Fluoreszenzeinheiten [FE] in Abhängigkeit von der Zeit, zusammen mit den jeweils durch nichtlineare Regression ermittelten Kurvenverläufen nach Gleichung 3 zur Bestimmung der Sekundärdaten Vi, V0 und Kobs. B: Sekundärplot. Dargestellt ist das Ergebnis der lineraren und nichtlinearen Regression der Sekundärdaten zur Ermittlung des Ki-Wertes. Y1 (blau): Normierte steady state Geschwindigkeit der Produktbildung in Abhängigkeit von der rOv17-Konzentration (Gleichung 5). Zur Normierung diente die Anfangsgeschwindigkeit V0. Y2 (rot): pre steady state Geschwindigkeitskonstante (Kobs) in Abhängigkeit von der rOv17-Konzentration (Gleichung 4).

A

B


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Abb. 12: Vergleich der inhibitorischen Wirksamkeit von rOv17, trOv17 und rOv33 gegenüber Papain. Die Messungen erfolgten bei 37°C. Als fluorogenes Substrat wurden Z-Phe-Arg-AMC in einer Konzentration von 25 µM eingesetzt. Dargestellt ist die normierte Geschwindigkeit der Produktbildung im steady state, die aus der nichtlinearen Regression der Sekundärdaten ermittelt wurde (Gleichung 5) als Funktion der Konzentration von rOv17, trOv17 und rOv33. Zur Normierung dienten entweder die Anfangsgeschwindigkeiten V0 (rOv17) oder die Kontrollmessungen ohne rekombinantes Protein (trOv17, rOv33).


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3.1.4 Quantifizierung des LPS-Gehaltes der rekombinant hergestellten O. volvulus Proteine

LPS ist Grundbaustein der Bakterienzellwand gramnegativer Bakterien und wirkt bereits im pg-Bereich immunmodulatorisch. Aufgrund der prokaryotischen Expression der Proteine enthalten die aufgereinigten Fraktionen LPS. Um einen möglichen Einfluß von LPS in den durchzuführenden Test quantifizieren zu können, wurde der LPS-Gehalt der Proteinfraktionen von rOv17, trOv17 und rOv33 mittels eines Limulus Amoebozytenlysat-Tests bestimmt (Tab. 5). Zusätzlich wurde nach Einsatz verschiedener Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 im Zelltest, die dadurch verursachte LPS-Kontamination durch die Messung der LPS-Konzentration in den entsprechenden Zellkulturüberständen bestimmt (Tab. 5).

Tab. 5: LPS-Gehalt der aufgereinigten Proteinfraktionen und LPS-Konzentration im Zellkulturüberstand nach Einsatz verschiedener Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33.

 

rOv17

trOv17

rOv33

Proteinfraktion

0,05 - 0,1 ng/ml

3 - 4 ng/ml

1 - 2 ng/ml

LPS-Konzentration im Kulturüberstand mit 0,01 µM rOv17, trOv17, rOv33

0,04 - 0,13 pg/ml

3 - 4 pg/ml

1,5 - 3 pg/ml

LPS-Konzentration im Kulturüberstand mit 0,5 µM rOv17, trOv17, rOv33

2,0 - 6,5 pg/ml

150 - 200 pg/ml

75 - 150 pg/ml

3.2 Bestimmung der Konzentration von Onchocystatin im Kulturüberstand von O. volvulus Weibchen

Die Konzentration von Onchocystatin im Kulturüberstand weiblicher Würmer wurde bestimmt, um die Ausscheidung von Onchocystatin in vivo beurteilen zu können. Der 24 h Kulturüberstand von 5 weiblichen O. volvulus Würmern wurde uns freundlicherweise von Dr. N. Brattig (Bernhard-Nocht Institut Hamburg) zur Verfügung gestellt. Die Konzentration von Onchocystatin wurde mittels ELISA bestimmt. In den 24 h-Kulturüberständen wurde pro Weibchen eine Konzentration von 20-40 ng Onchocystatin bestimmt.


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3.3 Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung der rekombinanten O. volvulus Cystatine

3.3.1 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die antigenspezifische Proliferation

3.3.1.1 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die PPD-stimulierte Proliferation humaner PBMC

Mit Hilfe der PPD-stimulierten Proliferation sollte untersucht werden, ob rOv17, ein rekombinant hergestellter, aktiver Cysteinproteasen-Inhibitor der humanpathogenen Filarie O. volvulus, die Fähigkeit besitzt, den Verlauf einer antigenspezifischen Immunantwort zu beeinflussen. Um zu untersuchen, ob die Eigenschaft als Cysteinproteasen-Inhibitor in diesem Zusammenhang von Bedeutung ist, wurde vergleichend zum rOv17 der Einfluß einer verkürzten und dadurch inhibitorisch weniger aktiven, rekombinant hergestellten Variante des Cysteinproteasen-Inhibitors (trOv17) auf die PPD-spezifische Proliferation charakterisiert. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Abb. 13 dargestellt. rOv17 und trOv17 inhibieren die PPD-stimulierte Proliferation von humanen T-Zellen gleichermaßen um durchschnittlich 45%. Im Vergleich dazu hat das Kontrollprotein rOv33 keinen Einfluß auf die PPD-stimulierte Proliferation.

Abb. 13: Inhibition der PPD-spezifischen T-Zell-Proliferation durch rOv17 und trOv17. PBMC von 3 Spendern wurden mit 10 IE/ml PPD stimuliert und jeweils in Dreieransätzen mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 90 h inkubiert. Die Proliferation der Zellen wurde durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA während der letzten 20 h der Inkubation quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte der Proliferation [cpm] ± Standardabweichung von 3 unabhängig voneinander durchgeführten Tests (A-C) mit 3 Spendern.


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3.3.1.2 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die O. volvulus-antigenspezifische Proliferation von Milzzellen immunisierter BALB/c Mäuse

Der Einfluß von rOv17 und trOv17 wurde auch auf den Verlauf der filarienantigenspezifischen Immunantwort charakterisiert. Hierfür wurden BALB/c Mäuse mit O. volvulus-Antigengesamtextrakt (OvAg) immunisiert und der Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Milzzellenproliferation nach Restimulation mit OvAg untersucht (Abb. 14). Die Proliferation OvAg-stimulierter Milzzellen wird durch rOv17 im Durchschnitt um 90% und durch trOv17 um 28% gehemmt. Das Kontrollprotein rOv33 supprimiert die Proliferation mit durchschnittlich 5% nur gering.

Abb. 14: Inhibition der OvAg-spezifischen Proliferation durch rOv17 und trOv17. Milzzellen OvAg immunisierter BALB/c Mäuse wurden in vitro mit 10 µg/ml OvAg restimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 90 h inkubiert. Die Proliferation wurde durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA der proliferierenden Zellen in den letzten 20 h der Inkubation quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte der Proliferation [cpm] ± Standardabweichung, die aus den dreifach bestimmten Proliferationswerten berechnet wurden. Der Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die OvAg-spezifische Proliferation wurde in 2 unabhängig voneinander durchgeführten Tests (A und B) untersucht. Pro Test wurden die Milzzellen von 3 Mäusen präpariert.


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3.3.2 Einfluß von EwC und E64 auf die PPD-stimulierte Proliferation humaner PBMC

Um zu überprüfen, ob die immunmodulierende Wirkung eine allgemeine Eigenschaft von Cysteinproteasen-Inhibitoren ist, wurde der Einfluß von zwei weiteren Cysteinproteasen-Inhibitoren auf die PPD-stimulierte T-Zell-Proliferation getestet. Untersucht wurde EwC, ein Vertreter der Typ 2-Cysteinproteasen-Inhibitoren und E64, ein irreversibler Cysteinproteasen-Inhibitor. In den Studien wurde ein E64-Derivat (E64d) eingesetzt, welches aufgrund seiner Modifizierung membrangängig ist. EwC und E64 induzieren im Vergleich zum rOv17 bei einer Konzentration von 0,5 µM keine Inhibition der PPD-stimulierten T-Zell-Proliferation (Abb. 15).

Abb. 15: PPD-stimulierte T-Zell-Proliferation in Anwesenheit von EwC und E64. Humane PBMC wurden in vitro mit 10 IE/ml stimuliert und mit 0,5 µM EwC und E64 für 90 h inkubiert. Die Proliferation der Zellen wurde durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA während der letzten 20 h der Inkubation bestimmt. Die Proben wurden in Dreieransätzen getestet, aus denen die Mittelwerte der Proliferation [cpm] und die Standardabweichungen berechnet wurden. Dargestellt sind 2 unabhängig voneinander durchgeführte Versuche (A und B) mit jeweils 1 Spender.


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3.3.3 Einfluß der rekombinanten O. volvulus Cystatine auf die polyklonal-stimulierte Proliferation von humanen PBMC

3.3.3.1 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die PHA-stimulierte Proliferation von humanen PBMC

Um zu untersuchen, ob rOv17 und trOv17 auch unabhängig von der Antigenpräsentation die Proliferation von T-Zellen beeinflussen können, wurde die Proliferation von PHA-stimulierten PBMC in Anwesenheit von rOv17 und trOv17 charakterisiert. Hierfür wurde zunächst durch den Einsatz von verschiedenen Konzentrationen von rOv17 und rOv33 eine mögliche Konzentrationsabhängigkeit analysiert. rOv17 inhibiert die PHA-stimulierte Proliferation in Abhängigkeit von der Konzentration um 12-42% (Abb. 16). Bei einer Konzentration von 0,1 µM supprimiert rOv17 die Proliferation durchschnittlich um 12%, bei 0,25 µM um 30% und bei 0,5 µM um 42%. Das Kontrollprotein, rOv33 hat keinen inhibitorischen Einfluß auf die Proliferation der PBMC (Abb. 16).

Abb. 16: Konzentrationsabhängige Inhibition der PHA-stimulierten Proliferation durch rOv17. Humane PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17 für 72 h inkubiert. Die Quantifizierung der Proliferation erfolgte durch die Messung der Radioaktivität der Zellen nach dem Einbau von 3H-Thymidin in die DNA während der letzten 20 h der Inkubation. Die rekombinanten Proteine und die Kontrollen wurden in Dreieransätzen getestet, aus denen der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet wurden. Dargestellt sind 2 unabhängig voneinander durchgeführte Tests (A und B) mit jeweils 1 Spender.


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Der inhibitorische Effekt von rOv17 auf die PHA-stimulierte Proliferation wurde mit humanen PBMC von 10 weiteren Spendern getestet. Dabei wurde rOv17 in einer Konzentration von 0,5 µM eingesetzt, da diese Konzentration im Vortest eine deutliche Inhibition induzierte. Desweiteren wurde vergleichend zum rOv17 der Einfluß des verkürzten trOv17 untersucht. rOv17 inhibiert die PHA-stimulierte Proliferation durchschnittlich um 40% (p<0,0001), das verkürzte trOv17 um 32% (p<0,0001) und das Kontrollprotein rOv33 supprimiert die Proliferation um 16% (p<0,0001) (Abb. 17). Wählt man rOv33 als Bezugsgröße für die Berechnung der Signifikanz, hemmen rOv17 und trOv17 auch dann die Proliferation statistisch signifikant (p<0,0001).

Abb. 17: Inhibition der PHA-stimulierten Proliferation humaner PBMC durch rOv17 und trOv17. PBMC von 10 Spendern wurden mit PHA stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 72 h inkubiert. Dargestellt sind die Proliferationswerte in [%] in Bezug auf die PHA-Kontrolle. Die Mittelwerte der Proliferation der 10 Spender sind durch Querstriche dargestellt.


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3.3.3.2 Proliferation von PHA-stimulierten PBMC in Anwesenheit von rOv17 und einem anti-rOv17 Kaninchenserum

Um zu überprüfen, ob die Inhibition der PHA-stimulierten Proliferation ein rOv17-spezifischer Effekt ist, wurde untersucht, ob ein anti-rOv17 Kaninchenserum den inhibitorischen Effekt von rOv17 auf die PHA-stimulierte Proliferation neutralisiert. Hierfür wurden PHA-stimulierte PBMC mit rOv17 und anti-rOv17 Kaninchenserum koinkubiert. Der Einsatz des anti-rOv17 Kaninchenserum hebt die durch rOv17-induzierte Inhibition der Proliferation auf (Abb.18). Im Vergleich dazu, hat das Kontrollserum, ein anti-Eimerien-Kaninchenserum, keinen Einfluß auf die durch rOv17-induzierte verminderte Proliferation.

Abb. 18: Neutralisation der durch rOv17 induzierten verminderten PHA-stimulierten Proliferation durch den Einsatz eines anti-rOv17 Kaninchenserums. PHA-stimulierte PBMC wurden mit 0,5 µM rOv17 und dem anti-rOv17 Kaninchenserum für 72 h inkubiert. Als Kontrollserum wurde ein anti-Eimerien-Kaninchenserum verwendet. Die Proliferation der Zellen wurde durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA während der letzten 20 h der Inkubation quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte der Proliferation [cpm] ± Standardabweichung, die aus den durchgeführten Dreifachbestimmungen berechnet wurden. Dargestellt ist das Ergebnis von 2 unabhängig voneinander durchgeführten Test (A und B) mit 2 Spendern.


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3.3.3.3 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die anti-CD3 Ak-stimulierte Proliferation humaner PBMC

Mit der Stimulation von humanen PBMC durch immobilisierte anti-CD3 Ak sollte überprüft werden, ob rOv17 und trOv17 die polyklonal-stimulierte Proliferation unabhängig vom verwendeten T-Zell-Stimulus inhibieren. rOv17 supprimiert die durch immobilisierte anti-CD3 Ak-stimulierte Proliferation durchschnittlich um 41,9% (p=0,002), trOv17 um 32,1% (p=0,002) und rOv33 um 16% (p=0,004) (Abb.19). Auch in Bezug zum Kontrollprotein rOv33 ist die Inhibition von rOv17 und trOv17 statistisch signifikant (p=0,02).

Abb. 19: Inhibition der anti-CD3 Ak-stimulierten Proliferation durch rOv17 und trOv17. PBMC wurden mit immobilisierten anti-CD3 Ak stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 72 h inkubiert. Die Kontrollen und rekombinanten Proteine wurden in Dreieransätzen getestet. Die Proliferationswerte sind in [%] im Vergleich zur anti-CD3 Kontrolle dargestellt. Die Mittelwerte sind durch Querstriche dargestellt.


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3.3.4 Bestimmung der Zielzelle(n) von rOv17

3.3.4.1 Charakterisierung der Bindung und Aufnahme von rOv17 und trOv17 durch Immunzellen

Ziel war es, mit Hilfe einer Fluoreszenzfarbstoffmarkierung (Fluos) von rOv17, trOv17 und rOv33, mögliche Zielzellen von rOv17 mittels FACS-Analyse zu bestimmen. Hierfür wurden die Fluos-markierten Proteine mit RPMI-verdünntem Blut inkubiert und anschließend die Bindung von rOv17, trOv17 und rOv33 im Durchflußzytometer analysiert. Die Zellpopulationen wurden durch ihr unterschiedliches Lichtstreuungsverhalten (forward scatter, side scatter) und Monozyten zusätzlich durch eine Markierung mit PE-Cy5-markierten anti-CD14 Ak identifiziert. Die Ergebnisse des Bindungsverhalten der rekombinanten Proteine sind in Abb. 20A-C dargestellt. Alle getesteten rekombinanten Proteine interagieren mit Granulozyten (Abb. 20A) und Monozyten (Abb. 20B), wobei die Interaktion der Proteine mit Monozyten im Vergleich zu den Granulozyten stärker ausgeprägt ist. Lymphozyten bleiben nach einer Inkubation von 2 h bei 37°C von rOv17, trOv17 und rOv33 unbeeinflußt (Abb. 20C).

Die Gesamtfluoreszenz gibt den Anteil an oberflächlich gebundenem und intrazellulärem Fluos-markiertem Protein wieder. Um den Anteil an aufgenommenen Protein durch die Granulozyten und Monozyten beurteilen zu können, wurde die Oberflächenfluoreszenz der Zellen mit einem Quenching-Reagenz neutralisiert und anschließend die verbleibende, intrazelluläre Fluoreszenz der Proben gemessen. rOv17, trOv17 und rOv33 werden in geringem Maße von Granulozyten, stärker jedoch von Monozyten aufgenommen (Abb. 20A, B).


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Abb. 20: Bindung und Aufnahme von Fluos-rOv17, Fluos-trOv17 und Fluos-rOv33 durch Granulozyten und Monozyten. A: Granulozyten. B: Monozyten. C: Lymphozyten. RPMI-verdünntes Blut wurde mit 0,25 µM Fluos-rOv17, Fluos-trOv17 oder Fluos-rOv33 für 2 h bei 37°C inkubiert. Nach Aufbereitung der Zellen wurde die Bindung und Aufnahme der Fluos-markierten Proteine im Durchflußzytometer ausgewertet. Dargestellt ist der Mittelwert der mittleren Fluoreszenzintensität ± Standardabweichung. Das Bindungsverhalten von rOv17, trOv17 und rOv33 wurde mit PBMC von 5 Spendern in 3 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen charakterisiert.


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3.3.4.2 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die PHA-stimulierte Proliferation humaner, Monozyten-depletierter PBMC

Die Untersuchungen mit humanen, Monozyten-depletierten PBMC wurden durchgeführt, um zu analysieren, ob die durch rOv17 und trOv17 induzierte verminderte Proliferation, durch die Modulation von Monozytenfunktionen verursacht wird. Monozyten und Granulozyten sind CD14+-Zellen, eine Eigenschaft, die bei der Separierung dieser Zellpopulationen ausgenutzt wird. Da durch die PBMC-Aufreinigung mittels Dichtegradientenzentrifugation keine Granulozyten mehr in der PBMC-Fraktion enthalten sein sollten, wurden durch die Depletion von CD14+-Zellen v. a. Monozyten aus der PBMC-Fraktion entfernt. Die CD14+-depletierten PBMC-Fraktionen, die für die Proliferationsstudien verwendet wurden, enthielten nach der CD14+-Depletion noch 1-2% CD14+-Zellen.

Zur Überprüfung des Erfolges der CD14+-Depletion wurde die Eigenschaft von Monozyten ausgenutzt, bereits 6 h nach einer LPS-Stimulation, TNF-alpha zu produzieren. Die CD14+- depletierten PBMC-Fraktionen wurden mit 5 ng LPS stimuliert und die TNF-alpha Produktion nach 6 h Inkubation im Überstand gemessen. Die TNF-alpha Produktion der CD14+- depletierten PBMC der 4 getesteten Spender betrug 80 pg/ml, 200pg, 43 pg/ml und 48 pg/ml im Vergleich zu einer TNF-alpha Produktion der entsprechenden gesamten PBMC-Fraktion von 2583 pg/ml, 3267 pg/ml, 1750 pg/ml, 1630 pg/ml. Die Messung der TNF-alpha Produktion bestätigte, daß in den CD14+- depletierten Zellfraktionen die Monozytenfraktion wirkungsvoll reduziert wurde.

Die Proliferation der CD14+-depletierten Zellen wurde sowohl mit PHA (Abb. 21 A, C, E, G), als auch mit anti-CD3 Ak / anti-CD28 Ak (Daten nicht gezeigt) stimuliert. rOv17 und trOv17 haben in beiden Fällen keinen Einfluß auf die Proliferation. Die Proliferationsstudien mit CD14+-depletierten Zellen zeigen, daß in Abwesenheit von Monozyten, rOv17 keine Inhibition der polyklonal-stimulierten Proliferation induziert. Gleiches gilt für trOv17.

Vergleichend zur PHA-stimulierten Proliferation der CD14+-depletierten PBMC sind die Ergebnisse der PHA-stimulierten Proliferation der entsprechenden gesamten PBMC-Fraktion dargestellt (Abb. 21 B, D, F, H). Die PHA-stimulierte Proliferation der gesamten PBMC-Fraktion wird durch rOv17 und trOv17 um durchschnittlich 44% und 40% inhibiert.


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Abb. 21: Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die PHA-stimulierte Proliferation von PBMC mit und ohne Depletion von Monozyten. Humane PBMC von 4 Spendern mit und ohne Monozyten wurden mit PHA stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 oder rOv33 für 72 h inkubiert. A, C, E, G: PHA-Stimulation von Monozyten-depletierten PBMC. B, D, F, H: PHA-Stimulation der gesamten PBMC-Fraktion. Dargestellt sind die Mittelwerte der Proliferation [cpm] ± Standardabweichung, die aus den Dreifachbestimmungen berechnet wurden.


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3.3.5 Zytokinproduktion von humanen PBMC in Anwesenheit der rekombinanten O. volvulus Cystatine

3.3.5.1 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Zytokinproduktion unstimulierter humaner PBMC

Die Untersuchungen hatten zum Ziel, das immunmodulatorische Potential von rOv17 und trOv17 auf die Zytokinproduktion unstimulierter humaner PBMC zu charakterisieren. Da die Proliferationsstudien mit Monozyten-depletierten PBMC gezeigt haben, daß rOv17 seine immunmodulierenden Wirkung über die Modulation von Monozytenfunktionen vermittelt, wurde in diesem Versuch der Einfluß von rOv17 und trOv17 auf Zytokine untersucht, die von Monozyten gebildet werden und im Verlauf einer Immunantwort aktivierende oder deaktivierende Funktionen besitzen. Bestimmt wurde die TNF-alpha, IL-10 und IL-12p40 Produktion.

Für die Bestimmung von TNF-alpha wurde der 6 h Kulturüberstand verwendet. rOv17 und trOv17 bedingen eine statistisch signifikant erhöhte TNF-alpha Produktion (p=0,001) (Abb. 22A). Das verkürzte trOv17 induziert dabei eine stärkere TNF-alpha Produktion als rOv17. Das Kontrollprotein rOv33 verursacht ebenfalls eine verstärkte TNF-alpha Bildung (p=0,001), wobei diese jedoch im Vergleich zum rOv17 und trOv17 um das 6-7 fache geringer ist.

Für die Bestimmung von IL-10 wurde der 48 h Kulturüberstand verwendet. rOv17 und trOv17 stimulieren PBMC zu einer statistisch signifikant erhöhten IL-10 Produktion (p= p=0,001) (Abb. 22B), wobei das verkürzte trOv17 im Vergleich zum rOv17 wiederum einen stärkeren stimulierenden Effekt besitzt. Das Kontrollprotein rOv33 induziert eine geringfügig erhöhte IL-10 Produktion von unstimulierten humanen PBMC (p=0,008).

rOv17 und trOv17 induzieren bereits nach 24 h eine verstärkte IL-10 Produktion (Daten nicht gezeigt).

Für die Bestimmung der IL-12p40 Produktion wurde ebenfalls der 48 h Kulturüberstand verwendet. Im Vergleich zur Mediumkontrolle ist in Anwesenheit von rOv17, trOv17 und rOv33 die IL-12p40 Produktion unstimulierter PBMC statistisch signifikant erhöht (p=0,003) (Abb. 22C).


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Abb. 22: Stimulation der TNF-alpha, IL-10 und IL-12 Produktion von unstimulierten humanen PBMC durch rOv17 und trOv17. PBMC von 6-8 Spendern wurden mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 6 h (TNF-alpha) oder 48 h (IL-10, IL-12p40) inkubiert. Die Medianwerte der gemessenen Zytokinkonzentrationen sind als Querstriche dargestellt. A: TNF-alpha Produktion. B: IL-10 Produktion. C: IL-12p40 Produktion.


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3.3.5.2 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Zytokinproduktion von stimulierten humanen PBMC

Die Untersuchungen hatten zum Ziel, vergleichend zur Zytokinproduktion von unstimulierten PBMC, den Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Zytokinproduktion von polyklonal-stimulierten PBMC zu untersuchen. Bestimmt wurde der Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Bildung von IL-2, IL-4, IL-10, IL-12p40, IFN-gamma und TGF-beta. Die Messung von IL-2 und IL-4 war aufgrund technischer Mängel der verwendeten ELISA nicht möglich. Auch die Bewertung der gemessenen TGF-beta Konzentrationen war aufgrund von Mängeln des verwendeten ELISA nicht eindeutig möglich. Die Ergebnisse für die IL-10-, IL-12p40- und IFN-gamma Produktion sind in Abb. 23 dargestellt. In Anwesenheit von rOv17 und trOv17 ist die Produktion von IL-10 statistisch signifikant erhöht (p=0,002), wobei trOv17 wiederum eine stärkere modulierende Wirkung besitzt (Abb. 23A). Das Kontrollprotein rOv33 induziert ebenfalls eine statistisch signifikant erhöhte Bildung von IL-10 (p=0,005), die im Vergleich zum rOv17 und trOv17 weniger potent ist (Abb. 23A).

Die Bildung von IL-12p40 ist durch rOv17 und trOv17 statistisch signifikant vermindert (p=0,025) (Abb. 23B). Das Kontrollprotein rOv33 beeinflußt im Vergleich dazu die IL-12p40 Bildung stimulierter PBMC nicht.

Die Bildung von IFN-gamma ist durch rOv17 nicht statistisch signifikant verändert (Abb. 23C). Im Gegensatz dazu induziert das verkürzte trOv17 eine statistisch signifikant verminderte IFN-gamma Produktion (p=0,023) (Abb. 23 C). Das Kontrollprotein rOv33 beeinflußt die Bildung von IFN-gamma nicht.


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Abb. 23: Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Zytokinproduktion stimulierter humaner PBMC. PBMC von 10 Spendern wurden mit immobilisierten anti-CD3 Ak stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 48 h inkubiert. Die Medianwerte der gemessenen Zytokinkonzentrationen sind als Querstriche dargestellt. A: IL-10 Produktion. B: IL-12p40 Produktion. C: IFN-gamma Produktion.


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3.3.6 Einfluß der rekombinanten O. volvulus Cystatine auf die Expression von Oberflächenmolekülen humaner Monozyten

3.3.6.1 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die HLA-DR-Expression

Die Untersuchung der Expression von HLA-DR auf humanen Monozyten sollte zeigen, ob rOv17 und trOv17 die Funktion dieser Zellen, Antigen zu präsentieren, beeinflussen. Die Inkubation von humanen PBMC mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 führt zu einer verminderten HLA-DR-Expression durch rOv17 und gleichermaßen durch trOv17 (Abb. 24). rOv17 und trOv17 induzieren dabei bereits bei einer Konzentration von 10 nM eine Inhibition der Expression von HLA-DR um 70% bis 80%, wobei mit zunehmender Konzentration keine weitere Suppression der HLA-DR-Expression erzielt werden konnte Das Kontrollprotein rOv33 hat bei einer Konzentration von 10 nM, 50 nM und 100 nM keinen Einfluß auf die HLA-DR-Expression, bei einer Konzentration von 0,5 µM vermindert rOv33 die Expression von HLA-DR um 15% bis 40%.

Abb. 24: Inhibition der HLA-DR-Expression von humanen Monozyten durch rOv17 und trOv17. Humane PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 für 72 h inkubiert und die HLA-DR-Expression mittels FACS-Analyse bestimmt. Monozyten wurden durch PE-Cy5-markierte anti-CD14 Ak identifiziert und deren HLA-DR-Expression durch PE-markierte anti-HLA-DR Ak quantifiziert. Dargestellt ist die prozentuale HLA-DR-Expression der mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubierten Monozyten im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rekombinante Proteine. 100% HLA-DR-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 2000-3000. Getestet wurden 2 Spender in 2 unabhängig voneinander durchgeführten Tests (A und B).


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3.3.6.2 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Expression kostimulatorischer Moleküle

Ziel dieser Untersuchungen war es, zu analysieren, ob rOv17 und trOv17 die Expression kostimulatorischer Moleküle, die wichtige Funktionen bei der Vermittlung einer antigenspezifisch-stimulierten Proliferation besitzen, beeinflussen. Getestet wurden die Expression von CD40, CD80 und CD86. (Abb. 25 A-F).

Die Expression von CD40 und CD80 auf unstimulierten humanen Monozyten ist gering. Dennoch wurde ein möglicher Einfluß von rOv17, trOv17 und rOv33 auf die Expression dieser kostimulatorischen Moleküle untersucht. Die Ergebnisse für die CD40-Expression sind in Abb. 25A und D dargestellt. rOv17 und trOv17 vermindern die CD40-Expression, wobei im ersten Versuch eine Suppression von 40% (Abb. 25A) und im zweiten Versuch eine Suppression von 20% (Abb. 25D) induziert wurde. Das Kontrollprotein rOv33 induziert im Gegensatz zu rOv17 und trOv17 eine verstärkte CD40-Expression.

Die Expression von CD80 auf humanen Monozyten wird von rOv17 und trOv17 nur unwesentlich beeinflußt. rOv17 und trOv17 vermindern die CD80-Expression um 10-20% (Abb. 25B und E). Das Kontollprotein rOv33 wiederum bedingt eine verstärkte Expression von CD80.

Die Expression des kostimulatorischen Moleküls CD86 wird durch rOv17 und trOv17 vermindert (Abb. 25C und F). Dabei induzieren rOv17 und trOv17 bereits bei einer Konzentration von 10 nM eine Inhibition von 40%-50%, höhere Konzentrationen führen nur in einem Falle zu einer weiteren Suppression der CD86-Expression (Abb. 25C). Das Kontrollprotein rOv33 beeinflußt die CD86-Expression nicht.


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Abb. 25: Modulation der Expression von CD40, CD80 und CD86 durch rOv17 und trOv17. Humane PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 für 72 h inkubiert. Die Expression der kostimulatorischen Moleküle wurde mittels FACS-Analyse bestimmt. Monozyten wurden dabei durch PE-Cy5-markierte anti-CD14 Ak identifiziert und die Expression der kostimulatorischen Moleküle durch FITC-markierte anti-CD40 Ak oder anti-CD80 Ak und durch PE-markierte CD86 Ak quantifiziert. Dargestellt ist die prozentuale Expression von CD40, CD80 und CD86 der mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubierten Monozyten im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rOv17, trOv17 und rOv33. 100% CD40-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 100-200, 100% CD80-Expression einer von 30-40 und 100% CD86-Expression einer von 200-350. Dargestellt sind die Ergebnisse von 2 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen mit 2 Spendern. A-C: Spender 1. D-F: Spender 2. A und D: CD40-Expression. B und E: CD80-Expression. C und F: CD86-Expression.


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3.3.7 Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung der durch rOv17 und trOv17 induzierten verstärkten IL-10 Produktion durch Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak

Zu den immunmodulierenden Eigenschaften von rOv17 und trOv17 gehört u. a. die Fähigkeit, die IL-10 Produktion von humanen Monozyten zu induzieren. IL-10 ist ein potentes immunmodulierendes Zytokin, welches insbesondere immunsupprimierende Eigenschaften besitzt. So vermindert IL-10 die Expression von MHC II Molekülen und von kostimulatorischen Molekülen auf der Oberfläche von APZ, inhibiert die IL-12 und IFN-gamma Produktion und supprimiert die T-Zell-Proliferation. IL-10 vermittelt somit immunmodulierende Eigenschaften, die den für rOv17 und trOv17 allgemein beschriebenen immunmodulierenden Eigenschaften entsprechen. Die Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak hatten daher zum Ziel, zu analysieren, ob die durch rOv17 und trOv17 induzierte erhöhte IL-10 Produktion Ursache der für rOv17 und trOv17 beschriebenen verminderten Expression von HLA-DR und der kostimulatorischen Moleküle CD40 und CD86 auf humanen Monozyten ist und ob IL-10 die verminderte IL-12 und IFN-gamma Produktion vermittelt. Darüber hinaus sollte durch die Neutralisation von IL-10 im Proliferationstest untersucht werden, welche Bedeutung die verstärkte IL-10 Produktion bei der durch rOv17 und trOv17 induzierten verminderte Proliferation besitzt.

3.3.7.1 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die HLA-DR-Expression humaner Monozyten nach Neutralisation von IL-10

Der Einsatz neutralisierender anti-IL-10 Ak verhindert die durch rOv17 und trOv17 bedingte Suppression der HLA-DR-Expression auf der Oberfläche humaner Monozyten (Abb. 26A, B, D, E). Auf die Wirkung von rOv33 hat der Die Einsatz von anti-IL-10 Ak keinen Einfluß.


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Abb. 26: Neutralisation der supprimierenden Wirkung von rOv17 und trOv17 auf die HLA-DR-Expression durch die Neutralisation von IL-10. PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 und mit 5 µg/ml anti-IL-10 Ak oder einem Isotyp-Kontroll Ak für 72 h inkubiert. Die HLA-DR-Expression wurde mittels FACS-Analyse bestimmt. Dargestellt ist die prozentuale Expression von HLA-DR der Monozyten, die mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubiert wurden, im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rekombinante Proteine. 100% HLA-DR-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 2000-4000. Dargestellt sind die Ergebnisse von 2 unabhängigen Versuchen mit 2 Spendern. A-C: Spender 1. D-F: Spender 2.


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3.3.7.2 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Expression kostimulatorischer Moleküle humaner Monozyten nach Neutralisation von IL-10

Die Neutralisation der durch rOv17 und trOv17 induzierten IL-10 Produktion verhindert die durch rOv17 und trOv17 induzierte Suppression der Expression von CD40 und CD86 und führt darüber hinaus zu einer verstärkten Expression von CD40, CD86 und auch CD86, wobei insbesondere die Expression von CD80 und CD86 um das 2-4 fache erhöht ist (Abb. 27-29). Im Vergleich zum rOv17 und trOv17 hat die Neutralisation von IL-10 auf die Wirkung von rOv33 bezüglich der Expression von CD40 und CD80 keinen Effekt (Abb. 27, 28). In Bezug auf die CD86-Expession induziert die Neutralisation von IL-10 im rOv33-Kontrollansatz eine verstärkte CD86-Expression (Abb. 29).


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Abb. 27: Neutralisation der supprimierenden Wirkung von rOv17 und trOv17 auf die CD40-Expression durch die Neutralisation von IL-10. PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17, rOv33 und mit 5 µg/ml anti-IL-10 Ak oder 5 µg/ml Isotyp-Kontoll Ak für 72 h inkubiert. Die Expression von CD40 wurde mittels FACS-Analyse quantifiziert. Dargestellt ist die prozentuale Expression von CD40 der mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubierten Monozyten im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rOv17, trOv17 und rOv33. 100% CD40-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 120-200. Dargestellt sind die Ergebnisse von 2 unabhängigen Versuchen mit 2 Spendern. A-C: Spender 1. D-F: Spender 2.


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Abb. 28: Expression von CD80 in Anwesenheit von rOv17 und neutralisierenden anti-IL-10 Ak. PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 und mit 5 µg/ml anti-IL-10 Ak oder mit 5 µg/ml eines Isotyp-Kontroll Ak für 72 h inkubiert. Die Monozyten wurden durch PE-Cy5-markierte anti-CD14 Ak identifiziert und die Expression von CD80 durch FITC-markierte anti-CD80 Ak im Durchflußzytometer quantifiziert. Dargestellt ist die prozentuale CD80-Expression der Monozyten, die mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubiert wurden, im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rOv17, trOv17 und rOv33. 100% CD80-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 30-60. Dargestellt sind die Ergebnisse von 2 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen mit 2 Spendern. A-C: Spender 1. D-F: Spender 2.


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Abb. 29: Neutralisation der supprimierenden Wirkung von rOv17 und trOv17 auf die CD86-Expression durch die Neutralisation von IL-10. Die PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 und mit 5 µg/ml anti-IL-10 Ak oder mit 5 µg/ml des Isotyp-Kontroll Ak für 72 h inkubiert. Die Expression von CD86 wurde nach der Markierung mit PE-konjugierten anti-CD86 Ak im Durchflußzytometer quantifiziert. Dargestellt ist die prozentuale CD86-Expression der Monozyten, die mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubiert wurden, im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rekombinante Proteine. 100% CD86-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 250-350. Dargestellt sind die Ergebnisse von 2 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen mit 2 Spendern. A-C: Spender 1. D-F: Spender 2.


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3.3.7.3 Zytokinproduktion von stimulierten humanen PBMC in Anwesenheit von rOv17, trOv17 und neutralisierenden anti-IL-10 Ak

rOv17 und trOv17 supprimieren die IL-12 und IFN-gamma Produktion von stimulierten humanen PBMC. Die Neutralisation der durch rOv17 und trOv17 induzierten verstärkten IL-10 Produktion sollte zeigen, inwieweit IL-10 die verminderte IL-12 und IFN-gamma Produktion bedingt. Die Ergebnisse sind in Abb. 30 dargestellt. Eine Neutralisation von IL-10 kann die durch rOv17 und trOv17 induzierte IL-12 Produktion nicht regenerieren (Abb. 30A). Im Vergleich dazu, wird die verminderte IFN-gamma Produktion, die nur durch trOv17 statistisch signifikant inhibiert wurde, durch die Neutralisation von IL-10 vollständig regeneriert (Abb. 30B). Darüber hinaus bedingt die Neutralisation von IL-10 in allen Ansätzen eine stark erhöhte IFN-gamma Produktion.

Abb. 30: Zytokinproduktion von stimulierten humanen PBMC in Anwesenheit von rOv17, trOv17 und neutralisierenden Ak. Humane PBMC von 4 Spendern wurden mit immobilisierten anti-CD3 Ak stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 48 h inkubiert. Dargestellt sind die Mittelwerte der Zytokinproduktion ± SEM. A: IL-12 Produktion. B: IFN-? Produktion.


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3.3.7.4 Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die polyklonal-stimulierte Proliferation in Anwesenheit neutralisierender anti-IL-10 Ak

Mit der Neutralisation von IL-10 durch anti-IL-10 Ak im Proliferationstest, sollte untersucht werden, ob die erhöhte IL-10 Produktion die verminderte polyklonal-stimulierte Proliferation von rOv17 und trOv17 bedingt. Die Ergebnisse sind in Abb. 31 dargestellt. Die Neutralisation von IL-10 hebt die rOv17 und trOv17-induzierte verminderte polyklonal-stimulierte Proliferation nicht auf.

Abb. 31: Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Proliferation nach Neutralisation von IL-10. Anti-CD3 Ak-stimulierte PBMC wurden mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 und mit 5 µg/ml anti-IL-10 Ak inkubiert. Als Kontrolle wurde ein Isotyp-Kontroll Ak eingesetzt. Dargestellt sind die Proliferationswerte [%] von 4 Spendern im Vergleich zur entsprechenden anti-CD3 Ak-Kontrolle.


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Fri Jun 8 15:42:14 2001