Schönemeyer, Annett: Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung eines Cysteinproteasen-Inhibitors der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus

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Kapitel 4. Diskussion

Filarien sind in der Lage ihr immunologisches Umfeld zu modulieren und können dadurch für lange Zeit im Wirt überleben. In dieser Arbeit wurde das immunmodulierende Potential eines Cysteinproteasen-Inhibitors der humanpathogenen Filarie O. volvulus untersucht. Der Cysteinproteasen-Inhibitor wurde erstmals von Lustigman et al. (1991, 1992) beschrieben. Für die Funktion des Inhibitors postulieren die Autoren die Regulation der Aktivität von Cysteinproteasen, die an der Häutung von der L3 zur L4 beteiligt sind (Lustigman et al. 1996).

Die vorliegende Arbeit zeigt, daß Onchocystatin nicht nur physiologische Funktionen für den Parasiten besitzt, sondern darüber hinaus immunmodulierend wirksam ist.

4.1 Immunmodulierende Eigenschaften der rekombinanten O. volvulus Cystatine

4.1.1 Inhibition der antigenspezifischen Proliferation durch rOv17 und trOv17

Filarieninfektionen sind chronisch verlaufende Erkrankungen, die durch eine lange Persistenz der Erreger im Wirt charakterisiert sind und bei einem Großteil der Infizierten zu einer klinisch manifesten Erkrankung führen. Der Immunstatus dieser Personen ist dabei durch eine zelluläre Hyporeaktivität und eine Typ 2 - und Typ 3 Immunantwort gekennzeichnet.

Um zu analysieren, ob Onchocystatin an der Herausbildung eines hyporeaktiven Immunstatus des Wirtes beteiligt ist, wurde das immunmodulierende Potential von Onchocystatin mit Hilfe der rekombinant hergestellten Onchocystatine, rOv17 und trOv17, charakterisiert. Eine mögliche Beteiligung von rOv17 und trOv17 an der Herausbildung einer zellulären Hyporeaktivität wurde in antigenspezifischen Proliferationsstudien untersucht. Dabei wurde der Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die antigenspezifische Proliferation von humanen PBMC, als auch auf die filarienantigenspezifische Proliferation von Milzzellen immunisierter BALB/c Mäuse untersucht. In beiden Fällen wird die antigenspezifische Proliferation durch rOv17 und trOv17 inhibiert.


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Eine erfolgreiche antigenspezifische Proliferation ist von verschiedenen Faktoren abhängig. Sie setzt die Aufnahme, die Prozessierung und Präsentation von Antigen durch APZ voraus, und sie bedarf der Wirkung modulierender Signale, die sowohl durch membranständige Moleküle (wie z. B. CD86 (B7-1), CD80 (B7-2), CD40, B7H1 und B7h), als auch durch lösliche Mediatoren (Zytokine, Chemokine) vermittelt werden. Eine Beeinflussung der antigenspezifischen Proliferation ist daher auf vielfältige Art und Weise möglich. Aufgrund der biologischen Eigenschaft von rOv17 und auch von trOv17, die Aktivität von Cysteinproteasen der Papain-Superfamilie zu inhibieren, war zu vermuten, daß die Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease, und somit eine Interaktion mit der Prozessierung und Präsentation von Antigen, Ursache für die rOv17 und trOv17 induzierte verminderte antigenspezifische Proliferation ist. Daß Cysteinproteasen-Inhibitoren ein derartiges immunmodulierendes Potential besitzen, haben Studien von Katunuma et al. (1994) gezeigt. Unter Verwendung des Cathepsin B-spezifischen Inhibitors CA074 haben die Autoren gezeigt, daß eine verminderte Prozessierung von Antigen durch die Inhibition der Aktivität von Cathepsin B eine verminderte antigenspezifische Proliferation zur Folge hat.

4.1.2 Bindung und Aufnahme von rOv17 und trOv17 durch Monozyten

Eine Interaktion von rOv17 mit Wirtscysteinproteasen von APZ, die an der Prozessierung und Präsentation von Antigen beteiligt sind, setzt voraus, daß rOv17 und trOv17 von APZ aufgenommen werden und mit Cysteinproteasen in einen direkten Kontakt kommen. Die Bindung und Aufnahme von rOv17 und trOv17 durch Monozyten wurde durch die Untersuchungen mit Fluos-markierten rOv17 und trOv17 gezeigt.

Die Aufnahme von Antigen durch APZ aus dem extrazellulären Kompartiment erfolgt über verschiedene Mechanismen, denen gemeinsam ist, daß sie die aufgenommenen Antigene in das endosomal-lysosomale Kompartiment entlassen (Lanzavecchia 1990, Guagliardi et al. 1990, Watts et al. 1997). Dies bedeutet, daß auch rOv17 und trOv17 mit großer Wahrscheinlichkeit in das endosomal-lysosomale Kompartiment gelangen und hier mit humanen Cysteinproteasen interagieren können.


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4.1.3 Inhibition der Aktivität von humanem Cathepsin L und S durch rOv17 und trOv17

Die Fähigkeit von rOv17 und trOv17 die Aktivität von humanen Cysteinproteasen, wie Cathepsin B, L und S, zu beeinflussen, wurde in enzymkinetischen Untersuchungen zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten Ki gezeigt. Dabei ist rOv17 ein potenter Inhibitor von Cathepsin L und S (Ki=0,03 nM). Das verkürzte trOv17 hat im Vergleich mit einem Ki von 11,5 nM für Cathepsin L und einem Ki von 29,6 nM für Cathepsin S eine geringere Affinität. Das Fehlen des N-Terminus' und damit des konservierten, N-terminalen aktiven Bereiches bedingt somit eine um das 300 bzw. 900 fache verminderte Affinität von trOv17 zu Cathepsin L und S, was bedeutet, daß die N-terminale aktive Domäne für Onchocystatin eine wichtige funktionelle Komponente des Moleküls ist. Dies ist ein Strukturmerkmal, welches auch für andere Vertreter der Cystatine beschrieben worden ist (Machleidt et al. 1989, Abrahamson et al. 1991, Lindahl et al. 1992, Hall et al. 1993, Bjork et al. 1995). Trotz der verminderten Affinität von trOv17 zu den Cathepsinen L und S, ist auch das verkürzte trOv17 noch in der Lage, die Aktivität dieser beiden Cathepsine zu inhibieren, was auf die inhibitorische Wirkung der beiden C-terminalen aktiven Bereiche des Cystatins zurückzuführen ist (Auerswald et al.1995, Hall et al. 1995, Bjork et al. 1996). Die Aktivität von Cathepsin B wird von rOv17 und trOv17 kaum beeinflußt. Dies liegt vermutlich an der strukturellen Besonderheit von Cathepsin B, welches am N-Terminus ein „occluding loop“ besitzt, der den Zugang zum aktiven Zentrum der Protease für den Inhibitor blockiert (Illy et al. 1997).

Die Inhibition der Cysteinproteasen durch rOv17 und trOv17 ist für Cathepsin L bei einem pH von 5,5 und für Cathepsin S und B bei einem pH von 6,0 gezeigt worden. Dies bedeutet, daß rOv17 und trOv17 potentiell in der Lage sind, auch im sauren Milieu des endosomal-lysosomalen Kompartiment die Aktivität humaner Cathepsine zu beeinflussen.

Cysteinproteasen antigenpräsentierender Zellen katalysieren im Verlauf einer Immunantwort zwei wichtige proteolytische Prozesse. So sind Cathepsine an der Proteolyse von Antigen, zur Generierung antigener Peptide, die nachfolgend an MHC-II-Moleküle binden können, beteiligt. Zum zweiten katalysieren Cathepsine die Degradation der Invarianten Kette (li), welche die Voraussetzung für die Bindung der Peptide an MHC-II-Moleküle und den


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anschließenden Transport der Peptid-MHC-II-Komplexe an die Zelloberfläche darstellt (Wolf und Ploegh 1995, Roche und Cresswell 1990). An beiden Prozessen sind Cathepsin L und S beteiligt, deren Aktivität von rOv17 und auch trOv17 inhibiert wird. Cathepsin L ist an der Prozessierung von Antigen und in Thymusepithelzellen essentiell an der Degradation von li beteiligt (Nakagawa et al. 1998, 1999a). Cathepsin S ist an der Prozessierung von Antigen beteiligt und in B-Zellen und Dendritischen Zellen (DZ) für die Spaltung von li verantwortlich (Riese et al. 1996, Nakagawa et al. 1999b). Eine Inhibition von Cathepsin S führt daher zu einer Akkumulation von li-assoziierten MHC-II-Molekülen in der Zelle und zu einer verminderten antigenspezifischen Proliferation. Die verminderte Proliferation ist dabei auf die unvollständige Spaltung von li und die damit verbundene verminderte Generierung von Peptid-MHC-II-Komplexen zurückzuführen (Riese et al. 1998). Auch die Reifung von DZ zu effizienten APZ, die u. a. durch eine verstärkte Oberflächenexpression von Peptid-MHC-II-Komplexen gekennzeichnet ist, wird über die Aktivität von Cathepsin S reguliert (Pierre und Mellman 1998). Während der Reifung von DZ nimmt die Aktivität von Cathepsin S zu und führt durch die verstärkte Spaltung von li zu einer verstärkten Expression von Peptid-MHC-II-Komplexen an der Oberfläche.

Ein weiteres Cathepsin, das spezifische Funktionen im Verlauf einer Immunantwort katalysiert, welches uns aber für Inhibitionsstudien mit rOv17 und trOv17 nicht zur Verfügung stand, ist Cathepsin F. Erst kürzlich wurde gezeigt, daß Cathepsin F essentiell an der Degradation von li in Makrophagen beteiligt ist (Shi et al. 2000). Cathepsin F ist somit ein weiteres Cathepsin, welches die Effizienz der Antigenpräsentation mitbestimmt, und deren Inhibition eine verminderte Antigenpräsentation bedingen würde.

Die Fähigkeit von rOv17 und trOv17, die Aktivität humaner Cathepsine zu inhibieren, ließ vermuten, daß rOv17 und trOv17 infolge einer verminderten Generierung von Peptid-MHC-II-Komplexen eine verminderte antigenspezifische Proliferation induzieren. rOv17 sollte dabei aufgrund des stärkeren inhibitorischen Potentials gegenüber Cathepsin L und S immunmodulatorisch potenter sein als trOv17. rOv17 und trOv17 inhibieren die antigenspezifische Proliferation von humanen PBMC jedoch gleichermaßen stark. Ursache hierfür könnte sein, daß das inhibitorische Potential von trOv17 ausreichend ist, die Aktivität der Cathepsine wirksam zu inhibieren. Denkbar ist auch, daß es neben den Cathepsinen andere Cysteinproteasen gibt, die essentielle Funktionen im Verlauf einer antigenspezifischen


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Proliferation übernehmen und gleichermaßen stark von rOv17 und trOv17 inhibiert werden. Die Inhibition der Aktivität von papainähnlichen Cysteinproteasen durch Cystatine wird durch drei konservierte Bereiche in der Sequenz der Cystatine vermittelt. Die wichtigste inhibitorische Komponente ist dabei die N-terminale aktive Domäne. Da dem verkürzten trOv17 diese N-terminale inhibitorische Domäne fehlt, ist eine gleichwertige Inhibition der Aktivität von Cathepsinen durch trOv17 im Vergleich zum rOv17, wenig wahrscheinlich.

Cystatine regulieren aber nicht nur die Aktivität von papainähnlichen Cysteinproteasen, sondern Vertreter der Typ 2-Cystatine können auch die Aktivität von Cysteinproteasen der Legumain-Superfamilie beeinflussen (Alvarez-Fernandez et al. 1999). Zu den Cystatinen, die die Aktivität von Legumain inhibieren, gehören Cystatin C, E/M und F. Diese Cystatine besitzen für die Inhibition der Legumaine neben der inhibitorischen Domäne für die Interaktion mit den Cathepsinen noch eine zweite inhibitorische Domäne auf dem Molekül, welche die inhibitorisch wichtige AS -Arg- an Position 39 (Die Numerierung entspricht der für humanes Cystatin C.) umfaßt. Interessanterweise weist Onchocystatin im Bereich dieser zweiten inhibitorischen Domäne AS-Homologien mit den Cystatinen C, E/M und F auf und besitzt an entsprechender Position die AS -Arg-. Onchocystatin hat damit die strukturelle Voraussetzung für eine Inhibition der Aktivität von humanem Legumain, einer Cysteinprotease, für die bisher gezeigt werden konnte, daß sie an der Prozessierung von Antigen beteiligt ist und für die eine weitere funktionelle Charakterisierung im Zusammenhang mit der Antigenpräsentation noch aussteht (Manoury et al. 1999).

Da rOv17 und auch trOv17 die inhibitorische Domäne für die Interaktion mit Legumainen besitzen, und damit die Voraussetzung erfüllen, die Aktivität von Legumainen zu beeinflussen, ist es denkbar, daß rOv17 und trOv17 die Aktivität dieser Cysteinproteasen mit ähnlicher Affinität inhibieren, da der N-Terminus der Cystatine, im Gegensatz zur Interaktion mit den Cathepsinen, bei der Inhibition der Legumaine keine Rolle spielt. Die Bedeutung einer möglichen Interaktion von rOv17 und trOv17 mit Legumain im Zusammenhang mit der verminderten antigenspezifischen Proliferation kann jedoch aufgrund fehlender Kenntnisse über die Funktion von Legumain und fehlender Inhibitionsstudien mit rOv17 und trOv17 noch nicht beurteilt werden.


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Die filarienantigenspezifische Proliferation von Milzzellen immunisierter BALB/c Mäuse wird ebenfalls durch rOv17 und trOv17 inhibiert. Im Unterschied zur antigenspezifischen Proliferation humaner PBMC ist die Inhibition der filarienantigenspezifischen Proliferation durch rOv17 effizienter und das verkürzte trOv17 induziert im Vergleich zum rOv17 eine geringere Inhibition der Proliferation. Im Falle der Inhibition der Aktivität von Cysteinproteasen durch rOv17 und trOv17, würde dies wiederum eine verminderte Generierung von Peptid-MHC-II-Komplexen und eine verminderte antigenspezifische Proliferation bedingen. Das stärkere inhibitorische Potential von rOv17 gegenüber Cathepsinen könnte dabei Ursache der potenteren Inhibition der antigenspezifischen Proliferation der Mausmilzzellen durch rOv17 im Vergleich zum trOv17 sein.

Der Vergleich der immunmodulierenden Wirkung von rOv17 auf die antigenspezifische Proliferation verdeutlicht, daß die PPD-spezifische Proliferation humaner PBMC mit 45% weniger potent inhibiert wird als die filarienantigenspezifische Proliferation von Mausmilzzellen mit 90%. Die stärkere Inhibition der filarienantigenspezifischen Proliferation von Mausmilzzellen durch rOv17 hat vermutlich verschiedene Ursachen. Wenn diese immunmodulierende Eigenschaft auf die Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease zurückzuführen ist, kann dies bedeuten, daß rOv17 murine Cathepsine mit stärkerer Potenz inhibiert als humane Cathepsine. Dies wiederum würde zur Folge haben, daß aufgrund einer unterschiedlichen immunmodulierenden Potenz von rOv17 und trOv17 im Mausmodell im Vergleich zum humanen System ein direkter Vergleich der Ergebnisse beider Systeme nicht möglich ist.

Zum anderen könnte die unterschiedliche Effizienz von rOv17 bei der Inhibition der antigenspezifischen Proliferation von humanen PBMC und Mausmilzzellen auf die Beteiligung unterschiedlicher Populationen von APZ in beiden Systemen zurückzuführen sein. So verfügen Mausmilzzellen über Makrophagen, dendritische Retikulumzellen und B-Zellen als APZ. PBMC besitzen hingegen Monozyten und B-Zellen. APZ unterscheiden sich in ihrer Ausstattung mit Cathepsinen. Jede APZ-Population verfügt über ein spezifisches Repertoire an Cathepsinen, die für jede APZ entsprechend spezifische Funktionen katalysieren. So ist beispielsweise in B-Zellen und DZ Cathepsin S für die Degradation von li essentiell, in Makrophagen übernimmt diese Funktion Cathepsin F und in Thymusepithelzellen Cathepsin L (Riese et al. 1996, Nakagawa et al. 1998, Shi et al. 2000).


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Daher ist denkbar, daß aufgrund der unterschiedlichen Cathepsinausstattung von APZ und einer unterschiedlichen inhibitorischen Potenz von rOv17 gegenüber Cathepsinen, die Wirkung von rOv17 auf die verschiedenen APZ-Populationen unterschiedlich ist.

APZ unterscheiden sich auch in ihren Mechanismen und in der Effizienz, Antigen aufzunehmen, was zur Folge haben kann, daß die wirksame Konzentrationen von rOv17 in den APZ unterschiedlich ist und deshalb ein unterschiedliches inhibitorisches Verhalten von rOv17 bezüglich der antigenspezifischen Proliferation zu beobachten ist.

Die Unterschiede im inhibitorischen Potential können desweiteren unabhängig von der Inhibition der Aktivität einer Cysteinprotease durch die Aktivierung unterschiedlich differenzierter Gedächtniszellen durch PPD bzw. durch O. volulus-Antigen hervorgerufen werden. So könnte beispielsweise die Immunisierung mit O. volvulus-Antigen eine verstärkte Bildung von Th2 oder Th3-differenzierten Gedächtniszellen hervorrufen, die bei der Restimulation in vitro eine verstärkte Bildung von supprimierend wirkenden Zytokinen, wie IL-10 und TGF-beta induzieren, und die den supprimierenden Effekt von rOv17 zusätzlich verstärken.

4.1.4 Einfluß von EwC und E64 auf die antigenspezifische Proliferation

Die potente Inhibition der Aktivität von humanen Cathepsinen durch rOv17 ließ die Interaktion mit Cathepsinen als Ursache der durch rOv17 induzierten verminderten antigenspezifischen Proliferation vermuten. Um zu untersuchen, ob auch andere Cysteinproteasen-Inhibitoren ein solches immunmodulierendes Potential besitzen, wurden EwC und E64 getestet. EwC ist ein Vertreter der Typ 2-Cystatine. Die Sequenzen von EwC und rOv17 sind zu 31% identisch. E64 ist ein irreversibler Cysteinproteasen-Inhibitor, welcher erstmals aus Kulturextrakten von Aspergillus japonicum isoliert wurde. Die Ergebnisse des Proliferationstests mit PPD-stimulierten humanen PBMC zeigen, daß EwC und E64 keinen Einfuß auf die T-Zell-Proliferation haben. EwC und E64 vermögen weder bei einer Konzentration von 0,5 µM, noch bei einer Konzentration von 2,5 µM (Daten nicht gezeigt) die antigenspezifische Proliferation zu inhibieren.


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Daß Cysteinproteasen-Inhibitoren wie E64 dennoch die Eigenschaft besitzen, die antigenspezifische Proliferation zu inhibieren, haben Untersuchungen von Katunuma et al. (1994) gezeigt. E64 wurde bei diesen Untersuchungen allerdings in Konzentrationen von 11 µM eingesetzt. Auch in anderen Studien, bei denen die Inhibition von Cysteinproteasen durch Leupeptin charakterisiert wurde, mußten höhere Konzentrationen des Inhibitors eingesetzt werden (420 µM), um einen Effekt zu erzielen (Vidard et al. 1991, Puri et al. 1988).

Im Vergleich zu diesen Ergebnissen besteht die Besonderheit von rOv17 somit darin, die antigenspezifische Proliferation bereits in niedrigen Konzentrationen effektiv zu inhibieren. Wenn die durch rOv17 und trOv17 bedingte verminderte antigenspezifische Proliferation durch eine Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease verursacht wird, würde dies bedeuten, daß es Wirtscysteinproteasen geben muß, die essentielle Reaktionen im Verlauf einer antigenspezifischen Proliferation katalysieren und deren Aktivität durch rOv17 und trOv17 mit hoher Affinität inhibiert werden, nicht aber bzw. nur mit geringer Affinität durch EwC und E64.

Eine Cysteinprotease, die vermutlich durch rOv17 mit hoher Affinität inhibiert wird, könnte humanes Cathepsin X sein, eine Cysteinprotease, die im menschlichen Organismus ubiquitär verbreitet ist (Nagler und Menard 1998). Humanes Cathepsin X zeigt eine 75%ige Homologie zu einer O. volvulus Cysteinprotease, die als die Häutungsprotease beschrieben wurde, deren Aktivität vermutlich von Onchocystatin reguliert wird (Lustigman et al. 1996). Aufgrund der hohen Sequenzhomologie von Cathepsin X und der Parasitenprotease wäre eine potente Inhibition von Cathepsin X durch rOv17 denkbar. Da aber das inhibitorische Potential von rOv17 gegenüber Cathepsin X noch nicht untersucht wurde, und auch die Funktion dieser Protease noch nicht bekannt ist, bleibt diese Interaktion von rOv17 und Cathepsin X als eine Ursache der Inhibition der antigenspezifischen Proliferation durch rOv17 hypothetisch.

Cystatine und E64 sind Inhibitoren von Cysteinproteasen der Papain-Superfamilie, zu denen auch die humanen Cathepsine gehören. Einige Vertreter der Typ 2-Cystatine besitzen darüber hinaus die Eigenschaft, die Aktivität von Cysteinproteasen der Legumain-Superfamilie zu inhibieren (Alvarez-Fernandez et al. 1999). E64 ist im Gegensatz dazu nicht in der Lage, die Aktivität von Legumainen zu beeinflussen. Die Eigenschaft von Typ 2-Cystatinen, die Aktivität von Legumainen zu inhibieren, liegt in einem zweiten inhibitorischen Bereich um die AS -39Arg- (Die Numerierung entspricht der des humanen Cystatin C) begründet. rOv17


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und trOv17, aber auch EwC besitzen diese inhibitorische Domäne, und wären somit potentiell in der Lage die Aktivität von Legumainen zu beeinflussen. Ob eine Interaktion der Inhibitoren mit Legumain eine Bedeutung bei der Beeinflussung der antigenspezifischen Proliferation besitzt, und ob ein unterschiedliches inhibitorisches Potential von rOv17, trOv17 und EwC gegenüber Legumain das unterschiedliche Verhalten bei der Inhibition der antigenspezifischen Proliferation bedingt, kann nicht beurteilt werden. Zum einen fehlen Untersuchungen, die die inhibitorische Potenz von rOv17, trOv17 und EwC gegenüber Legumain charakterisieren, und zum anderen ist eine weitere funktionelle Charakterisierung von Legumain im Zusammenhang mit der antigenspezifischen Proliferation nötig.

Das Unvermögen von EwC und E64 die antigenspezifische Proliferation in der verwendeten Konzentration zu inhibieren, kann aber auch bedeuten, daß die durch rOv17 und trOv17 induzierte verminderte antigenspezifische Proliferation nicht auf eine Modulation einer Wirtscysteinprotease zurückzuführen ist und rOv17 und trOv17 über andere Mechanismen Einfluß auf die antigenspezifische Proliferation nehmen.

Der fehlende inhibitorische Effekt von EwC und E64 kann möglicherweise aber auch darauf zurückgeführt werden, daß EwC und E64 nicht oder nicht in ausreichender Konzentration in das endosomal-lysosomale Kompartiment gelangen konnten und / oder hier sehr schnell inaktiviert wurden.

4.1.5 Inhibition der HLA-DR-Expression von humanen Monozyten durch rOv17 und trOv17

Die Untersuchungen zur Expression von HLA-DR, einem Haplotyp der MHC-II-Moleküle, auf humanen Monozyten zeigen, daß rOv17 und auch trOv17 die Expression dieses Oberflächenmoleküls vermindern. rOv17 und trOv17 reduzieren dadurch die Kapazität dieser Zellen, Antigen zu präsentieren.

MHC-II-Moleküle sind auf APZ konstitutiv exprimiert. Die Stärke der Expression wird durch verschiedene Mediatoren reguliert. Zytokine wie IFN-gamma, GM-CSF, TNF-alpha und IL-4 stimulieren und Zytokine wie IL-10 und TGF-beta vermindern die Expression von MHC-II auf Monozyten (Sztein et al. 1984, te Velde et al. 1988, de Waal Malefyt et al. 1991a, Williams et


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al. 1999). Posttranslational kann die Expression von MHC-II durch die Aktivität von li-degradierenden Cysteinproteasen beeinflußt werden. Pierre und Mellman (1998) haben gezeigt, daß die mit der Reifung von DZ verbundene verstärkte Expression von MHC-II auf eine verstärkte Aktivität der li-spaltenden Cysteinprotease Cathepsin S zurückzuführen ist. Die Aktivität von Cathepsin S wird dabei durch Cystatin C, einem endogenen Cysteinproteasen-Inhibitor reguliert. Ein Cysteinproteasen-Inhibitor ist damit entscheidend bei der Regulation der Expression von Peptid-MHC-II-Komplexen auf der Oberfläche von DZ beteiligt. Neben li-degradierenden Cathepsinen muß es weitere Mechanismen geben, die die posttranslationale Expression von MHC-II regulieren. Dies geht aus Studien mit Cathepsin S - und Cathepsin L defizienten Mäuse hervor (Villadangos et al. 1999). Trotz Akkumulation von li-Fragment (lip 10)-MHC-II-Komplexen in DZ oder in Thymusepithelzellen der Cathepsin S - bzw. Cathepsin L defizienten Mäusen ist die Gesamtzahl der exprimierten MHC-II-Moleküle auf der Oberfläche im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle unverändert. Dabei konnte gezeigt werden, daß auf der Oberfläche lip10-MHC-Komplexe, aber auch Peptid-beladene MHC-II-Komplexe exprimiert wurden.

Eine Beeinflussung der Expression von HLA-DR durch rOv17 und trOv17 ist auf vielfältige Art und Weise möglich. Eine Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease durch rOv17 und trOv17 würde eine verminderte Generierung und Expression von Peptid-MHC-II-Komplexen auf der Oberfläche der Monozyten bedingen. Die Gesamtzahl der exprimierten MHC-II-Moleküle wird dabei vermutlich nicht beeinflußt, was im Ergebnis der Untersuchungen mit Cathepsin S - und Cathepsin L defizienten Mäusen zu schlußfolgern ist. Es ist daher wahrscheinlich, daß die verminderte HLA-DR-Expression durch rOv17 und trOv17 nicht durch die Inhibition der Aktivität humaner Cathepsine bedingt ist, sondern, daß rOv17 und trOv17 die HLA-DR-Expression über einen anderen Mechanismus beeinflussen.


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4.1.6 Polyklonal-stimulierte Proliferation von humanen PBMC und von Monozyten-depletierten PBMC

rOv17 und auch trOv17 beeinflussen die antigenspezifische Proliferation und inhibieren die HLA-DR-Expression auf humanen Monozyten. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen der verminderten antigenspezifischen Proliferation und der verminderten HLA-DR-Expression beurteilen zu können, wurde der Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die durch PHA- und immobilisierte anti-CD3 Ak-stimulierte Proliferation untersucht, die unabhängig von der MHC-II-Expression erfolgt (mündliche Mitteilung von Prof. Volk, Charité, Berlin).

Die durch PHA- und immobilisierte anti-CD3 Ak-stimulierte Proliferation von humanen PBMC wird durch rOv17 um 40% und durch trOv17 um 32% inhibiert. Im Vergleich zur antigenspezifischen Proliferation inhibieren rOv17 und trOv17 die polyklonale Proliferation ähnlich potent. Die polyklonale Stimulation von T-Zellen durch das Mitogen PHA und durch immobilisierte anti-CD3 Ak erfolgt im Unterschied zur antigenspezifischen Proliferation unabhängig von der MHC-II-Expression von Monozyten. Da rOv17und trOv17 die polyklonal-stimulierte und die antigenspezifische Proliferation ähnlich stark inhibieren, kann die Inhibition der antigenspezifischen Proliferation nicht ausschließlich auf die verminderte HLA-DR-Expression zurückgeführt werden.

Die Inhibition der polyklonal-stimulierten Proliferation verdeutlicht, daß rOv17 und trOv17 unabhängig von der Antigenpräsentation weitere Faktoren, die den Verlauf einer erfolgreichen T-Zell-Proliferation bestimmen, beeinflussen.

Um zu analysieren, welche Zell-Population in ihrer Funktion von rOv17 und trOv17 moduliert wird, wurden Proliferationsstudien mit Monozyten-depletierten humanen PBMC durchgeführt. rOv17 und trOv17 sind nach der Depletion von Monozyten nicht mehr in der Lage, die polyklonal-stimulierte Proliferation von Monozyten-depletierten PBMC zu inhibieren. rOv17 und trOv17 entfalten daher ihre immunmodulierende Wirkung über die Modulation von APZ-Funktionen.


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4.1.7 Modulation der Zytokinproduktion durch rOv17 und trOv17

rOv17 und trOv17 modulieren die Zytokinproduktion von Monozyten, indem sie eine verstärkte Produktion von TNF-alpha und IL-10 induzieren, und auch die IL-12 Produktion modulieren.

TNF-alpha ist ein wichtiges proinflammatorisches Zytokin, welches sowohl lokal als auch systemisch wirkt. Neben vielen anderen Funktionen induziert TNF-alpha die Aktivierung und Differenzierung von Monozyten und moduliert T- und B-Zell-Funktionen (Beutler et al. 1989). TNF-alpha induziert aber nicht nur eine Entzündungsreaktion, sondern TNF-alpha bewirkt im weiteren Verlauf einer Entzündungsreaktion auch deren Limitierung, indem TNF-alpha u. a. die Produktion von IL-10 induziert (Wanidworanum et al. 1993, Meisel et al. 1996, Marino et al. 1997). Die wichtigsten TNF-alpha Produzenten sind aktivierte Monozyten und Makrophagen, aber auch eine Reihe anderer Zellen (Lymphozyten, NK-Zellen, Neutrophile, Mastzellen usw.) können zur TNF-alpha Produktion angeregt werden (Beutler et al. 1989, Ware et al. 1992). Eine Aktivierung von Monozyten zur TNF-alpha Produktion erfolgt u. a. nach einer Stimulation durch bakterielle Komponenten, wie LPS oder Superantigen (Burchett et al. 1988, Scholl et al. 1989).

rOv17 und auch trOv17 induzieren eine starke TNF-alpha Produktion und schaffen somit zunächst eine proinflammatorische Reaktionslage. Mit der Stimulation von Monozyten, TNF-alpha zu produzieren, schaffen rOv17 und trOv17 damit aber gleichzeitig die Voraussetzung, durch die nachfolgende Induktion von IL-10, die Entzündungs- und Immunreaktion im weiteren Verlauf zu supprimieren.

IL-10 ist ein potentes immunmodulierendes Zytokin. IL-10 kann von CD4+-Lymphozyten, CD8+-Lymphozyten, B-Zellen und Keratinozyten gebildet werden. Die potentesten IL-10 Produzenten sind jedoch Monozyten und Makrophagen (de Waal Malefyt et al. 1991a). Die IL-10 Produktion von Monozyten wird u. a. durch die TNF-alpha und cAMP induzierte Aktivierung von Proteintyrosinkinasen (PTK) und der Proteinkinase A und C (PKA, PKC) induziert (Platzer et al. 1995, 2000, Meisel et al. 1996). IL-10 wirkt immunsupprimierend und antiinflammatorisch (de Waal Malefyt et al. 1991b). Die immunsupprimierende Wirkung von IL-10 beruht auf der Eigenschaft, IL-12 und IFN-gamma zu inhibieren und die Antigenpräsentationskapazität von APZ zu vermindern, indem IL-10 die Expression von


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MHC-II, die Expression des Adhäsionsmoleküle ICAM-1 (CD54) und die Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 auf APZ inhibiert (de Waal Malefyt et al. 1991a, D'Andrea et al. 1993, Ding et al. 1993, Williams et al. 1994). Die Modulation dieser Faktoren bedingt eine IL-10 induzierte verminderte T-Zell-Proliferation. IL-10 vermag aber nicht nur über die Modulation von Monozytenfunktionen die T-Zell-Proliferation zu inhibieren, sondern IL-10 kann auch direkt, durch eine Inhibition der IL-2 Produktion, die T-Zell-Proliferation von CD4+-Zellen vermindern (de Waal Malefyt et al. 1993).

rOv17 und trOv17 induzieren eine starke IL-10 Produktion von unstimulierten und stimulierten PBMC, wobei das durch rOv17 und trOv17 induzierte IL-10 von Monozyten gebildet wird, da Monozyten-depletierte PBMC in Anwesenheit von rOv17 und trOv17 kein IL-10 produzieren (Daten nicht gezeigt).

Durch die verstärkte IL-10 Produktion sind rOv17 und trOv17 in der Lage, in ihrem Umfeld eine antiinflammatorische und immunsupprimierende Reaktionslage zu schaffen und über IL-10 eine Vielzahl von Immunfunktionen zu beeinflussen.

IL-12 ist ein Zytokin, welches von Monozyten/Makrophagen und DZ gebildet wird (D'Andrea et al. 1993, Trinchieri 1994). Eine IL-12 Produktion dieser Zellen wird durch verschiedene Stimuli induziert. So können Infektionserreger wie Viren, Bakterien und Protozoen eine IL-12 Produktion induzieren (Trinchieri 1998). Die Stimulation der IL-12 Bildung wird dabei v. a. durch verschiedene Produkte dieser Erreger, wie LPS, Glykolipide, Glykoproteine, bakterielle Superantigene und bakterielle DNA vermittelt (Leung et al. 1995, Cleveland et al. 1996, Grunvald et al. 1996, Ma et al. 1996, Sato et al. 1996, Camargo et al. 1997, Oswald et al. 1997). Weitere Mechanismen, die IL-12 Produktion von APZ zu induzieren, sind die Stimulation der Zellen durch IFN-gamma oder GM-CSF und die Stimulation des kostimulatorischen Moleküls CD40 (Cella et al. 1996, Kubin et al. 1994a). Eine Inhibition der IL-12 Produktion wird u. a. durch IL-10, TGF-beta und PGE2 induziert (D'Andrea et al. 1993, van der Pouw Kraan et al. 1995, Toossi et al. 1997). Im Verlauf einer Immunantwort vermittelt IL-12 die Aktivierung von Makrophagen und die Differenzierung von Th1-Zellen. IL-12 ist dadurch ein wichtiger Aktivator der zellvermittelten Immunität (Kobayashi et al. 1989, Chan et al. 1991, Scott 1993, Chehimi et al. 1994, Kubin et al. 1994b).


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rOv17 und trOv17 stimulieren die IL-12 Produktion von Monozyten unstimulierter PBMC. Im Gegensatz dazu wird die IL-12 Produktion von polyklonal-stimulierten PBMC durch rOv17 und trOv17 vermindert. Dies bedeutet, daß rOv17 und trOv17 zwar in der Lage sind, die IL-12 Produktion von Monozyten zu stimulieren, im Falle einer Aktivierung der Immunantwort bewirken rOv17 und trOv17 jedoch eine verminderte IL-12 Produktion.

Ein möglicher Mechanismus, die IL-12 Produktion stimulierter PBMC zu inhibieren, ist die durch rOv17 und trOv17 induzierte starke IL-10 Produktion. Da aber auch unstimulierte PBMC /Monozyten von rOv17 und trOv17 zu einer IL-10 Produktion angeregt werden, die IL-12 Produktion in diesem Falle aber nicht supprimiert ist, muß es einen weiteren Mechanismus geben, der die rOv17 und trOv17 induzierte verminderte IL-12 Produktion stimulierter PBMC induziert. Ein wichtiger Mechanismus, der die IL-12 Produktion von Monozyten induziert und der auf der Interaktion zwischen APZ und T-Zelle beruht, ist die Stimulation von CD40 durch CD40L. CD40L ist der T-Zell-Ligand von CD40, deren Expression auf T-Zellen durch eine Stimulation des T-Zell-Rezeptor-Komplexes und durch die Stimulation von CD28 induziert wird (Armitage et al. 1993, Yang et al. 1996). Die verminderte IL-12 Produktion von stimulierten humanen PBMC in Anwesenheit von rOv17 und trOv17 könnte deshalb ein Hinweis für eine verminderte CD40L-Expression der T-Zellen in Anwesenheit von rOv17 und trOv17 sein, in deren Folge die IL-12 Produktion von Monozyten vermindert ist.

Die Inhibition der IL-12 Produktion durch rOv17 und trOv17 bedeutet, daß rOv17 und trOv17 die Aktivierung von Makrophagen und T-Zellen modulieren und in der Lage sind, die Entwicklung einer zellvermittelten Immunantwort zu unterdrücken.

4.1.8 Inhibition der CD40- und CD86-Expression humaner PBMC durch rOv17 und trOv17

Eine Stimulation von T-Zellen wird im Verlauf einer Immunantwort durch die Bindung eines antigenspezifischen Liganden an den T-Zell-Rezeptor-Komplex initiiert und durch ein zweites, kostimulatorisches, Signal induziert (Janeway und Bottomly 1994, Robey et al. 1995). Das erste Signal, die Bindung eines antigenspezifischen Liganden an den T-Zell-Rezeptor, gewährleistet die Spezifität der Immunantwort. Das zweite, kostimulatorische


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Signal ist antigenunspezifisch und induziert die klonale Expansion der T-Zellen, die Sekretion von Zytokinen, die Expression weiterer kostimulatorischer Signale und die Entwicklung von Effektorzellen (McAdam et al. 1998). Das Fehlen des kostimulatorischen Signals bei einer gleichzeitigen Stimulation des T-Zell-Rezeptors induziert eine T-Zell-Anergie (Jenkins et al. 1988). Die erforderlichen kostimulatorischen Signale erhalten T-Zellen von APZ, durch die Bindung kostimulatorischer Moleküle an die entsprechenden T-Zell-Liganden. CD80 und CD86 sind zwei wichtige kostimulatorische Moleküle von APZ, die T-Zellen über ihre CD28-Rezeptoren aktivieren. Weitere kostimulatorische Moleküle, die aktivierende und regulierende Funktionen im Verlauf einer Immunantwort besitzen sind CD40 und CD40L, ICOS Ligand (B7h) -ICOS und B7-H1-mit unbekanntem Liganden (Cayabyab et al. 1994, Grewal et al. 1995, 1998, Dong et al. 1999, Hutloff et al. 1999, Swallow et al. 1999, Aicher et al. 2000, Ling et al. 2000, Mages et al. 2000).

Die Untersuchungen zum Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Expression kostimulatorischer Signale auf humanen Monozyten ergaben, daß rOv17 und trOv17 die Expression von CD86 und auch CD40 vermindern und die Expression von CD80 nicht beeinflussen.

CD86 ist konstitutiv und schnell induzierbar auf professionellen APZ exprimiert (McAdam et al. 1998). Die Expression wird im Verlaufe einer Immunantwort durch verschiedene Stimuli verstärkt bzw. induziert. Insbesondere IFN-gamma oder eine Stimulation von CD40 über CD40L induzieren die Expression von CD86 (Kiener et al. 1995, Cella et al. 1996, Yokozeki et al. 1997). Im Gegensatz dazu inhibieren Zytokine wie IL-4, IL-10, TGF-beta und TNF-alpha die Expression von CD86 auf humanen Monozyten (Ding et al. 1993, Moore et al. 1993, Creery et al. 1996). Die durch rOv17 und trOv17 induzierte verminderte CD86-Expression kann daher durch eine fehlende Stimulation und / oder durch eine Inhibition der Expression von CD86 bedingt sein. Da rOv17 und trOv17 eine verstärkte TNF-alpha und IL-10 Produktion induzieren, ist eine TNF-alpha/IL-10 induzierte verminderte Expression von CD86 sehr wahrscheinlich.

Aber auch eine verminderte Stimulation von CD40 konnte als Ursache der verminderten CD86-Expression zunächst nicht ausgeschlossen werden, insbesondere da gezeigt wurde, daß sich die kostimulatorischen Reaktionspartner CD86/CD80-CD28 und CD40-CD40L in ihrer Expression gegenseitig beeinflussen (Caux et al. 1994, Kiener et al. 1995, Yin et al. 1999).


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Dabei induziert eine Stimulation von CD28 der T-Zellen durch CD86/CD80 zunächst die Expression von CD40L auf T-Zellen (Yang et al. 1996). CD40L stimuliert anschließend APZ durch die Bindung von CD40, kostimulatorische Moleküle wie CD80 und CD86 zu exprimieren (Caux et al. 1994, Cella et al. 1996). Diese gegenseitige Regulation der Expression bedeutet, daß die durch rOv17 und trOv17 induzierte verminderte CD86-Expression auch Folge einer verminderten Expression von CD40L auf T-Zellen sein kann. Sie bedeutet aber auch, daß die durch rOv17 und trOv17 induzierte verminderte CD86-Expression eine verminderte CD40L-Expression auf T-Zellen bedingt, so daß rOv17 und trOv17 nicht nur über CD80 und CD28, sondern vermutlich auch über CD40 und CD40L die T-Zell-Proliferation beeinflussen.

Die verminderte Expression von CD40 auf humanen Monozyten durch rOv17 und trOv17 bestätigt die Vermutung, daß rOv17 und trOv17 auch auf die Expression dieser Kostimulatoren Einfluß nehmen. Um jedoch den Einfluß von rOv17 und trOv17 auf CD40-CD40L beurteilen zu können, sind weitere Untersuchungen nötig, die die Expression von CD40L charakterisieren, da die regulierte Größe des CD40-CD40L-Reaktionspaares CD40L auf den T-Zellen ist.

4.1.9 Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak

rOv17 und trOv17 induzieren eine verstärkte Bildung von IL-10, einem potenten immunsupprimierend wirkenden Zytokin, welches auf eine Vielzahl von Immunfunktionen deaktivierend wirkt. Die Bedeutung der durch rOv17 und trOv17 induzierten verstärkten IL-10 Produktion in Bezug auf die Modulation weiterer Immunfunktionen, haben die Studien mit neutralisierenden anti-IL-10 Ak verdeutlicht. So wird durch die Neutralisation von IL-10 die durch rOv17 und trOv17 induzierte verminderte HLA-DR-Expression und die verminderte Expression von CD40 und CD86 aufgehoben. Desweiteren induziert der Einsatz neutralisierender anti-IL-10 Ak eine starke Stimulation der IFN-gamma Produktion. Im Gegensatz dazu wird die verminderte IL-12 Produktion stimulierter humaner PBMC durch die Neutralisation von IL-10 nicht beeinflußt. Auch in Bezug auf die polyklonal-stimulierte Proliferation ist die alleinige Neutralisation der durch rOv17 und trOv17 induzierten IL-10-Produktion nicht ausreichend, die verminderte Proliferation von humanen PBMC aufzuheben.


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Die Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung von rOv17 und trOv17 belegt, daß beide O. volvulus Cystatine potente Immunmodulatoren sind (Abb. 32). Mit den in vitro Studien konnte erstmals ein einzelnes Parasitenprotein identifiziert werden, welches mit der Induktion einer verminderten zellulären Reaktivität und einer verstärkten IL-10 Produktion immunmodulierende Eigenschaften besitzt, die bislang nur als allgemeine Charakteristika des Immunstatus eines Großteils von filarieninfizierten Personen bekannt waren.

rOv17 und trOv17 beeinflussen eine Vielzahl von Immunfunktionen, die den Verlauf einer Immunantwort bestimmen. rOv17 und trOv17 modulieren dabei Monozytenfunktionen, die den Verlauf einer T-Zell-Aktivierung beeinflussen. So vermindern rOv17 und trOv17 die Antigenpräsentationskapazität von Monozyten, modulieren deren Zytokinproduktion und vermindern die Expression kostimulatorischer Signale. Die Fähigkeit von rOv17 und trOv17 die Antigenpräsentation von Monozyten zu beeinflussen, beruht darauf, die Aktivität von humanem Cathepsin L und S zu inhibieren und die Expression von HLA-DR zu supprimieren. Desweiteren beeinflussen rOv17 und trOv17 die Bildung von TNF-alpha (_), IL-10 (_) und IL-12 (_) und vermindern die Expression von CD40 und CD86. Die verminderte Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 ist dabei auf die rOv17 und trOv17 induzierte verstärkte IL-10 Produktion zurückzuführen. Auch die verminderte IFN-gamma Produktion wird durch die Neutralisation von IL-10 erhöht. Im Gegensatz dazu bleibt die verminderte IL-12 Produktion und die verminderte polyklonal-stimulierte Proliferation humaner PBMC trotz Neutralisation von IL-10 bestehen. Dies verdeutlicht, daß nicht alle modulierenden Effekte von rOv17 und trOv17 über IL-10 vermittelt werden. Welche zusätzlichen Faktoren die durch rOv17 und trOv17 induzierte verminderte polyklonal-stimulierte Proliferation bedingen, und welche Bedeutung diesbezüglich die verminderte IL-12 Produktion besitzt, kann noch nicht beurteilt werden.

Die Bedeutung von IL-10 auf die Proliferation wurde bislang nur für die polyklonal-stimulierte Proliferation untersucht. Die Charakterisierung der Bedeutung der erhöhten IL-10 Produktion für die antigenspezifische Proliferation steht noch aus. Da mit der Neutralisation von IL-10 die durch rOv17 und trOv17 induzierte verminderte Expression von HLA-DR und der kostimulatorischen Moleküle verhindert wird, ist durchaus denkbar, daß aufgrund der


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verbesserten Antigenpräsentationskapazität eine Neutralisation von IL-10 im antigenspezifischen System auch einen stimulierenden Effekt auf die Proliferation ausübt.

Die Hochregulation von IL-10 und die Induktion einer zellulären Hyporeaktivität sind charakteristische Merkmale einer chronischen Filarieninfektion. Eine Korrelation zwischen der IL-10 Produktion und der zelluläre Hyporeaktivität dieser Personen wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Eine Korrelation beider Parameter haben Untersuchungen von King et al. (1993) und Mahanty et al. (1995, 1996, 1997) gezeigt. Im Unterschied dazu fanden Dimock et al. (1994), Sartono et al. (1995) und MacDonald et al. (1998) keine Korrelation zwischen der IL-10 Produktion und der zellulären Hyporeaktivität. Daß die Hochregulation von IL-10 aber dennoch an der Vermittlung der zellulären Hyporeaktivität beteiligt ist, zeigen jüngste Studien von Doetze et al. (2000), die belegen, daß nur eine gemeinsame Neutralisation von IL-10 und TGF-beta die zelluläre Hyporeaktivität filarieninfizierter Personen aufheben kann.

Abb. 32: Übersicht über die immunmodulierenden Eigenschaften von rOv17 und trOv17.


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Die Ergebnisse der bisherigen Untersuchungen zur Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung von rOv17 und trOv17 lassen keine Aussagen über einen genauen Mechanismus zu, über den rOv17 und trOv17 ihre immunmodulierende Wirkung entfalten. Deshalb können diesbezüglich nur Hypothesen formuliert werden.

Hypothese 1)

Die durch rOv17 induzierte Immunmodulation ist auf die Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease zurückzuführen (Abb. 33).

Die Bedeutung einer möglichen Interaktion von rOv17 mit Cysteinproteasen als Ursache für die immunmodulierende Wirkung von rOv17 zu charakterisieren, war eine Zielstellung dieser Arbeit. Cysteinproteasen, die bei der Vermittlung einer Immunantwort wichtige Funktionen übernehmen und deren Aktivität durch Cystatine reguliert wird, sind Cathepsine. Cathepsine beeinflussen die Prozessierung von Antigen und vermitteln die Spaltung der invarianten Kette. Aufgrund dieser Eigenschaften bestimmen Cathepsine die antigenpräsentierende Funktion von APZ. Eine Interaktion von rOv17 mit der Aktivität von humanen Cysteinproteasen würde somit nur im Zusammenhang mit der Antigenpräsentation und der antigenspezifisch-stimulierten Proliferation von Bedeutung sein.

Argumente, die die Hypothese einer möglichen Interaktion von rOv17 mit humanen Cysteinproteasen unterstützten, waren die Fähigkeit von rOv17, die Aktivität humaner Cathepsine, wie Cathepsin L und S mit hoher Affinität zu inhibieren, die Eigenschaft von rOv17 die antigenspezifische Proliferation zu supprimieren und die Expression von HLA-DR auf humanen Monozyten zu vermindern. Die vergleichenden Untersuchungen mit dem verkürzten, weniger aktiven trOv17 haben aber gezeigt, daß trOv17 trotz geringerer inhibitorischer Potenz eine vergleichbare Inhibition der antigenspezifischen Proliferation humaner PBMC und eine vergleichbar starke Suppression der HLA-DR-Expression induziert. Wenn diese immunmodulierende Effekte von rOv17 und trOv17 auf eine Inhibition der Aktivität von humanen Cathepsinen zurückzuführen sein soll, wäre eine weniger starke Beeinflussung dieser Immunfunktionen durch trOv17 zu vermuten gewesen. Es sei denn, es gibt Cysteinproteasen (Cathepsine. Legumain), die im Verlauf der Immunantwort wichtige


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Funktionen ausüben und die inhibitorische Potenz von trOv17 ausreichend ist, die Aktivität dieser Cysteinproteasen zu inhibieren.

Um die Bedeutung einer verminderten Antigenpräsentation im Zusammenhang mit der verminderten antigenspezifischen Proliferation zu analysieren, wurde der Einfluß von rOv17 auf die polyklonal-stimulierte Proliferation untersucht. rOv17 und trOv17 induzieren eine vergleichbar starke Inhibition der antigenspezifischen und polyklonal-stimulierten Proliferation humaner PBMC. Dies bedeutet, daß die Antigenpräsentation im Zusammenhang mit der verminderten T-Zell-Proliferation von untergeordneter Bedeutung ist und damit auch eine mögliche Interaktion von rOv17 und trOv17 mit humanen Cysteinproteasen.

Auch die Suppression der durch rOv17 und trOv17 induzierten HLA-DR-Expression humaner Monozyten ist nicht auf die Inhibition einer Wirtscysteinprotease zurückzuführen, da die Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak gezeigt haben, daß die verminderte HLA-DR-Expression Folge der erhöhten IL-10 Produktion ist. Auch wenn die verminderte HLA-DR-Expression nicht auf die Inhibition der Aktivität li-degradierender Cysteinproteasen durch rOv17 und trOv17 zurückzuführen ist, schließt dies jedoch nicht aus, daß rOv17 und trOv17 eine verminderte Generierung und Expression von Peptid-MHC-II-Komplexen induzieren.

Auch wenn die Ergebnisse der in vitro Studien eine Inhibition der Aktivität von Cysteinproteasen durch rOv17 und trOv17 als Ursache der Immunmodulation als weniger bedeutsam erscheinen lassen, ist jedoch zu berücksichtigen, daß sich die immunmodulierende Wirkung von Onchocystatin auf die Antigenpräsentation in vivo im Vergleich zu den in vitro Studien unterscheiden kann. Da O. volvulus in der Unterhaut des Wirtes lebt, wird Onchocystatin mit den hier vorhandenen APZ, wie Makrophagen, Histiozyten und DZ (Langerhans Zellen) interagieren. In den in vitro Studien wurde bislang nur der Einfluß auf Monozyten untersucht. Da DZ die potentesten APZ sind (Cella et al. 1997), deren Reifung u. a. durch die Aktivität von Cystatin C reguliert wird (Pierre und Mellman 1998), ist denkbar, daß eine Beeinträchtigung der antigenpräsentierenden Funktion von DZ durch Onchocystatin als Cysteinproteasen-Inhibitor eine in vivo Relevanz bei der Entwicklung einer zellulären Hyporeaktivität besitzt.


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Abb. 33: Generierung von Peptid-beladenen MHC-II-Komplexen unter Beteiligung von Cathepsinen und mögliche Beeinflussung dieser Funktion durch rOv17 und trOv17. Cat: Cathepsin, Leg: Legumain, li: invariante Kette, Clip: class-II associated invariant chain peptide,? alphabeta: ?MHC-II-Molekül,?alphabeta-li: li-assoziiertes MHC-II-Molekül, alphabeta-lip10: li-Fragment p10-assoziiertes MHC-II-Molekül, ?alphabeta-Clip: Clip-assoziierte MHC-II-Moleküle.
Die Bildung von Peptid-beladenen MHC-II-Komplexen ist die Voraussetzung für eine erfolgreiche antigenspezifische Immunantwort. Cathepsine erfüllen hierbei zwei wichtige katalytische Prozesse. Zum ersten prozessieren Cathepsine im endosomal-lysosomalen Kompartiment Antigen und generieren Peptide, die anschließend, gebunden an MHC-II-Moleküle, auf der Oberfläche der APZ präsentiert werden. Zum zweiten vermitteln Cathepsine die Prozessierung der MHC-II-assoziierten invarianten Kette, die zur Bildung Clip-assoziierter MHC-II-Moleküle führt. Die Generierung von Clip, welches die antigene Bindungsgrube der MHC-II-Moleküle blockiert, ermöglicht anschließend die Beladung von MHC-II-Molekülen mit antigenen Peptiden. Dabei wird Clip unter Beteiligung der MHC-II-ähnlichen Moleküle HLA-DM und HLA-DO gegen das antigene Peptid ausgetauscht. Das Peptid-beladene MHC-II-Molekül kann nun auf der Oberfläche der APZ präsentiert werden und die antigenspezifische Immunantwort induzieren. An der Prozessierung von li sind Aspartyl- und Cysteinproteasen beteiligt. Die vollständige Prozessierung von li zum MHC-II-assoziierten Clip-Fragment erfolgt jedoch unter Beteiligung spezifischer Cysteinproteasen. So vermittelt Cathepsin S die Generierung von Clip in B-Zellen und DZ, Cathepsin L in Thymusepithelzellen und Cathepsin F in Makrophagen. Eine Inhibition der Aktivität von Cysteinproteasen durch rOv17 und trOv17 könnte daher zu einer Beeinflussung der Prozessierung von Antigen und zu einer Behinderung der Beladung von MHC-II-Molekülen mit antigenen Peptiden führen, in deren Folge die Präsentation der APZ vermindert ist.


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Hypothese 2)

Die immunmodulierenden Eigenschaften von rOv17 und trOv17 sind unabhängig von ihrer Funktion als Cysteinproteasen-Inhibitor und sind rezeptorvermittelt.

Aufgrund der Komplexität der immunmodulierenden Effekte von rOv17 und der gleichermaßen potenten Immunmodulation durch das verkürzte trOv17 und die Eigenschaft von rOv17 und trOv17, bereits in sehr niedrigen Konzentrationen eine potente immunmodulierende Wirkung zu entfalten, lassen die Hypothese einer rezeptorvermittelten Wirkung von rOv17 und trOv17 zu. Demnach würde durch die Bindung von rOv17 und trOv17 an bestimmte Rezeptoren humaner Monozyten eine Stimulation dieser Zellen erfolgen, die durch eine Hochregulation von TNF-alpha gekennzeichnet ist, die im weiteren von einer verstärkten IL-10 und einer verminderten HLA-DR- und CD86-Expression gefolgt wird. In Folge wird zusammen mit weiteren, noch nicht bekannten Faktoren, eine Suppression der Immunantwort induziert. Aufgrund der Ähnlichkeiten des modulierenden Potentials von rOv17/trOv17 und dem Endotoxin LPS, wäre es durchaus möglich, daß rOv17/trOv17 ihre Wirkung über ähnliche Mechanismen entfalten. LPS vermittelt seine immunmodulierende Wirkung auf Monozyten durch die Bindung an CD14/(LBP), ß2-Integrinen (CD11/CD18) und die Toll-like Rezeptoren (TLR) 2 und 4 (Wrigth et al. 1990, Poltorak et al. 1994, Flaherty et al. 1997, Yang et al. 1998). Die Eigenschaft dieser Rezeptoren, unterschiedlich strukturierte Liganden zu binden (Wright 1995, Takeuchi et al. 1999, Ulevitch et al. 1999), könnte eine Interaktion dieser Rezeptoren mit rOv17 und trOv17 ermöglichen.

Die Hypothese der rezeptorvermittelten Immunmodulation von rOv17 und trOv17 liefert auch eine mögliche Erklärung für die teilweise potentere immunmodulierende Wirkung des verkürzten trOv17. Demzufolge könnte eine höhere Affinität von trOv17 zu den entsprechenden Rezeptoren eine stärkere Signalwirkung zur Folge haben und eine im Vergleich zum rOv17 stärkere Immunmodulation bedingen.

Falls sich diese Hypothese bestätigt, würde dies bedeuten, daß Parasiten und bakterielle Erreger ähnliche Mechanismen benutzen, um die Immunantwort ihrer Wirte zu modulieren.


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Hypothese 3)

rOv17 und trOv17 interagieren aufgrund von Sequenzhomologien mit der Funktion der humanen mitogen-und streßaktivierten Proteinkinase-1 (MSK1) oder aber mit dem humanen MPM2-reaktiven Phosphoprotein-1.

Ein Aminosäuresequenzabgleich von Onchocystatin mit Proteinen der Swisspir-Datenbank hat neben den erwarteten Sequzenzhomologien zu anderen Cystatinen eine Sequenzhomologie mit der humanen MSK1 und mit dem humanen MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1 ergeben (Abb. 34). Die Homologie von Onchocystatin zur MSK1 befindet sich am C-Terminus im Bereich der AS 116 bis 162 und beträgt 29%. Mit dem MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1 weist Onchocystatin drei homologe Bereiche auf. Der erste umfaßt den Bereich zwischen den AS 33 und 83 und weist eine Homologie von 23% auf, der zweite Bereich mit 38% Homologie umfaßt die AS 76 bis 96 und der dritte Bereich mit einer Homologie von 27% umfaßt die AS 101 bis 129.

MSK1 ist eine Proteinkinase, die die Aktivierung des Transkriptionsfaktors CREB (cAMP response element-binding protein) vermittelt (Deak et al. 1998). MSK1 ist ein in vielen Geweben exprimiertes Enzym und ist im Zellkern lokalisiert.

Das MPM2-reaktive Phosphoprotein 1 ist ebenfalls im Zellkern lokalisiert und ist an der Mitose von Zellen beteiligt (Westerndorf et al. 1994).

Da nicht bekannt ist, welche Strukturmerkmale für die Funktion des MPP1 und des MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1 entscheidend sind, kann über die Bedeutung der homologen Bereiche des Onchocystatins mit diesen humanen Proteinen keine Aussage gemacht werden. Weiterhin würde eine Interaktion von rOv17 und trOv17 mit der MPP1 und dem MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1 voraussetzen, daß rOv17 und trOv17 bzw. Onchocystatin in den Zellkern der Zelle gelangen muß, um hier modulierend wirken zu können. Desweiteren ist nicht bekannt, welche Bedeutung diese Proteine für Monozyten haben.


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Abb. 34: Homologe Aminosäuresequenzabschnitte von Onchocystatin mit der humanen MSK 1 und dem humanen MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1. Der Aminosäureabgleich mit Proteinen der Swisspir-Datenbank hat eine Sequenzhomologie von Onchocystatin mit der humanen MSK 1 und dem humanem MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1 ergeben. A: Aminosäuresequenzähnlichkeit von Onchocystatin mit der humanen MSK 1. Der grau unterlegte Bereich kennzeichnet den Sequenzabschnitt (AS 116 bis 162), in dem Onchocystatin mit der MSK1 zu 29% homolog ist. B: Aminosäuresequenzähnlichkeit von Onchocystatin mit dem humanen MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1. Die 3 grau unterlegten Bereiche kennzeichnen die Sequenzabschnitte in denen Onchocystatin Homologien zum humanem MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1 besitzt. Der erste Bereich umfaßt die AS 33 bis 83 und weist eine Homologie von 23% auf. Der zweite Bereich umfaßt die AS 76 bis 96 und besitzt eine Homologie von 38%, der dritte Bereich umfaßt die AS 101 bis 129 und hat eine Homologie von 27%. Unterstrichen dargestellt ist die Signalsequenz von Onchocystatin.


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4.2 Charakterisierung des Kontrollproteins rOv33

rOv33 wurde als Kontrollprotein gewählt, da es ein Parasitenprotein der Filarie O. volvulus ist, welches strukturell charakterisiert worden war und welches uns für die Klonierung und Expression in E. coli zur Verfügung stand. rOv33 wurde erstmals von Lucius et al. (1988) beschrieben und hat strukturell Ähnlichkeit mit Aspartylproteasen-Inhibitoren (Willenbucher et al. 1993). rOv33 ist in der Hypodermis und in den Reproduktionsorganen der Filarien lokalisiert und ist eine Komponente des E/S-Produktes.

rOv33 wurde als Kontrolle vergleichend zum rOv17 und trOv17 in allen Untersuchungen getestet. Die Ergebnisse zeigen, daß rOv33 die polyklonal-stimulierte Proliferation und auch die Zytokinproduktion humaner PBMC beeinflußt. Es konnte nicht geklärt werden, ob es sich um einen rOv33-spezifischen Effekt oder um einen immunmodulierenden Effekt, des die Proteinfraktion kontaminierenden LPS handelt.

Die vergleichenden Untersuchungen mit rOv33 haben aber dennoch bestätigt, daß die durch rOv17 und trOv17 induzierten Effekte rOv17- bzw. trOv17 spezifisch sind.

4.3 Vergleichende Untersuchungen von rOv17, trOv17 und LPS

LPS ist Grundbaustein der Bakterienzellwand gramnegativer Bakterien und wirkt bereits im pg-Bereich immunmodulatorisch. Die Stimulation von Monozyten und Makrophagen durch LPS führt zunächst zu einer Produktion proinflammatorischer Zytokine, wie TNF-alpha, IL-1, IL-6 und IL-8 (Morrison et al. 1987). Dieser proinflammatorische Reaktionsstatus der Monozyten wird im weiteren Verlauf von einem antiinflammatorischen Reaktionsstatus (Endotoxintoleranz) abgelöst, der durch die Bildung von IL-10 und IL-1RA und durch eine verminderte Expression von MHC-II und von kostimulatorischen Signalen charakterisiert ist (Andersson et al. 1992, Howard et al. 1992, Randow et al. 1995, Wolk et al. 2000).

Aufgrund der prokaryotischen Expression von rOv17, trOv17 und rOv33 enthalten die aufgereinigten Proteinfraktionen LPS. Um einen möglichen Einfluß von LPS auf die immunmodulierende Wirkung der rekombinanten Proteine beurteilen zu können, wurde die LPS-Konzentration, die durch den Einsatz der rekombianten Proteine in die Zellkultur verursacht wurde, bestimmt. Die Bestimmung des LPS-Gehaltes in der Zellkultur


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verdeutlicht, daß mit dem Einsatz der rekombinanten Proteine ein LPS-Eintrag in die Zellkultur mit bereits wirksamen pg-Mengen erfolgte. Die Bestimmung des LPS-Gehaltes verdeutlicht aber auch, daß mit dem Einsatz von rO17 im Vergleich zum trOv17 und der Kontrolle rOv33 der niedrigste LPS-Eintrag in die Zellkultur verbunden war, so daß vergleichend zur Kontrolle rOv33 die beschriebenen immunmodulierenden Effekte von rOv17 vermutlich nicht auf die LPS-Kontamination von rOv17 zurückzuführen sind. Mit dem Einsatz von trOv17 war im Vergleich zum rOv17 eine höhere LPS-Kontamination der Zellkulturansätze verbunden, ein Umstand, der den direkten Vergleich der durch rOv17 und trOv17 induzierten immunmodulierenden Effekte erschwert. Die vergleichenden Untersuchungen der Ergebnisse von trOv17 mit der Kontrolle rOv33, die eine vergleichbare LPS-Kontamination verursacht, zeigen jedoch, daß auch durch trOv17 eine Immunmodulation induziert wird, die nicht ausschließlich auf deren LPS-Gehalt zurückzuführen ist.

Um den Einfluß der LPS-Kontamination der rekombinanten Proteine besser charakterisieren zu können, wurde vergleichend zum rOv17, trOv17 und rOv33 eine zusätzliche E. coli LPS-Kontrolle (0127 B8) getestet. Diese LPS-Kontrolle induziert in entsprechender Konzentration keine vergleichbar starke Immunmodulation wie rOv17 und trOv17. Es ist jedoch zu berücksichtigen, daß eine abschließende Beurteilung dieser Ergebnisse nicht möglich ist, da jüngste Untersuchungen gezeigt haben, daß sich das immunmodulierende Potential von LPS von unterschiedlichen E. coli-Stämme unterscheidet (mündliche Mitteilung von Prof. Hartung, Universität Konstanz). Da als reine LPS-Kontrolle LPS von einem anderen E. coli-Stamm (0127 B8) verwendet wurde, können diese Ergebnisse nur als Anhaltspunkt dienen.

Ein weiterer Versuch, einen möglichen Einfluß von LPS auszuschließen, beinhaltete den Einsatz eines LPS-neutralisierenden Proteins, BPI (bactericidal / permeability-increasing protein). Unter Verwendung von BPI wurde das immunmodulierende Potential von rOv17 und trOv17 auf die IL-10 Produktion humaner unstimulierter PBMC und die HLA-DR-Expression humaner Monozyten untersucht (Ergebnisse nicht gezeigt). In Anwesenheit des LPS-neutralisierenden Proteins BPI konnte der durch rOv17 induzierte Effekt auf die IL-10 Produktion und die HLA-DR-Expression fast vollständig aufgehoben werden, was zunächst vermuten ließ, daß die beschriebenen immunmodulierenden Effekte von rOv17 auf deren LPS-Gehalt zurückzuführen ist. Um bei der Beurteilung dieser Ergebnisse einen möglichen


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Einfluß von BPI auf die Wirksamkeit von rOv17 auszuschließen, wurde die inhibitorische Aktivität von rOv17 gegenüber humanem Cathepsin L mit und ohne BPI untersucht. Im Ergebnis dieser Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß BPI die inhibitorische Wirksamkeit von rOv17 gegenüber Cathepsin L um 60% vermindert. Aufgrund der Interaktion von BPI mit rOv17, ist daher auch mit dieser Untersuchung keine zuverlässige Beurteilung des Einflusses der LPS-Kontamination der rekombinanten Proteine auf die immunmodulierenden Eigenschaften von rOv17 und trOv17 möglich.

Im Ergebnis der verschiedenen Untersuchungen, mit dem Ziel, den Einfluß des LPS-Gehaltes der rekombinanten Proteine auf deren immunmodulierenden Potential quantifizieren zu können, wird deutlich, daß der Vergleich mit der Kontrolle rOv33 in diesem Zusammenhang am aussagekräftigsten ist.


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