Schönemeyer, Annett: Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung eines Cysteinproteasen-Inhibitors der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus

93

Kapitel 6. Material und Methoden

6.1 Material

6.1.1 Laborgeräte

Beta-counter

Wallac, Finnland

ELISA-Reader MRX

Dynatech, Denkendorf

ELISA-Waschgerät

Dynatech, Denkendorf

Lumineszenz Spektrophotometer

Perkin Elmer, Langen

Fluoroscan II

Labsystems, Frankfurt

Fluoreszenzphotometer SFM 25

BIO-TEK, Neufahrn

Invers-Mikroskop

Leica, Wetzlar

Kühlzentrifuge 5415 C

Eppendorf, Hamburg

Kühlzentrifuge 5810 R

Eppendorf, Hamburg

Magnetrührer

IKA Labortechnik, Staufen

Mikroskop

Zeiss, Oberkochen

Neubauer-Zählkammer

Migge, Heidelberg

Peristaltische Pumpe

BIORAD, München

pH-Meter 526

WTW, Weilheim

Präzisionspipetten

Eppendorf, Hamburg

Schüttelinkubator

New Brunswick, Nürtingen

Spektralphothometer Hitachi U 2000

Colora Meßtechnik, Lorch

Thermocycler

Eppendorf, Hamburg

Thermocycler PCR System 9700

Perkin Elmer, Langen

Tischzentrifuge 5415 C

Eppendorf, Hamburg

Ultraschallgerät HD 200

Heinemann, Schw. Gmünd

Video-Dokumentationsgerät E.A.S.Y.RH

Herolab, Wiesloch

Wasserbad DC3

Haake, Karlsruhe

Zell-Ernter

Wallac, Finnland

6.1.2 Verbrauchsmaterialien

Dialyse-Schläuche

Serva, Heidelberg

Einwegkanülen

Braun, Melsungen

Einwegpasteurpipetten

Greiner, Nürtingen

Einwegspritzen

Braun, Melsungen

ELISA-Platten (Maxisorp)

Nunc, Wiesbaden

Gel-Blotting-Papier

Schleicher & Schuell, Dassel

Nitrozellulosemembran (0,2 µm)

Pharmacia, Freiburg

Petrischalen

Greiner, Nürtingen

Pipettenspitzen

Greiner, Nürtingen

Polypropylen-Röhrchen (12, 14, 50 ml)

Greiner, Nürtingen

Reaktionsgefäße (1,5 und 2,0 ml)

Greiner, Nürtingen

Reaktionsgefäße (0,2 und 0,5 ml)

Biozym, Oldendorf

Sterilfilter (0,2 - 0,45 µm)

Schleicher & Schuell, Dassel

VS+ Säulen

Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach

Zellkulturplatten

Costar, Bodenheim


94

6.1.3 Reagenzien

3H-Thymidin

ICN, Eschwege

Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung

Roth, Karlsruhe

Agarose

Serva, Heidelberg

Antibiotika

AppliChem, Darmstadt

Anti-CD3 Ak (Orthoclone-Okt3)

Janssen-Cilag, Neuss

Agar

AppliChem, Darmstadt

Beriglobin (OBAE 30)

Centeon,

Brij 35

Sigma, Deisenhofen

BSA

AppliChem, Darmstadt

Chemikalien

Roth, Karlsruhe

DNA-Marker BioSizer II/V

AGS, Heidelberg

dNTP

Roth, Karlsruhe

E 64d

Bachem, Heidelberg

EDTA

Roth, Karlsruhe

EGTA

Roth, Karlsruhe

Eiweißcystatin

Sigma, Deisenhofen

Ethidiumbromid

Roth, Karlsruhe

FCS

Biochrom KG, Berlin

Ficoll Paque

Pharmacia, Freiburg

Fluoreszenzsubstrate

Bachem, Heidelberg

Glasfaserfilter

Wallac, Finnland

Hefeextrakt

AppliChem, Darmstadt

L-Glutamin

Gibco BRL, Karlsruhe

LPS (E. coli 0127 B8)

Sigma, Deisenhofen

b-Mercaptoethanol

Roth, Karlsruhe

Metofane (Metoxyfluran)

Janssen-Cilag, Neuss

Milchpulver

Fluka, Deisenhofen

MW-Standard (mid range)

Promega, Mannheim

MW-Standard vorgefärbt

Sigma, Deisenhofen

Ni-NTA-Agarose

Quiagen, Hilden

Oligonukleotide (Primer)

Roth, Karlsruhe

Oligonukleotide (Primer)

TIBMOL BIOL, Berli

Organische Lösungsmittel

Merck, Darmstadt

Penicillin-Streptomycin-Stammlösung

Gibco BRL, Karlruhe

PHA

Pharmacia, Freiburg

Protein-Marker

Pharmacia, Freiburg

Quenching Reagenz

OPREGEN Pharma, Heidelberg

RPMI 1640

Gibco BRL, Karlsruhe

RPMI (VLE) 1640

Biochrom KG, Berlin

Squalan

Fluka, Deisenhofen

Synperonic L101

Serva, Heidelberg

Szintillationsmembran

Wallac, Finnland

TMB-Substrat

Sigma, Deisenhofen

Triton X-100

Serva, Heidelberg

Trypanblau

Sigma, Deisenhofen

Trypton

AppliChem, Darmstadt

Tween

Serva, Heidelberg

6.1.4 Enzyme

DNase, RNase

Boehringer Mannheim, Mannheim

T4 DNA-Ligase

New England Biolab, USA

DNA-Restriktionsenzyme

AGS, Heidelberg

Taq-Polymerase

Gibco BRL, Karlsruhe

Lysozym

Sigma, Deisenhofen

Papain

Sigma, Deisenhofen


95

Humanes Cathepsin L

CALBIOCHEM, Bad Soden

Humanes Cathepsin B

Sigma, Deisenhofen

Humanes Cathepsin S

Prof. Wiederanders, Institut für Biochemie Universitätsklinik Jena

6.1.5 Kommerzielle Kits

Gel-Extraktionskit QUIAEXII

Quiagen, Hilden

Plasmid-Mini-Kit

Quiagen, Hilden

Plasmid-Midi-Kit

Quiagen, Hilden

Duoset (IFN-gamma, TGF-beta)

R & D System, Wiesbaden-Nordenstadt

IL-10-Kit

R & D System, Wiesbaden-Nordenstadt

OptEIATM (IL-10, IL-l2, IL-12p40, IFN-gamma, TNF-alpha, TGF-beta)

Pharmingen, Hamburg

BCA-Test

-Pierce, USA

pGEM T-Easy

Promega, Mannheim

Quantitativer Chromogener LAL-Test

BioWhittaker, Verviers, Belgien

6.1.6 Primer

Ov17

 

 

forward (Ov17 Start):

5' -GTTCAGTTGCAAGGAGCC- 3'-

 

reverse (Ov17 Ende)

5' -TCATACTTCTTTTGTTCCC- 3'-

 

 

 

 

Ov33

 

 

forward (33 f 5`)

5' -CCATGGAGCTCGGTGTAGTAAAAAGGTACAATAAACGT-

3'

reverse (33 f 3`)

5' -CACCCGTCGACCATAGATTGCGACGCAGAAATG-

3'

6.1.7 Agarosegel-Elektrophorese-Puffer

10x TBE

1M

Tris-HCl

 

1M

Borsäure

 

20 mM

EDTA (pH 8,0)

 

 

 

10x TAE

400 mM

Tris-Ac

 

10 mM

EDTA (pH 8,0)

 

1,14%

Eisessig

 

 

 

TE-Puffer

10 mM

Tris-HCl

 

10 mM

EDTA (pH 8,0)

 

 

 

6x Probenpuffer

0,25%

Bromphenolblau

 

0,25%

Xylen-Cyanol FF

 

30%

Glycerol

 

in H2O

 

 

 

 

EtBr-Lösung

10 mg/ml in H2O

 

6.1.8 Puffer für Kleine Plasmidpräparation

Lysispuffer

10 mM

1 mM

100 mM

0,5%

0,5 mg/ml

Tris

EDTA

NaOH

SDS

RNase (frisch zusetzen)

Kaliumazetat/Essigsäure

3 M

Kaliumazetat, pH 6,0


96

6.1.9 Plasmide, cDNA und E. coli-Stämme

E. coli Stämme

DH5 alpha

Stratagen, Heidelberg

XL-1 Blue

Stratagen, Heidelberg

BL21 (DE3)

Novabiochem, Bad Soden

BL21 (DE3) pLys S

Novabiochem, Bad Soden

 

 

Plasmide

 

pBlueskript (SK+)

Stratagen, Heidelberg

pET 28

Novabiochem, Bad Soden

Ov33-pGEX

Thomas Pogonka, HU-Berlin

 

 

cDNA

 

L3 cDNA-Bank

Dr. St. A. Williams, Northampton

6.1.10 Bakterien-Kulturmedien

LB-Medium

10 g

NaCl

 

10 g

Trypton

 

5 g

Hefeextrakt

 

ad 1l mit H2O, pH 7,5

 

 

autoklavieren

 

 

 

 

LB-Platten

LB-Medium

 

 

1,5 % Agar

 

 

autoklavieren

 

 

 

 

SOB-Medium

20 g

Trypton

 

5g

Hefeextrakt

 

0,5 g

NaCl

 

10 ml

KCl (250 mM)

 

ad 995 ml H2O

 

 

pH 7,0

 

 

autoklavieren

 

 

5 ml sterile 2 mM MgCl2

 

 

 

 

SOC-Medium

SOB-Medium

 

 

10 mM sterilfiltrierte Glukose

 

 

 

 

TB-Puffer

10 mM

PIPES

 

15 mM

CaCl2

 

250 mM

KCl

 

pH 6,7

(mit KOH einstellen)

 

55 mM

MgCl2

 

sterilfiltrieren

 

 

 

 

X-Gal-Stammlösung

20 mg/ml in Dimethyl-Formamid

 

 

 

 

IPTG-Stammlösung

1 M in H2O

 

6.1.11 Antibiotika

Ampicillin

50 mg/ml in H2O

 

Kanamycin

10 mg/ml in H2O

 

Chloramphenikol

34 mg/ml in Ethanol

 


97

6.1.12 Puffer für Löslichkeitstest

1) PBS / 0,1% Triton

PBS mit 0,5 M NaCl

 

 

0,1% Triton X-100

 

 

pH 8,0

 

 

 

 

2) Imidazol-Puffer

5 mM

Imidazol

 

0,5 M

NaCl

 

20mM

Tris-HCl

 

pH 7,9

 

 

 

 

3) Harnstoff-Puffer

6 M

Harnstoff

 

100 mM

NaH2PO4

 

10 mM

Tris-HCL

 

pH 8.0

 

 

 

 

6.1.13 Puffer für die affinitätschromatographische Aufreinigung von rOv17, trOv17 und rOv33

Denaturierende Aufreinigung

Puffer A: (Bindungspuffer)

6 M

Guanidinium-HCl

 

100 mM

NaH2PO4

 

10 mM

Tris-HCL

 

pH 8.0

 

 

 

 

Puffer B: (Waschpuffer)

6 M

Harnstoff

 

100 mM

NaH2PO4

 

10 mM

Tris-HCL

 

pH 8.0

 

 

 

 

Puffer C: (Waschpuffer)

 

Puffer B

 

 

pH 6,3

 

 

 

Puffer D: (Waschpuffer)

 

Puffer B

 

 

pH 5,9

 

 

 

Puffer E: (Elutionspuffer)

 

Puffer B

 

 

pH 4,5

Native Aufreinigung

A) Imidazolaufreinigung

Bindungspuffer

5 mM

Imidazol

 

0,5 M

NaCl

 

20mM

Tris-HCl

 

pH 7,9

 

 

 

 

Waschpuffer

60 mM

Imidazol

 

0,5 M

NaCl

 

20 mM

Tris-HCl

 

pH 7,9

 

 

 

 

Elutionspuffer

1 M

Imidazol

 

0,5 M

NaCl

 

20 mM

Tris-HCl

 

pH 7,9

 


98

B) Aufreinigung mit PBS/Triton X-100

Bindungspuffer

PBS mit 0,5 M NaCl

 

 

0,1% Triton X-100

 

 

pH 8,0

 

 

 

 

Waschpuffer

PBS mit 0,5 M NaCl

 

 

0,01% Triton X-100

 

 

pH 5,0

 

 

 

 

Elutionspuffer

PBS mit 0,5 M NaCl

 

 

0,01% Triton X-100

 

 

pH 4,5

 

6.1.14 SDS-PAGE-Pufferlösungen

Acrylamid-Stammlösung (30%)

29,2 g

Acrylamid

 

0,8 g

Bisacrylamid

 

ad 100 ml H2O

 

Acrylamidgel-Gebrauchslösung

 

4%

14%

16%

Acrylamid (30%)

2,7 ml

9,4 ml

10,7 ml

H2O

12 ml

5,4 ml

4 ml

0,5 M Tris (pH 6,8)

5 ml

-

-

1,5 M Tris (pH 8,8)

-

5 ml

5 ml

SDS (10%)

200 µl

200 µl

200 µl

Temed

40 µl

10 µl

10 µl

10% APS

auf 1% frisch zusetzen

auf 1% frisch zusetzen

auf 1% frisch zusetzen

APS

10% in H2O

 

 

 

 

2x SDS-Probenpuffer

20%

Glycerin

 

4%

SDS

 

1,5%

Bromphenolblau

 

125 mM

Tris-HCl, pH 6,8

 

10%

b-Mercaptoethanol

 

2 mM

PMSF

 

 

 

Laemmli-Laufpuffer

25 mM

Tris

 

192 mM

Glycin

 

0,1%

SDS

Färbelösung

20%

Ethanol

 

10%

Essigsäure

 

0,1%

Coomassie Blau R-250

 

in H20

 

 

 

 

Entfärber

20%

Ethanol

 

10%

Essigsäure

 

in H20

 


99

6.1.15 Puffer für Transfer und Western-Blot

Transferpuffer

50 mM

Tris

 

380 mM

Glycin

 

0,1%

SDS

 

20%

Methanol

 

 

 

10x TBS

1 M

NaCl

 

50 mM

Tris

 

pH 7,4

 

 

 

 

Ponceau-Färbelösung

2%

Ponceau

 

30%

Trichloressigsäure

 

30%

Sulfobenzoesäure

 

 

 

BSA/TBS

3% BSA in TBS

 

 

 

 

Peroxidase-Substratlösung

10 ml

TBS

 

600 µl aus 0,3% Chlornaphtol

 

 

5 µl aus 30% H2O2

 

 

 

 

 

 

 

6.1.16 Puffer für ELISA

Beschichtungspuffer

0,2 M

Carbonatpuffer, pH 9,0

 

 

 

Blockierungspuffer

 

3% BSA in PBS

 

 

 

Waschpuffer

PBS / 0,025% Tween 20

 

 

 

 

TMB-Substratlösung

1 mg TMB in 100 µl DMSO

 

 

9,9 ml 100 mM Na-Azetat

 

 

1 µl 30% H2O2

 

 

 

 

Stoplösung

1 M H2SO4

 

6.1.17 Antikörper und Konjugate

rOv17 Kaninchenserum

Charles River, Kisslegg

monoklonaler Maus-anti-rOv33 IgG1-Ak (IVA7)

R. Lucius, HU-Berlin

Ziege-anti-Maus IgG+IgM (H+L) Pox-konjugiert

Dianova, Hamburg

Ziege-anti-Kaninchen IgG+IgM (H+L) Pox-konjugiert

Dianova, Hamburg

monoklonaler Maus anti-humane-IL-10 Ak (IgG1)

Robert Sabat, Charité-Berlin

Maus IgG1 Kontrollantikörper

R & D System, Wiesbaden-Nordenstadt

PE-konjugierte anti-humane HLA-DR Ak (Klon L243)

Becton Dickenson, Heidelberg

FITC-konjugierte anti-humane CD80 Ak (Klon BB1)

Pharmingen, Hamburg

PE-konjugierte anti-humane CD86 Ak (Klon 2331)

Pharmingen, Hamburg

FITC-konjugierte anti-humane CD40 Ak (Klon 5C3)

Pharmingen, Hamburg

PE-Cy5-konjugiert anti-humane CD14 Ak (Klon RMO52)

Coulter Immunotech, Heidelberg

FITC-konjugierte anti-humane CD14 Ak (UCHM-1)

Dianova, Hamburg

FITC-konjugierte Maus IgG1 Ak (Klon 679.1Mc7)

Coulter Immunotech, Heidelberg

PE-konjugierte Maus IgG2a Ak (Klon X39)

Becton Dickenson, Heidelberg

anti-humane CD3 Ak (Orthoclone-Okt3)

Janssen-Cilag, Neuss

anti-humane CD28 Ak (Klon CD28.2)

Pharmingen, Hamburg


100

6.1.18 Puffer und Lösungen für kinetische Messungen mit rOv17 und trOv17

Probenpuffer

Papain-Probenpuffer

200 mM

K2HPO4

 

200 mM

KH2PO4

 

4 mM

EDTA

 

4 mM

DTT (frisch zusetzen)

 

0,01%

Brij 35

 

pH 6,8

 

 

 

 

Cathepsin S-Probenpuffer

13 mM

K2HPO4

 

87 mM

KH2PO4

 

5 mM

EDTA

 

5 mM

DTT (frisch zusetzen)

 

0,01%

Brij 35

 

pH 6,0

 

 

 

 

Cathepsin L-Probenpuffer

340 mM

Na-Azetat

 

60 mM

Essigsäure

 

4 mM

EDTA

 

8 mM

DTT (frisch zusetzen)

 

0,01%

Brij 35

 

pH 5,5

 

 

 

 

Cathepsin B-Probenpuffer

352 mM

KH2PO4

 

48 mM

Na2HPO4

 

4 mM

EDTA

 

8 mM

DTT

 

0,01%

Brij 35

 

pH 6,0

 

Cysteinproteasen-Stammlösung (EwC-titrierte Konzentration)

Cathepsin B

0,12 µM (E64-titriert)

Cathepsin L

0,85 µM

Cathepsin S

0,67 µM

Papain

1,5 µM

Cysteinproteasen-Arbeitslösung für Ki-Wert Bestimmung (EwC-titrierte Konzentration)

Cathepsin B

117 nM (E64-titriert)

Cathepsin L

11,3 nM

Cathepsin S

9,0 nM

Papain

10,0 nM

Substrat-Stammlösungen

Z-Val-Val-Arg-AMC (Cathepsin S)

10 mM in DMSO

Z-Phe-Arg-AMC (Cathepsin L)

10 mM in DMSO

Z-Arg-Arg-AMC (Cathepsin B)

10 mM in DMSO

Z-Phe-Arg-AMC (Papain)

10 mM in DMSO

Substrat-Arbeitslösungen für Ki-Wert Bestimmung

Z-Val-Val-Arg-AMC (Cathepsin S)

40 µM in Probenpuffer

Z-Phe-Arg-AMC (Cathepsin L)

5 µM in Probenpuffer

Z-Arg-Arg-AMC (Cathepsin B)

40 µM in Probenpuffer

Z-Phe-Arg-AMC (Papain)

25 µM in Probenpuffe


101

6.1.19 Zellkultur-Medien

1x PBS

136,9

mM NaCl

 

2,7

mM KCl

 

8,1 mM

Na2HPO4

 

1,5 mM

KH2PO4

 

pH 7,4

 

 

 

 

RPMI komplett

RPMI 1640

 

 

2 mM L-Glutamin

 

100 U/ml Penicillin

 

100 µg/ml /Streptomycin

 

5-10% hitzeinaktiviertes FCS

 

 

PHA-Arbeitslösung

200 µg/ml

 

 

anti-CD3 Ak-Arbeitslösung

200 ng/ml

 

 

3H-Thymidin- Arbeitslösung

50 µCi/ml

 

 

Trypanblau-Lösung

160 mg in 100 ml PBS

 

 

Erythrozytenlyse-Lösung

90 ml aus 160 mM NH4Cl

 

10 ml 170 mM Tris

 

pH 7,6

6.1.20 Adjuvans

2x STP

PBS

 

 

10%

Squalane

 

0,4%

Tween 80

 

1,0%

Synperonic L 101

6.1.21 Puffer für Durchflußzytometrie

FACS-Puffer

0,1%

NaN3

 

2%

FCS in PBS

6.1.22 Tiermaterial

BALB/c Mäuse

H-2d Haplotyp

BGVV, Berlin


102

6.2 Methoden

6.2.1 Gewinnung von Parasitenmaterial

6.2.1.1 Herstellung von O. volvulus-Antigenextrakt

5 tiefgefrorene, adulte O. volvulus Weibchen wurden bei RT aufgetaut, mit PBS gewaschen und in 1-2 ml PBS mit einer Schere in einem Blockschälchen fein zerkleinert und anschließend mit Hilfe eines Glashomogenisators homogenisiert. Das Wurmhomogenat wurde in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und auf Eis mit 60 W für 3 min beschallt. Die lösliche Proteinfraktion wurde anschließend durch Zentrifugation für 30 min bei 4°C und 15 000 rpm von der unlöslichen Proteinfraktion getrennt. Der Überstand (OvAg) wurde abpipettiert, aliquotiert und bei -80°C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde mittels BCA-Test (Pkt. 6.2.3.1 ) bestimmt.

6.2.1.2 Gewinnung von Kulturüberstand weiblicher O. volvulus Würmer

Die Kulturüberstände von O. volvulus Weibchen für die Quantifizierung der Ov17-Ausscheidung wurden uns freundlicherweise von Dr. Norbert (Bernhard-Nocht Institut, Hamburg) zur Verfügung gestellt. Nach der Isolierung aus bindegewebigen Knoten wurden unversehrte, bewegliche Weibchen einzeln in je 6 ml Kulturmedium für 8 h vorinkubiert, wobei durch stündlichen Mediumswechsel restliche Kollagenase entfernt wurde. Nur intakte, vitale Weibchen wurden für eine weitere in vitro Kultivierung ausgewählt. Die Kultivierung erfolgte in je 1 ml Kulturmedium, welches alle 24 h erneuert wurde. Die gesammelten Kulturüberstände wurden sterilfiltriert und in flüssigem Stickstoff gelagert.


103

6.2.2 Molekularbiologische Methoden

6.2.2.1 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die DNA der rekombinanten O. volvulus Proteine, rOv17 und rOv33, wurde mit Hilfe der PCR unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase amplifiziert (Saiki et al. 1988, Bej et al. 1991).

PCR-Ansatz:

Amplifikation der Ov17-DNA

Amplifikation der Ov33-DNA

2 µl 5' Primer (20 pmol/µl)

2 µl 3' Primer (20 pmol/µl)

5 µl O. volvulus L3 cDNA Bank

2 µl 2 mM dNTP Gemisch

5 µl 10x PCR Puffer mit MgCl2

1 µl Taq-Polymerase (1U/µl)

ad 50 µl HPLC Wasser

2 µl 5' Primer (20 pmol/µl)

2 µl 3' Primer (20 pmol/µl)

1 µl Template DNA (0,5 µg/µl Ov33-pGEX)

2 µl 2 mM dNTP Gemisch

5 µl 10x PCR Puffer mit MgCl2

1 µl Taq-Polymerase (1U/µl)

ad 50 µl HPLC Wasser

PCR-Amplifikationszyklus

Ov17

Zyklus

1:

2-34:

35:

2 min 95°C, 2 min 50°C, 4 min 72°C

1 min 95°C, 2 min 50°C, 4 min 72°C

1 min 95°C, 2 min 50°C, 4 min 72°C

Ov33

Zyklus

1:

2-29:

30:

3 min 95°C, 1 min 50°C, 1 min 72°C

1 min 95°C, 1 min 50°C, 1 min 72°C

1 min 95°C, 1 min 50°C, 11 min 72°C


104

6.2.2.2 Aufreinigung und Konzentrierung von DNA

6.2.2.2.1 Isolation von DNA-Fragmenten

a) Phenol-Chloroform Extraktion

Die Phenol-Chloroform Extraktion wurde nach der Methode von Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Die DNA-Lösung wurde mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) im Verhältnis 1:1 versetzt und 5 min bei RT und 14 000 rpm zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde anschließend im Verhältnis 1:1 mit Chloroform-Isoamylalkohol gewaschen, um verbliebene Reste an Phenol aus der DNA-Lösung zu entfernen. Die DNA wurde mittels Ethanolpräzipitation (Pkt. 6.2.2.2.3) konzentriert.

b) DNA-Isolierung aus Agarosegelen

Die Isolierung von DNA aus Agarosegelen wurde mit Hilfe des QIAEX II Gel-Extraktions-Kit durchgeführt. Das Grundprinzip dieser DNA-Aufreinigung besteht in der Auflösung der Agarose, der selektiven Bindung von Nukleinsäure an Silikatpartikel (Glasmilch) bei einem pH = 7,5 unter Hochsalzbedingungen, dem Waschen der gebundenen Nukleinsäuren mit Hochsalzpuffern und der anschließenden Elution der DNA bei pH 8,5 unter Niedrigsalzbedingungen (TE-Puffer oder H2O). Die Isolierung der DNA erfolgte entsprechend der Vorgaben des Herstellers.

6.2.2.2.2 Isolation von Plasmid-DNA

a) Plasmidaufreinigung aus E. coli mittels Quiagen-Säulen

Für die Präparation von hochreiner Plasmid-DNA aus E. coli wurden käuflich erworbene Quiagen-Säulen verwendet. Die Plasmidaufreinigung dieser Kits beruht auf der Methode der alkalischen Lyse (Birnboim und Doly 1979) mit anschließender Aufreinigung von supercoiled Plasmid-DNA durch Ionenaustausch-Chromatographie. Für die Plasmidisolation wurden Mini- und Midipräparationssäulen verwendet. Die Durchführung erfolgte entsprechend der Vorgaben des Herstellers.


105

b) Kleine Plasmidpräparation mittels alkalischer Lyse

2 ml LB-Medium wurden nach Zusatz eines entsprechenden Antibiotikums mit einer Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C und 220 rpm inkubiert. Das Bakterienpellet dieser Kultur wurde in 300 µl Lyse-Puffer resuspendiert und die Suspension nach Zugabe von 0,5 mg/ml RNase 5 min auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 150 µl einer 3 M Kaliumazetat/Essigsäure-Lösung wurde die Suspension 10 min auf Eis inkubiert und anschließend 5 min bei 14 000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und die Plasmid-DNA mittel Ethanolfällung (Pkt. 6.2.2.2.3) konzentriert. Das Plasmidpellet wurde in 25 µl TE-Puffer oder Wasser aufgenommen.

6.2.2.2.3 DNA Konzentrierung mittels Ethanolpräzipitation

DNA wurde aus einer Lösung durch Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 4,8) und mit dem 2,5 fachen Volumen an reinem Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde bei 4°C, 15 000 rpm für 10 min zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet. Die DNA wurde in TE-Puffer oder H2O gelöst.

6.2.2.3 DNA-Konzentrationsbestimmung

Die DNA-Konzentration einer Lösung wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm (Extinktionsmaximum für Nukleinsäuren) bestimmt. Verunreinigungen wurden bei einer Wellenlänge von 280 nm (Extinktionsmaximum für Proteine) gemessen. Für saubere Nukleinsäurelösungen sollte der Quotient der Extinktionswerte von 260 nm / 280 nm zwischen 1,8 und 2,0 liegen. Die DNA-Konzentration wurde wie folgt berechnet:

Nukleinsäure [ µg/ml] = OD260 x D x F

F = Verdünnungsfaktor

D = 50 µg/ml für doppelsträngige DNA

D = 40 µg/ml für einzelsträngige DNA / RNA

D = 33 µg/ml für Oligonukleotide


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6.2.2.4 Restriktionsverdau von Vektoren und DNA-Fragmenten

2-10 µg DNA wurden in einem Reaktionsansatz von 20 µl unter Zusatz der entsprechenden Restriktionsendonukleasen und ihren Puffern geschnitten. Plasmide wurden 2 h, PCR-Produkte 12 h inkubiert. Die Temperaturbedingungen des Restriktionsverdaus wurden nach den Vorgaben des Herstellers für das entsprechende Enzym festgelegt. Die Restriktionsendonukleasen wurden anschließend durch Hitzeinaktivierung deaktiviert oder durch eine Phenol-Chloroform Fällung oder durch Auftrennung im Agarosegel aus dem Reaktionsgemisch entfernt.

6.2.2.5 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten

Zur Vermeidung der Religierung von geschnittenen Vektoren wurden die terminalen 5'-Phosphatgruppen durch eine alkalische Kälberphosphatase abgespalten. 5 µg geschnittene, Phenol-Chloroform aufgereinigte oder geleluierte Vektor-DNA wurden wie folgt dephosphoryliert:

Dephosphorylierungsansatz

5 µg

Vektor-DNA

1 µl

alkalische Kälberphosphatase (1U/µl)

3 µl

10x Dephosphorylierungspuffer

ad 30 µl H20

 

Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1/10 Volumen 200 mM EGTA zum Reaktionsansatz und durch anschließende Inkubation bei 65°C für 10 min gestoppt. Die dephosphorylierte Vektor-DNA wurde Phenol-Chloroform extrahiert.


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6.2.2.6 Ligation von DNA

Die Ligation eines DNA-Inserts in den entsprechenden Vektor erfolgte in einem molaren Verhältnis von 3:1, 1:1 und 1:3.

Ligationsansatz:

1 µl

Vektor-DNA (ca. 50-100 ng)

4 µl

Insert-DNA

1 µl

10x Ligasepuffer

0,5 µl

T4 DNA-Ligase (3 Weiss U/µl)

ad 10 µl HPLC Wasser

 

Der Ligationsansatz wurde bei 12 °C für 12 bis 48h inkubiert. Als Kontrolle wurde eine Ligation ohne Insert-DNA durchgeführt.

6.2.2.7 Agarosegel-Elektrophorese

Die Agarosegel-Elektrophorese wurde zur Aufreinigung von DNA und zur Beurteilung von Restriktionsverdauansätzen durchgeführt. Je nach Größe der aufzutrennenden DNA wurde eine Konzentration der Agarose von 0,8-2,0% gewählt. Die Agarose wurde durch Erhitzen in 1x TAE-Puffer gelöst. Nach Abkühlen der Agarose auf 50°C wurde EtBr aus einem 10 mg/ml Stock auf eine Endkonzentration von 0,5 µg/ml zugegeben. Die DNA-Proben wurden mit 6x Probenpuffer versetzt, auf das Gel aufgetragen und bei 80 V aufgetrennt. Zur Beurteilung der Größe der aufgetrennten DNA wurden die Molekulargewichtsmarker Biosizer II und V verwendet. Die aufgetrennte DNA wurde unter UV-Licht sichtbar gemacht.

6.2.2.8 Herstellung transformationskompetenter E. coli-Bakterien

Die Herstellung transformationskompetenter E. coli-Bakterien erfolgte nach dem Protokoll von Inoue et al. (1990). 250 ml SOB Medium wurden mit einer Bakterienkolonie des gewünschten Bakterienstammes angeimpft und bei 18°C und 200 rpm bis zu einer OD600 von 0,6 (logarithmische Wachstumsphase) inkubiert. Die Bakterien wurden 10 min auf Eis inkubiert und anschließend bei 4°C und 4000 rpm für 10 min zentrifugiert. Das


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Bakterienpellet wurde in 80 ml kaltem TB Puffer resuspendiert, für 10 min auf Eis inkubiert und anschließend zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 20 ml TB-Puffer resuspendiert. DMSO wurde unter vorsichtigem Schütteln tropfenweise bis zu einer Endkonzentration von 7% zugegeben. Die Bakterien wurden erneut 10 min auf Eis inkubiert, anschließend à 1ml aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Die Transformationseffizienz der kompetenten Bakterien betrug 5x107-1x108 transformierte Bakterienkolonien pro µg Plasmid-DNA.

6.2.2.9 Transformation kompetenter E. coli-Bakterien mit Plasmid-DNA

50 ng Plasmid-DNA (1-5 µl) wurden in ein vorgekühltes 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert. Kompetente Zellen wurden bei RT aufgetaut und 100 µl zum Plasmid zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde 30 min auf Eis und anschließend für 30 sec bei 42°C inkubiert. Nach Zugabe von 900 µl SOB-Medium wurde der Transformationsansatz bei 37°C und 400 rpm für 1 h inkubiert. 100-200 µl des Transformationsansatzes wurden auf eine Agarplatte (mit entsprechendem selektiven Antibiotikum) ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Als Kontrollen wurden bei jedem Transformationsansatz zum einen Bakterien ohne Plasmid und zum anderen Bakterien mit einem „leeren“ Plasmid transformiert.

6.2.2.10 Identifizierung positiver Transformanten

6.2.2.10.1 Blau-Weiß-Screening

Bakterien mit einer Mutation im lac Z-Gen (lacZ ?M15) produzieren eine enzymatisch inaktive beta-Galaktosidase, der am N-Terminus 30 AS fehlen. Werden diese Bakterien mit einem Plasmid transformiert, welches die fehlende, sog. alpha-Region (alpha-Peptid) induzierbar exprimiert, kann durch alpha-Komplementation der beiden Proteine das funktionelle Enzym entstehen, welches das chromogene Substrat X-gal (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-beta-Galaktosidase) metabolisiert. Die Metabolisierung des Substrates X-gal führt zu einer Blaufärbung der Bakterienkolonie. Wird der kodierende Bereich des alpha-Peptids durch den


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Einbau von Fremd-DNA unterbrochen, so geht die alpha-Donoraktivität des alpha-Peptids verloren und es kann keine aktive-beta-Galaktosidase mehr gebildet werden. Transformierte Bakterien, die in ihrem Plasmid Fremd-DNA enthalten bleiben weiß.

LB-Agarplatten wurden für das Blau-Weiß-Screening vorbereitet, indem 40 µl X-gal (20 mg/ml) und 10 µl IPTG (1 M) mit einem Drigalski-Stab gleichmäßig ausplattiert wurden.

6.2.2.10.2 Plasmidpräparation und Restriktionsverdau

Zur Kontrolle des Transformationserfolges mittels Restriktionsverdau wurden jeweils 5 weiße Kolonien pro Platte einer Transformation mit Blau-Weiß-Sreening oder 10 Kolonien pro Platte einer Transformation ohne Blau-Weiß-Screening überprüft. 2 ml LB-Medium mit Antibiotikazusatz wurden mit jeweils einer Kolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C und 250 rpm inkubiert. Nach Plasmidextraktion mittels alkalischer Lyse (Pkt. 6.2.2.2.2) und anschließendem Restriktionsverdau (Pkt. 6.2.2.4) wurden die DNA-Proben im Agarosegel aufgetrennt und die Bakterienkolonien, deren Plasmid ein Insert enthielt, identifiziert.

6.2.2.11 Sequenzierung von Plasmid-DNA

Für die Sequenzierung wurde Plasmid-DNA mittels Quiagensäulen aufgereinigt (Pkt. 6.2.2.2.2). Die Sequenzierung wurde von der Firma AGOWA (Berlin) nach der Methode von Sanger et al. (1977) durchgeführt.

6.2.2.12 Langzeitlagerung von Bakterienstocks

Für die Langzeitlagerung von Bakterien wurden 0,5 ml einer 5 ml Übernachtkultur mit 0,5 ml sterilem 100%igem Glycerin versetzt. Die Bakterien wurden anschließend in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.


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6.2.2.13 Untersuchung des Löslichkeitsverhaltens von rOv17, trOv17 und rOv33

Eine 20 ml LB-Kultur mit entsprechendem Antibiotikazusatz wurde mit 0,5 ml einer Übernachtkultur angeimpft und inkubiert. Bei einer OD600 von 0,6 - 0,8 wurde die Expression der rekombinanten Proteine durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert. Nach 3 h Inkubation wurden 3x2 ml Kultur abgenommen und die Bakterien abzentrifugiert (5 min, 4°C, 15 000 rpm). Die Bakterinpellets wurden in jeweils 200 µl eines Löslichkeitspuffers resuspendiert. Die Löslichkeit wurde mit einem PBS/Triton X-100-Puffer, mit einem Imidazol-Puffer und mit einem 6M Harnstoff-Puffer getestet. Die Bakteriensuspension wurde 30 sec bei 60 W auf Eis beschallt und anschließend bei 15 000 rpm und 4°C für 5 min zentrifugiert. Der Überstand (lösliche Fraktion) wurde abgenommen und bei -20°C aufbewahrt. 10 µl des Überstandes und 5 µl der unlöslichen Pelletfraktionen wurden im SDS-PAGE aufgetrennt, um die Löslichkeit der rekombinanten Proteine zu beurteilen. Die Löslichkeit der rekombinanten Proteine bestimmte die Wahl der Aufreinigungsmethode.

6.2.2.14 Affinitätschromatographische Aufreinigung von rOv17, trOv17 und rOv33

Alle rekombinanten Proteine wurden im pET-Expressionssystems exprimiert, welches durch die Bereitstellung von 6 Histidinresten am N-Terminus der rekombinanten Proteine eine affinitätschromatographische Aufreinigung über eine Nickel-Chelat-Säule ermöglicht. Für die Aufreinigung rekombinanter Proteine wurde jeweils 1 l LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikazusatz mit 20 ml einer Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C und 220 rpm bis zu einer OD600 von 0,6-0,8 inkubiert. Die Expression der rekombinanten Proteine wurde durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert. Nach einer Inkubationsdauer von 3 h wurden die Bakterien bei 4°C und 5000 rpm für 5 min abzentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 20 ml Bindungspuffer resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym (100 µg/ml) und DNaseI (5 µg/ml) / RNase A (10 µg/ml) wurde die Suspension für 3 min auf Eis beschallt (60 W) und anschließend bei 4°C und 15 000 rpm für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min über die mit Bindungspuffer äquilibrierte Ni-NTA-Matrix (1 ml) gegeben. Die beladene Säule wurde


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mit 10 ml Bindungspuffer und 50 ml Waschpuffer gewaschen. Die Elution des rekombinanten Proteins wurde anschließend mit dem entsprechenden Elutionspuffer induziert. Das Eluat wurde in 10 Fraktionen à 2 ml aufgefangen und anschließend dialysiert. Bei nativer Aufreinigung erfolgte die Dialyse mehrmals gegen PBS. Bei denaturierender Aufreinigung erfolgte die erste Dialyse gegen einen 1 M Harnstoffpuffer und anschließend gegen einen 0,5 M und 0,25 M Harnstoffpuffer und im weiteren mehrmals gegen PBS. Die dialysierten Fraktionen wurden sterilfiltriert.


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6.2.3 Biochemische Methoden

6.2.3.1 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels BCA-Test

Die Proteinkonzentration der rekombinanten Parasitenproteine wurde mittels BCA-Test (Smith et al. 1985) bestimmt. Das Prinzip dieser Methode besteht in der Reduktion von Cu2+ zu Cu1+, die durch die Peptidbindungen der Proteine unter alkalischen Bedingungen induziert wird. Reduzierte Kupfer-Ionen bilden mit Bicinchonin-Säure (BCA) einen farbigen, wasserlöslichen Chelatkomplex, deren Absorption bei einer Wellenlänge von 562 nm gemessen wird. Die Durchführung des BCA-Tests erfolgte entsprechend den Vorgaben des Herstellers.

6.2.3.2 Präzipitation von Proteinen

6.2.3.2.1 Acetonfällung

Die Proteinlösung wurde zu 20-50% mit Aceton versetzt und anschließend bei 4°C und 14 000 rpm für 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und wenn erforderlich, verbliebenes Protein erneut mit Aceton gefällt. Das Proteinpellet wurde in 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen und nach Erhitzen auf 95°C (3 min) im SDS-PAGE aufgetrennt.

6.2.3.2.2 TCA-Fällung

Aus einer 100%igen TCA-Lösung wurde ein entsprechendes Volumen zum Erreichen einer Endkonzentration von 10% zu der Proteinlösung dazugegeben und 20 min auf Eis inkubiert. Die Lösung wurde anschließend 20 min bei 4°C und 14 000 rpm zentrifugiert. Das Proteinpellet wurde mit Ethanol-Ether (1:1) gewaschen, um restliche TCA zu entfernen. Das Proteinpellet wurde in 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen und nach Erhitzen auf 95°C im SDS-PAGE aufgetrennt.


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6.2.3.3 Funktionelle Charakterisierung von rOv17 und trOv17

6.2.3.3.1 Titration der aktiven Zentren von Papain und humanem Cathepsin B, L und S

Die Titration der aktiven Zentren der humanen Cysteinproteasen wurden mit E64 und mit EwC durchgeführt. Die Proteasen wurden hierfür mit verschiedenen Konzentrationen von E64 und EwC für 45 min bei RT in Mikrotiterplatten inkubiert. E64 und EwC wurden in Konzentrationen von 7, 14, 21, 28, 35, 42 und 49 nM eingesetzt. Nach Ablauf der Inkubation wurde dem Proteasen-Inhibitor-Gemisch fluorogenes Substrat zugesetzt (Tab. 6). Das Endvolumen der Ansätze betrug 250 µl. Die Restaktivität der Proteasen wurde durch unverzügliche Messung des freigesetzten fluorogenen Produktes Aminomethylcoumarin (AMC) in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt (Exzitationswellenlänge 355 nm, Emissionswellenlänge 460 nm).

Tab. 6: Substrate und Substratkonzentration im Titrationstest.

 

Substrat

Substratkonzentration

Papain

Z-Phe-Arg-AMC

25 µM

Cathepsin B

Z-Arg-Arg-AMC

120 µM

Cathepsin L

Z-Phe-Arg-AMC

10 µM

Cathepsin S

Z-Val-Val-Arg-AMC

40 µM

6.2.3.3.2 Titration der wirksamen rOv17 Konzentration

Die Titration der aktiven Zentren von rOv17 erfolgte mit titriertem, humanem Cathepsin L. Cathepsin L wurde mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17 (7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 nM) für 45 min bei RT in Microtiterplatten inkubiert. Nach Ablauf der Inkubation wurde dem Proteasen-Inhibitor-Gemisch Z-Phe-Arg-AMC-Substratlösung auf eine Endkonzentration von 10 µM zugesetzt. Das Endvolumen der Ansätze betrug 250 µl. Die Restaktivität der Proteasen wurde durch unverzügliche Messung des freigesetzten fluorogenen Produktes AMC in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt (Exzitationswellenlänge 355 nm, Emissionswellenlänge 460 nm). Die Auswertung der Messungen erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism.


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6.2.3.3.3 Bestimmung der Km-Werte für Cathepsin L und B

Die kinetischen Messungen erfolgten bei 37°C in einem beheizbaren Photometer über einen Zeitraum von 150 sec. Die Messungen wurden in einem 2 ml-Reaktionansatz in Quarzküvetten, die mit einem Magnetrührer versehen waren, durchgeführt. Für alle Reaktionsansätze wurde 37°C vorgewärmter Probenpuffer verwendet. Vor Beginn der Messungen wurde die Protease in ihrem Probenpuffer für 5 min bei 37°C aktiviert. Anschließend wurde die Proteaseaktivität austitriert, so daß in einem Zeitraum von 60-90 sec 1000 Fluoreszenzeinheiten freigesetzt wurden. Hierfür wurden 1980 µl des vorgewärmten Puffer-Substratlösung in die Küvette vorgelegt und 20 µl der aktivierten Proteaselösung dazugeben. Zeitgleich mit der Zugabe der Protease wurde die Messung gestartet. Entsprechend des Kurvenverlaufs wurde die Protease weiter verdünnt oder konzentriert, um die oben genannte Voraussetzung zu erfüllen. Anschließend wurde die Proteaseaktivität in Anwesenheit von verschiedenen Substratkonzentrationen über einen Zeitraum von 150 sec bei 37°C gemessen (Tab. 7). Hierfür wurden ein entsprechendes Volumen Cathepsin-Probenpuffer in die Quarzküvette vorgelegt und das entsprechende Volumen Substrat aus einer 10 mM Stammlösung zugegeben, so daß ein Endvolumen von 1980 µl erzielt wurde. Die Küvette wurde in das beheizte Fluoreszenzphotometer verbracht. Nach Nullabgleich des Gemisches wurde die Messung nach Zugabe der Protease (20 µl) zeitgleich gestartet. Die Abspaltung der fluorogenen Produktes AMC wurde bei einer Exzitationswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenänge 460 nm kontinuierlich über einen Zeitraum von 150 sec aufgezeichnet. Für die Messungen wurden jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism.

Tab. 7: Testparameter für die KM-Wert-Bestimmung.

 

Cathepsin-Konzentration

Substrat

Getestete Substratkonzentration

Cathepsin B

1,17 nM

Z-Arg-Arg-AMC

25; 50; 100; 200; 300; 400; 500 µM

Cathepsin L

0,47 nM

Z-Phe-Arg-AMC

0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 50; 6,0; 7,0; 8,0 µM

Der KM-Wertes für Cathepsin S war bereits am Institut für Biochemie der Universitätsklinik Jena bestimmt worden. Der Km-Wert für Papain war vorgegeben.


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6.2.3.3.4 Bestimmung der Dissoziationskonstanten Ki von rOv17 und trOv17 für Papain und Cathepsin B, L und S

Die Bestimmung der Ki-Werte für rOv17 erfolgte mit der pflanzlichen Cysteinprotease Papain und mit den humanen Cysteinproteasen Cathepsin B, L und S. Die Versuchsdurchführung erfolgte wie es bereits für die Bestimmung des Km-Wertes beschrieben wurde. Für die Bestimmung der Ki-Werte wurde die Proteaseaktivität in Anwesenheit von verschiedenen Inhibitorkonzentrationen (rOv17, trOv17) über einen Zeitraum von 320 sec bei 37°C gemessen. Der vorgewärmte Probenpuffer wurde mit der entsprechenden Menge Inhibitor in die Küvette pipettiert, so daß ein Volumen von 1980 µl erreicht wurde. Die Küvette wurde in das beheizte Fluoreszenzphotometer verbracht. Nach Zugabe der entsprechenden Protease (20 µl) wurde die Messung zeitgleich gestartet. Das Volumen des eingesetzten rOv17/trOv17 wurde so gewählt, daß 5% des Reaktionsendvolumens nicht überschritten wurden. Die getesteten Konzentrationen und Substrate sind in Tab. 8 aufgeführt. Die Messungen wurden als Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm „GraphPad Prism“.

Tab. 8: Testparameter für die Bestimmung der Ki-Werte.

 

Cathepsin-Konzentration

Substratkonzentration

Getestete rOv17-Konzentration

Getestete trOv17-Konzentration

Papain

0,10 nM

25 µM Z-Phe-Arg-AMC

1,7; 2,7; 3,4; 4,1; 5,5 nM

10; 50; 100 nM

Cathepsin B

1,17 nM

40 µM Z-Arg-Arg-AMC

3,5; 35; 70; 173 nM

n.d.

Cathepsin L

0,11 nM

5 µM Z-Phe-Arg-AMC

0,7; 1,4; 2,1;2,8; 3,5 nM

10; 50; 100 nM

Cathepsin S

0,09 nM

40 µM Z-Val-Val-Arg-AMC

0,7; 1,4; 2,1;2,8; 3,5 nM

10; 50; 100 nM

Das Kontrollprotein rOv33 wurde beispielhaft im Aktivitätstest mit Papain in einer Konzentration von 50, 100 und 200 nM getestet.

6.2.3.4 Fluoreszein-Markierung von rOv17, trOv17 und rOv33

Die Markierung der rekombinanten Parasitenproteine rOv17, trOv17 und rOv33 wurde mit einem Fluoreszein Labeling Kit durchgeführt. Die Markierung der Proteine erfolgte entsprechend der Durchführungsvorschriften des Herstellers. Der molare Reaktionsansatz wurde so gewählt, daß 1 Molekül Protein mit 5 Molekülen Fluos umgesetzt wurde.


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6.2.4 Immunologische Methoden

6.2.4.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Rekombinant, aufgereinigte Parasitenproteine, Bakterienproteingemische und OvAg-Gesamtextrakt wurden mittels SDS-PAGE unter Anwendung des diskontinuierlichen Puffer-System nach Laemmli (1970) analysiert. Beurteilt wurden die Auftrennung von Proteinen und die Reinheit von Proteinfraktionen. Zudem erfolgte eine Schätzung des Molekulargewichts und der Konzentration der aufgetrennten Proteine.

Für die Anfertigung der Acrylamidgele wurden Minigel-Apparaturen verwendet. Die Acrylamidkonzentration (12,5%, 14%, 16%) des Trenngeles wurde entsprechend des Molekulargewichts der aufzutrennenden Proteine variiert. Für das Sammelgel wurde eine 6%ige Acrylamidlösung verwendet. Die zu analysierenden Proteinfraktionen wurden mit 2x Probenpuffer versetzt und 3 min bei 95°C erhitzt. Nach Beladung des Polyacrylamidgels wurden die Proben bei 120-160 V bei RT oder 4°C aufgetrennt. Zur Charakterisierung des Molekulargewichts der aufzutrennenden Proteine wurde jeweils ein Standard mit vorgefärbten Proteinen definierter Größe im SDS-PAGE mitgeführt. Nach erfolgter Elektrophorese wurden die aufgetrennten Fraktionen im Coomassie-Bad angefärbt und anschließend entfärbt und getrocknet. Für eine weitere immunologische Charakterisierung wurden die aufgetrennten Fraktionen elektrophoretisch auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert (Towbin et al. 1979).

6.2.4.2 Western Blot

Für den Nachweis von Proteinen durch spezifische Antikörper wurden die im SDS-PAGE aufgetrennten Proteine bei 400 mA für 3 h oder über Nacht bei 80 mA elektrophoretisch auf eine Nitrozellulosemembran (NZ-Membran) transferiert. Die NZ-Membran wurde anschließend in 3% BSA/TBS für 15 min bei RT inkubiert, um die freien Bindungsstellen der NZ-Membran zu blockieren. Nach 3x Waschem mit TBS wurde die NZ-Membran mit dem ersten Antikörper für 1,5 h bei RT unter Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurden nichtgebundene Antikörper durch 3x Waschen mit TBS entfernt. Die NZ-Membran wurde


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anschließend für weitere 1,5 h bei RT mit dem zweiten, Peroxidase-konjugierten Antikörper inkubiert. Anschließend wurde nach 3x Waschen der NZ-Membran mit TBS die Farbreaktion durch Zugabe des entsprechenden Substrates induziert. Durch Waschen der NZ-Membran in TBS wurde die Farbreaktion gestoppt. Die NZ-Membran wurde anschließend getrocknet.

rOv17:

1. Antikörper:

anti-rOv17 Kaninchenserum, 1:500 in BSA/TBS verdünnt

2. Antikörper:

Peroxidase-konjugierter Ziege anti-Kaninchen Ak, 1:10000 in 3% BSA/TBS verdünnt

rOv33:

1. Antikörper:

anti-rOv33 monoklonaler Maus-Antikörper, IVA7, unverdünnt

2. Antikörper:

Peroxidase-konjugierter Ziege anti-Maus Ak, 1:10000 in 3% BSA/TBS verdünnt

6.2.4.3 Immunisierung von BALB/c Mäusen

Für die Immunisierung der Mäuse wurde das Adjuvans STP, welches sowohl die humorale als auch die zellvermittelte Immunantwort anregt, eingesetzt. Jeweils 6 männliche BALB/c Mäuse (ca. 7 Wochen alt) wurden 3x im Abstand von 12 Tagen mit jeweils 25 µg OvAg in STP immunisiert. Die Mäuse wurden mit dem Narkotikum Metoxyfluran betäubt. Pro Impfdosis wurden 25 µg/250 µl PBS mit 250 µl STP gemischt und subkutan appliziert. 14 Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse getötet und die Milzzellen für einen antigenspezifischen Proliferationstest präpariert.

6.2.4.4 ELISA

6.2.4.4.1 Zytokin-ELISA

Für die Zytokinbestimmung wurde der 6 h, 24 h und 48 h Kulturüberstand von unstimulierten oder polyklonal-stimulierten PBMC gewonnen. In den Überständen wurde die Konzentration von IL-2, IL-4, IL-10, IL-12p40, TNF-alpha, TGF-beta und IFN-gamma bestimmt. Verwendet wurden kommerzielle ELISA-Sets. Die ELISA wurden entsprechend der Vorgaben des Herstellers


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durchgeführt. Für die Bestimmung von IL-2 und IL-12p40 wurden die Kulturüberstände 1:2, für IL-10 1:5 und für die Messung von TGF-beta und IFN-gamma 1:10 verdünnt. Für die Bestimmung von IL-4 wurden unverdünnte Kulturüberstände eingesetzt. Die Überstände aus den Neutralisationsversuchen mit anti-IL-10 Ak wurden für die Bestimmung von IL-10 1:5, für die Bestimmung von IL-12p40 1:10 und für die Messung von IFNgamma 1:20 verdünnt.

6.2.4.4.2 ELISA zur Quantifizierung der Onchocystatin Ausscheidung durch O. volvulus Weibchen

Für die Bestimmung der Onchocystatin Ausscheidung wurden 24 h Kulturüberstände von 5 verschiedenen O. volvulus Weibchen verwendet. Hierfür wurden ELISA-Platten mit 50 µl Kulturüberstand plus 25 µl Beschichtungspuffer und mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17 beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach 3x Waschen mit PBS/0,025% Tween-20 erfolgte eine 30 minütige Inkubation mit Blockierungspuffer (3% BSA/TBS) bei 37°C. Nach einem erneuten Waschschritt wurde gebundenes Antigen mit einer 1:5000 Verdünnung des rOv17 Kaninchenserums in einem Volumen von 50 µl für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach 3x Waschen wurde ein Peroxidase-konjugierter Ziege-anti-Kaninchen Antikörper in einer Verdünnung von 1:1000 eingesetzt (50 µl), um gebundene rOv17 Ak zu quantifizieren. Nach erneutem Waschen wurden 50 µl der entsprechenden Enzym-Substrat-Lösung zugegeben. Die Farbreaktion wurde nach 1 min mit 1 M H2SO4 gestoppt und die Extinktion bei 450 nm im ELISA-Meßgerät bestimmt. Als Kontrolle wurde ein Kaninchen-anti-Eimerien Hyperimmunserum (1:5000 verdünnt) getestet.

6.2.4.5 FACS-Analyse zur Bestimmung der Zielzelle(n) von rOv17

Humanes Blut wurde mit RPMI 1:1 verdünnt und 300 µl dieser Verdünnung mit 0,5 µM Fluos-markiertem rOv17, trOv17 und rOv33 in einem 2 ml-Reaktionsgefäß für 2 h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden 100 µl Inkubationsansatz für eine CD14-Markierung ohne Quenching und 100 µl für eine CD14-Markierung mit Quenching in je ein Serum-Röhrchen überführt. Die Proben für eine CD14-Markierung ohne Quenching wurden 20 min mit 5 µl PE-Cy5-makierten CD14-Antikörpern bei 4°C inkubiert.


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Anschließend wurden die Erythrozyten durch Zugabe von 1 ml einer Erylyse-Lösung bei RT für 15 min lysiert. Die Zellen wurden anschließend zentrifugiert (4°C/5 min/1000 rpm) und nach einem Waschschritt mit 1 ml FACS-Puffer im Durchflußzytometer analysiert. Die Proben, die gequencht und CD14 markiert werden sollten, wurden zunächst mit 50 µl Quenching-Reagenz versetzt und anschließend sofort 3x mit 1ml FACS-Puffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen resuspendiert und mit 5 µl PE-Cy5-markiertem CD14-Antikörper für 20 min bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend wie bereits beschrieben für die durchflußzytometrische Analyse aufbereitet.

6.2.4.6 Bestimmung der Expression von HLA-DR, CD40, CD80 und CD86 auf humanen Monozyten in Anwesenheit von rOv17 und trOv17

Humane PBMC (8x105) wurden für 72 h mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 bei 37°C inkubiert. Für die anschließende FACS-Analyse der HLA-DR-, CD80-, CD86- und CD40-Expression humaner Monozyten wurde eine Doppelfluoreszenzmarkierung durchgeführt. Monozyten wurden durch eine CD14-Markierung unter Verwendung von PE-Cy5-konjugierten anti-CD14 Ak identifiziert. Für die Markierung von HLA-DR, CD80, CD86 und CD40 wurden PE-konjugierte anti-HLA-DR Ak, FITC-konjugierte anti-CD80 Ak, PE-konjugierte anti-CD86 Ak und FITC-konjugierte anti-CD40 Ak verwendet. Als Kontrollen wurde FITC-konjugiertes IgG1 und PE-konjugiertes IgG2a eingesetzt.

Nach Ablauf der Inkubation der PBMC mit rOv17, trOv17 und rOv33 wurden die Zellen vorsichtig resuspendiert und zu je 2x108 in Serum-Röhrchen überführt. Nach dem Waschen der PBMC mit 1 ml FACS-Puffer (5 min/1000 rpm/4°C) wurden die Zellen zur Markierung der Oberflächenmoleküle für 20 min bei 4°C mit den entsprechenden Ak inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde die Expression der Oberflächenmoleküle im Durchflußzytometer analysiert.


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6.2.4.7 Präparation von Mausmilzzellen

Die Mäuse wurden durch CO2-Inhalation getötet und in ein 70%iges Ethanolbad getaucht. Die Milz wurde steril entnommen und durch ein engmaschiges Sieb mit Hilfe eines Stempels passiert. Die Milzzellsuspension wurde durch auf- und abpipettieren homogenisiert und nachfolgend in ein 50 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die Milzzellsuspension wurde mit kaltem RPMI auf 40 ml aufgefüllt und 10 min auf Eis inkubiert, um Zellklumpen und grobe Bindegewebsteile sedimentieren zu lassen. Der Überstand wurde anschließend in ein neues 50 ml-Reaktionsgefäß pipettiert und bei 4°C und 1100 rpm für 10 min zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde das Milzzellpellet aufgeschüttelt und 10 min in 11 ml Erylyse-Lösung auf Eis inkubiert. Nach der anschließenden Zentrifugation wurden die Milzzellen 2x mit RPMI gewaschen und in 3 ml RPMI komplett aufgenommen. Die Zellzahl wurde in einer 1:100 Verdünnung mit Trypanblau in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.

6.2.4.8 Präparation von humanen PBMC

Die Präparation von humanen PBMC wurde mittels einer Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation durchgeführt. Pro Spender wurden 30 ml Blut zur Aufreinigung von PBMC verwendet. Das Blut wurde mit PBS 1:1 verdünnt. In einem 15 ml-Reaktionsgefäß wurden 3 ml Ficoll mit 10 ml verdünntem Blut überschichtet. In einem 50 ml-Reaktionsgefäß wurden 12 ml Ficoll mit 40 verdünntem ml Blut überschichtet. Nach einer Zentrifugation bei 18°C und 1200 rpm für 40 min (ohne Bremse) wurde die PBMC-Fraktion in ein 50 ml-Reaktionsgefäß überführt und 3x mit 30 ml RPMI gewaschen (18°C/1200 rpm/10 min). Anschließend wurden die PBMC in 10 ml RPMI komplett aufgenommen und die Zellzahl in einer 1:100 Verdünnung mit Trypanblau in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.

6.2.4.9 Depletion von CD14+-Zellen

CD14+-Zellen wurden aus aufgereinigten PBMC depletiert. Für die Depletion wurden CD14 MicroBeads verwendet. Nach der Aufreinigung der PBMC wurden alle Manipulationen der PBMC auf Eis oder bei 4°C durchgeführt.


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PBMC, die aus der Aufreinigung von 30 ml Blut gewonnen wurden (3-6x107 Zellen), wurden mit 40 ml PBS/1% BSA gewaschen und anschließend in 800 µl PBS/1% BSA resuspendiert. Die PBMC wurden anschließend für die Blockade von Fc-Rezeptoren mit 3 mg/ml Beriglobin und mit CD14 MicroBeads im Verhältnis 1:5 (200 µl) für 20 min bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 14 ml PBS/1%BSA gewaschen (4°C/1200 rpm/ 10 min) und anschließend in 1 ml PBS/1%BSA resuspendiert. Für die Depletion von CD14+-Zellen wurden VS+-Säulen verwendet. Die weitere Durchführung der Depletion erfolgte entsprechend der Protokollvorgaben des Herstellers.

Die Effektivität der CD14+-Depletion wurde durch eine CD14-Markierung der einzelnen Zellfraktionen mit FITC-konjugierten anti-CD14-Ak und anschließender FACS-Analyse überprüft. Hierfür wurden jeweils 50 µl der Zellfraktionen mit 1 ml PBS/1%BSA gewaschen (4°C/2000 rpm/10 min), in 100 µl PBS/1% BSA resuspendiert und mit FITC-konjugierten anti-CD14-Ak (1:50 verdünnt) für 10 min bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen der markierten Zellen mit 1 ml PBS/1%BSA wurden die Zellen im Durchflußzytometer analysiert. Die CD14+-negative Zellfraktion wurden auf 97-99% angereichert. Die CD14+-depletierte Zellfraktion wurden anschließend mit 40 ml RPMI gewaschen und in 10 ml RPMI komplett aufgenommen. Die Zellen wurden in einer 6-well Kulturplatte verteilt und bei 37°C für 1 h inkubiert. Noch vorhandene Monozyten wurden so durch Adhärenz aus der Zellfraktion entfernt. Das Adhärenzverfahren wurde nochmals wiederholt und die nichtadhärenten Zellen anschließend mit RPMI komplett über Nacht bei 37°C inkubiert. Die CD14+-depletierten Zellen wurden geerntet, zentrifugiert (RT/1200 rpm/10 min) und in RPMI komplett aufgenommen.

6.2.4.10 PHA-Stimulation von humanen PBMC

Humane PBMC wurden in einer Konzentration von 3,5x105 Zellen pro well in eine 96-well Flachbodenplatte ausplattiert und mit 10 µg/ml PHA stimuliert. Zu den stimulierten PBMC wurden verschiedene Konzentrationen von rOv17 (0,1 µM, 0,25 µM, 0,5 µM) und dem Kontrollprotein, rOv33 zugegeben. Für Neutralisationsstudien wurde zu den Ansätzen 1µl anti-rOv17 Kaninchenserum zugegeben. Das Endvolumen der Proliferationstests betrug 200 µl. Die Zellen wurden bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und einem CO2 Gehalt von 5% für 72


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h inkubiert. Für die Bestimmung der Proliferation der PBMC wurden in den letzten 20 h der Inkubation pro Well 1 µCi 3H-Thymidin zugegeben.

6.2.4.11 Anti-CD3 Ak-Stimulation von humanen PBMC

Humane PBMC (3,5 x 105/well) wurden mit löslichen oder immobilisierten anti-CD3 Ak stimuliert. Für die Stimulation mit löslichen anti-CD3 Ak wurden diese in einer Konzentration von 10 ng/ml eingesetzt. Für die Immobilisation von anti-CD3 Ak wurden 50 µl einer 100 µg/ml konzentrierten anti-CD3 Ak Stammlösung pro well einer 96-well Flachbodenplatte pipettiert. und 2 h bei 37°C inkubiert. Nicht gebundene Antikörper wurden durch 2x Waschen mit 100 µl PBS entfernt. Die anti-CD3 Ak stimulierte Proliferation wurde in Anwesenheit von 0,5 µM rOv17, trOv17, rOv33 und 200 pg/ml LPS untersucht. Für Neutralisationsstudien wurden 5 µg/ml anti-IL-10 Ak oder 5 µg/ml eines Maus-IgG1 Kontroll-Ak eingesetzt. Das Endvolumen der Proliferationstests betrug 200 µl. Die Zellen wurden bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und einem CO2 Gehalt von 5% für 72 inkubiert. Zur Quantifizierung der Proliferation wurden die Zellen 20 h vor Ablauf der Inkubationszeit mit 1 µCi 3H-Thymidin inkubiert. Alle Ansätze wurden in Dreieransätzen durchgeführt und alle Versuche mindestens einmal wiederholt.

6.2.4.12 Antigenspezifische Stimulation von humanen PBMC

Humane PBMC wurden in einer Konzentration von 3,5x105 Zellen pro well in eine 96-well Flachbodenplatte ausplattiert, mit 10 IE/ml PPD stimuliert und der Einfluß von 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 auf die Proliferation untersucht. Die Zellen wurden bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und einem CO2 Gehalt von 5% für 96 h inkubiert. Zur Quantifizierung der Proliferation wurden die Zellen 20 h vor Ablauf der Inkubationszeit mit 1 µCi 3H-Thymidin inkubiert. Alle Ansätze wurden in Dreieransätzen durchgeführt.


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6.2.4.13 Stimulation von CD14+-depletierten, humanen PBMC mit anti-CD3 Ak / anti-CD28 Ak und PHA

Die CD14+-depletierten PBMC wurden in einer Konzentration von 2x105 Zellen pro well in eine 96-well Flachbodenplatte ausplattiert und mit 2 µg/ml anti-CD3/2,5 µg/ml anti-CD28 Ak oder mit 10 µg/ml PHA stimuliert. Zu den stimulierten PBMC wurden 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 zugegeben. Das Endvolumen der Proliferationstests betrug 200 µl. Die Zellen wurden bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und einem CO2 Gehalt von 5% für 72 inkubiert. Zur Quantifizierung der Proliferation wurden die Zellen 20 h vor Ablauf der Inkubationszeit mit 1 µCi 3H-Thymidin inkubiert. Alle Ansätze wurden in Dreieransätzen durchgeführt und alle Versuche mindestens einmal wiederholt.

6.2.4.14 Antigenspezifische Stimulation von Mausmilzzellen

Die Milzzellen (3,5x105/well) von OvAg-immunisierten Mäusen wurden mit 10 µg/ml OvAg stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 oder rOv33 für 96 h bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und einem CO2-Gehalt von 5% inkubiert. Nach einer Inkubation von 76h wurden die Zellen mit je 1 µCi 3H-Thymidin versetzt und weitere 20 h inkubiert.

6.2.4.15 Gewinnung von Zellkulturüberständen

Zellkulturüberstände wurden nach 6 h, 24 h und 48 h von unstimulierten oder polyklonal stimulierten humanen PBMC geerntet und bei -80°C gelagert.

6.2.4.16 Ernten 3H-Thymidin markierter Zellen und Szintillationsmessung

Die Proliferation der Zellen wurden durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA sich teilender Zellen quantifiziert. Hierfür wurden die Zellen in den letzten 20 h der Inkubation mit 1 µCi 3H-Thymidin inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die radioaktiv markierten Zellen mit Hilfe eines Zellerntes auf Glasfaserfilter überführt. Die Filter wurden 1


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h bei 50°C getrocknet. Anschließend wurde auf einer Heizplatte bei 100°C eine Szintillatiosmembran auf die Glasfaserfilter aufgeschmolzen. Nach Erstarren der Szintillationsmembran wurde die Radioaktivität des inkorporierten 3H-Thymidins in einem Beta-Counter mit einer Zählzeit von 1 min gemessen. Die Proliferation wurde als Funktion der Radioaktivität in cpm dargestellt.

6.2.4.17 LPS-Konzentrationsbestimmung

Die LPS-Konzentration der rekombinanten Proteine wurde mit einem kommerziellen Testkit (Quantitativer Chromogener LAL-Test) bestimmt. Die Proteinfraktionen wurden in einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt. Die Durchführung erfolgte entsprechend der Vorgaben des Herstellers.

6.2.5 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Daten wurde am Institut für Informatik der Humboldt-Universität zu Berlin unter Verwendung des Student-T-Tests oder des Wilcoxon-Rank-Tests durchgeführt.


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Fri Jun 8 15:42:14 2001