93

Kapitel 6. Material und Methoden

6.1 Material

6.1.1 Laborgeräte

Beta-counter	Wallac, Finnland
ELISA-Reader MRX	Dynatech, Denkendorf
ELISA-Waschgerät	Dynatech, Denkendorf
Lumineszenz Spektrophotometer	Perkin Elmer, Langen
Fluoroscan II	Labsystems, Frankfurt
Fluoreszenzphotometer SFM 25	BIO-TEK, Neufahrn
Invers-Mikroskop	Leica, Wetzlar
Kühlzentrifuge 5415 C	Eppendorf, Hamburg
Kühlzentrifuge 5810 R	Eppendorf, Hamburg
Magnetrührer	IKA Labortechnik, Staufen
Mikroskop	Zeiss, Oberkochen
Neubauer-Zählkammer	Migge, Heidelberg
Peristaltische Pumpe	BIORAD, München
pH-Meter 526	WTW, Weilheim
Präzisionspipetten	Eppendorf, Hamburg
Schüttelinkubator	New Brunswick, Nürtingen
Spektralphothometer Hitachi U 2000	Colora Meßtechnik, Lorch
Thermocycler	Eppendorf, Hamburg
Thermocycler PCR System 9700	Perkin Elmer, Langen
Tischzentrifuge 5415 C	Eppendorf, Hamburg
Ultraschallgerät HD 200	Heinemann, Schw. Gmünd
Video-Dokumentationsgerät E.A.S.Y.RH	Herolab, Wiesloch
Wasserbad DC3	Haake, Karlsruhe
Zell-Ernter	Wallac, Finnland

6.1.2 Verbrauchsmaterialien

Dialyse-Schläuche	Serva, Heidelberg
Einwegkanülen	Braun, Melsungen
Einwegpasteurpipetten	Greiner, Nürtingen
Einwegspritzen	Braun, Melsungen
ELISA-Platten (Maxisorp)	Nunc, Wiesbaden
Gel-Blotting-Papier	Schleicher & Schuell, Dassel
Nitrozellulosemembran (0,2 µm)	Pharmacia, Freiburg
Petrischalen	Greiner, Nürtingen
Pipettenspitzen	Greiner, Nürtingen
Polypropylen-Röhrchen (12, 14, 50 ml)	Greiner, Nürtingen
Reaktionsgefäße (1,5 und 2,0 ml)	Greiner, Nürtingen
Reaktionsgefäße (0,2 und 0,5 ml)	Biozym, Oldendorf
Sterilfilter (0,2 - 0,45 µm)	Schleicher & Schuell, Dassel
VS+ Säulen	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Zellkulturplatten	Costar, Bodenheim

94

6.1.3 Reagenzien

3H-Thymidin	ICN, Eschwege
Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung	Roth, Karlsruhe
Agarose	Serva, Heidelberg
Antibiotika	AppliChem, Darmstadt
Anti-CD3 Ak (Orthoclone-Okt3)	Janssen-Cilag, Neuss
Agar	AppliChem, Darmstadt
Beriglobin (OBAE 30)	Centeon,
Brij 35	Sigma, Deisenhofen
BSA	AppliChem, Darmstadt
Chemikalien	Roth, Karlsruhe
DNA-Marker BioSizer II/V	AGS, Heidelberg
dNTP	Roth, Karlsruhe
E 64d	Bachem, Heidelberg
EDTA	Roth, Karlsruhe
EGTA	Roth, Karlsruhe
Eiweißcystatin	Sigma, Deisenhofen
Ethidiumbromid	Roth, Karlsruhe
FCS	Biochrom KG, Berlin
Ficoll Paque	Pharmacia, Freiburg
Fluoreszenzsubstrate	Bachem, Heidelberg
Glasfaserfilter	Wallac, Finnland
Hefeextrakt	AppliChem, Darmstadt
L-Glutamin	Gibco BRL, Karlsruhe
LPS (E. coli 0127 B8)	Sigma, Deisenhofen
b-Mercaptoethanol	Roth, Karlsruhe
Metofane (Metoxyfluran)	Janssen-Cilag, Neuss
Milchpulver	Fluka, Deisenhofen
MW-Standard (mid range)	Promega, Mannheim
MW-Standard vorgefärbt	Sigma, Deisenhofen
Ni-NTA-Agarose	Quiagen, Hilden
Oligonukleotide (Primer)	Roth, Karlsruhe
Oligonukleotide (Primer)	TIBMOL BIOL, Berli
Organische Lösungsmittel	Merck, Darmstadt
Penicillin-Streptomycin-Stammlösung	Gibco BRL, Karlruhe
PHA	Pharmacia, Freiburg
Protein-Marker	Pharmacia, Freiburg
Quenching Reagenz	OPREGEN Pharma, Heidelberg
RPMI 1640	Gibco BRL, Karlsruhe
RPMI (VLE) 1640	Biochrom KG, Berlin
Squalan	Fluka, Deisenhofen
Synperonic L101	Serva, Heidelberg
Szintillationsmembran	Wallac, Finnland
TMB-Substrat	Sigma, Deisenhofen
Triton X-100	Serva, Heidelberg
Trypanblau	Sigma, Deisenhofen
Trypton	AppliChem, Darmstadt
Tween	Serva, Heidelberg

6.1.4 Enzyme

DNase, RNase	Boehringer Mannheim, Mannheim
T4 DNA-Ligase	New England Biolab, USA
DNA-Restriktionsenzyme	AGS, Heidelberg
Taq-Polymerase	Gibco BRL, Karlsruhe
Lysozym	Sigma, Deisenhofen
Papain	Sigma, Deisenhofen

95

Humanes Cathepsin L	CALBIOCHEM, Bad Soden
Humanes Cathepsin B	Sigma, Deisenhofen
Humanes Cathepsin S	Prof. Wiederanders, Institut für Biochemie Universitätsklinik Jena

6.1.5 Kommerzielle Kits

Gel-Extraktionskit QUIAEXII	Quiagen, Hilden
Plasmid-Mini-Kit	Quiagen, Hilden
Plasmid-Midi-Kit	Quiagen, Hilden
Duoset (IFN-, TGF-)	R & D System, Wiesbaden-Nordenstadt
IL-10-Kit	R & D System, Wiesbaden-Nordenstadt
OptEIATM (IL-10, IL-l2, IL-12p40, IFN-, TNF-, TGF-)	Pharmingen, Hamburg
BCA-Test	-Pierce, USA
pGEM T-Easy	Promega, Mannheim
Quantitativer Chromogener LAL-Test	BioWhittaker, Verviers, Belgien

6.1.6 Primer

Ov17
forward (Ov17 Start):	5' -GTTCAGTTGCAAGGAGCC- 3'-
reverse (Ov17 Ende)	5' -TCATACTTCTTTTGTTCCC- 3'-
Ov33
forward (33 f 5`)	5' -CCATGGAGCTCGGTGTAGTAAAAAGGTACAATAAACGT-	3'
reverse (33 f 3`)	5' -CACCCGTCGACCATAGATTGCGACGCAGAAATG-	3'

6.1.7 Agarosegel-Elektrophorese-Puffer

10x TBE	1M	Tris-HCl
	1M	Borsäure
	20 mM	EDTA (pH 8,0)
10x TAE	400 mM	Tris-Ac
	10 mM	EDTA (pH 8,0)
	1,14%	Eisessig
TE-Puffer	10 mM	Tris-HCl
	10 mM	EDTA (pH 8,0)
6x Probenpuffer	0,25%	Bromphenolblau
	0,25%	Xylen-Cyanol FF
	30%	Glycerol
	in H2O
EtBr-Lösung	10 mg/ml in H2O

6.1.8 Puffer für Kleine Plasmidpräparation

Lysispuffer	10 mM 1 mM 100 mM 0,5% 0,5 mg/ml	Tris EDTA NaOH SDS RNase (frisch zusetzen)
Kaliumazetat/Essigsäure	3 M	Kaliumazetat, pH 6,0

96

6.1.9 Plasmide, cDNA und E. coli-Stämme

E. coli Stämme
DH5	Stratagen, Heidelberg
XL-1 Blue	Stratagen, Heidelberg
BL21 (DE3)	Novabiochem, Bad Soden
BL21 (DE3) pLys S	Novabiochem, Bad Soden
Plasmide
pBlueskript (SK+)	Stratagen, Heidelberg
pET 28	Novabiochem, Bad Soden
Ov33-pGEX	Thomas Pogonka, HU-Berlin
cDNA
L3 cDNA-Bank	Dr. St. A. Williams, Northampton

6.1.10 Bakterien-Kulturmedien

LB-Medium	10 g	NaCl
	10 g	Trypton
	5 g	Hefeextrakt
	ad 1l mit H2O, pH 7,5
	autoklavieren
LB-Platten	LB-Medium
	1,5 % Agar
	autoklavieren
SOB-Medium	20 g	Trypton
	5g	Hefeextrakt
	0,5 g	NaCl
	10 ml	KCl (250 mM)
	ad 995 ml H2O
	pH 7,0
	autoklavieren
	5 ml sterile 2 mM MgCl2
SOC-Medium	SOB-Medium
	10 mM sterilfiltrierte Glukose
TB-Puffer	10 mM	PIPES
	15 mM	CaCl2
	250 mM	KCl
	pH 6,7	(mit KOH einstellen)
	55 mM	MgCl2
	sterilfiltrieren
X-Gal-Stammlösung	20 mg/ml in Dimethyl-Formamid
IPTG-Stammlösung	1 M in H2O

6.1.11 Antibiotika

Ampicillin	50 mg/ml in H2O
Kanamycin	10 mg/ml in H2O
Chloramphenikol	34 mg/ml in Ethanol

97

6.1.12 Puffer für Löslichkeitstest

1) PBS / 0,1% Triton	PBS mit 0,5 M NaCl
	0,1% Triton X-100
	pH 8,0
2) Imidazol-Puffer	5 mM	Imidazol
	0,5 M	NaCl
	20mM	Tris-HCl
	pH 7,9
3) Harnstoff-Puffer	6 M	Harnstoff
	100 mM	NaH2PO4
	10 mM	Tris-HCL
	pH 8.0

6.1.13 Puffer für die affinitätschromatographische Aufreinigung von rOv17, trOv17 und rOv33

Denaturierende Aufreinigung

Puffer A: (Bindungspuffer)	6 M	Guanidinium-HCl
	100 mM	NaH2PO4
	10 mM	Tris-HCL
	pH 8.0
Puffer B: (Waschpuffer)	6 M	Harnstoff
	100 mM	NaH2PO4
	10 mM	Tris-HCL
	pH 8.0
Puffer C: (Waschpuffer)		Puffer B
		pH 6,3
Puffer D: (Waschpuffer)		Puffer B
		pH 5,9
Puffer E: (Elutionspuffer)		Puffer B
		pH 4,5

Native Aufreinigung

A) Imidazolaufreinigung

Bindungspuffer	5 mM	Imidazol
	0,5 M	NaCl
	20mM	Tris-HCl
	pH 7,9
Waschpuffer	60 mM	Imidazol
	0,5 M	NaCl
	20 mM	Tris-HCl
	pH 7,9
Elutionspuffer	1 M	Imidazol
	0,5 M	NaCl
	20 mM	Tris-HCl
	pH 7,9

98

Bindungspuffer	PBS mit 0,5 M NaCl
	0,1% Triton X-100
	pH 8,0
Waschpuffer	PBS mit 0,5 M NaCl
	0,01% Triton X-100
	pH 5,0
Elutionspuffer	PBS mit 0,5 M NaCl
	0,01% Triton X-100
	pH 4,5

6.1.14 SDS-PAGE-Pufferlösungen

Acrylamid-Stammlösung (30%)	29,2 g	Acrylamid
	0,8 g	Bisacrylamid
	ad 100 ml H2O

Acrylamidgel-Gebrauchslösung

	4%	14%	16%
Acrylamid (30%)	2,7 ml	9,4 ml	10,7 ml
H2O	12 ml	5,4 ml	4 ml
0,5 M Tris (pH 6,8)	5 ml	-	-
1,5 M Tris (pH 8,8)	-	5 ml	5 ml
SDS (10%)	200 µl	200 µl	200 µl
Temed	40 µl	10 µl	10 µl
10% APS	auf 1% frisch zusetzen	auf 1% frisch zusetzen	auf 1% frisch zusetzen

APS	10% in H2O
2x SDS-Probenpuffer	20%	Glycerin
	4%	SDS
	1,5%	Bromphenolblau
	125 mM	Tris-HCl, pH 6,8
	10%	b-Mercaptoethanol
	2 mM	PMSF
Laemmli-Laufpuffer	25 mM	Tris
	192 mM	Glycin
	0,1%	SDS
Färbelösung	20%	Ethanol
	10%	Essigsäure
	0,1%	Coomassie Blau R-250
	in H20
Entfärber	20%	Ethanol
	10%	Essigsäure
	in H20

99

6.1.15 Puffer für Transfer und Western-Blot

Transferpuffer	50 mM	Tris
	380 mM	Glycin
	0,1%	SDS
	20%	Methanol
10x TBS	1 M	NaCl
	50 mM	Tris
	pH 7,4
Ponceau-Färbelösung	2%	Ponceau
	30%	Trichloressigsäure
	30%	Sulfobenzoesäure
BSA/TBS	3% BSA in TBS
Peroxidase-Substratlösung	10 ml	TBS
	600 µl aus 0,3% Chlornaphtol
	5 µl aus 30% H2O2

6.1.16 Puffer für ELISA

Beschichtungspuffer	0,2 M	Carbonatpuffer, pH 9,0
Blockierungspuffer		3% BSA in PBS
Waschpuffer	PBS / 0,025% Tween 20
TMB-Substratlösung	1 mg TMB in 100 µl DMSO
	9,9 ml 100 mM Na-Azetat
	1 µl 30% H2O2
Stoplösung	1 M H2SO4

6.1.17 Antikörper und Konjugate

rOv17 Kaninchenserum	Charles River, Kisslegg
monoklonaler Maus-anti-rOv33 IgG1-Ak (IVA7)	R. Lucius, HU-Berlin
Ziege-anti-Maus IgG+IgM (H+L) Pox-konjugiert	Dianova, Hamburg
Ziege-anti-Kaninchen IgG+IgM (H+L) Pox-konjugiert	Dianova, Hamburg
monoklonaler Maus anti-humane-IL-10 Ak (IgG1)	Robert Sabat, Charité-Berlin
Maus IgG1 Kontrollantikörper	R & D System, Wiesbaden-Nordenstadt
PE-konjugierte anti-humane HLA-DR Ak (Klon L243)	Becton Dickenson, Heidelberg
FITC-konjugierte anti-humane CD80 Ak (Klon BB1)	Pharmingen, Hamburg
PE-konjugierte anti-humane CD86 Ak (Klon 2331)	Pharmingen, Hamburg
FITC-konjugierte anti-humane CD40 Ak (Klon 5C3)	Pharmingen, Hamburg
PE-Cy5-konjugiert anti-humane CD14 Ak (Klon RMO52)	Coulter Immunotech, Heidelberg
FITC-konjugierte anti-humane CD14 Ak (UCHM-1)	Dianova, Hamburg
FITC-konjugierte Maus IgG1 Ak (Klon 679.1Mc7)	Coulter Immunotech, Heidelberg
PE-konjugierte Maus IgG2a Ak (Klon X39)	Becton Dickenson, Heidelberg
anti-humane CD3 Ak (Orthoclone-Okt3)	Janssen-Cilag, Neuss
anti-humane CD28 Ak (Klon CD28.2)	Pharmingen, Hamburg

100

6.1.18 Puffer und Lösungen für kinetische Messungen mit rOv17 und trOv17

Probenpuffer

Papain-Probenpuffer	200 mM	K2HPO4
	200 mM	KH2PO4
	4 mM	EDTA
	4 mM	DTT (frisch zusetzen)
	0,01%	Brij 35
	pH 6,8
Cathepsin S-Probenpuffer	13 mM	K2HPO4
	87 mM	KH2PO4
	5 mM	EDTA
	5 mM	DTT (frisch zusetzen)
	0,01%	Brij 35
	pH 6,0
Cathepsin L-Probenpuffer	340 mM	Na-Azetat
	60 mM	Essigsäure
	4 mM	EDTA
	8 mM	DTT (frisch zusetzen)
	0,01%	Brij 35
	pH 5,5
Cathepsin B-Probenpuffer	352 mM	KH2PO4
	48 mM	Na2HPO4
	4 mM	EDTA
	8 mM	DTT
	0,01%	Brij 35
	pH 6,0

Cysteinproteasen-Stammlösung (EwC-titrierte Konzentration)

Cathepsin B	0,12 µM (E64-titriert)
Cathepsin L	0,85 µM
Cathepsin S	0,67 µM
Papain	1,5 µM

Cysteinproteasen-Arbeitslösung für Ki-Wert Bestimmung (EwC-titrierte Konzentration)

Cathepsin B	117 nM (E64-titriert)
Cathepsin L	11,3 nM
Cathepsin S	9,0 nM
Papain	10,0 nM

Substrat-Stammlösungen

Z-Val-Val-Arg-AMC (Cathepsin S)	10 mM in DMSO
Z-Phe-Arg-AMC (Cathepsin L)	10 mM in DMSO
Z-Arg-Arg-AMC (Cathepsin B)	10 mM in DMSO
Z-Phe-Arg-AMC (Papain)	10 mM in DMSO

Substrat-Arbeitslösungen für Ki-Wert Bestimmung

Z-Val-Val-Arg-AMC (Cathepsin S)	40 µM in Probenpuffer
Z-Phe-Arg-AMC (Cathepsin L)	5 µM in Probenpuffer
Z-Arg-Arg-AMC (Cathepsin B)	40 µM in Probenpuffer
Z-Phe-Arg-AMC (Papain)	25 µM in Probenpuffe

101

6.1.19 Zellkultur-Medien

1x PBS	136,9	mM NaCl
	2,7	mM KCl
	8,1 mM	Na2HPO4
	1,5 mM	KH2PO4
	pH 7,4
RPMI komplett	RPMI 1640
	2 mM L-Glutamin
	100 U/ml Penicillin
	100 µg/ml /Streptomycin
	5-10% hitzeinaktiviertes FCS
PHA-Arbeitslösung	200 µg/ml
anti-CD3 Ak-Arbeitslösung	200 ng/ml
3H-Thymidin- Arbeitslösung	50 µCi/ml
Trypanblau-Lösung	160 mg in 100 ml PBS
Erythrozytenlyse-Lösung	90 ml aus 160 mM NH4Cl
	10 ml 170 mM Tris
	pH 7,6

6.1.20 Adjuvans

2x STP	PBS
	10%	Squalane
	0,4%	Tween 80
	1,0%	Synperonic L 101

6.1.21 Puffer für Durchflußzytometrie

FACS-Puffer	0,1%	NaN3
	2%	FCS in PBS

6.1.22 Tiermaterial

BALB/c Mäuse

H-2d Haplotyp

BGVV, Berlin

102

6.2 Methoden

6.2.1 Gewinnung von Parasitenmaterial

6.2.1.1 Herstellung von O. volvulus-Antigenextrakt

5 tiefgefrorene, adulte O. volvulus Weibchen wurden bei RT aufgetaut, mit PBS gewaschen und in 1-2 ml PBS mit einer Schere in einem Blockschälchen fein zerkleinert und anschließend mit Hilfe eines Glashomogenisators homogenisiert. Das Wurmhomogenat wurde in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und auf Eis mit 60 W für 3 min beschallt. Die lösliche Proteinfraktion wurde anschließend durch Zentrifugation für 30 min bei 4°C und 15 000 rpm von der unlöslichen Proteinfraktion getrennt. Der Überstand (OvAg) wurde abpipettiert, aliquotiert und bei -80°C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde mittels BCA-Test (Pkt. 6.2.3.1 ) bestimmt.

6.2.1.2 Gewinnung von Kulturüberstand weiblicher O. volvulus Würmer

Die Kulturüberstände von O. volvulus Weibchen für die Quantifizierung der Ov17-Ausscheidung wurden uns freundlicherweise von Dr. Norbert (Bernhard-Nocht Institut, Hamburg) zur Verfügung gestellt. Nach der Isolierung aus bindegewebigen Knoten wurden unversehrte, bewegliche Weibchen einzeln in je 6 ml Kulturmedium für 8 h vorinkubiert, wobei durch stündlichen Mediumswechsel restliche Kollagenase entfernt wurde. Nur intakte, vitale Weibchen wurden für eine weitere in vitro Kultivierung ausgewählt. Die Kultivierung erfolgte in je 1 ml Kulturmedium, welches alle 24 h erneuert wurde. Die gesammelten Kulturüberstände wurden sterilfiltriert und in flüssigem Stickstoff gelagert.

103

6.2.2 Molekularbiologische Methoden

6.2.2.1 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die DNA der rekombinanten O. volvulus Proteine, rOv17 und rOv33, wurde mit Hilfe der PCR unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase amplifiziert (Saiki et al. 1988, Bej et al. 1991).

PCR-Ansatz:

Amplifikation der Ov17-DNA	Amplifikation der Ov33-DNA
2 µl 5' Primer (20 pmol/µl) 2 µl 3' Primer (20 pmol/µl) 5 µl O. volvulus L3 cDNA Bank 2 µl 2 mM dNTP Gemisch 5 µl 10x PCR Puffer mit MgCl2 1 µl Taq-Polymerase (1U/µl) ad 50 µl HPLC Wasser	2 µl 5' Primer (20 pmol/µl) 2 µl 3' Primer (20 pmol/µl) 1 µl Template DNA (0,5 µg/µl Ov33-pGEX) 2 µl 2 mM dNTP Gemisch 5 µl 10x PCR Puffer mit MgCl2 1 µl Taq-Polymerase (1U/µl) ad 50 µl HPLC Wasser

PCR-Amplifikationszyklus

Ov17

Zyklus

1: 2-34: 35:

2 min 95°C, 2 min 50°C, 4 min 72°C 1 min 95°C, 2 min 50°C, 4 min 72°C 1 min 95°C, 2 min 50°C, 4 min 72°C

Ov33

Zyklus

1: 2-29: 30:

3 min 95°C, 1 min 50°C, 1 min 72°C 1 min 95°C, 1 min 50°C, 1 min 72°C 1 min 95°C, 1 min 50°C, 11 min 72°C

104

6.2.2.2 Aufreinigung und Konzentrierung von DNA

6.2.2.2.1 Isolation von DNA-Fragmenten

a) Phenol-Chloroform Extraktion

Die Phenol-Chloroform Extraktion wurde nach der Methode von Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Die DNA-Lösung wurde mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) im Verhältnis 1:1 versetzt und 5 min bei RT und 14 000 rpm zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde anschließend im Verhältnis 1:1 mit Chloroform-Isoamylalkohol gewaschen, um verbliebene Reste an Phenol aus der DNA-Lösung zu entfernen. Die DNA wurde mittels Ethanolpräzipitation (Pkt. 6.2.2.2.3) konzentriert.

b) DNA-Isolierung aus Agarosegelen

Die Isolierung von DNA aus Agarosegelen wurde mit Hilfe des QIAEX II Gel-Extraktions-Kit durchgeführt. Das Grundprinzip dieser DNA-Aufreinigung besteht in der Auflösung der Agarose, der selektiven Bindung von Nukleinsäure an Silikatpartikel (Glasmilch) bei einem pH = 7,5 unter Hochsalzbedingungen, dem Waschen der gebundenen Nukleinsäuren mit Hochsalzpuffern und der anschließenden Elution der DNA bei pH 8,5 unter Niedrigsalzbedingungen (TE-Puffer oder H2O). Die Isolierung der DNA erfolgte entsprechend der Vorgaben des Herstellers.

6.2.2.2.2 Isolation von Plasmid-DNA

a) Plasmidaufreinigung aus E. coli mittels Quiagen-Säulen

Für die Präparation von hochreiner Plasmid-DNA aus E. coli wurden käuflich erworbene Quiagen-Säulen verwendet. Die Plasmidaufreinigung dieser Kits beruht auf der Methode der alkalischen Lyse (Birnboim und Doly 1979) mit anschließender Aufreinigung von supercoiled Plasmid-DNA durch Ionenaustausch-Chromatographie. Für die Plasmidisolation wurden Mini- und Midipräparationssäulen verwendet. Die Durchführung erfolgte entsprechend der Vorgaben des Herstellers.

105

2 ml LB-Medium wurden nach Zusatz eines entsprechenden Antibiotikums mit einer Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C und 220 rpm inkubiert. Das Bakterienpellet dieser Kultur wurde in 300 µl Lyse-Puffer resuspendiert und die Suspension nach Zugabe von 0,5 mg/ml RNase 5 min auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 150 µl einer 3 M Kaliumazetat/Essigsäure-Lösung wurde die Suspension 10 min auf Eis inkubiert und anschließend 5 min bei 14 000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und die Plasmid-DNA mittel Ethanolfällung (Pkt. 6.2.2.2.3) konzentriert. Das Plasmidpellet wurde in 25 µl TE-Puffer oder Wasser aufgenommen.

6.2.2.2.3 DNA Konzentrierung mittels Ethanolpräzipitation

DNA wurde aus einer Lösung durch Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 4,8) und mit dem 2,5 fachen Volumen an reinem Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde bei 4°C, 15 000 rpm für 10 min zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet. Die DNA wurde in TE-Puffer oder H2O gelöst.

6.2.2.3 DNA-Konzentrationsbestimmung

Die DNA-Konzentration einer Lösung wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm (Extinktionsmaximum für Nukleinsäuren) bestimmt. Verunreinigungen wurden bei einer Wellenlänge von 280 nm (Extinktionsmaximum für Proteine) gemessen. Für saubere Nukleinsäurelösungen sollte der Quotient der Extinktionswerte von 260 nm / 280 nm zwischen 1,8 und 2,0 liegen. Die DNA-Konzentration wurde wie folgt berechnet:

Nukleinsäure [ µg/ml] = OD260 x D x F

F = Verdünnungsfaktor D = 50 µg/ml für doppelsträngige DNA D = 40 µg/ml für einzelsträngige DNA / RNA D = 33 µg/ml für Oligonukleotide

106

6.2.2.4 Restriktionsverdau von Vektoren und DNA-Fragmenten

2-10 µg DNA wurden in einem Reaktionsansatz von 20 µl unter Zusatz der entsprechenden Restriktionsendonukleasen und ihren Puffern geschnitten. Plasmide wurden 2 h, PCR-Produkte 12 h inkubiert. Die Temperaturbedingungen des Restriktionsverdaus wurden nach den Vorgaben des Herstellers für das entsprechende Enzym festgelegt. Die Restriktionsendonukleasen wurden anschließend durch Hitzeinaktivierung deaktiviert oder durch eine Phenol-Chloroform Fällung oder durch Auftrennung im Agarosegel aus dem Reaktionsgemisch entfernt.

6.2.2.5 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten

Zur Vermeidung der Religierung von geschnittenen Vektoren wurden die terminalen 5'-Phosphatgruppen durch eine alkalische Kälberphosphatase abgespalten. 5 µg geschnittene, Phenol-Chloroform aufgereinigte oder geleluierte Vektor-DNA wurden wie folgt dephosphoryliert:

Dephosphorylierungsansatz

5 µg	Vektor-DNA
1 µl	alkalische Kälberphosphatase (1U/µl)
3 µl	10x Dephosphorylierungspuffer
ad 30 µl H20

Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1/10 Volumen 200 mM EGTA zum Reaktionsansatz und durch anschließende Inkubation bei 65°C für 10 min gestoppt. Die dephosphorylierte Vektor-DNA wurde Phenol-Chloroform extrahiert.

107

6.2.2.6 Ligation von DNA

Die Ligation eines DNA-Inserts in den entsprechenden Vektor erfolgte in einem molaren Verhältnis von 3:1, 1:1 und 1:3.

Ligationsansatz:

1 µl	Vektor-DNA (ca. 50-100 ng)
4 µl	Insert-DNA
1 µl	10x Ligasepuffer
0,5 µl	T4 DNA-Ligase (3 Weiss U/µl)
ad 10 µl HPLC Wasser

Der Ligationsansatz wurde bei 12 °C für 12 bis 48h inkubiert. Als Kontrolle wurde eine Ligation ohne Insert-DNA durchgeführt.

6.2.2.7 Agarosegel-Elektrophorese

Die Agarosegel-Elektrophorese wurde zur Aufreinigung von DNA und zur Beurteilung von Restriktionsverdauansätzen durchgeführt. Je nach Größe der aufzutrennenden DNA wurde eine Konzentration der Agarose von 0,8-2,0% gewählt. Die Agarose wurde durch Erhitzen in 1x TAE-Puffer gelöst. Nach Abkühlen der Agarose auf 50°C wurde EtBr aus einem 10 mg/ml Stock auf eine Endkonzentration von 0,5 µg/ml zugegeben. Die DNA-Proben wurden mit 6x Probenpuffer versetzt, auf das Gel aufgetragen und bei 80 V aufgetrennt. Zur Beurteilung der Größe der aufgetrennten DNA wurden die Molekulargewichtsmarker Biosizer II und V verwendet. Die aufgetrennte DNA wurde unter UV-Licht sichtbar gemacht.

6.2.2.8 Herstellung transformationskompetenter E. coli-Bakterien

Die Herstellung transformationskompetenter E. coli-Bakterien erfolgte nach dem Protokoll von Inoue et al. (1990). 250 ml SOB Medium wurden mit einer Bakterienkolonie des gewünschten Bakterienstammes angeimpft und bei 18°C und 200 rpm bis zu einer OD600 von 0,6 (logarithmische Wachstumsphase) inkubiert. Die Bakterien wurden 10 min auf Eis inkubiert und anschließend bei 4°C und 4000 rpm für 10 min zentrifugiert. Das

108

6.2.2.9 Transformation kompetenter E. coli-Bakterien mit Plasmid-DNA

50 ng Plasmid-DNA (1-5 µl) wurden in ein vorgekühltes 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert. Kompetente Zellen wurden bei RT aufgetaut und 100 µl zum Plasmid zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde 30 min auf Eis und anschließend für 30 sec bei 42°C inkubiert. Nach Zugabe von 900 µl SOB-Medium wurde der Transformationsansatz bei 37°C und 400 rpm für 1 h inkubiert. 100-200 µl des Transformationsansatzes wurden auf eine Agarplatte (mit entsprechendem selektiven Antibiotikum) ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Als Kontrollen wurden bei jedem Transformationsansatz zum einen Bakterien ohne Plasmid und zum anderen Bakterien mit einem „leeren“ Plasmid transformiert.

6.2.2.10 Identifizierung positiver Transformanten

6.2.2.10.1 Blau-Weiß-Screening

Bakterien mit einer Mutation im lac Z-Gen (lacZ ?M15) produzieren eine enzymatisch inaktive -Galaktosidase, der am N-Terminus 30 AS fehlen. Werden diese Bakterien mit einem Plasmid transformiert, welches die fehlende, sog. -Region (-Peptid) induzierbar exprimiert, kann durch -Komplementation der beiden Proteine das funktionelle Enzym entstehen, welches das chromogene Substrat X-gal (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl--Galaktosidase) metabolisiert. Die Metabolisierung des Substrates X-gal führt zu einer Blaufärbung der Bakterienkolonie. Wird der kodierende Bereich des -Peptids durch den

109

LB-Agarplatten wurden für das Blau-Weiß-Screening vorbereitet, indem 40 µl X-gal (20 mg/ml) und 10 µl IPTG (1 M) mit einem Drigalski-Stab gleichmäßig ausplattiert wurden.

6.2.2.10.2 Plasmidpräparation und Restriktionsverdau

Zur Kontrolle des Transformationserfolges mittels Restriktionsverdau wurden jeweils 5 weiße Kolonien pro Platte einer Transformation mit Blau-Weiß-Sreening oder 10 Kolonien pro Platte einer Transformation ohne Blau-Weiß-Screening überprüft. 2 ml LB-Medium mit Antibiotikazusatz wurden mit jeweils einer Kolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C und 250 rpm inkubiert. Nach Plasmidextraktion mittels alkalischer Lyse (Pkt. 6.2.2.2.2) und anschließendem Restriktionsverdau (Pkt. 6.2.2.4) wurden die DNA-Proben im Agarosegel aufgetrennt und die Bakterienkolonien, deren Plasmid ein Insert enthielt, identifiziert.

6.2.2.11 Sequenzierung von Plasmid-DNA

Für die Sequenzierung wurde Plasmid-DNA mittels Quiagensäulen aufgereinigt (Pkt. 6.2.2.2.2). Die Sequenzierung wurde von der Firma AGOWA (Berlin) nach der Methode von Sanger et al. (1977) durchgeführt.

6.2.2.12 Langzeitlagerung von Bakterienstocks

Für die Langzeitlagerung von Bakterien wurden 0,5 ml einer 5 ml Übernachtkultur mit 0,5 ml sterilem 100%igem Glycerin versetzt. Die Bakterien wurden anschließend in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.

110

6.2.2.13 Untersuchung des Löslichkeitsverhaltens von rOv17, trOv17 und rOv33

Eine 20 ml LB-Kultur mit entsprechendem Antibiotikazusatz wurde mit 0,5 ml einer Übernachtkultur angeimpft und inkubiert. Bei einer OD600 von 0,6 - 0,8 wurde die Expression der rekombinanten Proteine durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert. Nach 3 h Inkubation wurden 3x2 ml Kultur abgenommen und die Bakterien abzentrifugiert (5 min, 4°C, 15 000 rpm). Die Bakterinpellets wurden in jeweils 200 µl eines Löslichkeitspuffers resuspendiert. Die Löslichkeit wurde mit einem PBS/Triton X-100-Puffer, mit einem Imidazol-Puffer und mit einem 6M Harnstoff-Puffer getestet. Die Bakteriensuspension wurde 30 sec bei 60 W auf Eis beschallt und anschließend bei 15 000 rpm und 4°C für 5 min zentrifugiert. Der Überstand (lösliche Fraktion) wurde abgenommen und bei -20°C aufbewahrt. 10 µl des Überstandes und 5 µl der unlöslichen Pelletfraktionen wurden im SDS-PAGE aufgetrennt, um die Löslichkeit der rekombinanten Proteine zu beurteilen. Die Löslichkeit der rekombinanten Proteine bestimmte die Wahl der Aufreinigungsmethode.

6.2.2.14 Affinitätschromatographische Aufreinigung von rOv17, trOv17 und rOv33

Alle rekombinanten Proteine wurden im pET-Expressionssystems exprimiert, welches durch die Bereitstellung von 6 Histidinresten am N-Terminus der rekombinanten Proteine eine affinitätschromatographische Aufreinigung über eine Nickel-Chelat-Säule ermöglicht. Für die Aufreinigung rekombinanter Proteine wurde jeweils 1 l LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikazusatz mit 20 ml einer Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C und 220 rpm bis zu einer OD600 von 0,6-0,8 inkubiert. Die Expression der rekombinanten Proteine wurde durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert. Nach einer Inkubationsdauer von 3 h wurden die Bakterien bei 4°C und 5000 rpm für 5 min abzentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 20 ml Bindungspuffer resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym (100 µg/ml) und DNaseI (5 µg/ml) / RNase A (10 µg/ml) wurde die Suspension für 3 min auf Eis beschallt (60 W) und anschließend bei 4°C und 15 000 rpm für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min über die mit Bindungspuffer äquilibrierte Ni-NTA-Matrix (1 ml) gegeben. Die beladene Säule wurde

111

112

6.2.3 Biochemische Methoden

6.2.3.1 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels BCA-Test

Die Proteinkonzentration der rekombinanten Parasitenproteine wurde mittels BCA-Test (Smith et al. 1985) bestimmt. Das Prinzip dieser Methode besteht in der Reduktion von Cu2+ zu Cu1+, die durch die Peptidbindungen der Proteine unter alkalischen Bedingungen induziert wird. Reduzierte Kupfer-Ionen bilden mit Bicinchonin-Säure (BCA) einen farbigen, wasserlöslichen Chelatkomplex, deren Absorption bei einer Wellenlänge von 562 nm gemessen wird. Die Durchführung des BCA-Tests erfolgte entsprechend den Vorgaben des Herstellers.

6.2.3.2 Präzipitation von Proteinen

6.2.3.2.1 Acetonfällung

Die Proteinlösung wurde zu 20-50% mit Aceton versetzt und anschließend bei 4°C und 14 000 rpm für 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und wenn erforderlich, verbliebenes Protein erneut mit Aceton gefällt. Das Proteinpellet wurde in 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen und nach Erhitzen auf 95°C (3 min) im SDS-PAGE aufgetrennt.

6.2.3.2.2 TCA-Fällung

Aus einer 100%igen TCA-Lösung wurde ein entsprechendes Volumen zum Erreichen einer Endkonzentration von 10% zu der Proteinlösung dazugegeben und 20 min auf Eis inkubiert. Die Lösung wurde anschließend 20 min bei 4°C und 14 000 rpm zentrifugiert. Das Proteinpellet wurde mit Ethanol-Ether (1:1) gewaschen, um restliche TCA zu entfernen. Das Proteinpellet wurde in 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen und nach Erhitzen auf 95°C im SDS-PAGE aufgetrennt.

113

6.2.3.3 Funktionelle Charakterisierung von rOv17 und trOv17

6.2.3.3.1 Titration der aktiven Zentren von Papain und humanem Cathepsin B, L und S

Die Titration der aktiven Zentren der humanen Cysteinproteasen wurden mit E64 und mit EwC durchgeführt. Die Proteasen wurden hierfür mit verschiedenen Konzentrationen von E64 und EwC für 45 min bei RT in Mikrotiterplatten inkubiert. E64 und EwC wurden in Konzentrationen von 7, 14, 21, 28, 35, 42 und 49 nM eingesetzt. Nach Ablauf der Inkubation wurde dem Proteasen-Inhibitor-Gemisch fluorogenes Substrat zugesetzt (Tab. 6). Das Endvolumen der Ansätze betrug 250 µl. Die Restaktivität der Proteasen wurde durch unverzügliche Messung des freigesetzten fluorogenen Produktes Aminomethylcoumarin (AMC) in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt (Exzitationswellenlänge 355 nm, Emissionswellenlänge 460 nm).

Tab. 6: Substrate und Substratkonzentration im Titrationstest.

	Substrat	Substratkonzentration
Papain	Z-Phe-Arg-AMC	25 µM
Cathepsin B	Z-Arg-Arg-AMC	120 µM
Cathepsin L	Z-Phe-Arg-AMC	10 µM
Cathepsin S	Z-Val-Val-Arg-AMC	40 µM

6.2.3.3.2 Titration der wirksamen rOv17 Konzentration

Die Titration der aktiven Zentren von rOv17 erfolgte mit titriertem, humanem Cathepsin L. Cathepsin L wurde mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17 (7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 nM) für 45 min bei RT in Microtiterplatten inkubiert. Nach Ablauf der Inkubation wurde dem Proteasen-Inhibitor-Gemisch Z-Phe-Arg-AMC-Substratlösung auf eine Endkonzentration von 10 µM zugesetzt. Das Endvolumen der Ansätze betrug 250 µl. Die Restaktivität der Proteasen wurde durch unverzügliche Messung des freigesetzten fluorogenen Produktes AMC in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt (Exzitationswellenlänge 355 nm, Emissionswellenlänge 460 nm). Die Auswertung der Messungen erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism.

114

6.2.3.3.3 Bestimmung der Km-Werte für Cathepsin L und B

Die kinetischen Messungen erfolgten bei 37°C in einem beheizbaren Photometer über einen Zeitraum von 150 sec. Die Messungen wurden in einem 2 ml-Reaktionansatz in Quarzküvetten, die mit einem Magnetrührer versehen waren, durchgeführt. Für alle Reaktionsansätze wurde 37°C vorgewärmter Probenpuffer verwendet. Vor Beginn der Messungen wurde die Protease in ihrem Probenpuffer für 5 min bei 37°C aktiviert. Anschließend wurde die Proteaseaktivität austitriert, so daß in einem Zeitraum von 60-90 sec 1000 Fluoreszenzeinheiten freigesetzt wurden. Hierfür wurden 1980 µl des vorgewärmten Puffer-Substratlösung in die Küvette vorgelegt und 20 µl der aktivierten Proteaselösung dazugeben. Zeitgleich mit der Zugabe der Protease wurde die Messung gestartet. Entsprechend des Kurvenverlaufs wurde die Protease weiter verdünnt oder konzentriert, um die oben genannte Voraussetzung zu erfüllen. Anschließend wurde die Proteaseaktivität in Anwesenheit von verschiedenen Substratkonzentrationen über einen Zeitraum von 150 sec bei 37°C gemessen (Tab. 7). Hierfür wurden ein entsprechendes Volumen Cathepsin-Probenpuffer in die Quarzküvette vorgelegt und das entsprechende Volumen Substrat aus einer 10 mM Stammlösung zugegeben, so daß ein Endvolumen von 1980 µl erzielt wurde. Die Küvette wurde in das beheizte Fluoreszenzphotometer verbracht. Nach Nullabgleich des Gemisches wurde die Messung nach Zugabe der Protease (20 µl) zeitgleich gestartet. Die Abspaltung der fluorogenen Produktes AMC wurde bei einer Exzitationswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenänge 460 nm kontinuierlich über einen Zeitraum von 150 sec aufgezeichnet. Für die Messungen wurden jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism.

Tab. 7: Testparameter für die K_M-Wert-Bestimmung.

	Cathepsin-Konzentration	Substrat	Getestete Substratkonzentration
Cathepsin B	1,17 nM	Z-Arg-Arg-AMC	25; 50; 100; 200; 300; 400; 500 µM
Cathepsin L	0,47 nM	Z-Phe-Arg-AMC	0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 50; 6,0; 7,0; 8,0 µM

Der KM-Wertes für Cathepsin S war bereits am Institut für Biochemie der Universitätsklinik Jena bestimmt worden. Der Km-Wert für Papain war vorgegeben.

115

6.2.3.3.4 Bestimmung der Dissoziationskonstanten Ki von rOv17 und trOv17 für Papain und Cathepsin B, L und S

Die Bestimmung der Ki-Werte für rOv17 erfolgte mit der pflanzlichen Cysteinprotease Papain und mit den humanen Cysteinproteasen Cathepsin B, L und S. Die Versuchsdurchführung erfolgte wie es bereits für die Bestimmung des Km-Wertes beschrieben wurde. Für die Bestimmung der Ki-Werte wurde die Proteaseaktivität in Anwesenheit von verschiedenen Inhibitorkonzentrationen (rOv17, trOv17) über einen Zeitraum von 320 sec bei 37°C gemessen. Der vorgewärmte Probenpuffer wurde mit der entsprechenden Menge Inhibitor in die Küvette pipettiert, so daß ein Volumen von 1980 µl erreicht wurde. Die Küvette wurde in das beheizte Fluoreszenzphotometer verbracht. Nach Zugabe der entsprechenden Protease (20 µl) wurde die Messung zeitgleich gestartet. Das Volumen des eingesetzten rOv17/trOv17 wurde so gewählt, daß 5% des Reaktionsendvolumens nicht überschritten wurden. Die getesteten Konzentrationen und Substrate sind in Tab. 8 aufgeführt. Die Messungen wurden als Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm „GraphPad Prism“.

Tab. 8: Testparameter für die Bestimmung der K_i-Werte.

	Cathepsin-Konzentration	Substratkonzentration	Getestete rOv17-Konzentration	Getestete trOv17-Konzentration
Papain	0,10 nM	25 µM Z-Phe-Arg-AMC	1,7; 2,7; 3,4; 4,1; 5,5 nM	10; 50; 100 nM
Cathepsin B	1,17 nM	40 µM Z-Arg-Arg-AMC	3,5; 35; 70; 173 nM	n.d.
Cathepsin L	0,11 nM	5 µM Z-Phe-Arg-AMC	0,7; 1,4; 2,1;2,8; 3,5 nM	10; 50; 100 nM
Cathepsin S	0,09 nM	40 µM Z-Val-Val-Arg-AMC	0,7; 1,4; 2,1;2,8; 3,5 nM	10; 50; 100 nM

Das Kontrollprotein rOv33 wurde beispielhaft im Aktivitätstest mit Papain in einer Konzentration von 50, 100 und 200 nM getestet.

6.2.3.4 Fluoreszein-Markierung von rOv17, trOv17 und rOv33

Die Markierung der rekombinanten Parasitenproteine rOv17, trOv17 und rOv33 wurde mit einem Fluoreszein Labeling Kit durchgeführt. Die Markierung der Proteine erfolgte entsprechend der Durchführungsvorschriften des Herstellers. Der molare Reaktionsansatz wurde so gewählt, daß 1 Molekül Protein mit 5 Molekülen Fluos umgesetzt wurde.

116

6.2.4 Immunologische Methoden

6.2.4.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Rekombinant, aufgereinigte Parasitenproteine, Bakterienproteingemische und OvAg-Gesamtextrakt wurden mittels SDS-PAGE unter Anwendung des diskontinuierlichen Puffer-System nach Laemmli (1970) analysiert. Beurteilt wurden die Auftrennung von Proteinen und die Reinheit von Proteinfraktionen. Zudem erfolgte eine Schätzung des Molekulargewichts und der Konzentration der aufgetrennten Proteine.

Für die Anfertigung der Acrylamidgele wurden Minigel-Apparaturen verwendet. Die Acrylamidkonzentration (12,5%, 14%, 16%) des Trenngeles wurde entsprechend des Molekulargewichts der aufzutrennenden Proteine variiert. Für das Sammelgel wurde eine 6%ige Acrylamidlösung verwendet. Die zu analysierenden Proteinfraktionen wurden mit 2x Probenpuffer versetzt und 3 min bei 95°C erhitzt. Nach Beladung des Polyacrylamidgels wurden die Proben bei 120-160 V bei RT oder 4°C aufgetrennt. Zur Charakterisierung des Molekulargewichts der aufzutrennenden Proteine wurde jeweils ein Standard mit vorgefärbten Proteinen definierter Größe im SDS-PAGE mitgeführt. Nach erfolgter Elektrophorese wurden die aufgetrennten Fraktionen im Coomassie-Bad angefärbt und anschließend entfärbt und getrocknet. Für eine weitere immunologische Charakterisierung wurden die aufgetrennten Fraktionen elektrophoretisch auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert (Towbin et al. 1979).

6.2.4.2 Western Blot

Für den Nachweis von Proteinen durch spezifische Antikörper wurden die im SDS-PAGE aufgetrennten Proteine bei 400 mA für 3 h oder über Nacht bei 80 mA elektrophoretisch auf eine Nitrozellulosemembran (NZ-Membran) transferiert. Die NZ-Membran wurde anschließend in 3% BSA/TBS für 15 min bei RT inkubiert, um die freien Bindungsstellen der NZ-Membran zu blockieren. Nach 3x Waschem mit TBS wurde die NZ-Membran mit dem ersten Antikörper für 1,5 h bei RT unter Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurden nichtgebundene Antikörper durch 3x Waschen mit TBS entfernt. Die NZ-Membran wurde

117

rOv17:

1. Antikörper:	anti-rOv17 Kaninchenserum, 1:500 in BSA/TBS verdünnt
2. Antikörper:	Peroxidase-konjugierter Ziege anti-Kaninchen Ak, 1:10000 in 3% BSA/TBS verdünnt

rOv33:

1. Antikörper:	anti-rOv33 monoklonaler Maus-Antikörper, IVA7, unverdünnt
2. Antikörper:	Peroxidase-konjugierter Ziege anti-Maus Ak, 1:10000 in 3% BSA/TBS verdünnt

6.2.4.3 Immunisierung von BALB/c Mäusen

Für die Immunisierung der Mäuse wurde das Adjuvans STP, welches sowohl die humorale als auch die zellvermittelte Immunantwort anregt, eingesetzt. Jeweils 6 männliche BALB/c Mäuse (ca. 7 Wochen alt) wurden 3x im Abstand von 12 Tagen mit jeweils 25 µg OvAg in STP immunisiert. Die Mäuse wurden mit dem Narkotikum Metoxyfluran betäubt. Pro Impfdosis wurden 25 µg/250 µl PBS mit 250 µl STP gemischt und subkutan appliziert. 14 Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse getötet und die Milzzellen für einen antigenspezifischen Proliferationstest präpariert.

6.2.4.4 ELISA

6.2.4.4.1 Zytokin-ELISA

Für die Zytokinbestimmung wurde der 6 h, 24 h und 48 h Kulturüberstand von unstimulierten oder polyklonal-stimulierten PBMC gewonnen. In den Überständen wurde die Konzentration von IL-2, IL-4, IL-10, IL-12p40, TNF-, TGF- und IFN- bestimmt. Verwendet wurden kommerzielle ELISA-Sets. Die ELISA wurden entsprechend der Vorgaben des Herstellers

118

6.2.4.4.2 ELISA zur Quantifizierung der Onchocystatin Ausscheidung durch O. volvulus Weibchen

Für die Bestimmung der Onchocystatin Ausscheidung wurden 24 h Kulturüberstände von 5 verschiedenen O. volvulus Weibchen verwendet. Hierfür wurden ELISA-Platten mit 50 µl Kulturüberstand plus 25 µl Beschichtungspuffer und mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17 beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach 3x Waschen mit PBS/0,025% Tween-20 erfolgte eine 30 minütige Inkubation mit Blockierungspuffer (3% BSA/TBS) bei 37°C. Nach einem erneuten Waschschritt wurde gebundenes Antigen mit einer 1:5000 Verdünnung des rOv17 Kaninchenserums in einem Volumen von 50 µl für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach 3x Waschen wurde ein Peroxidase-konjugierter Ziege-anti-Kaninchen Antikörper in einer Verdünnung von 1:1000 eingesetzt (50 µl), um gebundene rOv17 Ak zu quantifizieren. Nach erneutem Waschen wurden 50 µl der entsprechenden Enzym-Substrat-Lösung zugegeben. Die Farbreaktion wurde nach 1 min mit 1 M H2SO4 gestoppt und die Extinktion bei 450 nm im ELISA-Meßgerät bestimmt. Als Kontrolle wurde ein Kaninchen-anti-Eimerien Hyperimmunserum (1:5000 verdünnt) getestet.

6.2.4.5 FACS-Analyse zur Bestimmung der Zielzelle(n) von rOv17

Humanes Blut wurde mit RPMI 1:1 verdünnt und 300 µl dieser Verdünnung mit 0,5 µM Fluos-markiertem rOv17, trOv17 und rOv33 in einem 2 ml-Reaktionsgefäß für 2 h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden 100 µl Inkubationsansatz für eine CD14-Markierung ohne Quenching und 100 µl für eine CD14-Markierung mit Quenching in je ein Serum-Röhrchen überführt. Die Proben für eine CD14-Markierung ohne Quenching wurden 20 min mit 5 µl PE-Cy5-makierten CD14-Antikörpern bei 4°C inkubiert.

119

6.2.4.6 Bestimmung der Expression von HLA-DR, CD40, CD80 und CD86 auf humanen Monozyten in Anwesenheit von rOv17 und trOv17

Humane PBMC (8x105) wurden für 72 h mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 bei 37°C inkubiert. Für die anschließende FACS-Analyse der HLA-DR-, CD80-, CD86- und CD40-Expression humaner Monozyten wurde eine Doppelfluoreszenzmarkierung durchgeführt. Monozyten wurden durch eine CD14-Markierung unter Verwendung von PE-Cy5-konjugierten anti-CD14 Ak identifiziert. Für die Markierung von HLA-DR, CD80, CD86 und CD40 wurden PE-konjugierte anti-HLA-DR Ak, FITC-konjugierte anti-CD80 Ak, PE-konjugierte anti-CD86 Ak und FITC-konjugierte anti-CD40 Ak verwendet. Als Kontrollen wurde FITC-konjugiertes IgG1 und PE-konjugiertes IgG2a eingesetzt.

Nach Ablauf der Inkubation der PBMC mit rOv17, trOv17 und rOv33 wurden die Zellen vorsichtig resuspendiert und zu je 2x108 in Serum-Röhrchen überführt. Nach dem Waschen der PBMC mit 1 ml FACS-Puffer (5 min/1000 rpm/4°C) wurden die Zellen zur Markierung der Oberflächenmoleküle für 20 min bei 4°C mit den entsprechenden Ak inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde die Expression der Oberflächenmoleküle im Durchflußzytometer analysiert.

120

6.2.4.7 Präparation von Mausmilzzellen

Die Mäuse wurden durch CO2-Inhalation getötet und in ein 70%iges Ethanolbad getaucht. Die Milz wurde steril entnommen und durch ein engmaschiges Sieb mit Hilfe eines Stempels passiert. Die Milzzellsuspension wurde durch auf- und abpipettieren homogenisiert und nachfolgend in ein 50 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die Milzzellsuspension wurde mit kaltem RPMI auf 40 ml aufgefüllt und 10 min auf Eis inkubiert, um Zellklumpen und grobe Bindegewebsteile sedimentieren zu lassen. Der Überstand wurde anschließend in ein neues 50 ml-Reaktionsgefäß pipettiert und bei 4°C und 1100 rpm für 10 min zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde das Milzzellpellet aufgeschüttelt und 10 min in 11 ml Erylyse-Lösung auf Eis inkubiert. Nach der anschließenden Zentrifugation wurden die Milzzellen 2x mit RPMI gewaschen und in 3 ml RPMI komplett aufgenommen. Die Zellzahl wurde in einer 1:100 Verdünnung mit Trypanblau in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.

6.2.4.8 Präparation von humanen PBMC

Die Präparation von humanen PBMC wurde mittels einer Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation durchgeführt. Pro Spender wurden 30 ml Blut zur Aufreinigung von PBMC verwendet. Das Blut wurde mit PBS 1:1 verdünnt. In einem 15 ml-Reaktionsgefäß wurden 3 ml Ficoll mit 10 ml verdünntem Blut überschichtet. In einem 50 ml-Reaktionsgefäß wurden 12 ml Ficoll mit 40 verdünntem ml Blut überschichtet. Nach einer Zentrifugation bei 18°C und 1200 rpm für 40 min (ohne Bremse) wurde die PBMC-Fraktion in ein 50 ml-Reaktionsgefäß überführt und 3x mit 30 ml RPMI gewaschen (18°C/1200 rpm/10 min). Anschließend wurden die PBMC in 10 ml RPMI komplett aufgenommen und die Zellzahl in einer 1:100 Verdünnung mit Trypanblau in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.

6.2.4.9 Depletion von CD14+-Zellen

CD14+-Zellen wurden aus aufgereinigten PBMC depletiert. Für die Depletion wurden CD14 MicroBeads verwendet. Nach der Aufreinigung der PBMC wurden alle Manipulationen der PBMC auf Eis oder bei 4°C durchgeführt.

121

Die Effektivität der CD14+-Depletion wurde durch eine CD14-Markierung der einzelnen Zellfraktionen mit FITC-konjugierten anti-CD14-Ak und anschließender FACS-Analyse überprüft. Hierfür wurden jeweils 50 µl der Zellfraktionen mit 1 ml PBS/1%BSA gewaschen (4°C/2000 rpm/10 min), in 100 µl PBS/1% BSA resuspendiert und mit FITC-konjugierten anti-CD14-Ak (1:50 verdünnt) für 10 min bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen der markierten Zellen mit 1 ml PBS/1%BSA wurden die Zellen im Durchflußzytometer analysiert. Die CD14+-negative Zellfraktion wurden auf 97-99% angereichert. Die CD14+-depletierte Zellfraktion wurden anschließend mit 40 ml RPMI gewaschen und in 10 ml RPMI komplett aufgenommen. Die Zellen wurden in einer 6-well Kulturplatte verteilt und bei 37°C für 1 h inkubiert. Noch vorhandene Monozyten wurden so durch Adhärenz aus der Zellfraktion entfernt. Das Adhärenzverfahren wurde nochmals wiederholt und die nichtadhärenten Zellen anschließend mit RPMI komplett über Nacht bei 37°C inkubiert. Die CD14+-depletierten Zellen wurden geerntet, zentrifugiert (RT/1200 rpm/10 min) und in RPMI komplett aufgenommen.

6.2.4.10 PHA-Stimulation von humanen PBMC

Humane PBMC wurden in einer Konzentration von 3,5x105 Zellen pro well in eine 96-well Flachbodenplatte ausplattiert und mit 10 µg/ml PHA stimuliert. Zu den stimulierten PBMC wurden verschiedene Konzentrationen von rOv17 (0,1 µM, 0,25 µM, 0,5 µM) und dem Kontrollprotein, rOv33 zugegeben. Für Neutralisationsstudien wurde zu den Ansätzen 1µl anti-rOv17 Kaninchenserum zugegeben. Das Endvolumen der Proliferationstests betrug 200 µl. Die Zellen wurden bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und einem CO2 Gehalt von 5% für 72

122

6.2.4.11 Anti-CD3 Ak-Stimulation von humanen PBMC

Humane PBMC (3,5 x 105_/well) wurden mit löslichen oder immobilisierten anti-CD3 Ak stimuliert. Für die Stimulation mit löslichen anti-CD3 Ak wurden diese in einer Konzentration von 10 ng/ml eingesetzt. Für die Immobilisation von anti-CD3 Ak wurden 50 µl einer 100 µg/ml konzentrierten anti-CD3 Ak Stammlösung pro well einer 96-well Flachbodenplatte pipettiert. und 2 h bei 37°C inkubiert. Nicht gebundene Antikörper wurden durch 2x Waschen mit 100 µl PBS entfernt. Die anti-CD3 Ak stimulierte Proliferation wurde in Anwesenheit von 0,5 µM rOv17, trOv17, rOv33 und 200 pg/ml LPS untersucht. Für Neutralisationsstudien wurden 5 µg/ml anti-IL-10 Ak oder 5 µg/ml eines Maus-IgG1 Kontroll-Ak eingesetzt. Das Endvolumen der Proliferationstests betrug 200 µl. Die Zellen wurden bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und einem CO2 Gehalt von 5% für 72 inkubiert. Zur Quantifizierung der Proliferation wurden die Zellen 20 h vor Ablauf der Inkubationszeit mit 1 µCi 3H-Thymidin inkubiert. Alle Ansätze wurden in Dreieransätzen durchgeführt und alle Versuche mindestens einmal wiederholt.

6.2.4.12 Antigenspezifische Stimulation von humanen PBMC

Humane PBMC wurden in einer Konzentration von 3,5x105 Zellen pro well in eine 96-well Flachbodenplatte ausplattiert, mit 10 IE/ml PPD stimuliert und der Einfluß von 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 auf die Proliferation untersucht. Die Zellen wurden bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und einem CO2 Gehalt von 5% für 96 h inkubiert. Zur Quantifizierung der Proliferation wurden die Zellen 20 h vor Ablauf der Inkubationszeit mit 1 µCi 3H-Thymidin inkubiert. Alle Ansätze wurden in Dreieransätzen durchgeführt.

123

6.2.4.13 Stimulation von CD14+-depletierten, humanen PBMC mit anti-CD3 Ak / anti-CD28 Ak und PHA

Die CD14+-depletierten PBMC wurden in einer Konzentration von 2x105 Zellen pro well in eine 96-well Flachbodenplatte ausplattiert und mit 2 µg/ml anti-CD3/2,5 µg/ml anti-CD28 Ak oder mit 10 µg/ml PHA stimuliert. Zu den stimulierten PBMC wurden 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 zugegeben. Das Endvolumen der Proliferationstests betrug 200 µl. Die Zellen wurden bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und einem CO2 Gehalt von 5% für 72 inkubiert. Zur Quantifizierung der Proliferation wurden die Zellen 20 h vor Ablauf der Inkubationszeit mit 1 µCi 3H-Thymidin inkubiert. Alle Ansätze wurden in Dreieransätzen durchgeführt und alle Versuche mindestens einmal wiederholt.

6.2.4.14 Antigenspezifische Stimulation von Mausmilzzellen

Die Milzzellen (3,5x105/well) von OvAg-immunisierten Mäusen wurden mit 10 µg/ml OvAg stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 oder rOv33 für 96 h bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und einem CO2-Gehalt von 5% inkubiert. Nach einer Inkubation von 76h wurden die Zellen mit je 1 µCi 3H-Thymidin versetzt und weitere 20 h inkubiert.

6.2.4.15 Gewinnung von Zellkulturüberständen

Zellkulturüberstände wurden nach 6 h, 24 h und 48 h von unstimulierten oder polyklonal stimulierten humanen PBMC geerntet und bei -80°C gelagert.

6.2.4.16 Ernten ³H-Thymidin markierter Zellen und Szintillationsmessung

Die Proliferation der Zellen wurden durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA sich teilender Zellen quantifiziert. Hierfür wurden die Zellen in den letzten 20 h der Inkubation mit 1 µCi 3H-Thymidin inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die radioaktiv markierten Zellen mit Hilfe eines Zellerntes auf Glasfaserfilter überführt. Die Filter wurden 1

124

6.2.4.17 LPS-Konzentrationsbestimmung

Die LPS-Konzentration der rekombinanten Proteine wurde mit einem kommerziellen Testkit (Quantitativer Chromogener LAL-Test) bestimmt. Die Proteinfraktionen wurden in einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt. Die Durchführung erfolgte entsprechend der Vorgaben des Herstellers.

6.2.5 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Daten wurde am Institut für Informatik der Humboldt-Universität zu Berlin unter Verwendung des Student-T-Tests oder des Wilcoxon-Rank-Tests durchgeführt.

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.