Schönemeyer, Annett: Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung eines Cysteinproteasen-Inhibitors der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus
Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung eines Cysteinproteasen-Inhibitors der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Faktultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Annett Schönemeyer ,
17.08.1970 in Teterow

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Hans Meyer

Dekan der Fakultät
Prof. Dr. B. Ronacher

Gutachter:
Prof. Dr. Richard Lucius
Prof. Dr. Hans-Dieter Volk
Prof. Dr. Michael F. G. Schmidt

eingereicht am: 27.07.2000

Datum der Promotion: 12.12.2000

Zusammenfassung

Filarien persistieren bis zu 15 Jahren in ihren Wirten. Als eine Ursache dieser Persistenz diskutiert man die Fähigkeit der Filarien, die Immunantwort des Wirtes gezielt zu modulieren und eine zelluläre Hyporeaktivität zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob ein sezernierter Cysteinproteasen-Inhibitor (Onchocystatin) der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus immunmodulierende Eigenschaften besitzt und an der Herausbildung eines hyporeaktiven Immunstatus des Wirtes beteiligt ist. Für die Untersuchungen wurde Onchocystatin als full length Molekül (rOv17) und als verkürztes Molekül (trOv17) rekombinant hergestellt. Das verkürzte trOv17 besitzt aufgrund des Fehlens des N-terminalen Bereiches eine verminderte proteaseinhibitorische Aktivität. Die in vitro Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen verdeutlichen, daß rOv17 und auch trOv17 potente Immunmodulatoren sind, die sowohl die antigenspezifische als auch die polyklonal-stimulierte Proliferation von humanen PBMC inhibieren. Die zelluläre Hyporeaktivität ist dabei auf die Modulation von Monozytenfunktionen zurückzuführen. rOv17 und trOv17 modulieren die Antigenpräsentation, die Zytokinproduktion und die Expression kostimulatorischer Signale von humanen Monozyten. So konnte gezeigt werden, daß rOv17 und trOv17 die Aktivität von humanem Cathepsin L und S inhibieren und die Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 vermindern. Die Modulation der Zytokinproduktion durch rOv17 und trOv17 ist durch eine verstärkte TNF-alpha und IL-10 Produktion und durch eine verminderte IL-12 Produktion charakterisiert. Desweiteren konnte in Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak gezeigt werden, daß die verminderte Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 Folge der durch rOv17 und trOv17 induzierten verstärkten IL-10 Produktion ist. Im Gegensatz dazu bleibt die verminderte IL-12 Produktion und die verminderte polyklonal-stimulierte Proliferation humaner PBMC auch nach der Neutralisation von IL-10 bestehen. Die Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen zeigen, daß rOv17 und trOv17 ihr immunologisches Umfeld auf vielfältige Art und Weise modulieren. Dabei spielt vermutlich die Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease, aber auch ein von der Funktion als Cysteinproteasen-Inhibitor unabhängiger Mechanismus eine Rolle. Der Cysteinproteasen-Inhibitor der Filarie O. volvulus besitzt somit die Eigenschaft, die Immunantwort des Wirtes zu modifizieren, und ist vermutlich eine wesentliche Komponente, die dem Parasiten eine lange Persistenz im Wirt ermöglicht.

Schlagwörter:
Parasiten, Filarien, Onchocerca volvulus, Cysteinproteasen-Inhibitor, Cystatin, Onchocystatin Immunmodulation, Zytokine, IL-10, Kostimulation, CD86

Abstract

Immune responses of individuals infected with filarial nematodes are characterized by a marked cellular hyporesponsiveness. The establishment of this hyporesponsiveness is considered as an important mechanism to avoid host immune responses which could eliminate the parasites. The present study is investigating the immunomodulatory potential of a 17 kD secreted cysteine protease inhibitor (onchocystatin) of the human pathogenic filaria Onchocerca volvulus. In vitro studies using recombinant onchocystatin (rOv17) identified this inhibitor as a potent immunomodulator. rOv17 suppresses the antigen-driven and the polyclonally-stimulated proliferation of human PBMC. This cellular hyporeactivity is due to the modulation of monocytic function by rOv17, comprising the modulation of antigenpresentation, the expression of costimulatory molecules and the production of cytokines. Thus rOv17 strongly inhibits the activity of human cathepsin L and S and reduces the expression of MHC class II molecules as well as the expression of CD40 and CD86 on human monocytes. The modulation of cytokine production by rOv17 is characterized by an initial increase of TNF-alpha which is followed by an increase of IL-10 and a decrease of IL-12. By neutralization studies it was shown that the suppression of MHC class II molecules and of CD86 and CD40 is mediated by the rOv17 induced increase of IL-10. In contrast cellular hyporeactivity and the reduced IL-12 production remain unaffected by neutralization of IL-10. In comparison to rOv17 a truncated onchocystatin (trOv17) with lowered protease inhibitory activity was investigated. Surprisingly even trOv17 is immunomodulatory active suggesting that immunomodulation by onchocystatin is mediated by both an inhibitor-dependent and an inhibitor-independent mechanism. These data demonstrate that onchocystatin is a potent immunomodulator of host immune responses and in consequence is an essential component that enables the parasites a long persistence within their hosts.

Keywords:
parasites, filariae, Onchocerca volvulus, cysteine protease inhibitor, cystatin, onchocystatin, immunomodulation, cytokines, IL-10, costimulation, CD86


Seiten: [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [120] [121] [122] [123] [124] [125] [126] [127] [128] [129] [130] [131] [132] [133] [134] [135] [136] [137] [138] [139] [140] [141] [142] [143] [144]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteCharakterisierung der immunmodulierenden Wirkung eines Cysteinproteasen-Inhibitors der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus
Danksagung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Zusammenfassung Zusammenfassung
1 Einleitung
1.1Einführung
1.2O. volvulus und die Onchozerkose
1.2.1Lebenszyklus
1.2.2Klinische Manifestation einer O. volvulus-Infektion
1.2.3Charakterisierung des Immunstatus infizierter Personen
1.3Charakterisierung humaner Cysteinproteasen
1.4Charakterisierung der Superfamilie der Cysteinproteasen-Inhibitoren (Cystatine)
1.4.1Klassifizierung
1.4.2Inhibitionsmodell einer papainähnlichen Cysteinprotease durch einen
Typ 2-Inhibitor
1.5Charakterisierung von Onchocystatin
1.6Immunmodulation durch Helminthenproteine und -produkte
2 Ziele der Arbeit
3 Ergebnisse
3.1Herstellung und funktionelle Charakterisierung von rekombinanten
O. volvulus Proteinen
3.1.1Klonierung und prokaryotische Expression rekombinanter O. volvulus Proteine
3.1.1.1Klonierung und Expression eines „full length“ O. volvulus Cystatins (rOv17)
3.1.1.2Klonierung und Expression eines verkürzten O. volvulus Cystatins (trOv17)
3.1.1.3Klonierung und Expression eines O. volvulus Kontrollproteins (rOv33)
3.1.2Sequenzanalyse von rOv17 und trOv17
3.1.2.1Sequenzierung der klonierten DNA von rOv17 und trOv17
3.1.2.2Aminosäuresequenzvergleich von rOv17, trOv17 und Onchocystatin
3.1.3Funktionelle Charakterisierung von rOv17 und trOv17
3.1.3.1Charakterisierung des inhibitorischen Potentials von rOv17 und trOv17
3.1.3.1.1Titration der aktiven Zentren von humanem Cathepsin B, L und S
3.1.3.1.2Sekundärtitration von rOv17 mit humanem Cathepsin L
3.1.3.1.3Bestimmung der Km-Werte von Cathepsin L und B
3.1.3.1.4Bestimmung der Dissoziationskonstanten Ki
3.1.4Quantifizierung des LPS-Gehaltes der rekombinant hergestellten O. volvulus Proteine
3.2Bestimmung der Konzentration von Onchocystatin im Kulturüberstand von O. volvulus Weibchen
3.3Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung der rekombinanten O. volvulus Cystatine
3.3.1Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die antigenspezifische Proliferation
3.3.1.1Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die PPD-stimulierte Proliferation humaner PBMC
3.3.1.2Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die O. volvulus-antigenspezifische Proliferation von Milzzellen immunisierter BALB/c Mäuse
3.3.2Einfluß von EwC und E64 auf die PPD-stimulierte Proliferation humaner PBMC
3.3.3Einfluß der rekombinanten O. volvulus Cystatine auf die polyklonal-stimulierte Proliferation von humanen PBMC
3.3.3.1Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die PHA-stimulierte Proliferation von humanen PBMC
3.3.3.2Proliferation von PHA-stimulierten PBMC in Anwesenheit von rOv17 und einem anti-rOv17 Kaninchenserum
3.3.3.3Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die anti-CD3 Ak-stimulierte Proliferation humaner PBMC
3.3.4Bestimmung der Zielzelle(n) von rOv17
3.3.4.1Charakterisierung der Bindung und Aufnahme von rOv17 und trOv17 durch Immunzellen
3.3.4.2Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die PHA-stimulierte Proliferation humaner, Monozyten-depletierter PBMC
3.3.5Zytokinproduktion von humanen PBMC in Anwesenheit der rekombinanten O. volvulus Cystatine
3.3.5.1Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Zytokinproduktion unstimulierter humaner PBMC
3.3.5.2Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Zytokinproduktion von stimulierten humanen PBMC
3.3.6Einfluß der rekombinanten O. volvulus Cystatine auf die Expression von Oberflächenmolekülen humaner Monozyten
3.3.6.1Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die HLA-DR-Expression
3.3.6.2Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Expression kostimulatorischer Moleküle
3.3.7Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung der durch rOv17 und trOv17 induzierten verstärkten IL-10 Produktion durch Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak
3.3.7.1Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die HLA-DR-Expression humaner Monozyten nach Neutralisation von IL-10
3.3.7.2Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Expression kostimulatorischer Moleküle humaner Monozyten nach Neutralisation von IL-10
3.3.7.3Zytokinproduktion von stimulierten humanen PBMC in Anwesenheit von rOv17, trOv17 und neutralisierenden anti-IL-10 Ak
3.3.7.4Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die polyklonal-stimulierte Proliferation in Anwesenheit neutralisierender anti-IL-10 Ak
4 Diskussion
4.1Immunmodulierende Eigenschaften der rekombinanten O. volvulus Cystatine
4.1.1Inhibition der antigenspezifischen Proliferation durch rOv17 und trOv17
4.1.2Bindung und Aufnahme von rOv17 und trOv17 durch Monozyten
4.1.3Inhibition der Aktivität von humanem Cathepsin L und S durch rOv17 und trOv17
4.1.4Einfluß von EwC und E64 auf die antigenspezifische Proliferation
4.1.5Inhibition der HLA-DR-Expression von humanen Monozyten durch rOv17 und trOv17
4.1.6Polyklonal-stimulierte Proliferation von humanen PBMC und von Monozyten-depletierten PBMC
4.1.7Modulation der Zytokinproduktion durch rOv17 und trOv17
4.1.8Inhibition der CD40- und CD86-Expression humaner PBMC durch rOv17 und trOv17
4.1.9Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak
4.2Charakterisierung des Kontrollproteins rOv33
4.3Vergleichende Untersuchungen von rOv17, trOv17 und LPS
5 Schlußfolgerung
6 Material und Methoden
6.1Material
6.1.1Laborgeräte
6.1.2Verbrauchsmaterialien
6.1.3Reagenzien
6.1.4Enzyme
6.1.5Kommerzielle Kits
6.1.6Primer
6.1.7Agarosegel-Elektrophorese-Puffer
6.1.8Puffer für Kleine Plasmidpräparation
6.1.9Plasmide, cDNA und E. coli-Stämme
6.1.10Bakterien-Kulturmedien
6.1.11Antibiotika
6.1.12Puffer für Löslichkeitstest
6.1.13Puffer für die affinitätschromatographische Aufreinigung von rOv17, trOv17 und rOv33
6.1.14SDS-PAGE-Pufferlösungen
6.1.15Puffer für Transfer und Western-Blot
6.1.16Puffer für ELISA
6.1.17Antikörper und Konjugate
6.1.18Puffer und Lösungen für kinetische Messungen mit rOv17 und trOv17
6.1.19Zellkultur-Medien
6.1.20Adjuvans
6.1.21Puffer für Durchflußzytometrie
6.1.22Tiermaterial
6.2Methoden
6.2.1Gewinnung von Parasitenmaterial
6.2.1.1Herstellung von O. volvulus-Antigenextrakt
6.2.1.2Gewinnung von Kulturüberstand weiblicher O. volvulus Würmer
6.2.2Molekularbiologische Methoden
6.2.2.1Polymerasekettenreaktion (PCR)
6.2.2.2Aufreinigung und Konzentrierung von DNA
6.2.2.2.1Isolation von DNA-Fragmenten
6.2.2.2.2Isolation von Plasmid-DNA
6.2.2.2.3DNA Konzentrierung mittels Ethanolpräzipitation
6.2.2.3DNA-Konzentrationsbestimmung
6.2.2.4Restriktionsverdau von Vektoren und DNA-Fragmenten
6.2.2.5Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten
6.2.2.6Ligation von DNA
6.2.2.7Agarosegel-Elektrophorese
6.2.2.8Herstellung transformationskompetenter E. coli-Bakterien
6.2.2.9Transformation kompetenter E. coli-Bakterien mit Plasmid-DNA
6.2.2.10Identifizierung positiver Transformanten
6.2.2.10.1Blau-Weiß-Screening
6.2.2.10.2Plasmidpräparation und Restriktionsverdau
6.2.2.11Sequenzierung von Plasmid-DNA
6.2.2.12Langzeitlagerung von Bakterienstocks
6.2.2.13Untersuchung des Löslichkeitsverhaltens von rOv17, trOv17 und rOv33
6.2.2.14Affinitätschromatographische Aufreinigung von rOv17, trOv17 und rOv33
6.2.3Biochemische Methoden
6.2.3.1Proteinkonzentrationsbestimmung mittels BCA-Test
6.2.3.2Präzipitation von Proteinen
6.2.3.2.1Acetonfällung
6.2.3.2.2TCA-Fällung
6.2.3.3Funktionelle Charakterisierung von rOv17 und trOv17
6.2.3.3.1Titration der aktiven Zentren von Papain und humanem Cathepsin B, L und S
6.2.3.3.2Titration der wirksamen rOv17 Konzentration
6.2.3.3.3Bestimmung der Km-Werte für Cathepsin L und B
6.2.3.3.4Bestimmung der Dissoziationskonstanten Ki von rOv17 und trOv17 für Papain und Cathepsin B, L und S
6.2.3.4Fluoreszein-Markierung von rOv17, trOv17 und rOv33
6.2.4Immunologische Methoden
6.2.4.1SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
6.2.4.2Western Blot
6.2.4.3Immunisierung von BALB/c Mäusen
6.2.4.4ELISA
6.2.4.4.1Zytokin-ELISA
6.2.4.4.2ELISA zur Quantifizierung der Onchocystatin Ausscheidung durch O. volvulus Weibchen
6.2.4.5FACS-Analyse zur Bestimmung der Zielzelle(n) von rOv17
6.2.4.6Bestimmung der Expression von HLA-DR, CD40, CD80 und CD86 auf humanen Monozyten in Anwesenheit von rOv17 und trOv17
6.2.4.7Präparation von Mausmilzzellen
6.2.4.8Präparation von humanen PBMC
6.2.4.9Depletion von CD14+-Zellen
6.2.4.10PHA-Stimulation von humanen PBMC
6.2.4.11Anti-CD3 Ak-Stimulation von humanen PBMC
6.2.4.12Antigenspezifische Stimulation von humanen PBMC
6.2.4.13Stimulation von CD14+-depletierten, humanen PBMC mit anti-CD3 Ak / anti-CD28 Ak und PHA
6.2.4.14Antigenspezifische Stimulation von Mausmilzzellen
6.2.4.15Gewinnung von Zellkulturüberständen
6.2.4.16Ernten 3H-Thymidin markierter Zellen und Szintillationsmessung
6.2.4.17LPS-Konzentrationsbestimmung
6.2.5Statistische Auswertung
Bibliographie Literatur
Anhang A Publikationen
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Übersicht über die Klonierungs- und Expressionsdaten von rOv17, trOv17 und rOv33
Tab. 2: Titrierte Konzentrationen von Papain und Cathepsin B, L und S mit E64 und EwC.
Tab. 3: KM-Werte für Papain und Cathepsin B, L, und S. Für die Bestimmung der KM-Werte wurde die Aktivität der Proteasen bei verschiedenen Substratkonzentration bestimmt. Die KM-Werte wurden durch Doppelbestimmungen ermittelt.
Tab. 4: Ki-Werte von rOv17 und trOv17 für Papain und Cathepsin B, L und S. Die Bestimmung der Ki-Werte erfolgte durch die Messung der Änderung der Proteasenaktivität in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33. Für die Bestimmung derKi-Werte wurden Doppelbestimmungen durchgeführt.
Tab. 5: LPS-Gehalt der aufgereinigten Proteinfraktionen und LPS-Konzentration im Zellkulturüberstand nach Einsatz verschiedener Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33.
Tab. 6: Substrate und Substratkonzentration im Titrationstest.
Tab. 7: Testparameter für die KM-Wert-Bestimmung.
Tab. 8: Testparameter für die Bestimmung der Ki-Werte.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Entwicklungszyklus der Filarie O. volvulus. (Quelle: Archiv des Lehrstuhls für Molekulare Parasitologie, Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin.)
Abb. 2: Aminosäuresequenzvergleich von Onchocystatin und humanem Cystatin C, D, E/M, F und S. Die Numerierung bezieht sich auf die Sequenz von Onchocystatin. Übereinstimmung von Onchocystatin mit Cystatin C 18%, Cystatin D 22%, Cystatin E/M 18%, Cystatin F 17% und Cystatin S 21%. Bindestriche (-) stellen eingefügte Lücken dar, die einen optimalen Sequenzabgleich ermöglichen. Sterne (*) kennzeichnen identische AS. Punkte (.) markieren ähnliche AS. Kästchen markieren die aktiven, konservierten Bereiche. Unterstreichungen (_) kennzeichnen die Signalsequenzen. Die durch Linien verbundenen Cysteine stellen Disulfidbrücken dar. Die Cysteine, die durch eine durchgehende Linie verbunden sind, bilden eine Disulfidbrücke, die von allen dargestellten Cystatinen ausgebildet wird. Die gestrichelte Linie stellt eine Disulfidbrücke dar, die typischerweise von Typ 2-Cystatinen, nicht aber von Onchocystatin gebildet wird.
Abb. 3: Expression und Aufreinigung von rOv17. Spur 1: Molekulargewichtsmarker, Spur 2: Bakterienkultur ohne Induktion, Spur 3: Bakterienkultur nach 3 h Induktion mit IPTG, Spur 4: eluierte rOv17 Fraktion, Spur 5: dialysierte und sterilfiltrierte rOv17 Fraktion.
Abb. 4: Expression und Aufreinigung von trOv17. Spur 1: Molekulargewichtsmarker, Spur 2: Bakterienkultur ohne Induktion, Spur 3: Bakterienkultur nach 3 h Induktion mit IPTG, Spur 4: eluierte trOv17 Fraktion, Spur 5: dialysierte und sterilfiltrierte trOv17 Fraktion.
Abb. 5: Expression und Aufreinigung von rOv33. Spur 1: Molekulargewichtsmarker, Spur 2: Bakterienkultur ohne Induktion, Spur 3: Bakterienkultur nach 3 h Induktion mit IPTG, Spur 4: dialysierte und sterilfiltrierte rOv33 Fraktion.
Abb. 6: Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz von rOv17 und trOv17. Die Numerierung beginnt mit dem ersten Nukleotid bzw. mit der ersten Aminosäure von rOv17 ohne Signalsequenz. Der Pfeil markiert den Beginn von trOv17. Eingekästelt dargestellt ist in der Sequenz von rOv17 die AS Leucin, an deren Stelle sich in der Sequenz von trOv17 ein Serin befindet.
Abb. 7: Aminosäuresequenzvergleich von Onchocystatin, rOv17 und trOv17. Die Numerierung bezieht sich auf die Sequenz von Onchocystatin. Sterne (*) markieren identische AS. Eingekästelt dargestellt sind die konservierten, aktiven Bereiche, die an der Inhibition papainähnlicher Cysteinproteasen beteiligt sind. Grau unterlegt ist die AS, in der sich trOv17 von Onchocystatin und rOv17 unterscheidet. Anstelle des Leucins an Position 91 von Onchocystatin bzw. 70 von rOv17 befindet sich in der Sequenz von trOv17 ein Serin.
Abb. 8: Vergleich der inhibitorischen Wirksamkeit von rOv17, trOv17 und rOv33 gegenüber Papain. Die Messungen erfolgten bei 37°C. Als fluorogenes Substrat wurden Z-Phe-Arg-AMC in einer Konzentration von 25 µM eingesetzt. Dargestellt ist die normierte Geschwindigkeit der Produktbildung im steady state, die aus der nichtlinearen Regression der Sekundärdaten ermittelt wurde (Gleichung 5), als Funktion der Konzentration von rOv17, trOv17 und rOv33. Zur Normierung dienten entweder die Anfangsgeschwindigkeiten V0 (rOv17) oder die Kontrollmessungen ohne rekombinantes Protein (trOv17, rOv33).
Abb. 9: Inhibition von Cathepsin B durch rOv17. A: Primärplot: Die Aktivität von Cathepsin B wurde fluorimetrisch in Anwesenheit verschiedener rOv17 Konzentrationen bestimmt. Die Messungen erfolgten bei 37°C. Als fluorogenes Substrat wurden Z-Arg-Arg-AMC in einer Konzentration von 40 µM eingesetzt. Dargestellt ist die gemessene Produktbildung in Fluoreszenzeinheiten [FE] in Abhängigkeit von der Zeit, zusammen mit den jeweils durch nichtlineare Regression ermittelten Kurvenverläufen nach Gleichung 3 zur Bestimmung der Sekundärdaten Vi, V0 und Kobs. B: Sekundärplot. Dargestellt ist die normierte steady state Geschwindigkeit der Produktbildung, die aus der nichtlinearen Regression der Sekundärdaten ermittelt wurde (Gleichung 5), in Abhängigkeit von der rOv17 Konzentration. Zur Normierung der Geschwindigkeit diente die Geschwindigkeit der Kontrollmessungen ohne Inhibitor.
Abb. 10: Inhibition von humanem Cathepsin L durch rOv17. A: Primärplot. Die Aktivität von Cathepsin L wurde fluorimetrisch in Anwesenheit verschiedener rOv17 Konzentrationen (wie angegeben) bestimmt. Die Messungen erfolgten bei 37°C. Als fluorogenes Substrat wurden Z-Phe-Arg-AMC in einer Konzentration von 5 µM eingesetzt. Dargestellt ist die gemessene Produktbildung in Fluoreszenzeinheiten [FE] in Abhängigkeit von der Zeit, zusammen mit den jeweils durch nichtlineare Regression ermittelten Kurvenverläufen nach Gleichung 3 zur Bestimmung der Sekundärdaten Vi, V0 und Kobs. B: Sekundärplot. Dargestellt ist das Ergebnis der lineraren und nichtlinearen Regression der Sekundärdaten zur Ermittlung des Ki-Wertes. Y1 (blau): Normierte steady state Geschwindigkeit der Produktbildung in Abhängigkeit von der rOv17-Konzentration (Gleichung 5). Zur Normierung diente die Anfangsgeschwindigkeit V0. Y2 (rot): pre steady state Geschwindigkeitskonstante (Kobs) in Abhängigkeit von der rOv17-Konzentration (Gleichung 4).
Abb. 11: Inhibition von humanem Cathepsin S durch rOv17. A: Primärplot. Die Aktivität von Cathepsin S wurde fluorimetrisch in Anwesenheit verschiedener rOv17 Konzentrationen (wie angegeben) bestimmt. Die Messungen erfolgten bei 37°C. Als fluorogenes Substrat wurden Z-Val-Val-Arg-AMC in einer Konzentration von 40 µM eingesetzt. Dargestellt ist die gemessene Produktbildung in Fluoreszenzeinheiten [FE] in Abhängigkeit von der Zeit, zusammen mit den jeweils durch nichtlineare Regression ermittelten Kurvenverläufen nach Gleichung 3 zur Bestimmung der Sekundärdaten Vi, V0 und Kobs. B: Sekundärplot. Dargestellt ist das Ergebnis der lineraren und nichtlinearen Regression der Sekundärdaten zur Ermittlung des Ki-Wertes. Y1 (blau): Normierte steady state Geschwindigkeit der Produktbildung in Abhängigkeit von der rOv17-Konzentration (Gleichung 5). Zur Normierung diente die Anfangsgeschwindigkeit V0. Y2 (rot): pre steady state Geschwindigkeitskonstante (Kobs) in Abhängigkeit von der rOv17-Konzentration (Gleichung 4).
Abb. 12: Vergleich der inhibitorischen Wirksamkeit von rOv17, trOv17 und rOv33 gegenüber Papain. Die Messungen erfolgten bei 37°C. Als fluorogenes Substrat wurden Z-Phe-Arg-AMC in einer Konzentration von 25 µM eingesetzt. Dargestellt ist die normierte Geschwindigkeit der Produktbildung im steady state, die aus der nichtlinearen Regression der Sekundärdaten ermittelt wurde (Gleichung 5) als Funktion der Konzentration von rOv17, trOv17 und rOv33. Zur Normierung dienten entweder die Anfangsgeschwindigkeiten V0 (rOv17) oder die Kontrollmessungen ohne rekombinantes Protein (trOv17, rOv33).
Abb. 13: Inhibition der PPD-spezifischen T-Zell-Proliferation durch rOv17 und trOv17. PBMC von 3 Spendern wurden mit 10 IE/ml PPD stimuliert und jeweils in Dreieransätzen mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 90 h inkubiert. Die Proliferation der Zellen wurde durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA während der letzten 20 h der Inkubation quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte der Proliferation [cpm] ± Standardabweichung von 3 unabhängig voneinander durchgeführten Tests (A-C) mit 3 Spendern.
Abb. 14: Inhibition der OvAg-spezifischen Proliferation durch rOv17 und trOv17. Milzzellen OvAg immunisierter BALB/c Mäuse wurden in vitro mit 10 µg/ml OvAg restimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 90 h inkubiert. Die Proliferation wurde durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA der proliferierenden Zellen in den letzten 20 h der Inkubation quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte der Proliferation [cpm] ± Standardabweichung, die aus den dreifach bestimmten Proliferationswerten berechnet wurden. Der Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die OvAg-spezifische Proliferation wurde in 2 unabhängig voneinander durchgeführten Tests (A und B) untersucht. Pro Test wurden die Milzzellen von 3 Mäusen präpariert.
Abb. 15: PPD-stimulierte T-Zell-Proliferation in Anwesenheit von EwC und E64. Humane PBMC wurden in vitro mit 10 IE/ml stimuliert und mit 0,5 µM EwC und E64 für 90 h inkubiert. Die Proliferation der Zellen wurde durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA während der letzten 20 h der Inkubation bestimmt. Die Proben wurden in Dreieransätzen getestet, aus denen die Mittelwerte der Proliferation [cpm] und die Standardabweichungen berechnet wurden. Dargestellt sind 2 unabhängig voneinander durchgeführte Versuche (A und B) mit jeweils 1 Spender.
Abb. 16: Konzentrationsabhängige Inhibition der PHA-stimulierten Proliferation durch rOv17. Humane PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17 für 72 h inkubiert. Die Quantifizierung der Proliferation erfolgte durch die Messung der Radioaktivität der Zellen nach dem Einbau von 3H-Thymidin in die DNA während der letzten 20 h der Inkubation. Die rekombinanten Proteine und die Kontrollen wurden in Dreieransätzen getestet, aus denen der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet wurden. Dargestellt sind 2 unabhängig voneinander durchgeführte Tests (A und B) mit jeweils 1 Spender.
Abb. 17: Inhibition der PHA-stimulierten Proliferation humaner PBMC durch rOv17 und trOv17. PBMC von 10 Spendern wurden mit PHA stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 72 h inkubiert. Dargestellt sind die Proliferationswerte in [%] in Bezug auf die PHA-Kontrolle. Die Mittelwerte der Proliferation der 10 Spender sind durch Querstriche dargestellt.
Abb. 18: Neutralisation der durch rOv17 induzierten verminderten PHA-stimulierten Proliferation durch den Einsatz eines anti-rOv17 Kaninchenserums. PHA-stimulierte PBMC wurden mit 0,5 µM rOv17 und dem anti-rOv17 Kaninchenserum für 72 h inkubiert. Als Kontrollserum wurde ein anti-Eimerien-Kaninchenserum verwendet. Die Proliferation der Zellen wurde durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA während der letzten 20 h der Inkubation quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte der Proliferation [cpm] ± Standardabweichung, die aus den durchgeführten Dreifachbestimmungen berechnet wurden. Dargestellt ist das Ergebnis von 2 unabhängig voneinander durchgeführten Test (A und B) mit 2 Spendern.
Abb. 19: Inhibition der anti-CD3 Ak-stimulierten Proliferation durch rOv17 und trOv17. PBMC wurden mit immobilisierten anti-CD3 Ak stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 72 h inkubiert. Die Kontrollen und rekombinanten Proteine wurden in Dreieransätzen getestet. Die Proliferationswerte sind in [%] im Vergleich zur anti-CD3 Kontrolle dargestellt. Die Mittelwerte sind durch Querstriche dargestellt.
Abb. 20: Bindung und Aufnahme von Fluos-rOv17, Fluos-trOv17 und Fluos-rOv33 durch Granulozyten und Monozyten. A: Granulozyten. B: Monozyten. C: Lymphozyten. RPMI-verdünntes Blut wurde mit 0,25 µM Fluos-rOv17, Fluos-trOv17 oder Fluos-rOv33 für 2 h bei 37°C inkubiert. Nach Aufbereitung der Zellen wurde die Bindung und Aufnahme der Fluos-markierten Proteine im Durchflußzytometer ausgewertet. Dargestellt ist der Mittelwert der mittleren Fluoreszenzintensität ± Standardabweichung. Das Bindungsverhalten von rOv17, trOv17 und rOv33 wurde mit PBMC von 5 Spendern in 3 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen charakterisiert.
Abb. 21: Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die PHA-stimulierte Proliferation von PBMC mit und ohne Depletion von Monozyten. Humane PBMC von 4 Spendern mit und ohne Monozyten wurden mit PHA stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 oder rOv33 für 72 h inkubiert. A, C, E, G: PHA-Stimulation von Monozyten-depletierten PBMC. B, D, F, H: PHA-Stimulation der gesamten PBMC-Fraktion. Dargestellt sind die Mittelwerte der Proliferation [cpm] ± Standardabweichung, die aus den Dreifachbestimmungen berechnet wurden.
Abb. 22: Stimulation der TNF-alpha, IL-10 und IL-12 Produktion von unstimulierten humanen PBMC durch rOv17 und trOv17. PBMC von 6-8 Spendern wurden mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 6 h (TNF-alpha) oder 48 h (IL-10, IL-12p40) inkubiert. Die Medianwerte der gemessenen Zytokinkonzentrationen sind als Querstriche dargestellt. A: TNF-alpha Produktion. B: IL-10 Produktion. C: IL-12p40 Produktion.
Abb. 23: Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Zytokinproduktion stimulierter humaner PBMC. PBMC von 10 Spendern wurden mit immobilisierten anti-CD3 Ak stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 48 h inkubiert. Die Medianwerte der gemessenen Zytokinkonzentrationen sind als Querstriche dargestellt. A: IL-10 Produktion. B: IL-12p40 Produktion. C: IFN-gamma Produktion.
Abb. 24: Inhibition der HLA-DR-Expression von humanen Monozyten durch rOv17 und trOv17. Humane PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 für 72 h inkubiert und die HLA-DR-Expression mittels FACS-Analyse bestimmt. Monozyten wurden durch PE-Cy5-markierte anti-CD14 Ak identifiziert und deren HLA-DR-Expression durch PE-markierte anti-HLA-DR Ak quantifiziert. Dargestellt ist die prozentuale HLA-DR-Expression der mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubierten Monozyten im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rekombinante Proteine. 100% HLA-DR-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 2000-3000. Getestet wurden 2 Spender in 2 unabhängig voneinander durchgeführten Tests (A und B).
Abb. 25: Modulation der Expression von CD40, CD80 und CD86 durch rOv17 und trOv17. Humane PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 für 72 h inkubiert. Die Expression der kostimulatorischen Moleküle wurde mittels FACS-Analyse bestimmt. Monozyten wurden dabei durch PE-Cy5-markierte anti-CD14 Ak identifiziert und die Expression der kostimulatorischen Moleküle durch FITC-markierte anti-CD40 Ak oder anti-CD80 Ak und durch PE-markierte CD86 Ak quantifiziert. Dargestellt ist die prozentuale Expression von CD40, CD80 und CD86 der mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubierten Monozyten im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rOv17, trOv17 und rOv33. 100% CD40-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 100-200, 100% CD80-Expression einer von 30-40 und 100% CD86-Expression einer von 200-350. Dargestellt sind die Ergebnisse von 2 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen mit 2 Spendern. A-C: Spender 1. D-F: Spender 2. A und D: CD40-Expression. B und E: CD80-Expression. C und F: CD86-Expression.
Abb. 26: Neutralisation der supprimierenden Wirkung von rOv17 und trOv17 auf die HLA-DR-Expression durch die Neutralisation von IL-10. PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 und mit 5 µg/ml anti-IL-10 Ak oder einem Isotyp-Kontroll Ak für 72 h inkubiert. Die HLA-DR-Expression wurde mittels FACS-Analyse bestimmt. Dargestellt ist die prozentuale Expression von HLA-DR der Monozyten, die mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubiert wurden, im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rekombinante Proteine. 100% HLA-DR-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 2000-4000. Dargestellt sind die Ergebnisse von 2 unabhängigen Versuchen mit 2 Spendern. A-C: Spender 1. D-F: Spender 2.
Abb. 27: Neutralisation der supprimierenden Wirkung von rOv17 und trOv17 auf die CD40-Expression durch die Neutralisation von IL-10. PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17, rOv33 und mit 5 µg/ml anti-IL-10 Ak oder 5 µg/ml Isotyp-Kontoll Ak für 72 h inkubiert. Die Expression von CD40 wurde mittels FACS-Analyse quantifiziert. Dargestellt ist die prozentuale Expression von CD40 der mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubierten Monozyten im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rOv17, trOv17 und rOv33. 100% CD40-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 120-200. Dargestellt sind die Ergebnisse von 2 unabhängigen Versuchen mit 2 Spendern. A-C: Spender 1. D-F: Spender 2.
Abb. 28: Expression von CD80 in Anwesenheit von rOv17 und neutralisierenden anti-IL-10 Ak. PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 und mit 5 µg/ml anti-IL-10 Ak oder mit 5 µg/ml eines Isotyp-Kontroll Ak für 72 h inkubiert. Die Monozyten wurden durch PE-Cy5-markierte anti-CD14 Ak identifiziert und die Expression von CD80 durch FITC-markierte anti-CD80 Ak im Durchflußzytometer quantifiziert. Dargestellt ist die prozentuale CD80-Expression der Monozyten, die mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubiert wurden, im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rOv17, trOv17 und rOv33. 100% CD80-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 30-60. Dargestellt sind die Ergebnisse von 2 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen mit 2 Spendern. A-C: Spender 1. D-F: Spender 2.
Abb. 29: Neutralisation der supprimierenden Wirkung von rOv17 und trOv17 auf die CD86-Expression durch die Neutralisation von IL-10. Die PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von rOv17, trOv17 und rOv33 und mit 5 µg/ml anti-IL-10 Ak oder mit 5 µg/ml des Isotyp-Kontroll Ak für 72 h inkubiert. Die Expression von CD86 wurde nach der Markierung mit PE-konjugierten anti-CD86 Ak im Durchflußzytometer quantifiziert. Dargestellt ist die prozentuale CD86-Expression der Monozyten, die mit rOv17, trOv17 und rOv33 inkubiert wurden, im Vergleich zu den Kontrollansätzen ohne rekombinante Proteine. 100% CD86-Expression entsprechen einer mittleren Fluoreszenzintensität von 250-350. Dargestellt sind die Ergebnisse von 2 unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen mit 2 Spendern. A-C: Spender 1. D-F: Spender 2.
Abb. 30: Zytokinproduktion von stimulierten humanen PBMC in Anwesenheit von rOv17, trOv17 und neutralisierenden Ak. Humane PBMC von 4 Spendern wurden mit immobilisierten anti-CD3 Ak stimuliert und mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 für 48 h inkubiert. Dargestellt sind die Mittelwerte der Zytokinproduktion ± SEM. A: IL-12 Produktion. B: IFN-? Produktion.
Abb. 31: Einfluß von rOv17 und trOv17 auf die Proliferation nach Neutralisation von IL-10. Anti-CD3 Ak-stimulierte PBMC wurden mit 0,5 µM rOv17, trOv17 und rOv33 und mit 5 µg/ml anti-IL-10 Ak inkubiert. Als Kontrolle wurde ein Isotyp-Kontroll Ak eingesetzt. Dargestellt sind die Proliferationswerte [%] von 4 Spendern im Vergleich zur entsprechenden anti-CD3 Ak-Kontrolle.
Abb. 32: Übersicht über die immunmodulierenden Eigenschaften von rOv17 und trOv17.
Abb. 33: Generierung von Peptid-beladenen MHC-II-Komplexen unter Beteiligung von Cathepsinen und mögliche Beeinflussung dieser Funktion durch rOv17 und trOv17. Cat: Cathepsin, Leg: Legumain, li: invariante Kette, Clip: class-II associated invariant chain peptide,? alphabeta: ?MHC-II-Molekül,?alphabeta-li: li-assoziiertes MHC-II-Molekül, alphabeta-lip10: li-Fragment p10-assoziiertes MHC-II-Molekül, ?alphabeta-Clip: Clip-assoziierte MHC-II-Moleküle.
Die Bildung von Peptid-beladenen MHC-II-Komplexen ist die Voraussetzung für eine erfolgreiche antigenspezifische Immunantwort. Cathepsine erfüllen hierbei zwei wichtige katalytische Prozesse. Zum ersten prozessieren Cathepsine im endosomal-lysosomalen Kompartiment Antigen und generieren Peptide, die anschließend, gebunden an MHC-II-Moleküle, auf der Oberfläche der APZ präsentiert werden. Zum zweiten vermitteln Cathepsine die Prozessierung der MHC-II-assoziierten invarianten Kette, die zur Bildung Clip-assoziierter MHC-II-Moleküle führt. Die Generierung von Clip, welches die antigene Bindungsgrube der MHC-II-Moleküle blockiert, ermöglicht anschließend die Beladung von MHC-II-Molekülen mit antigenen Peptiden. Dabei wird Clip unter Beteiligung der MHC-II-ähnlichen Moleküle HLA-DM und HLA-DO gegen das antigene Peptid ausgetauscht. Das Peptid-beladene MHC-II-Molekül kann nun auf der Oberfläche der APZ präsentiert werden und die antigenspezifische Immunantwort induzieren. An der Prozessierung von li sind Aspartyl- und Cysteinproteasen beteiligt. Die vollständige Prozessierung von li zum MHC-II-assoziierten Clip-Fragment erfolgt jedoch unter Beteiligung spezifischer Cysteinproteasen. So vermittelt Cathepsin S die Generierung von Clip in B-Zellen und DZ, Cathepsin L in Thymusepithelzellen und Cathepsin F in Makrophagen. Eine Inhibition der Aktivität von Cysteinproteasen durch rOv17 und trOv17 könnte daher zu einer Beeinflussung der Prozessierung von Antigen und zu einer Behinderung der Beladung von MHC-II-Molekülen mit antigenen Peptiden führen, in deren Folge die Präsentation der APZ vermindert ist.
Abb. 34: Homologe Aminosäuresequenzabschnitte von Onchocystatin mit der humanen MSK 1 und dem humanen MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1. Der Aminosäureabgleich mit Proteinen der Swisspir-Datenbank hat eine Sequenzhomologie von Onchocystatin mit der humanen MSK 1 und dem humanem MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1 ergeben. A: Aminosäuresequenzähnlichkeit von Onchocystatin mit der humanen MSK 1. Der grau unterlegte Bereich kennzeichnet den Sequenzabschnitt (AS 116 bis 162), in dem Onchocystatin mit der MSK1 zu 29% homolog ist. B: Aminosäuresequenzähnlichkeit von Onchocystatin mit dem humanen MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1. Die 3 grau unterlegten Bereiche kennzeichnen die Sequenzabschnitte in denen Onchocystatin Homologien zum humanem MPM2-reaktiven Phosphoprotein 1 besitzt. Der erste Bereich umfaßt die AS 33 bis 83 und weist eine Homologie von 23% auf. Der zweite Bereich umfaßt die AS 76 bis 96 und besitzt eine Homologie von 38%, der dritte Bereich umfaßt die AS 101 bis 129 und hat eine Homologie von 27%. Unterstrichen dargestellt ist die Signalsequenz von Onchocystatin.

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