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3  MATERIAL UND METHODEN

3.1 LÖSUNGEN

3.1.1 LISS

Zur Herabsetzung des Zetapotentials der Erythrozytenoberfläche und Durchführung des Gelkartentests werden die Testerythrozyten in Diluent 2 (DiaMed AG, Cressier sur Morat, Schweiz), einer mit Trimethoprim und Sulfamethoxazol modifizierten Low Ionic Strength Solution (LISS), aufgeschwemmt.

3.1.2 Aufbewahrungslösung

Die Testerythrozyten werden in CellStab (DiaMed Ag, Cressier sur Morat, Schweiz), einem Glycin-Kochsalzpuffer, der mit Trimethoprim und Sulfameth­oxazol versetzt ist, aufbewahrt.

3.1.3 Chromchloridlösung

Chromchlorid ist in der Lage, Proteine, hier IgA, unspezifisch auf Zellmembranen zu binden. 1g des Pulvers (Sigma Chemical, St. Louis, USA) wird in 100ml NaCl 0,9% gelöst. Von dieser Stammlösung kann mit NaCl 0,9% eine Konzentration von 0,039µg/µl hergestellt werden [35,36 und eigene Vorversuche].


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3.2  IMMUNGLOBULINE / ANTIKÖRPER

3.2.1 IgA

Aus humanem Plasma gewonnenes affinitätsgereinigtes IgA, das ein Gemisch aller Subklassen darstellt (Dako, Carpinteria, USA), wird als Antigen an die Poly­styrolbeads bzw. an die Erythrozyten gekoppelt.

Für die Bestimmung der Subklassenspezifität wird affinitätsgereinigtes IgA1 und IgA2 (Calbiochem, San Diego, USA) verwendet.

3.2.2 Antiglobulinseren

Mit monoklonalen Antiglobulinseren gegen humanes IgA, IgG und IgM (Biotest AG, Dreieich) wird die Kopplung des IgA an die Polystyrolbeads und Testery­throzyten und die Spezifität der Kopplung überprüft.


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3.3  Gelkartentest - Micro-Typing System

Dieses System ermöglicht den Nachweis und die Spezifizierung verschiedener Antikörper gegen Erythrozytenantigene mit praktisch allen Methoden, die auch im klassischen Röhrchentest zur Anwendung kommen. Der wesentliche Vorteil dieser Methode liegt in dem geringen Verbrauch an Zellen und Serum, einer standardisierten Beurteilung und einer höheren Sensitivität und Spezifität [38,39,40,41,42,43,44]. Die Erythrozyten durchwandern eine Gelmatrix, in der sie je nach Stärke der Agglutination weiter oben oder unten bzw. bei keiner Agglutination gar nicht hängenbleiben und als roter Ring sichtbar sind (Abbildung 1, Abbildung 2). Zudem sind die Ergebnisse für eine gewisse Zeit in den Gelsäulen der Karte auch später noch ablesbar und die Handhabung des Systems ist einfach.


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3.4  PaGIA-BEADS

Rot eingefärbte Polystyrolpartikel von ca. 3µm Durchmesser und hoher Dichte (1,3g/cm3), deren physikalische Eigenschaften gegenüber der Matrix des Gelkartentests denen von Erythrozyten entsprechen, dienen als Träger für IgA Moleküle. Sie werden in PBS gepuffert als 0,15%-ige Suspension verwendet [45].


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3.5  HERSTELLUNG der PaGIA-BEADS

Geeignete synthetische Partikel aus Polystyrol werden mit der Dispersions-Polymerisation hergestellt. Zuerst werden sogenannte Basis-Partikel von 2,3µm Durchmesser synthetisiert, die dann in einem zweiten Schritt durch Copolymerisierung mit Styrol/Bromstyrol zu High-Density Partikeln von 3,1µm Durchmesser und 1,28g/cm3 Dichte „geschwollen“ werden. Schließlich werden sie mit Sudan IV rot eingefärbt [45,46].

Die Partikel werden nun über mehrere Schritte mit Glutaraldehyd zu Aldehyd-Partikeln funktionalisiert. Danach werden sie über ebenfalls mehrere Schritte mit Streptavidin behandelt (streptavidinisiert). Die Partikel werden dann mit biotinylierten Antikörpern inkubiert. Abschließend werden die Partikel gewaschen und mit PBS zu einer gebrauchsfertigen 0,15%-igen Lösung suspendiert [45,46]. Zur Erleichterung der Arbeit wurden die Beads von der Firma DiaMed AG (Cressier sur Morat, Schweiz) bestellt und mit den gewünschten Antikörpern beladen (gecoated) und für die Lagerung stabilisiert.


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3.6  HERSTELLUNG der TESTERYTHROZYTEN

Von ca. sieben Tage alten Erythrozytenkonzentraten der Blutgruppe 0 Rhesus (D) negativ werden ca. 500µl viermal mit NaCl 0,9% gewaschen. Die Erythrozyten werden bei 3.000 UpM für fünf Minuten zentrifugiert, der Überstand mit der Wasserstrahlpumpe abgesaugt und das Sediment in der isotonischen Kochsalzlösung resuspendiert. Nach dem Waschen wird das Sediment mit NaCl 0,9% 1:1 suspendiert.

In einem 10ml Glasröhrchen werden 250µl IgA-Lösung (mit NaCl 0,9% auf 0,65µg/µl eingestellt) mit 500µl der Erythrozytensuspension durchmischt und dazu 2,5ml der Chromchloridlösung (0,039µg/µl) gegeben. Das Röhrchen wird sofort kräftig geschüttelt und für 25 Minuten bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend werden die beladenen Zellen wie zuvor viermal mit NaCl 0,9% gewaschen. Zum Nachweis einer stattgefundenen IgA-Kopplung und zum Ausschluß einer Kopplung anderer Immunglobuline aus Verunreinigungen des kommerziellen IgA werden direkte Antiglobulinteste (DAT) in der Gelkarte mit anti-IgA, anti-IgG und anti-IgM durchgeführt. Die beladenen Erythrozyten werden nun zur Aufbewahrung in CellStab suspendiert und bei 4°C wenige Tage aufbewahrt.

Zum Gebrauch in der Gelkarte werden die Testerythrozyten erneut in NaCl 0,9% gewaschen und mit Diluent 2 zu einer 1%-igen Lösung suspendiert. In dieser Lösung können sie einige Tage aufbewahrt werden, bevor der Überstand hämolytisch wird und die gewaschenen Erythrozyten deutlich vermehrt agglutinieren.

3.6.1 Negativkontrollen

Auf dieselbe Weise wie oben beschrieben werden Erythrozyten desselben Spenders nur mit Chromchlorid inkubiert, gewaschen und aufbewahrt. Hierzu genügt etwa ein Fünftel bis ein Zehntel obiger Menge. Ein weiterer Teil derselben Ery­throzytencharge als unbehandelte Negativkontrolle wird nur gewaschen und in CellStab aufbewahrt bzw. zur Testung in Diluent 2 1%-ig suspendiert.


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3.6.2  Optimierung der Kopplung

Da verschiedene Arbeitsanleitungen [36,47] zur unspezifischen Beladung in der Literatur beschrieben sind, wurde durch Titerreihen mit Seren gesunder Spender eine optimale Konzentration aller Reagenzien gesucht, bei der die Testerythrozyten weder spontan noch durch normale Seren agglutinieren. Die Chromchloridkonzentration ist maßgebend und muß niedrig sein. Es darf nur kurz mit Erythrozyten durchgemischt werden. Nichtbeachtung dessen führt zu Spontanhämolysen und -agglutinationen sowie zu mangelnder oder fehlender Kopplung.

Die Konzentrationen der Erythrozyten und des IgA sind zweitrangig, solange genügend IgA-Moleküle zur Verfügung stehen. Allerdings spielt das Alter der Erythrozyten eine wichtige Rolle, da ganz frische Erythrozyten fast immer spontan während der Kopplung agglutinierten und zu alte (>10 Tage) stets beim Waschen zu einem Großteil lysierten.

Trotz optimaler Herstellung sind die Testerythrozyten in vielen Fällen nur zwei Tage sicher zu verwenden. Einige Chargen zeigten auch nach sieben Tagen keine Spontanagglutinationen. Allerdings zeigen solche Erythrozyten meistens Hämolyse.

Einige Chargen wurden an verschiedenen Tagen mit denselben Seren inkubiert und zeigten verschiedene Titer. Dieses gilt sowohl für unspezifische Reaktionen mit Seren gesunder Spender als auch für Seren von Patienten mit anti-IgA Antikörpern. Die Schwankungen der Titerstufen bei der Verwendung von Testerythrozyten war nicht vermeidbar. Dadurch können auch falsch positive Reaktionen resultieren.

Die Seren gesunder Blutspender zeigten praktisch immer Agglutinationen mit Testerythrozyten. Die Reaktionen waren variabel (Titerstufen von 1:1 bis 1:80).


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3.7  GEWINNUNG und AUFBEREITUNG der SEREN

Geronnenes Nativblut von Patienten aus der Blutspenderoutine des Virchow Klinikums wird fünf Minuten bei 3.000 UpM zentrifugiert und das abgetrennte Serum sodann in Eppendorfhütchen pipettiert. Die Lagerung des Serums erfolgt bei -30°C. Bei Bedarf läßt es sich auftauen und bei 4°C einige Tage aufbewahren.

Die Seren der IgA defizienten Patienten stammen aus eingefrorenen Beständen des Zentrallabors Bern des Schweizer Roten Kreuzes (ZLB SRK, Frau R. Krieg) und des Virchow Klinikums.

Die Antikörper werden in einer geometrischen Verdünnungsreihe der Seren ermittelt. Diese werden dazu jeweils 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 usw. mit NaCl 0,9% verdünnt, indem 200µl Kochsalzlösung in ein Glasröhrchen vorgelegt werden und aus der vorhergehenden Verdünnungsstufe dieselbe Menge hineinpipettiert und gemischt wird. Zur Antikörpersuche ist eine Reihe bis 1:64 in der Regel ausreichend. Bei Nachweis eines anti-IgA Antikörpers kann die Verdünnungsreihe fortgeführt werden.

Um unspezifische Reaktionen mit Serum auszuschließen, wurde jede neue Charge Testerythrozyten mit Seren gesunder Blutspender des jeweiligen Tages getestet. Auch hier wurde - wie oben beschrieben - eine Verdünnungsreihe bis 1:64 angefertigt.


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3.8  NACHWEISMETHODEN von ANTI-IGA ANTIKÖRPERN

3.8.1 Prinzip des Gelkartentests

Die ID-Gelkarten (DiaMed AG, Cressier sur Morat, Schweiz) werden seit einigen Jahren routinemäßig in der Blutgruppenserologie verwendet.

Abbildung 1: Nachweis von IgA auf Erythrozyten / Gelmatrix mit Agglutinaten

Eine Karte enthält sechs trichterförmige Vertiefungen, an die sich die aus Sephadex, einem Dextrangel, bestehenden Gelsäulen anschließen (Abbildung 1). Das Gel kann auf Kochsalzbasis neutral oder mit unterschiedlichen Antikörpern (Coombskarte) oder Reagenzien entsprechend der Fragestellung präpariert werden. Die Antigenträger, Beads oder Erythrozyten, werden als Suspension in die Vertiefungen pipettiert und anschließend das Serum dazugegeben. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird die Karte 10 Minuten bei 980 UpM (80g) in der Kartenzentrifuge der Firma DiaMed zentrifugiert. Agglutinate können die Gelmatrix je nach ihrer Größe nur teilweise oder gar nicht durchwandern, während nicht agglutinierte Beads oder Erythrozyten bis auf den Boden der Säule gelangen. Starke Antigen-Antikörperreaktionen zeigen sich durch einen roten Ring im oberen Bereich der Gelsäule und fehlende Reaktionen durch einen roten Bodensatz. Mischagglutinationen ergeben ein je nach Stärke unterschiedliches Verteilungsmuster innerhalb der Gelsäule.


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Abbildung 2: Schema der Reaktionsmuster im Gelkartentest

Zum Nachweis von anti-IgA Antikörpern im Plasma oder Serum wurden IgA beladene Erythrozyten oder Beads verwendet.

3.8.2 Particle Gel Immuno Assay (PaGIA)

Je Säule werden 10µl Serum in die Vertiefung pipettiert und anschließend 20µl der gebrauchsfertigen Partikelesuspension hinzugefügt. Nach 5 Minuten Inkubationszeit wird die Karte wie oben beschrieben zentrifugiert. Die verwendete Karte ist speziell den Beads, die kleiner als Erythrozyten sind, angepaßt.

3.8.3 Passive Hämagglutination (PHA) - Gelkartentest

50µl der Testerythrozytensuspension werden in jede Säule einer Coombskarte pipettiert und danach 25µl Serum hinzugefügt. Nach 15 Minuten Inkubationszeit wird die Gelkarte entsprechend zentrifugiert.

Bei den untersuchten Seren wird jeweils eine Negativkontrolle zum Ausschluß antierythrozytärer Antikörper, die falsch positive Agglutinationen hervorrufen können, mit unbehandelten Erythrozyten und zum Ausschluß unspezifischer Reaktionen eine weitere mit Chromchlorid-behandelten Erythrozyten desselben Spenders durchgeführt. 50µl der Erythrozytensuspension werden mit 25µl des Serums inkubiert und zentrifugiert. Bei einer Agglutination sind positive Ergebnisse der Testerythrozyten nicht zu verwerten, und der Nachweis von anti-IgA Antikörpern muß mit Testerythrozyten eines anderen Spenders wiederholt werden.

3.8.4 PHA – Röhrchentest

50µl der Testerythrozytensuspension werden mit 100µl Serum und einem Tropfen Coombsserum in einem Coombsröhrchen gemischt und anschließend 15 Sekunden [Seite 24↓]zentrifugiert. Das Röhrchen wird unmittelbar danach über einer Lichtplatte schräg gehalten und leicht gegen diese geklopft, um eventuell im Sediment vorhandene Agglutinate sichtbar zu machen. Positive Reaktionen sind nur kurze Zeit eindeutig ablesbar. Wie beim Gelkartentest müssen die entsprechenden Negativkontrollen mitgeführt werden.

3.8.5 IgA-Testerythrozyten

Die Kopplung an die Testerythrozyten gelingt nicht immer sicher, da die behandelten Erythrozyten relativ häufig spontane Agglutinationen zeigen. Deshalb wird ein direkter Antiglobulintest mit je einem monoklonalen Antiglobulinserum gegen IgA, IgG und IgM sowie eine Negativkontrolle mit NaCl 0,9% durchgeführt. Auch hier werden 50µl der Erythrozytensuspension in jede Vertiefung pipettiert und 25µl des unverdünnten Antiglobulinserums bzw. NaCl 0,9% hinzugefügt, 10 Minuten inkubiert und zentrifugiert.

Die Gelsäule mit anti-IgA muß ein 4-fach positives Ergebnis (++++) aufweisen, während die drei Säulen mit anti-IgG, anti-IgM und NaCl 0,9% keine Reaktionen (-) zeigen dürfen. Sollte diese Konstellation nicht erzielt werden, so darf die Charge nicht verwendet werden.

Da es auch durch Seren ohne anti-IgA Antikörper zu unspezifischen Reaktionen kommen kann, wird zum Ausschluß bzw. zur Einschätzung derselben sowohl jede neue Charge als auch nur mit Chromchlorid-behandelte Erythrozyten mit sechs bis acht unverdünnten Seren gesunder Blutspender inkubiert. Bei positiven Reaktionen wird dann der Titer ermittelt. Gleichzeitig muß eine Negativkontrolle mit unbehandelten Erythrozyten der Charge zum Ausschluß eventuell vorhandener antierythrozytärer Antikörper mitgeführt werden. 50µl der jeweiligen 1%-igen Erythrozytensuspension werden in die Vertiefung pipettiert und 25µl des Serums dazugegeben. Nach 10 Minuten Inkubation wird die Karte zentrifugiert und anschließend das Ergebnis abgelesen.


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3.9  BESTIMMUNG der IMMUNGLOBULINKONZENTRATIONEN

Zur quantitativen Bestimmung der Immunglobuline IgA, IgG und IgM im Serum durch Immunturbidimetrie wurde das Modular Gerät von Hitachi des Zentrallabors des Virchow-Klinikums verwendet (Dr. med. Müller - Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie, Direktor: Prof. Dr. med. E. Köttgen).

3.9.1 Testprinzip

Der Serumprobe werden Antikörper gegen das zu bestimmende Immunglobulin zugegeben, so daß die entstehenden Antigen-Antikörper-Komplexe kolloidal verteilt sind. Anhand der Extinktion des durchtretenden Lichts kann anhand des Lambert-Beer-Gesetzes (E=d·ε·C)die Konzentration des Immunglobulins errechnet werden. Die Messung erfolgt mit den Wellenlängen 340 nm und 700 nm.

Ca. 100µl des Serums werden in eine spezielle Küvette pipettiert und in dem Gerät vollautomatisch aufbereitet und untersucht.

Tabelle 1: Meßbereiche und Normalwerte (g/l) für IgA, IgG und IgM

 

Meßbereich

Referenzbereich

IgA

0,00 - 10,00

0,70 - 4,00

IgG

0,00 - 40,00

7,00 - 16,00

IgM

0,00 - 5,00

0,40 - 2,30


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07.06.2005