Kai Oliver Schönhage: Particle Gel Immuno Assay (ID-PaGIA) zum Nachweis von anti-IgA Antikörpern
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4  ERGEBNISSE

4.1 Immunglobulinkonzentrationen

In allen untersuchten Seren wurde die Konzentration von IgA, IgG und IgM bestimmt (Immunturbidimetrie, 3.9). Die Seren gesunder Blutspender wiesen vom Normbereich keine abweichenden Konzentrationen auf (Tabelle 3). Hingegen zeigten die nachuntersuchten Seren von Patienten mit IgA-Mangel und CVID starke Verminderung der IgA- bzw. der Immunglobulinkonzentrationen (Tabelle 4). Bei zwei Seren (##1,4) konnten die Immunglobuline wegen Materialmangels nicht bestimmt werden.

4.2 IgA-Kopplung

Zum Nachweis einer spezifischen IgA-Kopplung an die Beads und Erythrozyten wurden alle Chargen der PaGIA Beads und behandelten Testerythrozyten mit Antiglobulinseren bzw. NaCl (0,9%) im Gelkartensystem untersucht.

Alle untersuchten Chargen reagierten spezifisch mit anti-human-IgA. Anti-human-IgG und -IgM sowie NaCl führten in keinem Fall zu einer Agglutination der Beads oder Erythrozyten. Die Reaktionen im PHA waren insgesamt hier deutlich stärker als die Reaktionen im PaGIA ([LINK to link] ).

Tabelle 2: Reaktivität der Antiglobulinseren mit den Beads und IgA-Testery­throzyten

[Seite 27↓]

4.3  NACHWEIS von Anti-IgA im Serum

4.3.1 Normalseren

Es wurden insgesamt 105 Seren gesunder Blutspender aus der Blutspenderoutine des Virchow-Klinikums in einer Titrationsreihe (unverdünnt, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80) mit den IgA-beladenen Erythrozyten im passiven Hämagglutinationsassay (PHA) im ID-Micro Typing System und mit dem PaGIA getestet. Während im PHA 70 Seren zu einer Agglutination der Testerythrozyten führten (Titer 1:1 - 1:80), ließen sich im PaGIA keine positiven Reaktionen nachweisen. Die Kontrollen auf antierythrozytäre Antikörper in den Spenderseren mit unbehandelten Erythrozyten derselben Chargen waren stets negativ. Daher sind die positiven Reaktionen im PHA offensichtlich unspezifisch und können durch eine spontane Agglutination der behandelten Erythrozyten erklärt werden.

Tabelle 3: Immunglobulinkonzentrationen (g/l) und Reaktionen der normalen Serumproben

#

PaGIA

PHA

IgA

IgG

IgM

1

-

1:80

1,54

8,63

1,52

2

-

1:10

2,67

11,27

1,76

3

-

1:5

2,94

9,91

0,79

4

-

1:5

1,22

7,54

1,11

5

-

1:20

3,51

14,07

1,89

6

-

1:10

1,81

9,20

2,31

7

-

1:5

1,29

12,56

1,84

8

-

1:5

2,50

8,46

2,02

9

-

1:5

0,93

12,93

1,41

10

-

1:5

3,37

10,71

0,99

11

-

1:1

1,85

9,56

1,74

12

-

-

2,33

11,44

1,21

13

-

-

2,74

10,79

2,07

14

-

1:20

1,53

10,26

1,58

15

-

1:20

1,32

8,66

0,51

16

-

1:5

2,05

12,81

1,73

17

-

-

0,86

11,92

0,74

18

-

1:80

1,10

7,37

1,93

19

-

1:1

2,27

14,84

1,85

20

-

1:20

1,66

11,643

2,27

21

-

-

2,19

8,16

1,46

22

-

1:10

1,28

13,52

0,87

23

-

1:1

3,37

11,41

2,06

24

-

1:40

1,01

7,99

1,88

25

-

1:1

2,05

10,51

1,11

26

-

-

1,79

10,82

1,90

27

-

1:1

2,94

15,40

1,32

28

-

1:20

1,59

10,52

0,47

29

-

1:5

1,18

11,04

1,61

30

-

1:10

2,13

9,87

1,22

31

-

1:10

0,99

7,21

1,82

32

-

1:5

1,23

12,22

0,99

33

-

-

1,60

9,64

1,63

34

-

1:40

2,74

8,82

1,31

35

-

-

1,73

13,71

0,61

36

-

1:1

0,95

10,51

1,97

37

-

1:5

2,37

11,24

1,00

38

-

-

1,41

10,84

1,25

39

-

-

1,56

10,00

0,93

40

-

-

3,02

9,44

2,11

41

-

1:5

1,34

10,13

1,29

42

-

1:10

1,35

8,86

1,22

43

-

-

1,27

8,42

1,74

44

-

1:1

1,26

7,75

0,85

45

-

-

2,67

11,73

1,19

46

-

1:1

1,00

12,30

1,14

47

-

-

2,52

10,30

1,50

48

-

-

2,34

10,81

1,14

49

-

1:1

1,23

7,44

1,09

50

-

-

1,64

9,07

2,17

51

-

-

1,66

11,45

0,82

52

-

1:10

2,46

10,99

0,93

53

-

1:1

1,03

10,73

1,06

54

-

-

1,76

10,17

0,80

55

-

-

1,64

10,98

1,28

56

-

1:1

1,23

8,48

0,73

57

-

-

2,34

9,53

0,64

58

-

1:1

1,81

10,09

0,94

59

-

-

1,36

8,75

1,12

60

-

-

1,06

15,15

1,29

61

-

1:5

3,30

13,42

0,67

62

-

-

1,55

10,12

0,91

63

-

-

0,67

8,34

1,10

64

-

-

1,53

11,01

0,87

65

-

-

1,51

8,58

1,05

66

-

1:5

2,55

11,06

1,30

67

-

1:10

0,99

10,03

1,06

68

-

1:1

1,04

10,08

1,16

69

-

1:20

0,96

13,30

0,88

70

-

1:5

2,30

8,85

0,50

71

-

1:5

1,08

7,95

1,06

72

-

1:10

3,98

11,97

1,01

73

-

1:20

1,15

11,66

0,76

74

-

1:10

1,23

9,19

0,30

75

-

1:10

0,61

7,41

0,99

76

-

-

2,76

10,36

0,50

77

-

-

1,71

12,33

1,03

78

-

1:5

1,39

15,62

1,83

79

-

1:80

2,07

14,05

1,77

80

-

-

1,50

10,17

1,07

81

-

1:20

1,08

7,12

0,96

82

-

1:1

2,17

11,04

0,67

83

-

1:20

2,75

10,48

0,81

84

-

1:5

2,17

9,55

1,36

85

-

1:1

1,83

11,10

0,77

86

-

1:5

2,50

11,19

0,85

87

-

1:1

2,50

10,66

1,13

88

-

1:1

3,99

10,21

0,78

89

-

1:10

1,88

10,24

0,87

90

-

1:1

2,09

13,61

0,95

91

-

1:40

1,71

10,05

0,99

92

-

-

2,32

10,54

0,75

93

-

-

1,49

10,96

0,61

94

-

1:20

2,13

12,11

0,98

95

-

-

1,10

7,65

1,12

96

-

-

1,87

12,30

0,57

97

-

1:1

1,79

10,95

0,41

98

-

1:1

2,26

16,95

1,22

99

-

1:5

1,62

9,03

0,70

100

-

-

3,50

9,72

0,52

101

-

-

2,70

10,53

0,83

102

-

-

1,74

8,98

1,72

103

-

1:5

1,53

14,06

0,89

104

-

1:5

2,74

11,83

0,53

105

-

1:5

2,09

10,89

1,01

[Seite 29↓]

4.3.2  Patientenseren

Insgesamt wurden 34 Seren von Patienten mit bekanntem IgA-Mangel bzw. CVID untersucht (Tabelle 4). Bei elf dieser Seren lag ein selektiver IgA-Mangel vor und bei den übrigen 23 variable Immundefekte (CVID) mit zusätzlicher Erniedrigung der Immunglobulinklassen IgG und/oder IgM. Wegen Materialmangels konnten die Bestimmungen der Immunglobulinkonzentrationen der Seren ##1 und 4 mit der Diagnose sDIgA in dieser Arbeit nicht durchgeführt werden. Eine Patientin (#1) hatte eine anaphylaktische Reaktion nach Gabe von anti-Rh(D).

Tabelle 4: Immunglobulinkonzentration (g/l) und Reaktionen der Serumproben von Patienten mit IgA-Mangel bzw. CVID (n.b.: nicht bekannt;
n.u.: nicht untersucht; ↓/↑: unter-/oberhalb Normalbereich)

ID#

w/m

Alter

IgA

IgG

IgM

Diagnose

PaGIA

PHA

Ig-Gabe

1

W

34

n.u.

n.u.

n.u.

sDIgA

1:256

1:512

anti-Rh

2

W

49

0,00 ↓

25,31 ↑

4,55 ↑

sDIgA

1:80

>1:25601

i.v. IgG

3

W

31

0,00 ↓

17,63 ↑

1,09

sDIgA

1:4

1:128

i.v. IgG

4

W

50

n.u.

n.u.

n.u.

sDIgA

1:32

1:64

i.v. IgG

5

W

53

0,06 ↓

10,59

0,20 ↓

CVID

1:32

1:64

i.v. IgG

6

n.b.

n.b.

0,08 ↓

5,12 ↓

0,23 ↓

CVID

1:32

1:320

i.v. IgG

7

M

42

0,00 ↓

5,53 ↓

0,54

CVID

1:8

1:32

i.v. IgG

8

n.b.

n.b.

0,03 ↓

12,50

0,21 ↓

CVID

1:32

1:32

i.v. IgG

9

W

12

0,00 ↓

15,79

0,87

sDIgA

1:4

1:20

i.v. IgG

10

W

55

0,01 ↓

4,60 ↓

0,30 ↓

CVID

1:2

1:5

i.v. IgG

11

W

9

0,00 ↓

14,72

0,44

sDIgA

-

1:1

i.v. IgG

12

M

32

0,37 ↓

11,52

0,81

sDIgA

-

-

i.v. IgG

13

W

54

0,00 ↓

3,86 ↓

0,08 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

14

M

1

0,44 ↓

7,59

0,42

sDIgA

-

-

i.v. IgG

15

W

44

0,75 ↓

4,08 ↓

0,33 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

16

W

49

0,02 ↓

3,93 ↓

5,68 ↑

CVID

-

-

i.v. IgG

17

W

29

0,35 ↓

12,36

3,21 ↑

sDIgA

-

-

i.v. IgG

18

M

11

0,01 ↓

5,04 ↓

0,27 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

19

W

13

0,40 ↓

9,74

2,77 ↑

sDIgA

-

-

i.v. IgG

20

M

15

0,01 ↓

22,97 ↑

0,04 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

21

n.b.

n.b.

0,10 ↓

38,61 ↑

0,05 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

22

n.b.

n.b.

0,16 ↓

4,22 ↓

1,76

CVID

-

-

i.v. IgG

23

n.b.

n.b.

0,61 ↓

29,81 ↑

0,14 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

24

n.b.

n.b.

0,00 ↓

0,00 ↓

0,00 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

25

n.b.

n.b.

0,00 ↓

6,70 ↓

0,39 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

26

n.b.

n.b.

0,03 ↓

3,31 ↓

0,02 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

27

n.b.

n.b.

0,00 ↓

7,79

1,93

sDIgA

-

-

i.v. IgG

28

n.b.

n.b.

0,02 ↓

5,65 ↓

0,06 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

29

n.b.

n.b.

0,41 ↓

5,83 ↓

1,39

CVID

-

-

i.v. IgG

30

n.b.

n.b.

0,00 ↓

21,79 ↑

0,02 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

31

n.b.

n.b.

0,71 ↓

24,99 ↑

0,30 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

32

n.b.

n.b.

0,00 ↓

3,41 ↓

0,00 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

33

n.b.

n.b.

0,12 ↓

2,34

0,05 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

34

n.b.

n.b.

0,01 ↓

0,00 ↓

0,00 ↓

CVID

-

-

i.v. IgG

Von den untersuchten Serumproben zeigten 10 Seren positive Reaktion sowohl im PaGIA als auch im PHA (##1-10). Die Titer der Antikörper waren im PaGIA stets kleiner als im PHA. Außerdem führte ein Serum (#11) nur im PHA zu einer positiven Reaktion. Die übrigen Seren (##12-34) zeigten weder mit Beads noch mit Testerythrozyten Reaktionen. Somit handelt es sich bei den positiven Reaktionen eindeutig um spezifische Reaktionen gegen IgA-Moleküle.

Von den zehn positiv getesteten Seren waren fünf von den Patienten mit sDIgA (##1-4 und 9) und fünf mit der Diagnose CVID (##5-8 und 10). Hiermit beträgt die Prävalenz der anti-IgA Antikörper bei sDIgA 45% (5/11) und bei CVID 22% (5/23). Dabei fanden sich bei Patienten mit sDIgA Antikörper mit höheren Titern als bei solchen mit CVID. Die Titer blieben über mehrere Monate mit allen getesteten Serumproben (##4,5,7 und 10) und derselben Charge der Beads konstant (Tabelle 5) während im PHA teilweise innerhalb desselben Tages Schwankungen von ein bis zwei Stufen der Verdünnungsreihe (z.B. 1:8/1:16/1:32) beobachtet werden konnten. Die Titer in Tabelle 4 sind die vom 15.02.00.

[Seite 31↓]

Tabelle 5: Titer im PaGIA von 8/99 bis 2/00

#

31.8.99

29.01.00

15.02.00

4

1:32

1:32

1:32

4

1:32

1:32

1:32

7

1:8

1:8

1:8

10

1:2

1:2

1:2

Eine Gegenüberstellung der positiven und negativen Ergebnisse beider Methoden bei Gesunden und Patienten ist in Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6: positive und negative Reaktionen der beiden Testmethoden

Serum

Anzahl

PaGIAPHA

positiv/negativ

Blutspender

105

0/105

70/35

Patienten

34

10/24

11/23

4.3.3 Spezifität

Die Patientenseren ##1,2,7,8 wurden mit einem für anti-IgA1 oder anti-IgA2 spezifischen PaGIA in einer ersten Testreihe auf ihre Spezifität und Höhe des jeweiligen Titers hin untersucht. Alle vier Seren hatten klassenspezifische anti-IgA Antikörper. Für Untersuchungen weiterer Seren standen nicht genügend Serummengen zur Verfügung.

Tabelle 7: Spezifität und Titer der Antikörper (PaGIA)

#

IgA

IgA1

IgA2

1

1:256

1:256

1:256

2

1:128

1:128

1:128

7

1:8

1:32

1:32

8

1:4

1:4

1:8

4.3.4 Vergleich der Methoden

Zum Vergleich wurden die Testerythrozyten im Röhrchentest mit vier Seren von gesunden Blutspendern aus der Blutspenderoutine und mit elf Patientenseren mit [Seite 32↓]anti-IgA Antikörpern untersucht (Tabelle 8). Die Reaktionen waren erwartungsgemäß im Gelkartentest stärker als im Röhrchentest. Im PaGIA zeigten die negativen Seren keine Positivität und positive Seren eher schwächere Reaktionen.

Tabelle 8: Vergleich der Methoden

Typ

Serum #

PaGIA

PHA

Röhrchen

monoklonal

anti-IgA

1:320

1:5.120

1:1.280

"

anti-IgG

-

-

-

"

anti-IgM

-

-

-

Blutspender

A1 Rh neg.

-

-

-

"

B Rh pos.

-

-

-

"

0 Rh pos.

-

-

-

"

AB Rh pos.

-

1:20

-

Patienten

1

1:256

1:512

1:256

"

2

1:80

1:2560

1:1.000

"

3

1:4

1:128

1:8

"

4

1:32

1:64

1:32

"

5

1:32

1:64

1:32

"

6

1:32

1:320

n.u.

"

7

1:8

1:32

1:16

"

8

1:4

1:32

1:16

"

9

1:4

1:20

1:8

"

10

1:2

1:5

1:2

"

11

-

1:1

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der Humboldt-Universität zu Berlin		HTML-Version erstellt am:
07.06.2005