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5  Diskussion

In der Diagnostik und der Verlaufsbeobachtung des Sézary Syndroms kommen zur Zeit eine Vielzahl von Methoden zum Einsatz. Im Vordergrund stehen die klinische Untersuchung, klinische Laborparameter, Histopathologie, Elektronenmikroskopie, zytogenetische Analysen, Immunophänotypisierung und die Immunogenotypisierung als molekularbiologische Methode.

Insbesondere um den Erfolg der Therapie zu evaluieren, haben sich neben der klinischen Untersuchung die Immunophänotypisierung und die Genotypisierung von PBMC bzw. Hautbioptaten als objektivierbare Parameter erwiesen.

5.1 Methodik

5.1.1 FACS-Analyse und Zellsortierung

Die durchflußzytometrische Analyse von PBMC bei Sézary Syndrom Patienten war Gegenstand vieler Untersuchungen. Die Expression der T-Zell Epitope CD7 und CD26 wurde in den meisten Untersuchungen mit einer Kombination der Färbungen von CD4 und CD7 bzw. CD4 und CD26 monoklonalen Antikörpern analysiert (Novelli et al. 1995, Harmon et al. 1996, Jakob et al. 1996, Dummer et al. 1999, Laetsch et al. 2000, Rappl et al. 2001, Vonderheid et al. 2001, Schwab et al. 2002). T-Zellen exprimieren den T-Zell Marker CD3 in Kombination mit dem T-Zell Epitop CD4 oder CD8. Es konnte gezeigt werden, dass CD3 exprimierende CD8 positive Zellen in den meisten Fällen von Sézary Syndrom Patienten nur bis zu 10% der CD3+ Zellen ausmachen, d.h. bei einer klonalen Expansion von CD3+CD4+ Zellen ist der Anteil der CD3+CD8+ gering (Vonderheid et al. 2001). Der Verlust des T-Zell Epitops CD4 beim Sézary Syndrom, welches wie beschrieben in den meisten Untersuchungen verwendet wurde, ist mehrfach beobachtet worden. Um diesem möglichen Phänomen Rechnung zu tragen, wurde in unserer Untersuchung die Kombination einer CD3 und einer CD7 bzw. einer CD3 und CD26 Färbung, wie schon von Harmon et al. und Wood et al. beschreiben, gewählt (Wood et al. 1990, Harmon et al. 1996). Mit dieser Färbung erfasst man sowohl die CD4+ Zellen, die CD8+ Zellen aber auch mögliche CD4- Zellen. Das Auftreten von CD8+CD7- Lymphozyten ist beim Sézary Syndrom nicht beobachtet worden, so dass eine Expansion von CD3+CD7- Zellen sehr wahrscheinlich auf einer Expansion der CD3+CD4+CD7- Zellen beruht (Rappl et al. 2001).

Die Analyse der PBMC der Sézary Syndrom Patienten mit CD7 bzw. CD26 Antikörpern ergab ein Muster, bei dem sich die positiven und negativen Populationen nicht eindeutig [Seite 66↓]voneinander abgrenzten. Das sich in der Analyse darstellende Bild wurde von Jones et al. als straight line staining pattern beschrieben (Jones et al. 2001). Dieses Phänomen fanden viele Arbeitsgruppen, die Untersuchungen zur CD7 bzw. CD26 Expression beim Sézary Syndrom durchführten (Bogen et al. 1996, Dummer et al. 1999, Bernengo et al. 2001).

Wood et al. beschrieb 1990, dass CD7-FITC markierte Antikörper nur bis zu 76% der Zellen anfärbten, hingegen PE markierte Antikörper bis zu 97%. Diese Feststellung begründet sich wahrscheinlich in dem damaligen Aufbau der CD7-Antikörper. Als Ursache für das straight line staining pattern ist sie nicht heranzuziehen, da das beschriebene Phänomen auch bei der Verwendung von CD7-PE markierten Antikörpern auftritt. Viel wahrscheinlicher ist die Vermutung, dass die unscharfe Abgrenzung der einzelnen Populationen beim Sézary Syndrom in einem allmählichen Verlust der T-Zell Epitope aufgrund einer malignen Transformation und Expansion der Tumorzellen begründet ist bzw. in einer verminderten Stimulation und damit geringerer Expression der Antigene auf den T-Lymphozyten (Harmon et al. 1996).

In der FACS Analyse ließen sich bei den Kontrollbluten alle Populationen sauber getrennt darstellen, ein straight line staining pattern war nicht zu beobachten. Aus diesem Grund erfolgte die Festlegung der FACS-Analyse-Gates mit Hilfe von gefärbten und ungefärbten Kontroll-PBMC.

Der Anteil der CD3+CD7- Zellen in den PBMC der Kontrollen lag zwischen 12,3% und 8,6% der CD3+ Zellen. Angaben aus der Literatur beziehen sich auf die CD4+ Population. Hier wird ein Anteil der CD4+CD7- Zellen bis zu 10,6% von Bogen et al. und 3-13% von Harmon et al. angegeben (Bogen et al. 1996, Harmon et al. 1996).

Die CD3+CD26+ Zellen der Kontroll-PBMC hatten einen Anteil von 71% - 80,6% an den CD3+ Zellen. Bernengo et al. gibt einen Durchschnittswert für diese Population bei gesunden Probanden von 56,85% an (Bernengo et al. 2001). Andere Autoren nennen für die CD4+CD26+ Population einen Wert von 77% +/- 8% bzw. einen Wert zwischen 87,6% und 98% (Novelli et al. 1995, Jones et al. 2001).

Aufgrund der mechanischen Beanspruchung der Zellen während der Aufbereitung und dem Absterben einiger Zellen während der Lagerung waren in der hier durchgeführten FACS-Analyse avitale Zellen zu beobachten. Da eine Verfälschung der FACS-Ergebnisse denkbar wäre, wurden diese von der Analyse ausgeschlossen. Die vitalen Zellen hatten einen Reinheitsgrad von mehr als 99%. Diese Ergebnisse decken sich mit den Daten von Dummer et al., die den Anteil vitaler Zellen an der zu untersuchenden T-Zell Population [Seite 67↓]mit 97% angaben (Dummer et al. 1999).

Um die verschiedenen Populationen in den PBMC zu untersuchen, wurden diese mit Hilfe des CellSorters getrennt. Dabei wurden die Auswahl der Populationen so getroffen, das eine Gewinnung der Zellen mit hohem Reinheitsgrad möglich war. Er betrug für alle Populationen mehr als 99%. Auch hier decken sich die Ergebnisse mit denen von Dummer et al. (Dummer et al. 1999). Die Zellen, die aufgrund ihres Expressionsmusters nicht eindeutig einer Population zuzuordnen waren, wurden von der Untersuchung ausgeschlossen.

5.1.2 Entwicklung und Spezifität klonspezifischer Primer

Der eindeutige Nachweis von neoplastischen T-Zell Populationen mit Hilfe durchflußzytometrischer Verfahren ist schwierig, da leicht anwendbare Methoden zum Nachweis von Monoklonalität fehlen (Jones et al. 2001). Zum Nachweis von Monoklonalität bei T-Zell Lymphomen ist der Einsatz einer PCR-Analyse als Standarddiagnostik anerkannt (Weinberg et al. 1995, Willemze et al. 1997, Russel-Jones und Whittaker 1999). Eine solche PCR kann mit Primern, die das TCR-γ-Gen oder das TCR-β-Gen der klonal expandierten T-Zellen amplifizieren, durchgeführt werden. Eine weitere Möglichkeit ist die Entwicklung von klonspezifischen Primern, die das klonal expandierte TCR-Gen amplifizieren (Volkenandt et al. 1993, Trainor et al. 1996, Fraser-Andrews et al. 2001).

Für die Untersuchungen innerhalb dieser Arbeit war die Identifizierung der klonalen Sequenz notwendig. Aufgrund der limitierten Anzahl von TCR-Vγ und TCR-Jγ Segmenten und daraus resultierenden einfacheren Methodik wurde zuerst auf Klonalität einer TCR-γ-Sequenz untersucht. Dabei kamen Konsensus-Primer zum Einsatz, die in der Lage sind fast alle möglichen Rearrangements des TCR-γ zu amplifizieren. Darüber hinaus wurde eine PCR zur Bestimmung der klonalen TCR-Vβ-Sequenz durchgeführt. Hier kamen Primer für das bekannte TCR-Vβ-Gen und Konsensusprimer für das TCR-Jβ-Segment zum Einsatz. Ein klonal expandierter T-Zell Tumor stellte sich jeweils als diskrete Bande in der TGGE dar. Diese klonale Bande wurde ausgeschnitten und die DNA zur Sequenzierung extrahiert. Dieses Verfahren der Identifizierung der klonalen Sequenz ist vom Untersucher abhängig, aber in der Literatur anerkannt (Volkenandt et al. 1991, Trainor et al. 1996, Muche et al. 1997). Zur Vermeidung von Fehleinschätzungen, wurde die Bewertung von zwei erfahrenen Wissenschaftlern unabhängig überprüft.

Die auf diese Weise gewonnene Sequenz entspricht dem rearrangierten TCR-Gen eines klonal expandiertem T-Lymphozyten. Diese klonale Sequenz steht nicht automatisch auch [Seite 68↓]für die Sequenz der malignen Zellen. Da im Blut von Sézary Syndrom Patienten jedoch die malignen T-Lymphozyten alle anderen Lymphozytenpopulationen dominieren ist es sehr wahrscheinlich, dass die gefundene Sequenz auch der Sequenz der malignen Zellen entspricht. Für die hier untersuchten Proben konnte für alle Patienten die TCR-γ-Sequenz und mit Ausnahme von Patient DK auch die TCR-β-Sequenz der malignen Zellen identifiziert werden.

Ist die Sequenz einer klonalen T-Zelle bekannt, kann spezifisch für diese Sequenz ein Primerpaar entwickelt werden, so dass in einer PCR nur die gesuchte Sequenz amplifiziert wird. Entscheidend ist die Entwicklung eines Primers, der an die N-Region des TCR-Gens bindet, da diese für jeden T-Zell-Klon spezifisch ist (s.1.4.4) (Lessin et al. 1991, Volkenandt et al. 1991, Kneba et al. 1994). Dies führt im Vergleich zu einer PCR mit Konsensusprimern zu einer Steigerung der Spezifität und vor allem der Sensitivität (0,1-5% für die Konsensus-PCR vs. 0,0001% für die klonspezifische PCR) (Volkenandt et al. 1993, Muche et al. 1997, Meyer et al. 2001). Für jede ermittelte klonale Sequenz wurde ein Primerpaar, bestehend aus einem TCR-Vγ bzw. TCR-Vβ-Primer und einem Primer für die N-Region, entwickelt und getestet. Das Ergebnis war, dass für DK der klonspezifische Primer der TCR-γ-Sequenz und für FN, OS, RM und SH die klonspezifischen Primer der TCR-β-Sequenz ein spezifisches Ergebnis erbrachten. Für die Spezifität der klonspezifischen PCR ist die Bindung des klonspezifischen Primers an die N-Region von Bedeutung. Insbesondere die Länge der N-Region und deren Basenverhältnis GC : AT spielen eine Rolle, da bei der Ausbildung der drei Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Guanin und Cytosin mehr Energie frei wird als bei der Bildung der zwei Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Adenosin und Thymin (Volkenandt et al. 1991, Volkenandt et al. 1993). So führt ein hoher Anteil von Adenin und Thymin zu einer hohen Spezifität der Primer, andererseits sinkt die Annealingtemperatur und damit die Sensitivität. Ein optimales Verhältnis von GC : AT scheint bei über 2 : 1 zu liegen (Volkenandt et al. 1993). Bei den N-Regionen der TCR-γ-Sequenzen für die keine klonspezifische PCR etabliert werden konnte war zum einen die Anzahl der Basen zu gering (FN und RM mit 2 bzw. 4 Basen), zum anderen war das Verhältnis der Basen GC : AT ungünstig (OS 0,66:1, SH 0,6 : 1). Für die klonalen TCR-β-Sequenzen konnte jeweils eine klonspezifische PCR etabliert werden, hier zeigte die N-Region eine ausreichende Basenanzahl (>9) und ein günstiges Verhältnis der Basen GC : AT (>2,5). Zur Kontrolle der Spezifität wurden verschiedene Negativkontrollen (PBMC von Gesunden Probanden, PBMC von Patienten mit anderen Hauterkrankungen, PBMC von Patienten mit Sézary Syndrom und H2O) für jede etablierte PCR hinzugezogen.


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5.1.3  Quantitative PCR

Die Entstehung des PCR-Produktes wird in drei Phasen unterteilt: anfangs befindet sich die PCR in einer s.g. lag-Phase, in der das vom PCR-Produkt erzeugte Fluoreszenzsignal kleiner als das s.g. „Hintergrundrauschen“ ist. Anschließend folgt die log-Phase, in der die DNA exponentiell vervielfältigt wird bis zum Schluss eine Plateauphase erreicht wird, in der die Menge des PCR-Produkts nicht weiter zunimmt. Von der entstandenen Produktmenge kann auf die eingesetzte DNA-Menge geschlossen werden, falls die Effizienz konstant bleibt. Diese Forderung ist jedoch nur während der Log-Phase erfüllt. Beim Übergang in die Plateauphase nimmt die Effizienz ab, eine Quantifizierung ist hier nicht mehr möglich. Die Zahl der Zyklen, nach denen die PCR in die Plateauphase übergeht, ist abhängig von der DNA-Konzentration und der Menge der PCR-Reagenzien. Die Zyklen-Zahl, in denen sich die PCR in der log-Phase befindet, wird auf 4-10 Zyklen geschätzt (Jung et al. 2000, Rasmussen 2001).

Zur Abschätzung der eingesetzten DNA-Menge ist die Auftrennung des PCR-Produktes im Agarosegel als semiquantitatives Verfahren möglich. Vorteile sind die technische Einfachhheit und der geringe Zeitaufwand. Die Nachteile liegen in der niedrigen Validität durch eine hohe Abhängigkeit vom Untersucher. Da die PCR während der Plateauphase beendet wird, ist darüber hinaus die Vergleichbarkeit von zwei Produktmengen nicht möglich. Um die PCR genau in der log-Phase zu beenden wären, mehrere PCR-Ansätze mit verschiedener Zyklenzahl notwendig.

Ein anderes Verfahren ist die kompetitive PCR, bei der neben der Proben-DNA eine um Primer und PCR-Reagenzien konkurrierende Standard-DNA eingesetzt wird. Beide DNAs besitzen die gleiche Primerbindungsstelle, können über Unterschiede in der Sequenz oder Länge getrennt werden. Vorausgesetzt, im Ansatz befinden sich gleiche Mengen an Standard- und Proben-DNA, entsteht gleich viel Produkt (Äquivalenzpunkt). In einer Gelelektrophorese erscheinen die Banden dann gleich stark. Das Verhältnis zwischen Proben- und Standard-DNA bleibt auch nach Erreichen der Plateauphase konstant, gleichzeitig steigt die Sensitivität (Powell et al. 1992). Ein Nachteil ist die Notwendigkeit mehrerer PCR-Ansätze mit einer Standardverdünnungsreihe zur Ermittlung des Äquivalenzpunktes beider DNAs und die Weiterverarbeitung mittels Gelelektrophorese. (Reischl et al. 1995).

Eine real-time PCR ermöglicht die Messung der Menge doppelsträngiger DNA nach jedem Zyklus. Betrachtet man die log-Phase dieser Kurve, kann mit Hilfe eines Standards auf die [Seite 70↓]eingesetzte DNA-Menge geschlossen werden.

In der hier durchgeführten Untersuchung wurde diese Methode angewandt. Sie erweißt sich gegenüber der kompetitiven PCR als kostenintensiver, ist jedoch weniger zeitaufwendig, da sie nicht mehrere PCR-Ansätze benötig. Desweiteren ist eine Weiterverarbeitung des Produkts nach der PCR nicht notwendig, was mögliche Kontaminationen ausschließt (Sarris et al. 2002).

Bei der hier angewandten Methode der LightCycler®-PCR kam der Farbstoff SYBRGreen I® zum Einsatz. Diese Methode ist etabliert und mehrfach beschrieben worden (Jung et al. 2000, Gutzmer et al. 2001). Ein Nachteil dieser Methode ist von Eckert et al. gezeigt worden. Sie untersuchten mittels TCR-δ-PCR Blutproben von ALL-Patienten und stellten fest, dass der SYBRGreen I®-Farbstoff auch an unspezifische PCR-Produkte bindet. In der Negativprobe wurde ein Fluoreszenzsignal nachgewiesen, das nicht wesentlich niedriger als in den Proben war (Eckert et al. 2000). In der hier durchgeführten Untersuchung wurde mit Hilfe der Schmelzkurvenanalyse die Bindung von SYBRGreen I® an unspezifische PCR-Produkte analysiert. Aufgrund einer von der Ziel-DNA unterschiedlichen Länge und Sequenz weisen unspezifische Produkte verschiedene Schmelztemperaturen auf. Die Messtemperatur wurde dementsprechend so gewählt, dass unspezifische PCR-Produkte vernachlässigt werden konnten. In den Negativproben konnte bei keinem der Primer ein signifikantes Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden.

Eine Alternative zur SYBRGreen I®-Technik ist der Einsatz von Oligonukleotid Hybridisationssonden, dabei kommt es zur Bindung zweier unterschiedlicher mit Fluorescein gelabelter Sonden an der DNA nebeneinander und es entsteht ein sequenzspezifisches Signal (Rasmussen 2001). Eine weitere ist die TaqMan®-Probe, bei der ein spezifisches Fluoreszenzsignal durch Abkopplung eines s.g. Quencher, von einer spezifischen Sonde entsteht. (Sarris et al. 2002).

Der Vorteil dieser Methoden liegt in der höheren Spezifität, die mit diesen Alternativen im Vergleich zu SYBRGreen I® erreicht werden kann.

Sowohl TaqMan®- als auch Hybridisationssonden bestehen aus einer definierten Zahl von Basenpaaren um an einer konservierten TCR-V-Sequenz zu binden. Die N-Region der hier untersuchten DNA bietet mit Längen kleiner als 14 Basen nicht genügend Platz für den Einsatz dieser Sonden. Desweiteren ist die Etablierung dieser Methoden für wenige DNA-Proben hinsichtlich der Entwicklungszeit und der benötigten finanziellen Resourcen zu aufwendig.


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Als Lösung der dargestellten Problematik hat sich in dieser Arbeit der Einsatz des SYBRGreen I® mit erhöhter, an die spezifische PCR angepaßte Meßtemperatur, angeboten.

Für eine zuverlässige Quantifizierung der PCR-Produkte ist die Gewinnung zuverlässiger Standardverdünnungen wichtig. Die DNA der Standardkonzentrationen wurde aus PCR-Produkten der klonspezifischen PCR gewonnen. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte über eine photometrische Messung. Diese Methode ist zur Ermittlung unbekannter DNA-Konzentrationen beschrieben (Dummer et al. 1999).

Mit Hilfe der Crossingpoints der Standardverdünnungsreihe ist die Erstellung einer Standardkurve möglich, mit deren Hilfe auf die Konzentration der Proben geschlossen werden kann. Die Validität der Standardkurve wächst mit der eingesetzten Anzahl von Standardverdünnungen. Es musste ein Mittelweg zwischen genügender Validität und ausreichendem Probendurchsatz gefunden werden. Wir setzten deshalb den Standard in vier Zehnerverdünnungsstufen ein (Rasmussen 2001). Wichtig für die Genauigkeit der Quantifizierung ist außerdem der Einsatz von Standard mit in der DNA-Menge ähnlichen Konzentrationen der zu untersuchenden Proben, was mit dem Einsatz der Zehnerverdünnungsstufen zwischen 102 und 106 bei 5x103 DNA-Kopien erfüllt wurde. Um eine Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten, wurde für alle Proben eines Patienten die gleiche Standardkonzentration und gleiche Verdünnungsreihen verwendet. Um die Validität der Quantifizierungsergebnisse zu erhöhen, wurden alle Messwerte zwei- bis vierfach bestimmt. Zu stark abweichende Werte wurden aus der Messung herausgenommen und wiederholt.

Mittels unterschiedlicher Methoden wird der Crossingpoint der Amplifikationskurve Cp bestimmt. Hier wurde die second-derivate-maximum-Methode verwendet, da sie gegenüber der fit-point-Methode untersucherunabhängig ist.

Die DNA der im CellSorter präparierten Zellen wurde extrahiert und für die quantitative PCR aus jeder Probe DNA von 5000 Zellen eingesetzt. Der Einsatz einer definierten Menge an DNA garantierte eine vergleichbare Effizienz der PCR. Beachtet werden muss, dass beim Einsatz geringer DNA-Mengen, die Quantifizierungsergebnisse auch aufgrund statistischer Schwankungen variieren. Die Amplifikation eines Moleküls kann nur in zwei Extremsituationen mit Sicherheit vorausgesagt werden: Beträgt die PCR-Effizienz 1, kommt es zu keiner Amplifikation, beträgt sie 2, kommt es zu einer Verdoppelung der Ausgangs-DNA. Liegt die Effizienz der PCR zwischen 1 und 2, kann nur mit statistischer [Seite 72↓]Wahrscheinlichkeit die Amplifikation eines Moleküls vorhergesagt werden. Ist die DNA-Menge groß, kann dies vernachlässigt werden. Die Varianz aufgrund statistischer Überlegungen ist dagegen bei niedrigen DNA-Mengen ausgeprägter. Rasmussen fand bei 10000 Kopien/Ansatz einen Variationskoeffizienten von 6,4%, bei 100 dagegen von 18%. Je niedriger die eingesetzte DNA-Menge, umso größer also das Konfidenzintervall (Rasmussen 2001). Da in dieser Untersuchung 5000 Kopien pro Ansatz eingesetzt wurden, beträgt der Variationskoeffizient ca. 10%, wodurch eine Varianz zumindest teilweise erklärt werden kann.

Eine weitere Ursache für die Varianz der Werte könnte in Pipettierungenauigkeiten liegen. Da die Menge der Ziel-DNA mit 1000 - 3000 Kopien/µl klein ist, können geringe Abweichungen der Ausgangs-DNA-Menge bereits große Schwankungen der Produktmenge bewirken.

Vergleicht man die Ergebnisse der qualitativen PCR mit denen der quantitativen PCR so zeigt sich, dass in 15 Patientenproben mit Hilfe der qualitativen PCR und in 14/15 Patientenproben durch die quantitative PCR ein T-Zell-Klon nachgewiesen wird. Um eine Aussage über das Vorhandensein von klonalen T-Zellen zu treffen sind somit beide Methoden als gleichwertig zu betrachten. Eine höhere Nachweisgrenze für die LightCycler® PCR mit Schmelzkurvenanalyse konnte hier festgestellt werden. So wurde in 49/50 untersuchten Proben der einzelnen separierten Zellpopulationen T-Zell-Klonalität mit Hilfe der qualitativen PCR und Gelelektrophorese gezeigt. Demgegenüber konnte durch die quantitative PCR in nur 39/50 der gleichen Proben ein T-Zell-Klon gesichert werden.

Dies deckt sich mit bisher veröffentlichten Ergebnissen. So wird die Sensitivität von Pfitzner et al. für eine real-time PCR mit 0,002% bis 10,2% angegeben (Pfitzner et al. 2002). Demgegenüber steht die hohe Sensitivität einer qualitativen klonspezifischen PCR mit 1 in 105-106 Zellen (Volkenandt et al. 1993, Muche et al. 1999). Dieser Unterschied in der Sensitivität könnte die Diskrepanz der Ergebnisse der LightCycler®-PCR und qualitativer klonspezifischer PCR bei einigen Patientenproben (FN2, FN3 CD7- und CD26+, FN4 CD7- und CD26-, OS1 CD26+, OS2 CD26+, SH1 CD7+ und CD26+) erklären.

Für die Bewertung der Ergebnisse der quantitativen PCR müssen beeinflussende Faktoren berücksichtigt werden. Dazu gehört, dass bei der Präparation der DNA aus den im CellSorter gewonnenen Zellen es zu einem Verlust von Zellen und damit von DNA kommen kann. Dieser Verlust ist zum einen durch die Adhäsion von Zellen an den [Seite 73↓]Präparationsgefäßen und zum anderen durch mehrere Zentrifugationsschritte bedingt. Da die DNA-Konzentration anhand der Zahl präparierter Zellen bestimmt wurde, kann es hier zu einem Fehler in der Quantifizierung kommen. Da das Procedere der Zellpräparation und DNA-Gewinnung alle Proben in gleicher Weise betraf, handelt es sich um einen systematischen Fehler.

Alternativ zu dem beschriebenen Vorgehen, besteht die Möglichkeit, die Konzentration der extrahierten DNA als Berechnungsgrundlage zu bestimmen. Bei dieser Methode stößt man jedoch wieder auf das Problem einer exakten DNA-Quantifizierung. Wie schon beschrieben, steht hierfür die Spektrographie zur Verfügung, doch auch dieses Verfahren ist mit einem nicht zu vernachlässigenden Fehler behaftet.

Um den beschriebenen möglichen Fehlerquellen gerecht zu werden, wurde der relative Anteil der klonalen Zellen an jeder Population bestimmt und zur Auswertung herangezogen. Mit Hilfe dieser Daten war es möglich, die Ratio der klonalen Zellen auf die wahren Verteilungen der Populationen im Blut umzurechnen. Mit der so gewonnen Ratio kann man Aussagen über die Verteilung der klonalen Zellen auf die einzelnen Populationen und über Veränderungen des Anteils der klonalen Zellen in den Populationen treffen.

Für eine Patientenprobe (FN2) war für keine Population trotz mehrfacher Wiederholung ein Ergebnis in der Quantifizierung zu erzielen.

5.2 Ergebnisse

5.2.1 CD7 und CD26 Expression beim Sézary Syndrom

Haynes et al. führten 1981 erste durchflußzytometrische Untersuchungen an Zellen von Sézary Syndrom Patienten mit monoklonalen Antikörpern durch und beschrieben den Verlust von T-Zell Epitopen (Hayens et al. 1981). Die Untersuchung von PBMC von Sézary Syndrom Patienten ist inzwischen Gegenstand vieler Untersuchungen gewesen. Sterry et al. zeigten, dass die CD4+ Zellen in CTCL CD45RA- und CDw29+ sind (Sterry und Mielke 1989). Wood et al. beschrieben 1990 den Verlust des T-Zell Antigen CD7 (Wood et al. 1990). Novelli et al. veröffentlichten 1995 Daten, die die verminderte Expression von CD7 und CD26 darstellten (Novelli et al. 1995). Der Verlust von T-Zell Epitopen wurde von Harmon et al. als Indiz für Malignität der betroffenen Zellen gewertet (Harmon et al. 1996). Jakob et al. konnten in ihren Untersuchungen zur Expression der T-Zell Marker CD7, CD45RO, CD45RA und CD25 weitere Abweichungen zur nicht-malignen Zelle zeigen. Weitere Untersuchungen zur CD7 und CD26 Expression wurden von Bogen et al., Dummer et al., [Seite 74↓]Bernengo et al., Scala et al., Laetsch et al., Rappl et al., Vonderheid et al. und Jones et al. veröffentlicht.

5.2.1.1 CD7 Expression beim Sézary Syndrom

Die in der Literatur beschriebene Expansion CD7 defizienter T-Zellen war auch Gegenstand unserer Arbeit.

Bei allen hier untersuchten Proben der Sézary Syndrom Patienten zeigten sich gegenüber den Kontrollen ein vermehrter Anteil CD3+CD7- Zellen. Diese expandierte CD3+CD7- Population hatte Anteile von 13,8 – 99,1%. Unsere Ergebnisse der FACS-Analyse zur CD7 Expression der PBMC gehen mit den Veröffentlichungen anderer Autoren konform. Der Anteil der CD4+CD7- Zellen zeigte hier ebenfalls eine große Streuung. Er wird mit 4,9% bis 99% angegeben (Novelli et al. 1995, Harmon et al. 1996, Jakob et al. 1996, Dummer et al. 1999, Laetsch et al. 2000, Rappl et al. 2001, Vonderheid et al. 2001, Schwab et al. 2002). Der Verlust des Antigen CD7 beim Sézary Syndrom ist zwar als mögliches Phänomen der Erkrankung anerkannt, es stellt trotzdem kein konstantes Merkmal von Sézary-Zellen dar. Bernengo et al. beschrieben CD7+ Sézary-Zellen in 21/53 Fällen.

Im Blut der hier untersuchten gesunden Kontrollen lag der Anteil der CD3+CD7- Zellen im Durchschnitt unter 10,0%. In der Literatur wird ein Wert von 9% +/- 3,4% angegeben (Reinhold et al. 1993).

Im Verlauf zeigten die meisten Patienten einen stabilen Anteil an CD3+CD7- Zellen. So hatten DK, OS und SH nur Schwankungen von unter 8,5% aufzuweisen. Bei FN zeigte sich im Verlauf ein Zu- und Abnehmen der CD7- Population (initial 13,8% Anstieg auf 40,0% Abfall auf 14,0% und erneuter Anstieg auf 23,4%). RM zeigte die größten intraindividuellen Schwankungen. Hier kam es zu einem Anstieg der CD7- Population von 43,1% vom initialen Wert 46,5% und in der nächsten Probe wieder zu einem Absinken des Anteils um 16,5%. Andere Untersuchungen zur Entwicklung der CD7 Zellen im Verlauf sind bisher nicht veröffentlicht.

Der Anteil der CD3+CD7- Zellen im Blut der Patienten erlaubt eine Einteilung in drei Gruppen, die Grenzen wurden bei über 70% CD7+ für ein überwiegend positives Expressionsmuster, unter 10% CD7+ für ein überwiegend CD7- Muster und ein intermediäres Muster zwischen diesen Grenzen festgelegt. Es stellte sich zum einen eine Gruppe (Patient DK) mit überwiegend CD7- Zellen dar, zum anderen eine Gruppe (Patienten OS, RM, SH) mit einem intermediären Expressionsmuster für CD7 und eine [Seite 75↓]Gruppe (Patient FN) mit einem überwiegend positiven Muster der CD7-Expression. Diese Einteilung wurde vorgenommen um später eventuelle Zusammenhänge zu klinischen oder prognostischen Faktoren aufzuzeigen. Eine derartige Unterteilung entsprechend dem Auftreten von CD7- Zellen im Blut von Sézary Syndrom Patienten wurde auch schon von anderen Autoren durchgeführt. Wood et al. definierten auf Grundlage ihrer Untersuchung ebenfalls drei Gruppen. Die erste mit einer Grenze von 10% CD7+ Zellen enthielt einen Patienten, die zweite mit den Grenzen 20% und 40% als unterer bzw. obere Grenze enthielt 2 Patienten und die letzte Gruppe, mit mehr als 50% CD7+ Zellen, beinhaltete 13 Patienten (Wood et al. 1990). Jakob et al. stellten eine Einteilung für CTCL in 4 Stadien vor. Ein Stadium III und IV ihrer Einteilung, welche die Entität Sézary Syndrom beinhalten, sollte mit einem Anteil von CD4+CD7- von 70,9% +/- 26,9% einhergehen (Jakob et al. 1996). Vonderheid et al. definierten zwei Kohorten. Eine repräsentierte 19/42 Patienten mit überwiegend CD7+ Lymphozyten und die andere Kohorte, enthält 23/42 Patienten mit überwiegend CD7- Zellen. Die Grenze zwischen beiden Kohorten wurde bei 50% der jeweiligen Population festgelegt (Vonderheid et al. 2001). Problematisch bei allen bisher beschriebenen Einteilungen ist die geringe Anzahl von Patienten (Wood et al. 1990), die fehlende Unterscheidung der CTCL-Entitäten (Wood et al. 1990, Jakob et al. 1996) und nach welchen Kriterien die Expressionsmuster der Zellen abgegrenzt werden sollen. Die in dieser Arbeit vorgenommene Einteilung beinhaltet demgegenüber nur Sézary Syndrom Patienten und die Grenzen sind so gewählt, um differenziert die Patienten beurteilen zu können. Ein Nachteil, der in der niedrigen Inzidenz der Erkrankung begründet liegt, ist auch die in dieser Beobachtung kleine Fallzahl.

5.2.1.2 CD26 Expression beim Sézary Syndrom

Bisher sind nur wenige Untersuchungen zur Expression des T-Zell Epitops CD26 beim Sézary Syndrom veröffentlicht worden. Die variable Expression dieses Antigens bei malignen Entartungen der T-Zell Reihe ist beschrieben. Es zeigte sich dabei eine vermehrte aber auch eine verminderte Expression von CD26 auf den PBMC im Vergleich zu PBMC gesunder Probanden (Verstovsek et al. 2000).

Auch in unserer Untersuchung wurden T-Zellen auf ihre CD26-Expression untersucht.

In allen Proben der hier Untersuchten Patienten konnte eine Expansion der CD3+CD26- T-Zell Populationen gezeigt werden. Dies geht konform mit bisherigen Betrachtungen im Zusammenhang mit dem Sézary Syndrom bei denen eine verminderte Expression von [Seite 76↓]CD26 auf CD4+ Zellen und eine Expansion der CD4+CD26- Lymphozyten gezeigt wurden (Novelli et al. 1995, Bernengo et al. 1998, Bernengo et al. 2001, Jones et al. 2001, Rappl et al. 2001). Darüber hinaus beschreibt Bernengo et al. eine positive Korrelation der Expansion der CD4+CD26- und der Zahl der im Blut vorhandenen Sézary-Zellen.

Für die von uns durchgeführte Untersuchung der CD26 Expression an gesunden Kontrollen wurde ein durchschnittlicher Anteil CD3+CD26- Zellen von 23,3% gefunden. Dieser Wert deckt sich mit den in der Literatur beschriebenen Wert von 14% - 44% (Bernengo et al. 2001, Jones et al. 2001).

Für die Proben der Patienten betrug der Anteil der CD3+CD26- Lymphozyten zwischen 42,3% bis 99,4%, wobei der Median bei 96,8% lag. Die Angaben anderer Autoren nennen einen Anteil der CD4+CD26- Zellen von 58,7% +/- 26,9% bzw. 76,5% +/- 3,4% (Novelli et al. 1995, Bernengo et al. 2001). Rappl et al. beschrieben weniger als 5% CD26+ in einer expandierten Vβ Population (Rappl et al. 2001). Der Verlust des T-Zell Epitops CD26 auf den PBMC von Sézary Syndrom Patienten konnte somit bestätigt werden und scheint ein konstantes Merkmal bei dieser Erkrankung zu sein.

In Analogie zur Untersuchung der CD7 Expression erfolgte auch für die CD26-Expression eine Einteilung entsprechend des Expressionsmusters. Eine Gruppierung entsprechend dem Anteil CD26- Zellen an den Lymphozyten ist bisher nicht beschrieben. In dieser Arbeit wurde eine solche Einteilung vorgenommen, um mögliche Ähnlichkeiten zur CD7 Expression feststellen zu können und um eine Korrelation der CD26 Expression zur Klinik auswerten zu können.

Es wurde eine Gruppe mit überwiegend CD26- PBMC (mehr als 90% CD3+CD26- Zellen) definiert, zu dieser Gruppe gehören vier Patienten (DK, OS, RM, SH). Die zweite Gruppe enthielt Patienten mit einem intermediären Expressionsmuster für CD26 (Anteil der CD3+CD26- Zellen zwischen 30% und 90%). Ihr konnte Patient FN zugeordnet werden. Die dritte Gruppe mit überwiegend CD26+ Lymphozyten (weniger als 30% CD3+CD26-) beinhaltete nur die gesunden Kontrollen.

5.2.1.3 CD7, CD26 Koexpression beim Sézary Syndrom

Eine weitere in dieser Arbeit durchgeführte Untersuchung galt der Koexpression der T-Zell Epitope CD7 und CD26. Bisher publizierte Arbeiten stellten nur getrennte Untersuchungen zu beiden T-Zell Antigenen an. Dort wurde der Verlust jeweils eines der beiden Antigene auf den PBMC beschrieben. Der Verlust wurde für jedes Antigen an sich als Zeichen von [Seite 77↓]Malignität und damit als Marker für die Tumorzellen bewertet.

Für die gesunden Kontrollen ergab sich ein hoher Anteil doppelt-positiver Zellen (40,1%), ca. ein Drittel der Zellen waren CD7+CD26-, etwa ein Viertel der Zellen zeigte einen doppelnegativen Phänotyp. Es fand sich nur ein geringer Anteil CD7-CD26+ Zellen.

Auffallend ist bei allen hier untersuchten Patienten, der verringerte Anteil CD7+CD26+ Zellen, wobei ein Patient (FN) mit durchschnittlich 16% den höchsten Anteil aufwies. Die übrigen Patienten zeigten einen Anteil von weniger als 6%. Die Zellpopulationen der CD7+CD26- und CD7-CD26- Zellen zeigten entsprechend, und auch im Vergleich zu den vorausgegangenen Untersuchungen, einen erhöhten Anteil. Allein der Anteil der CD7-CD26+ positiven Zellen war sowohl für die Kontrollen als auch für die Patienten gering (unter 6,3%).

In zwei Veröffentlichungen ist bisher auf die Koexpression von CD7 und CD26 eingegangen worden. Novelli et al. beschreiben den Anteil der CD4+CD7-CD26- Zellen in den Proben ihrer Patienten mit 23% - 78% Median bei 35,5% (Novelli et al. 1995). Bernengo et al. zeigten, dass CD4+CD26- auch defizient für CD7 sein können. Dabei variierte der Anteil der CD7- in dieser CD4+/ CD26- Population von 10% bis 90% (Bernengo et al. 2001). Diese Ergebnisse bestätigen die hier gemachten Beobachtung einer verringerten CD7+CD26+ Population und einer vergrößerten doppelnegativen Population bei Patienten mit Sézary Syndrom.

5.2.2 Präsenz des T-Zell-Klons in den CD7+, CD7- und CD26+, CD26- Populationen

Die eindeutige Identifizierung und Charakterisierung der Tumorzellen beim Sézary Syndrom ist Gegenstand vieler Arbeiten gewesen. Die von Lutzner et al. anhand der Morphologie identifizierten Zellen, s.g. Sézary-Zellen, galten lange als die maligne entarteten Zellen (Lutzner und Jordan 1968). In verschiedenen späteren Untersuchungen wurde diese Annahme widerlegt. Es konnte gezeigt werden, dass nicht alle Sézary-Zellen einen klonalen Ursprung haben. Die Zahl der Sézary-Zellen kann darüber hinaus von der Zahl der tatsächlich klonal expandierten Zellen übertroffen werden (Weinberg et al. 1995, Bogen et al. 1996, Bernengo et al. 1998, Rappl et al. 2001). Da also die Morphologie der PBMC allein nicht die Tumorzellen identifiziert, kann man die Tatsache nutzten, dass T-Zellen klonalen Ursprungs einen identischen T-Zell-Rezeptor rearrangieren und exprimieren. Die Tumorzellen lassen sich deshalb anhand des T-Zell-Rezeptors sowohl auf molekularbiologischer als auch auf immunophänotypischer Ebene nachweisen. Da der Verlust der T-Zell Epitope CD7 und CD26 als Merkmal der Tumorzellen diskutiert wird, [Seite 78↓]wurde eine Charakterisierung der Tumorzellen anhand von Klonalitätsmerkmalen und Oberflächenantigenmerkmalen angestrebt. Hierzu sind zwei Ansätze verfolgt worden. Zum einen die reine immunophänotypische Darstellung der Zellen mit monoklonalen Antikörpern in einer FACS-Analyse und zum anderen die Kombination von durchflußzytometrischen Analysen mit PCR-Analysen. Für den exakten Nachweis von Tumorzellen in der PCR-Analyse bietet sich der Einsatz von klonspezifischen Primern an. In der hier vorliegenden Arbeit wurden PBMC nach einer FACS-Analyse entsprechend ihrer Oberflächenmerkmale für CD7 und CD26 mit Hilfe des CellSorters sortiert und die Tumorzellen durch einen qualitativen und einen quantitativen PCR-Assay, unter Verwendung von klonspezifischen Primern, nachgewiesen.

Durch diese Herangehensweise, konnte zum erstenmal sicher gezeigt werden, dass Tumorzellen ein und desselben Sézary Syndrom Patienten sowohl CD7 bzw. CD26 exprimieren, als auch defizient für diese T-Zell Epitope sein können. Der entsprechende T-Zell-Klon konnte mit Hilfe der PCR-Analyse unter Verwendung klon-spezifischer Primer in 11/15 Proben für die CD3+/ CD7+ Population, in allen 15 Proben der CD3+CD7- Population, in 8/15 Proben der CD3+CD26+ Zellen und in allen 15 Proben der CD3+CD26- Lymphozyten gezeigt werden.

Im Gegensatz zu unserer Methode des Klonalitätsnachweises durch eine PCR-Analyse, wurde von vielen Arbeitsgruppen lediglich eine immunophänotypische Charakterisierung der Tumorzellen vorgenommen. Wood et al. stellten anhand der Ergebnisse eines solchen Vorgehens die Hypothese auf, dass die CD7- Population Tumorzellen enthält (Wood et al. 1990). Rappl et al. beobachteten, dass TCR-Vβtm+ T-Zellen (TCR-Vβtm+ steht für das Vβ, welches von der expandierten Zellpopulation exprimiert wird) kein CD7 exprimierten (Rappl et al. 2001). Dies kann mit unseren Beobachtungen bestätigt werden, da auch hier klonale T-Zellen in der CD3+CD7- Population gezeigt werden konnten. Die Frage, ob die Tumorzellen ausschließlich negativ für CD7 sind, wie von Laetsch et al. angenommen (Laetsch et al. 2000), ist damit noch nicht geklärt. In unseren Untersuchungen konnte sowohl in der CD7+ als auch in der CD7- Population ein klonales TCR-γ Rearrangement nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde hier eine Untersuchung mit klonspezifischen Primern durchgeführt. Dadurch konnte gezeigt werden, das es sich bei den klonal expandierten Zellen tatsächlich um ein und denselben Klon handelt. Dies ist somit der Beweis dafür, dass die Tumorzellen beim Sézary Syndrom sowohl CD7 exprimieren als auch defizient sein können. Die hier gemachte Untersuchung untermauert damit von [Seite 79↓]anderen Autoren gemachte Beobachtungen. So berichteten Vonderheid et al., dass CD7 nicht von allen TCR-Vβtm+Zellen exprimiert wird (Vonderheid et al. 2001). Weitere Untersuchungen von Dummer et al. zeigten ebenfalls, dass TCR-Vβtm+T-Zellen nicht nur CD7- sondern auch CD7+ sein können, wobei der Anteil der CD7+ mit 35% kleiner als der der CD7- Zellen sei. Eine PCR-Analyse beider Populationen zeigte Klonalität für ein TCR-γ Rearrangement in beiden Gruppen (Dummer et al. 1999). Problematisch bei dem alleinigen Nachweis eines klonalen Rearrangements ist, dass dies kein Beweis für einen identischen Klon in den einzelnen Populationen ist. Dies konnte erstmals durch den Einsatz der klonspezifischen Primer unserer Untersuchung gezeigt werden.

Obwohl der Verlust des T-Zell Epitops CD26 auf den PBMC beim Sézary Syndrom als Merkmal anerkannt ist, sind Untersuchungen zum möglichen klonalen Ursprungs dieser Zellen bisher nicht angestellt worden. Die hier durchgeführten Analysen mit Hilfe der klon-spezifischen PCR wiesen klonale Zellen sowohl in der CD26+ als auch in der CD26- Population nach. Dies bestätigt die veröffentlichten Ergebnisse, von Bernengo et al. und Rappl et al., die mit Hilfe immunophänotypischer Analysen zeigten, dass TCR-Vβtm+ T-Zellen defizient für CD26 sein können (Bernengo et al. 2001, Rappl et al. 2001).

Unsere Daten zeigen somit, dass beim Sézary Syndrom der genetisch definierte Tumorzellklon unterschiedliche Phänotypen zeigen kann, nämlich CD3+CD7+,CD3+CD7-, CD3+CD26+ und CD3+CD26-.

Die sich anschließende Fragestellung, nach der Verteilung der Tumorzellen auf die einzelnen Populationen und eines dominanten Phänotyps wurde in dieser hier vorliegenden Arbeit ebenfalls untersucht. Es wurde eine quantitative PCR-Analyse, eine s.g. real-time-PCR, durchgeführt und die Verteilung der klonalen Zellen auf die einzelnen Populationen anhand einer Ratio von CD positiven zu CD negativen dargestellt.

Für die CD7 Expression zeigte sich, dass die Verteilung der klonalen Zellen eine Einteilung in drei Gruppen ermöglichte: zum einen die Gruppe (Patient DK) mit einer niedrigen Ratio (<0,0001) und überwiegend CD7- klonalen Zellen, zum anderen die Gruppe (Patienten OS, RM, SH) mit einer Verteilung der klonalen Zellen auf beide CD7-Populationen (Ratio zwischen 0,12 und 1,4) und eine Gruppe (Patient FN) mit einer Dominanz von CD7+ (Ratio > 52,16) in der klonalen Population.

Bisher veröffentlichte Daten basierten auf durchflußzytometrischen Untersuchungen, die zeigen, dass alle TCR-Vβ+ Zellen, also entsprechend den hier nachgewiesenen klonalen Zellen, einen Anteil von 15% -96% an der Gesamtzahl der PBMC haben können (Dummer et [Seite 80↓]al. 1999, Fraser-Andrews et al. 2001, Rappl et al. 2001). Dies spricht für einen sehr variablen Anteil von Tumorzellen an den PBMC. Die Verteilung der Tumorzellen auf die Populationen der CD7 exprimierenden bzw. defizienten Zellen wurde unterschiedlich angegeben. Zum einen berichteten Rappl et al., dass über 98% der TCR-Vβtm+ Zellen negativ für CD7 seien (Rappl et al. 2001), zum anderen zeigten Dummer et al., dass bis zu 35% der TCR-Vβtm+ Zellen noch CD7 exprimieren können (Dummer et al. 1990). Diese variable Verteilung der klonalen Zellen konnte von uns bestätigt werden.

Die bisherigen Ergebnisse zeigen auch, weshalb der alleinige Nachweis von CD7- Zellen kein Rückschluss auf die Tumorlast erlaubt (vgl. Laetsch et al. 2000).

Hinsichtlich der CD26 Expression zeigte die Ratio RCD26+/CD26- von unter 0,04 für alle Patienten, dass die klonalen Zellen fast ausschließlich auf die CD26- Population verteilt waren. D.h. bei allen hier untersuchten Sézary Syndrom Patienten waren die Tumorzellen defizient für CD26. Bestätigung findet sich in den Beobachtungen von Bernengo et al. und Rappl et al., die mit Hilfe immunophänotypischer Analysen zeigten, dass 95% der TCR-Vβtm+ T-Zellen kein CD26 exprimieren (Bernengo et al. 2001, Rappl et al. 2001).

Aus den von uns gefundenen Ergebnissen zur Verteilung der klonalen Zellen auf die CD7 und CD26 Populationen, lassen sich für die Tumorzellen beim Sézary Syndrom folgende dominante Phänotypen beschreiben: zum einen der Phänotyp einer CD3+CD7+CD26- Tumorzelle zum anderen einer CD3+CD7-CD26- Tumorzelle. Diese Phänotypisierung der Tumorzelle kann als gesichert gelten, da für alle Populationen mit Hilfe der klonspezifischen PCR-Analyse der klonale Ursprung der Zellen nachgewiesen wurde. Desweiteren war festzustellen, dass sich für die klonalen Zellen eine Gruppierung in drei Gruppen, negativ, intermediär und positiv für CD7, vornehmen ließ.

Das von uns angewendete Verfahren zum Nachweis klonaler Zellen in den CD7 und CD26 Populationen ist bisher nicht beschrieben worden. Bisherige Untersuchungen stützten sich überwiegend auf durchflußzytometrische Analysen. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dassmit Hilfe von monoklonalen Antikörpern gegen die Vβ-Kette des T-Zell-Rezeptors eine gute Annäherung an die Menge von klonal expandierten Zellen möglich ist (Bogen et al. 1996).Weiterhin gehören durchflußzytometrische Untersuchungen heute zur Routinediagnostik und sind damit vielfach verfügbar. Die Methodik ist schnell und einfach anwendbar. Trotz aller Vorteile, hat diese Methode vor allem für den Nachweis klonaler Zellen auch Nachteile. Da ein Antikörper gegen ein TCR-Vβ nur T-Zellen, die mindestens einen Anteil von 1% -5% der physiologischen T-Zellen ausmachen, können kleine [Seite 81↓]Tumorpopulationen, z.B. in Form von minimalen Resterkrankungen, unerkannt bleiben (Bogen et al. 1996). Ein weiterer Punkt ist, dass mit einem TCR-Vβ identifizierte Populationen auch immer nicht klonale Zellen in wechselndem Ausmaß enthalten. Darüber hinaus sind nicht für jedes mögliche rearrangierte TCR-Vβ Antikörper verfügbar. So konnte bei Dummer et al. nur in 3/8 Patienten der Klon anhand des TCR-Vβ identifiziert werden (Dummer et al. 1999). Problematisch ist weiterhin, dass diese Antikörper inkonstant oder mit geringerer Affinität reagieren können. Die Ursachen dafür liegen in Unterschieden im JC-Bereich des T-Zell-Rezeptors und der rearrangierten N-Region. Diese Faktoren können die ursprüngliche Affinität des Antikörpers auf 1/10 reduzieren. Diese Phänome sollte vor allem vor dem Hintergrund beachtet werden, dass die zu untersuchenden Zellen maligne entartet sind und somit veränderte Oberflächenmerkmale, auch im TCR, aufweisen können (Bigler et al. 1996). Die Schwankungsbreite des Anteils der klonal expandierten Zellen stellt für die Identifizierung des Klons mit Hilfe monoklonaler Antikörper ein Problem dar. In einer Untersuchung eines anderen Typs von einem T-Zell Non-Hodgkin-Lymphom wurde gezeigt, dass zur Identifizierung des Klons mittels Antiköper gegen die TCR-Vβ-Kette eine Vβ Expansion von über 60% der PMC nötig war, um eine Sensitivität von 81% bei einer Spezifität von 100% zu erreichen (Vonderheid et al. 2002).

Durch die in unserer Arbeit durchgeführte Analyse der Klonalität mit Hilfe eines PCR-Assays, wurden die eben genannten Probleme umgangen. Hier erfolgte der Nachweis molekulargenetisch und unabhängig vom Phänotyp der Zellen. Nachteilig an dieser Vorgehensweise ist der hohe methodische Aufwand und die Gefahr der Kontamination der Proben. Da die PCR-Analyse eine hohe Sensitivität hat, können geringe Mengen DNA von Zellen oder PCR-Produkten des gleichen Patienten zu falsch positiven Ergebnissen führen. Das Problem der Kontamination von Proben wurde durch einen sorgfältigen Umgang mit der DNA in speziell dafür eingerichteten Laboren minimiert.

5.2.3 Korrelation der FACS-Daten und der Daten der Quantifizierung

Bisher wurde in den verschiedenen Arbeiten versucht, mit Hilfe der FACS-Analyse ein Verfahren für die Beobachtung der Therapie und Einschätzung der Prognose zu etablieren (Dummer et al. 1999, Bogen et al. 1996, Harmon et al. 1996, Rappl et al. 2001, Schwab et al. 2002). Problematisch ist bei der alleinigen Anwendung der FACS-Analyse der bisher fehlende exakte Nachweis der klonalen Zellen, d.h. der Tumorzellen, gewesen. Mit Hilfe der [Seite 82↓]Quantifizierung und der Ermittlung der Ratio konnte die Verteilung der Tumorzellen auf die einzelnen Populationen gezeigt werden. Der Nachteil dieser Methode ist der erhebliche Zeit- und Materialaufwand.

Stellt man die Ergebnisse der quantitativen PCR-Analyse mit denen der FACS-Analyse gegenüber, so zeigt sich, dass in 23/30 Proben die Tumorzellen auch auf die, prozentual gesehen, dominante CD7 bzw. CD26 Population in der FACS-Analyse verteilt sind. Für die verbleibenden sieben Proben stellt es sich wie folgt dar: drei Proben (SH1CD7, FN1CD26, FN3CD26) zeigten eine Tumorzellpopulation in der ein Expressionsmuster der Oberflächenantigene dominierte, in der FACS-Analyse stellte sich jedoch ein intermediäres Verteilungsmuster dar. Für drei Proben (FN2CD7, FN2CD26, SH1CD26) war kein Ergebnis in der LighCycler®-PCR zu gewinnen und für die Probe FNCD26 ist zu beachten, dass hier eine dominante CD3dim/ CD26- Population auftrat. Hier waren nur wenige Tumorzellen in der CD3+CD26- Population vorhanden. Damit kann RCD26+/ CD26- für diese Probe nicht bewertet werden. Für die Proben FN1 und FN3 bedeutet das Ergebnis, dass in diesen Proben viele nicht klonale CD26+ Zellen vorhanden waren. Das Ergebnis von SH1 ist eher als Ausreißer zu bewerten, da hier innerhalb kurzer Zeit die Tumorzellen vermehrt CD7 exprimieren müssten um das Ergebnis von SH2 zu erreichen. Eine derartige Progression erscheint unwahrscheinlich und wurde auch in der Literatur nicht beschrieben.

Die Abschätzung der Tumorlast allein anhand der FACS-Analyse der CD7 exprimierenden Zellen ist nicht ausreichend, hier ist eine Klonalitätsanalyse der Populationen, insbesondere der CD7+ Populationen zu fordern. Damit ist die Vermutung von Wood et al., Laetsch et al. und Rappl et al. widerlegt, dass die Tumorzellen allein von den CD7- Zellen repräsentiert werden (Wood et al. 1990, Laetsch et al. 2000, Rappl et al. 2001). Zusätzlich zu dieser Arbeit wurde in den Veröffentlichungen von Bogen et al., Dummer et al. und Vonderheid et al. gezeigt, dass die Tumorzellen auch den Phänotyp einer CD7+ Zelle annehmen können (Bogen et al. 1996, Dummer et al. 1999, Vonderheid et al. 2001). Damit ist eine Abschätzung der Tumorlast allein aufgrund der CD7 Expression nicht möglich, da auch vermeintlich "normale" CD3+CD7+ Zellen in erheblichem Ausmaß Tumorzellen darstellen können (s. Patient FN).

Die Analyse der CD26 Populationen beim Sézary Syndrom könnte eine Möglichkeit der schnellen Abschätzung der Tumorlast darstellen. Wie in dieser Arbeit vorgestellt und auch von Bernengo et al. angedeutet, stellt der überwiegende Teil der CD3+CD26- Zellen die [Seite 83↓]Tumorzellen dar. In 12/13 Proben waren die Tumorzellen auf die CD26- Population verteilt. Bestätigt sich dieses Phänomen auch bei größeren Patientenkollektiven mit der Diagnose Sézary Syndrom, bestünde hier die Möglichkeit, mit einer FACS-Analyse der CD3+CD26- Zellen einen schnellen Überblick über die Tumorlast im Blut der Patienten zu erhalten und damit eventuell die Möglichkeit eines objektiven Monitorings der Erkrankung.

5.2.4  dim-Expression von CD3

Das Phänomen des Verlustes von T-Zell Antigenen beim Sézary Syndrom ist in den vorangegangenen Kapiteln schon beschrieben worden. Gelegentlich kommt es jedoch vor, dass ein T-Zell Antigen von den Tumorzellen noch synthetisiert und exprimiert wird, die Dichte dieses Antigens auf der Oberfläche der Zelle jedoch geringer ist als auf „gesunden“ Lymphozyten. Dieses Phänomen der dim Expression eines Antigen ist auch für das Sézary Syndrom beschrieben worden. Es wurde für die T-Zell Epitope CD3, CD4, CD7 und CD26 beobachtet (Bogen et al. 1996, Dummer et al. 1999, Jones et al. 2001). Dummer et al. beschrieben eine CD3dim Population in der Gruppe der TCR-Vβtm+ Zellen. Eine CD3dim-Population wurde auch in dieser Arbeit beobachtet. In den PBMC von FN wurde eine CD3dim Population in allen vier untersuchten Proben nachgewiesen. Diese CD3dim Population war überwiegend defizient für CD26. Im Verlauf kam es zu einer stetigen Zunahme dieser CD3dimCD26- Population, so dass sie in der letzten Probe, FN4, die anderen Populationen dominierte. Die Möglichkeit eines Fehlers in der Methodik ist unwahrscheinlich, da die Färbung der Kontroll-PBMC sich wie erwartet darstellte. Problematisch stellte sich die Auswahl der zu sortierenden Populationen dar. Um eine Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten, wurde diese dim-Population gesondert untersucht. Mit Hilfe der klonspezifischen PCR für FN konnte gezeigt werden, dass sich in dieser dim-Population derselbe Klon, der auch in den anderen Populationen zu finden war, darstellte.

Das Auftreten dieser CD3dim Population ist bei der Auswertung insbesondere der FACS-Analysen und der quantitativen PCR-Analysen zu beachten. Für die Auswertung der FACS-Analyse ergibt sich deshalb für die Proben FN3 und FN4 anstelle des intermediären Expressionsmusters für CD26 ein überwiegend negatives Expressionsmuster. In der quantitativen PCR-Analyse der Proben FN1 und FN3 konnten die Tumorzellen noch überwiegend in der CD3+CD26- Population nachgewiesen werden. In der Probe FN4 war dies nicht mehr möglich, so dass sich hier eine Umkehr der Ratio RCD26+/CD26- von 0,0005 zu >162 darstellte. In Anbetracht der dominanten CD3dim CD26- Population, die wie [Seite 84↓]schon erwähnt ebenfalls Tumorzellen enthielt, ist das Ergebnis der Quantifizierung der Probe FN4 gesondert zu bewerten. Hier liegt die Vermutung nahe, dass der Tumorzellklon einen CD3dim CD26- Phänotyp exprimiert.

5.3 Prognostische und diagnostische Relevanz der Ergebnisse zur Tumorlast, CD7 Expression, CD26 Expression in Bezug zur Klinik und Therapie

Das Sézary Syndrom hat eine fünf Jahres Überlebensrate von 11% - 33% (Willemze et al. 1997, Bernengo et al. 1998). Möglichkeiten, die Ansprechrate auf eine Therapie zu objektivieren, ein s.g. Therapie-Monitoring durchzuführen und Aussagen zur Prognose zu treffen, sind begrenzt (Wieselthier et al. 1990). Es wurde in mehreren Arbeiten versucht ein System zum Staging der Patienten und Parameter zur Therapieüberwachung und Prognoseeinschätzung zu etablieren. Bisher konnte sich kein Ansatz durchsetzen (Bernengo et al. 1998, Fraser-Andrews et al. 2001, Jones et al. 2001, Scarisbrick et al. 2001).

5.3.1 CD7 und CD 26 Expression in Korrelation zu klinischem Status und Therapie

Bei allen hier untersuchten Sézary Syndrom Patienten konnte beobachtet werden, dass die Tumorzellen im Blut einen weitgehend konstanten Phänotyp zeigten. Der klinische Status zeigte ebenfalls keine signifikanten Veränderungen, weder starke Progression noch Remissionen.

Um die bisherigen Therapieschemata und Verlaufsparameter besser beurteilen zu können, wurde in dieser Untersuchung eine Einteilung vorgenommen, die den dominanten Phänotyp der Tumorzellen als Grundlage hat. Für alle Patienten zeigte sich ein dominanter, konstant CD26- T-Zell-Klon. Anhand der CD7-Expression der Tumorzellen konnte eine Einteilung der Patienten in drei Gruppen erfolgen. Die Tumorzellen der ersten Gruppe (Patient DK) hatten einen überwiegend CD7- Phänotyp. Hier waren paraklinisch konstant erhöhte Leukozytenwerte, hohe Zahl CD4+ Lymphozyten und leicht erhöhte LDH-Werte vorhanden. Die zweite Gruppe (Patienten OS, RM, SH) zeigten einen intermediären CD7-Phänotyp der Tumorzellen. Hier waren eine erhöhte CD4/CD8-Ratio, erhöhte LDH-Werte und z.T. erhöhte Leukozytenzahlen auffällig. In der dritten Gruppe (Patient FN) konnten überwiegend CD7+ Tumorzellen nachgewiesen werden. Hier konnte eine Abnahme der CD3+ Zellen und gleichzeitig ein Absinken der CD4/CD8-Ratio beobachtet werden.

Schwab et al. untersuchten mit Hilfe TCR-Vβ-Antikörpern in einer FACS-Analyse die Tumorlast bei Sézary Syndrom Patienten. Dort wurde beobachtet, das unter der [Seite 85↓]angewandten Therapie bei drei Patienten eine Abnahme der CD4+Vβtm+ Zellen im Verlauf stattfand. Es wurde eine komplette Remission, eine partielle Remission und ein Todesfall dokumentiert. Bei zwei weiteren Patienten wurden keine Veränderungen in dem Anteil der TCR-Vβtm+ und der Klinik der Patienten festgestellt (Schwab et al. 2002). Diese therapeutischen Erfolge konnten von uns, bei ähnlichen Therapieschemata, nicht beobachtet werden. Die Dokumentation der Tumorlast im Blut wird auch von den Daten unserer Arbeit unterstützt, allerdings bietet sich hier die Dokumentation der CD3+CD26- Zellen an. Dies hat den Vorteil, dass auch Patienten ohne dominante TCR-Vβ+ Zellen bzw. Patienten, die auf den PBMC ein TCR-Vβ exprimieren, dass von bisher erhältlichen Antikörpern nicht erkannt wird, ein Monitoring erhalten können.

Ein weiteres Ziel der verschiedensten Untersuchungen zum Phänotyp der Tumorzellen beim Sézary Syndrom ist die Identifizierung eines Parameters zur Diagnosesicherung bzw. –erhärtung.

Nach den hier gefundenen Ergebnissen einer variablen CD7-Expression auf den Tumorzellen scheint zur Erhärtung der Diagnose Sézary Syndrom die Bewertung der CD7-Expression als ungeeignet. Wie beschrieben, konnte bei allen hier untersuchten Patienten eine konstante Defizienz von CD26 sowohl in der FACS-Analyse als auch in den molekularbiologischen Untersuchungen gezeigt werden. Dies bestätigt die Beobachtungen von Bernengo et al., dass die CD26 Expression besser mit der Klinik und mit paraklinischen Daten korreliert als die Analyse der CD7 Expression (Bernengo et al. 2001). Die hier gefundene Tumorzellverteilung in der CD26 Population eröffnet möglicherweise die Chance für eine Beurteilung der Tumorlast im Blut von Sézary Syndrom Patienten. Eine von Bernengo et al. vorgeschlagene Untersuchung der CD3+ bzw. CD4+ Zellen auf eine CD26 Defizienz bei Verdacht auf Sézary Syndrom scheint sinnvoll (Bernengo et al. 2001).

5.3.2 CD7 und CD26 Expression in Korrelation zum Überleben der Patienten

Für die Einschätzung der Malignität einer Erkrankung und den Erfolg von Therapieschemata ist die Überlebenszeit ein entscheidendes Kriterium.

Betrachtet man die Überlebenszeiten der hier untersuchten Patienten, stellen sich drei Gruppen dar. Zum einen, die der Patienten, die zum Ende des Beobachtungszeitraumes noch lebten (Patient FN), zum anderen eine Gruppe Patienten, die mehr als fünf Jahre nach Diagnosestellung lebten (Patient DK) und des weiteren die Gruppe mit den Patienten die kurze Zeit nach der Diagnose Sézary Syndrom verstarben (Patient OS, RM, SH). Schaut [Seite 86↓]man sich diese drei Gruppen in bezug zum exprimierten Phänotyp der PBMC und der Tumorzellen an, werden einige Unterschiede in den Gruppen deutlich.

So zeigte die erste Gruppe in der FACS-Analyse ein CD7+ bzw. CD26+ Expressionsmuster und einen hohen Anteil CD7+CD26+ Zellen. Die Tumorzellen dieser Patientengruppe wiesen einen überwiegend CD7+ Phänotyp auf. Auffallend ist der meist nicht klonale Ursprung der CD26+ Zellen. In der zweiten Gruppe fand sich ein CD7- und CD26- Phänotyp sowohl der PBMC als auch der Tumorzellen. CD26+ Zellen waren kaum vorhanden und die CD7-CD26- Zellen dominierten. Die Gruppe der „kurze Zeit nach Diagnose verstorbenen“ zeigte eine intermediäre Expression von CD7 auf den PBMC und den Tumorzellen. In dieser Gruppe waren etwas mehr CD26+ Zellen als in der zweiten Gruppe zu finden, ob schon die CD26- den größten Anteil hatten.

Die aus diesen Beobachtungen resultierende Schlussfolgerung ist die, dass Sézary Syndrom Patienten mit einer geringen Anzahl CD26+ bzw. CD7+CD26+ Zellen eher versterben. Desweiteren kann man die Überlegung anstellen, ob ein intermediäres CD7 Expressionsmuster mit einem früheren Versterben als die beiden dominanten Phänotypen assoziiert sein könnte. Die Thesen gelten jedoch nur eingeschrämkt, da zum einen die Patientenzahl gering und zum anderen der Beobachtungszeitraum von FN relativ kurz ist.

Der Zusammenhang zwischen einer vermehrter CD7 Expression und einer günstigeren Prognose ist von einigen Autoren vermutet worden (Bernengo et al. 1998), kann hier aber nur bedingt bestätigt werden. Bernengo et. al. veröffentlichten, dass eine vermehrte CD7 Expression mit einer besseren Prognose assoziiert sei (Bernengo et al. 1998). Auch der von Laetsch et. al. beschriebene Zusammenhang von erhöhten CD7- Zellzahlen und einem positivem PCR-Ergebnis mit einem fortgeschrittenem Stadium der Krankheit kann nicht gestützt werden (Laetsch et al. 2000), da hier bei allen Patienten, unabhängig von der Prognose, ein positives PCR-Ergebnis und CD7- Zellen zu finden waren..

Die von uns gemachten Beobachtungen werden durch die Beschreibung von Schwab et al. bestätigt. Sie zeigten an sieben Patienten, dass CD7- Zellen bei sechs Patienten vorhanden waren (Schwab et al. 2002). Ordnet man die dort untersuchten Patienten unseren aufgestellten Gruppen zu, dann beobachtet man, dass Patienten mit einem progredienten Krankheitsverlauf einen intermediären Expressionstyp zeigen, Patienten mit einem stabilen Krankheitsbild ebenfalls intermediäres Expressionsmuster, jedoch mit einem höheren Anteil an CD4+CD7- als die Patienten mit progredienten Krankheitsverlauf. Patienten mit einer partiellen bzw. kompletten Remission waren in der Gruppe mit positivem und intermediärem Expressionsmuster zu finden, jedoch war hier ein geringerer Anteil an CD4+CD7- Zellen als in dem Kollektiv mit progredientem Krankheitsverlauf zu finden.

Veröffentlichungen zur prognostischen Relevanz der CD26 Expression wurden bisher [Seite 87↓]nicht publiziert. Anhand der in dieser Arbeit gezeigten Daten kann vermutet werden, dass Patienten mit einem hohen Anteil nicht-klonaler CD26+ Zellen eine bessere Prognose aufweisen.

5.3.3 Diskussion des Zusammenhangs zwischen den weiteren klinischen und paraklinischen Parametern und der Prognose des Sézary Syndroms

Zur Einschätzung der Prognose von Patienten mit Sézary Syndrom werden mehrere vor allem paraklinische Werte als signifikant diskutiert. So sollen eine hohe Leukozytenzahl, eine erhöhte Zahl CD4+ Zellen und damit auch eine erhöhte CD4/ CD8 Ratio eine prognostische Signifikanz haben (Bernengo et al. 1998, Fraser-Andrews et al. 2001). Bei den hier untersuchten Patienten zeigte sich dieser Zusammenhang ebenfalls.

Von den bisher untersuchten Blutenzymen von Patienten mit Sézary Syndrom zeigte eine erhöhte Serum-LDH prognostische Signifikanz (Bernengo et al. 1998, Fraser-Andrews et al. 2001). Dieses Enzym, dass bei Tumorerkrankungen erhöht sein kann, zeigte auch bei den Patienten in dieser Arbeit einen Zusammenhang mit der Überlebenszeit.

In einigen Publikationen wurden komplette und auch partielle Remissionen beim Sézary Syndrom beschrieben (Schwab et al. 2002). Bei keinem hier untersuchten Patienten konnte eine solche Beobachtung gemacht werden.


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22.10.2004