Aus der Klinik für Dermatologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Molekularbiologische Identifizierung und immunophänotypische Charakterisierung der malignen Zellen beim Sézary Syndrom unter Berücksichtigung von Klinik und Prognose

zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae
(Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charié –
Universitätsmedizin Berlin

von
Herr Sebastian Schöpp
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr.med. Joachim W. Dudenhausen

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Univ.-Prof. Dr.med. H. Abken
2. PD Dr.rer.nat. A. Lukowsky
3. Prof. Dr.med. C. Neumann

Datum der Promotion: 27. September 2004

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Definition kutaner Lymphome und des Sézary Syndroms
    • 1.1.1 Definition kutaner Lymphome
    • 1.1.2 Das Sézary Syndrom
  • 1.2  Pathogenese
  • 1.3  Klinik und Paraklinik des Sézary Syndroms
  • 1.4  Diagnostik des Sézary Syndroms
    • 1.4.1 Histopathologie
    • 1.4.2 Zytogenetik
    • 1.4.3 Immunophänotypisierung und Durchflußzytometrie
      • 1.4.3.1 Zellsortierverfahren und Flowzytometrie
      • 1.4.3.2 T-Zell Phänotyp in den verschiedenen Entwicklungsstadien von T-Zellen
      • 1.4.3.3 Immunophänotyp des Sézary Syndroms
      • 1.4.3.4 Das Oberflächenantigen CD7
      • 1.4.3.5 Das Oberflächenantigen CD26
    • 1.4.4 Molekularbiologie
      • 1.4.4.1 Klonalitätsnachweis durch Southern Blot
      • 1.4.4.2 Klonalitätsanalyse mittels PCR
      • 1.4.4.3 Klonalitätsnachweis und Therapie-Monitoring mit Hilfe quantitativer PCR-Analyse
  • 1.5 Therapie, Prognose und prognostische Faktoren
    • 1.5.1 Therapie des Sézary Syndroms
    • 1.5.2 Prognose und prognostische Faktoren
• 2  Problemstellung
• 3  Material und Methoden
  • 3.1 Geräte und Chemikalien
    • 3.1.1 Geräte
    • 3.1.2 Chemikalien
  • 3.2 Patienten/ Proben
  • 3.3 Präparation und Lagerung der PBMC
    • 3.3.1 Gewinnung der PBMC
    • 3.3.2 Lagerung der PBMC
    • 3.3.3 Mikroskopische Zellzahlbestimmung
  • 3.4 Zellfärbung, FACS und Zellsortierung
    • 3.4.1 Zellfärbung
    • 3.4.2 Fluoreszenzmessung am Durchflußzytometer
    • 3.4.3  Zellsortierung mittels CellSorter
  • 3.5 DNA-Extraktion/ Konsensus PCR/ TCR-β-PCR/ Agarosegelelektrophorese/ TGGE
    • 3.5.1 DNA-Extraktion
    • 3.5.2 TCR-γ-PCR
    • 3.5.3 TCR-β-PCR
    • 3.5.4 PCR-Programme
    • 3.5.5 Agarosegelelektrophorese
    • 3.5.6 Temperaturgradientengelelektrophorese (HD-TGGE-PAGE)
  • 3.6  PCR-Produktaufreinigung/ Re-PCR/ Klonierung/ Sequenzierung/ klonspezifische Primer
    • 3.6.1 PCR-Produktaufreinigung
    • 3.6.2 Re-PCR
    • 3.6.3 Klonierung
    • 3.6.4 Sequenzierung
    • 3.6.5 klonspezifische Primer
  • 3.7 quantitative PCR
    • 3.7.1 Herstellung eines klonspezifischen Standards
    • 3.7.2 Die quantitative PCR im LightCycler®
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 FACS-Analysen an mononukleären Zellen des peripheren Blutes von Patienten mit Sézary Syndrom
    • 4.1.1 CD7-Expression peripherer CD3+ Lymphozyten
    • 4.1.2  CD26 Expression peripherer CD3+ Lymphozyten
    • 4.1.3 Korrelation der CD7 und CD26 Expressionsmuster
  • 4.2 Qualitative PCR-Analysen an PBMC von Sézary Syndrom Patienten
    • 4.2.1 TCR-γ-PCR
    • 4.2.2 TCR-β-PCR
    • 4.2.3 Patientenspezifische PCR
  • 4.3  Quantitative PCR-Analysen an PBMC von Patienten mit Sézary Syndrom
    • 4.3.1 Entwicklung der PCR-Bedingungen für eine quantitative PCR im LightCycler®
    • 4.3.2 Quantifizierung der CD7+ und CD7- Fraktion
    • 4.3.3 Quantifizierung der CD26+ und CD26- Fraktion
    • 4.3.4 Korrelation der PCR- und FACS-Ergebnisse
  • 4.4  Korrelation der Analysen mit klinischen Befunden
    • 4.4.1 Klinische und paraklinische Befunde
    • 4.4.2  Betrachtung der Daten im Zusammenhang zum klinischen Verlauf
  • 4.5 Zusätzliche Aspekte der FACS-Analysen
    • 4.5.1 Ungewöhnliche Expressionsmuster von CD7 und CD26 auf peripheren Lymphozyten
    • 4.5.2  Koexpression von CD7 und CD26 auf peripheren Lymphozyten
• 5  Diskussion
  • 5.1 Methodik
    • 5.1.1 FACS-Analyse und Zellsortierung
    • 5.1.2 Entwicklung und Spezifität klonspezifischer Primer
    • 5.1.3  Quantitative PCR
  • 5.2 Ergebnisse
    • 5.2.1 CD7 und CD26 Expression beim Sézary Syndrom
      • 5.2.1.1 CD7 Expression beim Sézary Syndrom
      • 5.2.1.2 CD26 Expression beim Sézary Syndrom
      • 5.2.1.3 CD7, CD26 Koexpression beim Sézary Syndrom
    • 5.2.2 Präsenz des T-Zell-Klons in den CD7+, CD7- und CD26+, CD26- Populationen
    • 5.2.3 Korrelation der FACS-Daten und der Daten der Quantifizierung
    • 5.2.4  dim-Expression von CD3
  • 5.3 Prognostische und diagnostische Relevanz der Ergebnisse zur Tumorlast, CD7 Expression, CD26 Expression in Bezug zur Klinik und Therapie
    • 5.3.1 CD7 und CD 26 Expression in Korrelation zu klinischem Status und Therapie
    • 5.3.2 CD7 und CD26 Expression in Korrelation zum Überleben der Patienten
    • 5.3.3 Diskussion des Zusammenhangs zwischen den weiteren klinischen und paraklinischen Parametern und der Prognose des Sézary Syndroms
• 6  Zusammenfassung und Thesen
  • 6.1 Zusammenfassung
  • 6.2 Thesen
• Abkürzungsverzeichnis
• Literatur
• Erklärung an Eides Statt
• Danksagung

Tabellen

• Tab. 1: Vergleich der Klassifikation der EORTC und der WHO
• Tab. 2: Stadien der hämatologischen Beteiligung beim Sézary Syndrom
• Tab. 3: CD26 Expression und DPPIV Aktivität bei anderen Erkrankungen
• Tab. 4: Auflistung der Patientenproben
• Tab. 5: Kombination der Antikörper für die Zellanalyse
• Tab. 6: verwendete Primer
• Tab. 7: verwendete PCR-Programme
• Tab. 8: CD7 Expression der CD3+ PBMC
• Tab. 9: CD26 Expression der CD3+ PBMC
• Tab. 10: Korrelation von CD7 und CD26 Expressionsmustern
• Tab. 11: Darstellung der Ergebnisse der TCR-γ Sequenzierung
• Tab. 13: Übersicht über die klonspezifischen Primer
• Tab. 14: PCR-Programme
• Tab. 15: Ergebnisse der klonspezifischen PCR
• Tab. 16: PCR-Programme für den LightCycler®
• Tab. 17: Ergebnisse der quantitativen PCR der nach der CD7 Expression sortierten Zellen
• Tab. 18: Ergebnisse der quantitativen PCR der nach der CD26 Expression sortierten Zellen
• Tab. 20: Klinische und paraklinische Parameter der Patienten.
• Tab. 21: CD7, CD26 Koexpression der PBMC als prozentualer Anteil der einzelnen Populationen

Bilder

• Abb. 1: CD7 Expression der CD3+ Zellen
• Abb. 2: Kontrolle der Reinheit der sortierten, CD3+/CD7- Zellen
• Abb. 3: CD26 Expression der CD3+ Zellen
• Abb. 4: Kontrolle der Reinheit der sortierten, CD3+/CD26+ Zellen
• Abb. 5: Bsp. für ein Ergebnis einer klonspezifischen PCR (für SH), Auftrennung im Agarosegel
• Abb. 6: Bsp. für eine klonspezifische PCR an sortierten Zellen (OS vom 04.08.00), Auftrennung im Agarosegel
• Abb. 7: Bsp. für eine quantitative PCR (CD7+ und CD7- Populationen von RM)
• Abb. 8: Schmelzkurvenanalyse der quantitativen PCR aus Abb.7
• Abb. 9: Bsp. für eine quantitative PCR der CD26+ und CD26- Populationen (von SH)
• Abb. 10: Schmelzkurvenanalyse der quantitativen PCR aus Abb.9
• Abb. 11: CD7, CD26 Koexpression der PBMC von RM