19

Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Patienten-DNA

DNA von 31 nicht konsanguinen Patienten indogermanischer (caucasian) Abstammung wurde zwischen Juni 1996 und Februar 1998 auf einen Surfaktantproteindefekt untersucht. Alle Patienten befanden sich zum Zeitpunkt der Probenentnahme zur stationären Behandlung in einer Kinder- oder Lungenklinik. Die Indikation zur Untersuchung der Surfaktantproteine wurde von den behandelnden Ärzten in Absprache mit dem Leiter des Projektbereichs “Molekulare und zelluläre Biologie des Surfaktants“ gestellt. EDTA-Blut wurde mit Einwilligung der Eltern beziehungsweise der volljährigen Patienten entnommen und zur DNA-Isolation verwendet. Differentialdiagnostische Erwägungen entschieden, bei welchen Patienten die SP-A-Gene vollständig sequenziert wurden.

3.1.1 Indikation zur Untersuchung der Surfaktantproteine

Zwölf Patienten waren Frühgeborene, die seit der Geburt beatmungspflichtig waren. Zwei litten an einer therapierefraktären Pneumonie und zehn am Atemnotsyndrom des Neugeborenen ( RDS ). Von diesen zehn konnten sieben nicht vom Respirator entwöhnt werden, bei einem war ein fatales Atemnotsyndrom aus der Familienanamnese bekannt, bei den beiden anderen war PAS -positives Material in der bronchoalveolären Lavage ( BAL ) nachgewiesen worden.

Vierzehn Patienten waren reifgeborene Säuglinge, von denen sich sieben zum Zeitpunkt der Untersuchung noch im Neugeborenenalter befanden. Drei der Säuglinge wurden wegen einer therapierefraktären Pneumonie behandelt und einer hatte ein akutes Atemnotsyndrom (ARDS) im Anschluss an eine virale Pneumonie entwickelt. Von den zehn übrigen Säuglingen mit dem klinischen Bild eines RDS waren sieben nicht vom Respirator zu entwöhnen, zwei benötigten vorübergehend eine extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO), beim anderen war ein fatales Atemnotsyndrom aus der Familienanamnese bekannt.

Fünf ältere Kinder und Erwachsene mit allmählicher Verschlechterung der Lungenfunktion und interstitieller radiologischer Zeichnungsvermehrung wurden wegen PAS-positivem Material in der BAL oder einer Lungenbiopsie unter dem Verdacht auf eine Alveolarproteinose untersucht. Fünf Mitarbeiter ohne pulmonale Erkrankung hatten ihre SP-A-Gene ebenso analysieren lassen.

20

Tabelle 3-1: Patientendaten mit Angaben zur Indikation und Alter zum Zeitpunkt der Blutabnahme
ARDS = akutes Atemnotsyndrom, BPD = bronchopulmonale Dysplasie, CMV = Zytomegalievirus, ECMO = extrakorporale Membranoxygenierung, PAS+ = PAS -positives Material in BAL oder Biopsat (pathognomonisch für Alveolarproteinose), RDS = Atemnotsyndrom, SSW = vollendete Schwangerschaftswochen bei Frühgeburt, Surf = Zahl der Surfaktantgaben (falls bekannt), verst = verstarb im Alter von: Ta(gen), Wo(chen), Mo(naten) oder J.(ahren). * = aufgrund dieser Diagnose wurde eine vollständige Sequenzierung der SP-A-Gene durchgeführt.

Nr	Alter	SSW	Indikation	Differentialdiagnose	Surf	verst
1	2 Wo		RDS mit Langzeitbeatmung	pulmonale Maladaptation bei maternalem Diabetes
2	4 Mo		therapierefraktäre Pneumonie	Aspiration, Chromosom 20p-Syndrom, Glykogenose		4 Mo
3	2 Wo		RDS mit 10 Tagen ECMO	idiopathische Alveolarproteinose*	3 ×	4 Wo
4	15 J.		chronische Dyspnoe (PAS+)	idiopathische Alveolarproteinose*
5	9 Wo	25	RDS mit Langzeitbeatmung	BPD, therapierefraktärer Surfaktantmangel*
6	4 Wo		RDS mit Langzeitbeatmung	idiopathische Alveolarproteinose*		7 Wo
7	1 Mo	35	therapierefraktäre Pneumonie	rezidivierende konnatale Pneumonie*
8	7 Wo	25	RDS mit Langzeitbeatmung	BPD, therapierefraktärer Surfaktantmangel*	4 ×
9	14 J.		chronische Dyspnoe (PAS+)	idiopathische Alveolarproteinose*
10	4 Wo		RDS mit Langzeitbeatmung	zeitweise verminderter SP-A-Gehalt in der BAL*	8 ×
11	2 Wo		RDS, Familienanamnese	Besserung nach Ausschluss der Alveolarproteinose
12	11 J.		chronische Dyspnoe (PAS+)	Leukämie, idiopathische Alveolarproteinose*
13	7 Mo	25	rezidivierende Pneumonie	Wilson-Mikity-Syndrom (Blasenlungensyndrom)
14	2 Wo	25	RDS mit Langzeitbeatmung	Vierling mit BPD	9 ×
15	4 Mo	27	RDS mit Langzeitbeatmung	BPD, therapierefraktärer Surfaktantmangel*	5 ×
16	5 Mo		therapierefraktäre Pneumonie	rezidivierende interstitielle Pneumonie*
17	9 Mo		therapierefraktäre Pneumonie	rezidivierende Bronchopneumonie*
18	5 Wo		RDS mit Langzeitbeatmung	konnatale Alveolarproteinose bei SP-B-Mangel		4 Mo
21	7 Mo		ARDS mit Langzeitbeatmung	ARDS, interstitielle Pneumonie, SP-B-Mangel	3 ×
22	4 Wo		RDS mit Langzeitbeatmung	Besserung nach Ausschluss der Alveolarproteinose
23	40 J.		chronische Dyspnoe (PAS+)	sekundäre Alveolarproteinose bei Pneumokoniose
24	1 Wo	35	RDS, Familienanamnese	schweres RDS	3 ×
25	7 Wo		RDS, ECMO, CMV-Infekt	konnatale Alveolarproteinose bei SP-B-Mangel	2 ×	3 Mo
26	9 Wo	30	RDS mit Langzeitbeatmung	BPD, Sepsis, nosokomiale Pneumonien	13 ×	5 Mo
27	7 Wo	34	RDS mit Langzeitbeatmung	RDS, BPD, nosokomiale Pneumonie	6 ×
28	3 Wo		RDS mit Langzeitbeatmung	Besserung nach Ausschluss der Alveolarproteinose
31	4 Mo	34	schweres RDS (PAS+)	konnatale Alveolarproteinose bei GM-CSF-Mangel	1 ×	4 Mo
32	3 Wo	29	RDS mit Langzeitbeatmung	Atelektase mit Verteilungsstörung in der Lunge
33	6 Wo		RDS mit Langzeitbeatmung	nosokomiale Pneumonie, Chromosom 22q-Syndrom		3 Mo
34	1 Wo	36	schweres RDS (PAS+)	idiopathische Alveolarproteinose*	3 ×	6 Wo
37	35 J.		chronische Dyspnoe (PAS+)	Idiopathische Alveolarproteinose*

21

3.1.2 Differentialdiagnostische Erwägungen

Bei elf Patienten wurde die Diagnose einer Alveolarproteinose durch den Nachweis des charakteristischen, protein- und phospholipidhaltigen, PAS-positiven Materials in der Lunge gesichert. Bei zwei dieser Patienten war kein Surfaktantprotein B (SP-B) in der Lavage nachweisbar. Es wurden Untersuchungen des SP-B-Gens (sftp3 nach Pilot-Matias et al. 1989) auf die Mutationen 121ins2 ( Nogee et al. 1994), Arg236Cys ( Ballard et al. 1995) und Gly135Cys ( Klein et al. 1998) durchgeführt, die jedoch nicht Bestandteil dieser Arbeit sein sollen. Patient 18 hatte die Leserastermutation 121ins2 (nach den aktuellen Vorschlägen zur Nomenklatur Phe120fs mit einem frameshift in Codon 120) in einem Allel des SP-B-Gens und im anderen Allel eine Einzelbasensubstitution, die den Aminosäureaustausch Cys49Arg bewirkt, es bestand also compound heterozygosity (kombinierte Heterozygotie) für [g.2587delCinsGAA] + [g.1508T>C], was den letalen Ausgang erklärt (L. Nogee et al., unveröffentlicht). Patient 25 hatte ebenfalls eine konnatale Alveolarproteinose, der für den SP-B-Mangel verantwortliche Defekt war jedoch nicht zu ermitteln. Die bei diesem Patienten ebenfalls nachgewiesene Infektion mit dem Zytomegalievirus (CMV) soll bei einigen Formen der Alveolarproteinose pathogenetisch beteiligt sein ( Ranchod und Bissell 1979). Bei Patient 31 konnte ein Defekt im GM-CSF-Rezeptorgen als Ursache der konnatalen Alveolarproteinose nachgewiesen werden, Patient 23 entwickelte die Alveolarproteinose sekundär im Rahmen einer Pneumokoniose. Bei Autopsien ist dies kein seltener Befund ( Honma und Chiyotani 1991). Nach Ausschluss bekannter Ursachen wurden die übrigen sieben Fälle zunächst als idiopathische Alveolarproteinose eingeordnet. Es handelte sich hierbei um drei Neugeborene, die innerhalb weniger Wochen verstarben und vier ältere Kinder oder Erwachsene. Bei Patient 12 wäre auch die Einordnung als sekundäre Alveolarproteinose bei Leukämie gerechtfertigt ( Cordonnier et al. 1994), doch soll der auffällige SP-A-Genotyp in Abschnitt 5.2.2 diskutiert werden.

Außer bei den sieben Patienten mit idiopathischer Alveolarproteinose wurden die SP-A-Gensequenzen bei drei Säuglingen mit rezidivierender Pneumonie im Alter von einem, fünf, beziehungsweise neun Monaten und vier seit mehreren Wochen beatmungspflichtigen RDS-Patienten vollständig ermittelt. Eins dieser Kinder war durch den vorübergehenden Nachweis einer niedrigen Konzentration des SP-A in der BAL aufgefallen, drei waren Frühgeborene, bei denen wegen der schlechten Antwort auf wiederholte Surfaktantgaben ein für den Surfaktantmangel verantwortlicher Defekt in den Surfaktantproteinen als Differentialdiagnose zur sich abzeichnenden bronchopulmonalen Dysplasie ( BPD ) diskutiert wurde. Bei den übrigen Patienten erklärten die in Tabelle 3-1 aufgeführten Differentialdiagnosen die Schwere der Erkrankung. Nach Entlassung wurde der Krankheitsverlauf nicht weiter verfolgt. Drei der

22

3.2 Geräte und Chemikalien

Die benutzten Geräte sind in Tabelle 3-2 aufgeführt, die Verbrauchsmaterialien in Tabelle 3-3 .

Tabelle 3-2: Geräte

Bezeichnung	Typ	Hersteller
Autoklav	2540 EL	tuttnauer®
Schüttelbrutschrank	3032	G.F.L. ®
Direkt-Blotter	1500 System	GATC GmbH in Konstanz (BRD)
Elektrophorese (horizontal)	GFA 100	Pharmacia Biotech in Uppsala (Schweden)
Elektrophorese (vertikal)	SE 600	Hoefer Scientific Instruments in S. F. (USA)
Feinwaage	MC BA 100	Sartorius GmbH in Göttingen (BRD)
Foto Scanner	ScanJet 4C	Hewlett Packard
Gefrierkühlschrank	KK EE 26 A	Robert Bosch GmbH in München (BRD)
Hybridisiertrommel		GATC GmbH in Konstanz (BRD)
Imaging-Densitometer	GS-670	Bio-Rad Laboratories GmbH in München (BRD)
Kältezentrifuge	MR 18 22	Jouan®
Kühlpumpe	Colora	Spandau Pumpen in Berlin (BRD)
Netzgerät	PowerPac3000	Bio-Rad Laboratories GmbH in München (BRD)
PH-Meter	761 calimatic	Knick Elektr. Messgeräte GmbH in Berlin (BRD)
Pipetten	Vario	eppendorf® in Hamburg (BRD)
Sofortbildkamera	DS 34	Polaroid® in Cambrigde (Großbritannien)
Sterilwerkbank	BSK 6 MP	antair®
Thermocycler	TRIO-Thermobloc	Biometra® in Göttingen (BRD)
Thermomixer	5436	eppendorf® in Hamburg (BRD)
Tischzentrifuge	5410	eppendorf® in Hamburg (BRD)
UV-Crosslinker	GATC LINK	GATC GmbH in Konstanz (BRD)
UV-Transilluminator	UVVIS-20	Hoefer Scientific Instruments in S.F. (USA)
Vortex	Reax 2000	Heidolph®
Waage	34.002	VEB Wägetechnik Rapido (DDR)

Die Chemikalien stammten, wo nicht anders angegeben, von der Carl Roth GmbH in Karlsruhe, der Serva Feinbiochemica GmbH in Heidelberg oder der Sigma-Aldrich GmbH in Deisenhofen, die Restriktionsendonukleasen und Reaktionspuffer von New England Biolabs in Beverly

23

Tabelle 3-3: Verbrauchsmaterial

Bezeichnung	Typ	Hersteller
Filter	1573 ½	Schleicher & Schüll GmbH in Dassel (BRD)
Direct Blotting Membrane	Breite 15 cm	GATC GmbH in Konstanz (BRD)
Gel drying film	25,5 × 28 cm	Promega®Boehringer Ingelheim in Heidelberg (BRD)
Parafilm®	4 × 24 cm	American National Can in Greenwich (USA)
Petrischalen	Falcon® 1029	Becton Dickinson Labware in New Jersey (USA)
Pipettenspitzen	Pipet Tips	eppendorf® in Hamburg (BRD)
(dito gestopft)	Safe Seal-Tips	BIOzym® in Hessisch Oldendorf (BRD)
Reaktionsgefäße	Safe-lock	eppendorf® in Hamburg (BRD)
Schwarzweißfilme	Type 667	Polaroid® in Cambrigde (Großbritannien)

3.3 Gelelektrophorese

Mit Hilfe der Gelelektrophorese wurde DNA zur Analyse und Isolierung aufgetrennt. Die Größe der DNA-Moleküle in Basenpaaren (bp) wurde im Vergleich mit einem DNA-Standard abgeschätzt. Tabelle 3-4 zeigt die Reagenzien für die Gelelektrophoresen.

Tabelle 3-4: Reagenzien für die Gelelektrophorese

Reagenz	Bezeichnung	Hersteller
DNA-Standards	100 bp DNA ladder HindII-digest des -Phagen	GibcoBRL® in Eggenheim (BRD) Eigenproduktion
Agarose	Agarose (für > 500 bp)	Biozym Diagnostik GmbH in Hessisch Old. (BRD)
Acrylamidlösung	40%-Acryl.(37,5:1)Bis-Acr.	amresco® in Solon, Ohio (USA)
SSCP-Gellösung	MDE® Gel Solution	FMC BioProducts in Rockland, Maine (USA)
abweisendes Silan	Dimethyldichlorsilan	Serva Feinbiochemica GmbH in Heidelberg (BRD)

Hochmolekulare genomische DNA und Plasmid-DNA wurden in der Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Die DNA kann nach Einschmelzen des Gels in Anwesenheit chaotropischer Salze leicht isoliert werden. PCR-Produkte und DNA-Restriktionen wurden aufgrund der besseren Trennschärfe in der Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Dem Auftragepuffer wurden Farbstoffe zur Markierung der Laufmittelfront zugesetzt. Tabelle 3-5 zeigt die Stammlösungen.

24

Tabelle 3-5: Lösungen für die Gelelektrophorese

Lösung	Konzentration der	Bestandteile
Auftragepuffer	10 mmol/l 25 % 0,1 % 0,1 %	Tris-Base (pH 8,0) Ficoll 400 Xylencyanol FF Bromphenolblau
Polymerisationsstarter	0,1 % 0,15 %	Ammoniumpersulfat (APS) N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
TAE-Puffer (pH 8,0 bei 25 °C)	40 mmol/l 5 mmol/l 1 mmol/l	Tris-Base Natriumacetat Na2EDTA
(10×)TBE-Puffer (pH 8,0 bei 25 °C)	900 mmol/l 900 mmol/l 20 mmol/l	Tris-Base Borsäure Na2EDTA

Die SSCP-Gelelektrophorese wurde in Polyacrylamidgelen geringer Querverzweigung zum Nachweis des Einzelstrangkonformationspolymorphismus ( single strand conformation polymorphism) mit amplifizierter DNA durchgeführt. Die Proben wurden vor der Elektrophorese im Einzelstrangpuffer denaturiert, also in sense- und antisense-Einzelstränge aufgetrennt, die im nicht denaturierenden Gel eine individuelle Konformation (räumliche Anordnung) annehmen und sich dadurch von der ebenfalls gebildeten Doppelstrang-DNA isolieren lassen. Zum Farbnachweis der DNA im Gel wurden interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt. Beim Nachweis von Einzelstrang-DNA war die Silberfärbung sensitiver.

3.3.1 Agarosegelelektrophorese

1 µl genomische DNA oder 2 µl amplifizierte DNA wurde mit 1 µl Auftragepuffer in einem 8 × 4 × ½ cm-Gel aus 1 % Agarose in TAE-Puffer bei einem konstanten Strom von 40 mA etwa 20 Minuten aufgetrennt. Zur Gelexzision wurde 50 µl PCR-Produkt mit 10 µl Auftragepuffer in einem 12 × 8× 0,8 cm-Gel bei 85 mA etwa 60 Minuten aufgetrennt.

3.3.2 Polyacrylamidgelelektrophorese

5 - 10 µl amplifizierte DNA wurde in 16 × 14 × 0,15 cm-Gelen aus 5 - 8 % Polyacrylamid in TBE-Puffer mit 5 µl Auftragepuffer bei 55 mA etwa 1 h aufgetrennt.

25

3.3.3 SSCP-Gelelektrophorese

Die in Tabelle 3-6 gezeigten Stammlösungen mit verschiedenen Bisacrylamidanteilen wurden bei 4 °C aufbewahrt. Die Glasplatten wurden vor dem Gießen mit abweisendem Silan beschichtet. 5 - 10 µl PCR-Amplifikat wurden mit 5 - 10 µl Einzelstrangpuffer für 5 Minuten bei 95 °C inkubiert und in 16 × 16 × 0,15 cm-Gelen aus 3,5 - 12 % Polyacrylamid in TBE-Puffer 90 - 150 Minuten mit einer konstanten Leistung von 7 Watt aufgetrennt. Eine zusätzliche Probe wurde mit Doppelstrangpuffer gemischt und nicht denaturiert.

Tabelle 3-6: Lösungen für die SSCP-Gelelektrophorese

Lösung	Konzentration	der Bestandteile
40%-Acrylamidlösung Acryl.(39:1)Bis-Acryl.	35,1 g 0,9 g 90 ml	Acrylamid N, N’-Methylenbisacrylamid H2O
40%-Acrylamidlösung Acryl. (99:1)Bis-Acryl.	39,6 g 0,4 g 100 ml	Acrylamid N, N’-Methylenbisacrylamid H2O
40%-Acrylamidlösung Acryl. (199:1)Bis-Acryl.	19,9 g 0,1 g 50 ml	Acrylamid N, N’-Methylenbisacrylamid H2O
Einzelstrangpuffer	80 % 1 mmol/l 10 mmol/l 0,1 %	Formamid Na2EDTA NaOH Xylencyanol FF/ Bromphenolblau
Doppelstrangpuffer	80 % 1 mmol/l 0,1 %	Formamid Na2EDTA Xylencyanol FF/ Bromphenolblau

3.3.4 Farbnachweis der DNA im Gel

Polyacrylamidgele wurden 10 Minuten in Ethidiumbromidlösung gefärbt. Agarosegelen wurde Ethidiumbromid in entsprechender Konzentration zugegeben. Zum Nachweis schwacher Banden wurde das Gel mit 1,5 ml SYBR^®-Green I für 30 Minuten überschichtet.

SSCP-Gele wurden mit dem silver stain kit aus Tabelle 3-7 auf dem Horizontalwipptisch gefärbt. Zunächst wurde 60 Minuten in Fixativ 1 und zweimal 30 Minuten in Fixativ 2 gespült. Der Oxidizer wirkte 10 Minuten auf das Gel ein, bevor er in drei Waschschritten von 10 Minuten Dauer gründlich ausgespült wurde. Das Silberreagenz wirkte 30 Sekunden ein, bevor 2 Minuten mit H₂O gespült wurde. Entwicklerlösung wurde dreimal bis zur Ausflockung eingesetzt. Stopplösung beendete die Reaktion, bevor sich eine Hintergrundfärbung einstellte.

26

Tabelle 3-7: Lösungen zum Farbnachweis der DNA im Gel
1): Biozym Diagnostik GmbH in Hessisch Oldendorf
2): silver stain kit der Bio-Rad Laboratories in Richmond, California

Lösung	Konzentration der	Bestandteile
Ethidiumbromidlösung	0,5 µg/ml	in H2O
SYBR®-Green I stain solution1)	1:10.000	in TBE-Puffer (pH 8,0)
Fixativ 1	40 %	Methanol
Fixativ 2	10 %	Ethanol
Oxidizer2)	(keine Angaben)	KCr2O7 und HNO3
Silberreagenz2)	0,05 %	AgNO3
Entwickler2)	3 % 0,2 %	NaCO3 Paraformaldehyd
Stopplösung	5 %	Essigsäure

3.4 DNA-Isolation

Genomische DNA aus Leukozyten wurde nach Auflösen der Zellen mittels geeigneter Detergentien und Präzipitation der Proteine in einer Salzlösung durch alkoholische Fällung pelletiert. Die freigesetzte RNA wurde enzymatisch abgebaut. Plasmid-DNA wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (1979) isoliert. Amplifizierte DNA-Sequenzen wurden durch Bindung an silikatisches Trägermaterial isoliert. In der PCR nicht verbrauchte Nukleotide und Primer wurden enzymatisch abgebaut. Nebenprodukte wurden elektrophoretisch abgetrennt und die gewünschte DNA mittels Gelexzision isoliert.

3.4.1 Genomische DNA aus Leukozyten

Tabelle 3-8: Lösungen zur Isolation chromosomaler DNA
Puregene^®DNA-Isolation Kit: Volumina zur DNA-Isolation aus 300µl Vollblut und Zusammensetzung nach Angaben des Herstellers: Gentra Systems, Inc. in Minneapolis (USA)

Lösung	Volumen	Zusammensetzung
Red Blood Cell (RBC) Lysis Solution	900 µl	NH4Cl, Na2EDTA, Na2CO3
Cell Lysis Solution	300 µl	Tris-Base, Na2EDTA, SDS
RNase A Solution	1,5 µl	>120 Units/µl RNase A
Protein Precipitation Solution	150 µl	Ammoniumacetat
DNA Hydration Solution	100 µl	10 mmol/l Tris-Base, 1 mmol/l Na2EDTA

27

3.4.2 Plasmid-DNA

1,5 ml Bakterienkultur wurden 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 100 µl des Suspensionspuffers in Tabelle 3-9 suspendiert, unter Vortexen mit 200 µl Detergenz gemischt und für 5 Minuten auf Eis gestellt. 30 Minuten nach Zugabe von 150 µl Salzlösung 1 wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (13.000 Upm). Der Überstand wurde mit 1 ml 96 %igem Ethanol gemischt und die DNA bei -20 °C für 30 Minuten ausgefällt. Nach 10 Minuten Zentrifugieren bei 4 °C (13.000 Upm) wurde der Überstand abgesaugt.

Tabelle 3-9: Lösungen zur Isolation von Plasmid-DNA

Lösung	Konzentration	der Bestandteile
Suspensionspuffer	25 mmol/l 50 mmol/l 10 mmol/l	Tris-HCl (pH 8,0) Glucose Na2EDTA
Detergenz	1% 0,2 mol/l	SDS NaOH
Salzlösung 1	3,0 mol/l	Natriumacetat (pH 4,8)
Salzlösung 2	0,3 mol/l	Natriumacetat (pH 4,8)

Das Pellet wurde in 150 µl Salzlösung 2 gelöst, mit 300 µl tiefgekühltem Ethanol gefällt, in der Vakuumzentrifuge 5 Minuten getrocknet und in 30 µl H₂O zur weiteren Analyse gelöst.

3.4.3 Amplifizierte DNA-Sequenzen

Ein PCR-Ansatz (50 µl) wurde mit je 0,5 µl Exonuklease und Phosphatase 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. 15 Minuten Erhitzen auf 80 °C inaktivierte die Enzyme. Die Probe wurde mit 250 µl Puffer PB in ein QIAquick^®spin column überführt und 30 Sekunden zentrifugiert (13.000Upm). Nach Waschung mit 500 µl Puffer PE wurde mit 30 µl H₂O eluiert. Zur Gelexzision wurde die entsprechende Farbbande aus dem Agarosegel geschnitten und mit QIAEXII-Suspension aus

28

Tabelle 3-10: Materialien zur Aufbereitung amplifizierter DNA
1): Reagent pack for use with Sequencing Kit Nr. US 70995 von Amersham in Cleveland, Ohio (USA)
2): Reagenzien zur DNA-Extraktion von der QIAGEN GmbH in Hilden (BRD)

Produkt	Bestandteile
Enzyme1)	2 Units/µl shrimps alcaline phosphatase + 10 Units/µl Exonuclease I
QIAquick®spin column2)	silikatisches Trägermaterial
Puffer PB/ Puffer QX 1	Chaotropische Salze
Puffer PE	Tris-Base / NaCl / 70% Ethanol
QIAEX II-Suspension	silikatisches Trägermaterial

3.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Tabelle 3-11: Reagenzien für die PCR
1): Promega^® oder TaKaRa^®, Boehringer Ingelheim Bioproducts in Heidelberg (BRD)
2): Expand^®-Long Template PCR-System von Boehringer in Mannheim (BRD)
3): PerkinElmer Weiterstadt, 4): PAN-Systems GmbH Aidenbach, 5): Braun^® Melsungen (BRD)

Reagenz	Konzentration	der Bestandteile
(10×)PCR-Puffer1) (pH 9,0 bei 25 °C)	500 mmol/l 100 mmol/l 1 %	KCl TrisHCl Triton® X 100
(10×)PCR-Puffer II3) (pH 8,3 bei 25 °C)	500 mmol/l 100 mmol/l	KCl TrisHCl
Additiva	5 - 10 mmol/l 10 % 5 - 10 %	Ammoniumsulfat Glycerol Formamid
Magnesiumlösung1)	25 mmol/l	MgCl2
dNTP-Mix1) (pH 7,8 bei 25 °C)	10 mmol/l 10 mmol/l 10 mmol/l 10 mmol/l	dATP dCTP dGTP dTTP
thermostabile DNA-Polymerasen	5 Units/µl 5 Units/µl	Taq-DNA-Polymerase1) Tfl-DNA-Polmerase1)
hot start -DNA-Polymerase3)	5 Units/µl	AmpliTaq Gold®
DNA-Polymerasen mit proof reading-Aktivität	5 Units/µl 5 Units/µl 5 Units/µl	ExTaq-DNA-Polymerase1) Pwo-DNA-Polymerase + Taq-DNA-Polymerase2) PowerScript DNA-Polymerase + Pyrophosphatphosphohydrolase4)
aqua ad iniectibilia5)	100 %	H2O

29

Die Berechnung geeigneter Primersequenzen mit speziellen Algorithmen bildet die Grundlage für die experimentelle Auswahl der Primer. Die verschiedenen Reagenzien aus Tabelle 3-11 wurden zur Optimierung der Reaktionsbedingungen in wechselnden Konzentrationen eingesetzt. Alle Schritte der DNA-Isolation und die Vorbereitung der PCR wurden unter der Sterilwerkbank mit gestopften Pipettenspitzen und Einmalhandschuhen durchgeführt. Reaktionsgefäße und Reagenzien wurden autoklaviert. Bei jeder PCR wurde ein Reaktionsansatz ohne DNA mitgeführt, um Kontaminationen auszuschließen.

3.5.1 nested PCR

Um wie bei einer allelspezifischen PCR ( ASPCR ) nur eine aus mehreren annähernd identischen DNA-Sequenzen zu amplifizieren, sind “diskriminierende“ Primer nötig, deren 3‘-terminale Nukleotide in unserem Fall für eine der beiden SP-A-Gensequenzen spezifisch sind. Mit jeder genomischen DNA-Probe wurden wie in Abbildung 3-1 dargestellt zwei separate Polymerasekettenreaktionen zur Isolation der beiden Genkopien durchgeführt. In diesen externen PCRs wurde mit diskriminierenden Primern eine alle kodierenden Exone umfassenden Sequenz des SP-A1-Gens (3.104 bp) beziehungsweise des SP-A2-Gens (3.090 bp) amplifiziert. Die voramplifizierten Sequenzen dienten jeweils als template (DNA-Matrize) zur Amplifikation der Exonsequenzen in den internen PCRs. Die für ein Exon spezifischen Primer diskriminieren nicht SP-A1 von SP-A2. Als optimale Verdünnung des externen PCR-Produkts in der internen PCR wurde 1:50.000 bei Anwendung von 25 Reaktionszyklen ermittelt. Von der externen PCR wurde unter sterilen Bedingungen 1 µl entnommen, mit 999 µl H₂O verdünnt und bei minus 20 °C aufbewahrt. 1 µl je Reaktionsansatz wurde als DNA in der internen PCR eingesetzt.

30

Abbildung 3-1: Getrennte Amplifikation der SP-A-Gene mittels nested PCR

31

3.5.2 Berechnung geeigneter Primersequenzen

Die Schmelztemperatur (T_m), bei der Oligonukleotide von komplementärer DNA dissoziieren, wurde nach Gleichung 3-1 berechnet. Multiple annealing tests nach Hillier und Green (1991) dienten der Selektion spezifischer Primersequenzen. Diese wurden mit dem FastA-Algorithmus nach Pearson und Libman (1988) auf Homologie zu den in der GenBank gespeicherten Sequenzen von Primaten geprüft. Primer mit über 94 % Analogie zu einem anderen Gen wurden ausgeschlossen. Bei Identität am 3‘-Ende wurden nur 85 % Analogie akzeptiert.

Gleichung 3-1: Schmelztemperatur von DNA-Oligomeren (nach Rychlik et al. 1990)
Legende: H ist die Enthalpie und S die Entropie der Helixbildung. R ist die Gaskonstante (1.987 cal/°C/mol).
c ist die Primer- und [K⁺] die Kaliumionenkonzentration

Einige Sequenzen wurden manuell modifiziert. Um alle Primer vergleichen zu können, wurde der Schätzung der Hybridisierungstemperatur ( T _a) eines Primerpaars die vom Hersteller nach Gleichung 3-2 berechnete Schmelztemperatur (T_m) zugrundegelegt.

Gleichung 3-2: Schmelztemperatur von DNA-Oligomeren (vereinfacht nach Newton und Graham 1997)
Legende: n ist die Zahl der Nukleotide und (%G+C) der Anteil der DNA-Basen Guanin und Cytosin

Angrenzend an jedes Exon wurden innerhalb der Introne Paare interner Primer konzipiert, die Tabelle 4-1 im Ergebnisteil zeigt. Auf ihre Eignung geprüft wurden Sequenzen von 18 - 22 bp mit einem G+C-Gehalt von 40 - 55 % und G oder C als 3‘-terminalem Nukleotid. T_m wurde zwischen 50 - 65 °C gewählt mit weniger als 2 °C Differenz zwischen T_m(forward-Primer) und T_m(reverse-Primer). In den nichttranslatierten Bereichen ober- und unterhalb der kodierenden Gensequenz wurden beide SP-A-Gene diskriminierend e Primer identifiziert, die sich am 3‘-Ende wie in Tabelle 3-12 zu sehen in mindestens zwei Nukleotiden unterscheiden und so zwischen SP-A1- und SP-A2-Sequenzen diskriminieren.

32

Tabelle 3-12: Getestete diskriminierende Primer
Miteinander amplifizierende Primer sind unterstrichen, Einzelheiten siehe in Abschnitt 4.1.2 .

Bezeichnung	Nukleotide	Position	DNA-Basensequenz (vom 5‘- zum 3‘-Ende)	T m [°C]
SPA-1-FW-01	911-932	vor Exon D	GTCGCCCGCCCTGCCTCGTCGG	73,5
SPA-1-FW-02	916-932	vor Exon D	CCGCCCTGCCTCGTCGG	62,0
SPA-1-FW-04	913-929	vor Exon D	GTCGCCCGCCCTGCCTCGT	66,0
SPA-1-FW-05	131-151	vor Exon A	AAATGCTGCGTCTACCTTACC	50,6
SPA-1-FW-07	917-933	vor Exon D	CGCCCTGCCTCGTCGGG	62,0
SPA-1-FW-08	555-579	Exon B	CTGAAAAGAAAGTAACACAGCAGGG	60,3
SPA-1-FW-09	603-628	nach Exon B	GTGAGTGAGTGACCTGACTAATAGCC	63,8
SPA-1-FW-10	442-466	vor Exon B	AGAGAACAGACCCCAAAAAGAAAGG	60,3
SPA-1-FW-11	553-577	Exon B	GCCTGAAAAGAAAGTAACACAGCAG	55,6
SPA-1-FW-12	550-574	Exon B	GGAGCCTGAAAAGAAAGTAACACAG	54,7
SPA-1-FW-13	548-572	Exon B	TTGGAGCCTGAAAAGAAAGTAACAC	55,1
SPA-1-RE-01	3381-3361	UT von Exon 4	GAGGCCGACAAGGAGAGCGTC	59,8
SPA-1-RE-05	3406-3387	UT von Exon 4	ACAGACCAAGTGGAGCCTCA	51,8
SPA-1-RE-06	3394-3376	UT von Exon 4	GAGCCTCAGGATGGAGGCC	55,8
SPA-1-RE-07	3470-3452	UT von Exon 4	TAAGGGTGCCTCCAGTCCC	53,7
SPA-1-RE-08	3416-3392	UT von Exon 4	CTAGCATCTCACAGACCAAGTGGAG	56,1
SPA-2-FW-01	940-960	vor Exon D	CTCGCCCGCCCTGCCTCTCGC	70,4
SPA-2-FW-02	944-960	vor Exon D	CCCGCCCTGCCTCTCGC	61,2
SPA-2-FW-03	578-599	Exon B	CCTGAAAAGAAGGTAACTGGGC	53,8
SPA-2-FW-04	577-597	Exon B	GCCTGAAAAGAAGGTAACTGG	50,1
SPA-2-RE-01	3395-3373	UT von Exon 4	GAAACTGAAGGCCAGACAGGATC	55,8
SPA-2-RE-02	3403-3385	UT von Exon 4	TGGGGATGGAAACTGAAGG	52,0
SPA-2-RE-03	3403-3386	UT von Exon 4	TGGGGATGGAAACTGAAG	47,6

3.5.3 Optimierung der Reaktionsbedingungen

Primer wurden in Konzentrationen von 0,1 µmol/l, Nukleotide in einer Konzentration von 200 µmol/l eingesetzt. Magnesiumionenkonzentration [Mg⁺⁺] und Hybridisierungstemperatur (T_a) wurden in parallelen Reaktionen aufeinander abgestimmt. Bei der touchdown-Technik wurde T_a zur Erhöhung der Spezifität im ersten Zyklus etwa 5 - 15 °C über der Idealtemperatur gewählt und in den folgenden 10 - 20 Zyklen um jeweils ½ - 1 °C herabgesetzt ( Don et al. 1991). Zur Durchführung eines hot starts ( d‘Áquila et al. 1991) wurde eine DNA-Polymerase eingesetzt, die erst nach dem Denaturierungsschritt aktiv wird und so die DNA-Synthese an den vor dem Reaktionsstart entstandenen, unspezifischen Primerbindungen verhindert. Additiva wurden dem Reaktionspuffer in Einzelversuchen zugesetzt. Fehlerkorrigierende ( proof reading )

33

Tabelle 3-13: Universalprimer zur Amplifikation klonierter DNA
1): Position in pCR2.1 ( Mead et al. 1991); 2): Position in pUC19 ( Yanisch-Perron et al. 1985)

Bezeichnung	pCR2.11)	pUC192)	Nukleotidsequenz	T m [°C]
M13(-29)	205-221	481-464	CAGGAAACAGCTATGACC	41,9
M13(-43)	453-431	356-378	AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTT	59,7

Zur Amplifikation oder Sequenzierung klonierter DNA aus den isolierten Plasmiden können die in beiden Vektoren integrierten Universalprimersequenzen M13 dienen. Tabelle 3-13 zeigt die nach der Entfernung von der multiplen Klonierungsstelle (multiple cloning site) als M13(-29) und M13(-43) bezeichneten Sequenzen. Die entsprechende PCR erforderte 25 Zyklen mit einer Magnesiumionenkonzentration [Mg⁺⁺] = 1,5 mmol/l und Hybridisierung bei T_a = 48 °C.

3.6 DNA-Sequenzierung

Die DNA wurde nach der Kettenterminationsmethode (chain termination method, Sanger et al. 1977) sequenziert. Jede Probe wurde in vier separaten zyklischen Sequenzierreaktionen ( cycle sequencing reactions , Murray 1989), bei denen im Gegensatz zur PCR nur ein Primer eingesetzt wird, amplifiziert. Da jeweils eine der vier Desoxynukleotidfraktionen teilweise durch Didesoxynukleotide ersetzt wird, bricht die Synthese der DNA-Sequenzen früher oder später bei der entsprechenden Base ab. Die DNA-Einzelstränge wurden während der elektrophoretischen Auftrennung in einem denaturierenden Gel direkt auf eine Membran übertragen ( direct blotting , Beck et al. 1984) und anschließend durch eine enzymatische Farbreaktion sichtbar gemacht.

3.6.1 cycle sequencing reactions

Für dGTP wurde das analoge dITP eingesetzt, wie Tabelle 3-14 zeigt. Aus je 1,3 µl (10×)-Reaktionspuffer und dITP-Mix wurden mit jeder DNA-Probe 13 µl Reaktionsgemisch mit einer Primerkonzentration von 1,5 pmol/µl und 6 Units Enzym vorbereitet. 3,1 µl Reaktionsgemisch wurden zu 1 µl eines ddNTP-Mix gegeben und mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet, bevor die in Protokoll 3-1 gezeigte cycle sequencing reaction gestartet wurde. Die amplifizierten Sequenzen wurden mit 2,7 µl Stoppmix 5 Minuten auf 95 °C erhitzt, auf Eis

34

Tabelle 3-14: Lösungen für die cycle sequencing reaction
BioCycle Sequencing Kit von GATC in Konstanz (BRD) außer 1): Amersham in Cleveland, Ohio (USA).
ddNTP steht für jeweils eins der vier Didesoxynukleotide, die durch eine Biotinylierung markiert sind.

Lösung	Konzentration	der Bestandteile
(10×)-Reaktionspuffer	274 mmol/l 68,6 mmol/l 200 mmol/l 27,4 mmol/l	TrisHCl (pH 7,5) Trinatriumcitrat NaCl MnCl2
dITP-Mix	(unbekannt)	dATP, dCTP, dITP, dTTP
Enzym1)	32 Units/µl	Thermo Sequenase®-DNA-Polymerase
ddNTP-Mix	1,25 µmol/l 50 mmol/l je 125 µmol/l	ddNTP NaCl dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Stopp-Mix	99% 0,1% 5 mmol/l	Formamid Bromphenolblau Na2EDTA

Protokoll 3-1: cycle sequencing reaction

Reaktionsschritt	Temperatur	Dauer
initiale Denaturierung	95 °C	180 Sekunden
Denaturierung	95 °C	30 Sekunden
Hybridisierung	48 °C	25 Sekunden	60 Zyklen
Extension	60 °C	30 Sekunden
finale Extension	72 °C	180 Sekunden

3.6.2 direct blotting

Zwischen speziell geschliffenen Glasplatten, die zuvor mit 150 µl bindendem Silan beschichtet worden waren, wurde ein denaturierendes 4 %iges Polyacrylamidgel von 22 × 32 × 0,019 cm mit 50 % Harnstoffanteil gegossen. 21,65 ml Harnstoffreagenz aus Tabelle 3-15 und 3,35 ml Acrylamidlösung wurden gemischt und mit 110 µl APS und 25 µl TEMED polymerisiert. Parafilm ^® verhinderte das Austrocknen der Gelkante. Nach drei Gelen wurden die Platten 1 h in 0,5-molarer NaOH-Lösung gereinigt. Von jeder Sequenzreaktion wurden 3 - 4 µl aufgetragen und nach einer langsamen Einlaufphase von 5 Minuten bei 500 V mit einer konstanten Leistung von 30 W bei einer angelegten Spannung von 1.400 - 1.800 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die Membran wurde tangenzial an der Gelkante durch einen Schrittmotor vorangetrieben und nach der Elektrophorese mit Heißluft getrocknet. Vor der weiteren Entwicklung wurde die DNA

35

Tabelle 3-15: Lösungen für das denaturierende Harnstoffgel
1): BioCycle Sequencing Kit von GATC in Konstanz (BRD)

Lösung	Konzentration	der Bestandteile
(10×)-TBE-Puffer (pH 8,0 bei 25 °C)	154,5 g 26,2 g 9,0 g 810,0 g	Tris-Base Borsäure Na2EDTA H2O
Harnstoffreagenz	56,9 g 11,4 ml ad 100 ml	Harnstoff (10×)-TBE-Puffer H2O
Acrylamidlösung	30 %	Acrylamid-(30:0,8)-Bisacrylamidlösung1)
bindendes Silan	50 µl 30 µl 9,92 ml	3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan Essigsäure (99,9 %) Ethanol (95 %)

3.6.3 Farbreaktion

Tabelle 3-16: Lösungen zum Nachweis der biotinylierten DNA auf der Membran
1): GATC GmbH in Konstanz; 2): Boehringer in Mannheim; 3): Bio-Rad Laboratories GmbH in München

Lösung	Konzentration	der Bestandteile
Maleinsäurepuffer (pH 7,5 bei 20 °C)	12,61 g/l 8,77 g/l 8 g/l	Maleinsäure NaCl NaOH
Reaktionspuffer (pH 9,5 bei 20 °C)	5,84 g/l 0,83 g/l 11,58 g/l	NaCl TrisHCl Tris-Base
(10×)-blocking reagent	10 g 90 ml	blocking powder2) Maleinsäurepuffer
SA-AP-Lösung	1:7.500	Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat1)
NBT-Lösung	300 mg 7 ml 3 ml	Nitrotetrazoliumblauchlorid3) N, N-Dimethylformamid H2O
BCIP-Lösung	150 mg 10 ml	5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-toluidinsalz3) N, N-Dimethylformamid

Der pH-Wert des in Tabelle 3-16 gezeigten Maleinsäurepuffers wurde mit NaOH-Lösung exakt titriert. Das mit Maleinsäurepuffer verdünnte (10×)-blocking reagent blockiert unspezifische Bindungsstellen. In der Hybridisiertrommel wurde die Membran mit 150 ml Maleinsäurepuffer 5 Minuten equilibriert. Nach 45 Minuten Inkubation mit 80 ml blocking reagent wurde mit 4 µl SA-AP-Lösung in 20 ml blocking reagent 45 Minuten inkubiert. Nach 3 Waschungen für

36

3.7 DNA-Restriktion

Mit der GCG -Software wurde in den SP-A-Genen nach den Erkennungssequenzen von 217 verschiedenen Restriktionsendonukleasen gesucht. Zum Nachweis eines beschriebenen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) wurde die DNA mit 5 Units Enzym für 2 Stunden inkubiert. Im Falle einer kombinierten Restriktion mit zwei Enzymen, die sich im in Tabelle 3-17 angegebenen Temperaturoptimum unterscheiden, wurde zunächst mit dem Enzym bei der niedrigen Temperatur inkubiert. Nach Deaktivierung des ersten Enzyms bei 80 °C für 15 Minuten wurde mit dem anderen Enzym bei höherer Temperatur inkubiert. PCR-Amplifikate ohne Nebenprodukte wurden zum Teil unter Verzicht auf die Aufreinigung durch Hinzufügen entsprechender Volumina an Magnesiumlösung, Puffer und H₂O auf die nötigen Pufferbedingungen gebracht und mit 5 Units Enzym inkubiert. Plasmid-DNA wurde vor der gelelektrophoretischen Auftrennung mit RNase inkubiert.

Tabelle 3-17: Restriktionsendonukleasen
Gezeigt werden die Schnittstelle innerhalb der palindromischen Erkennungssequenz, die gelieferte Konzentration, die optimale Temperatur und der verwendete, vom Hersteller mitgelieferte Restriktionspuffer.

Enzym	Palindrom	Konzentration	Optimum	Puffer
ApaI	GGGCCC	10 Units/µl	25°C	NEB 4
BamHI	GGATCC	20 Units/µl	37°C	NEB for Bam
EcoRI	GAATTC	20 Units/µl	37°C	NEB for Eco
HindIII	AAGCTT	20 Units/µl	37°C	NEB 2
NcoI	CCATGG	10 Units/µl	37°C	NEB 4
NdeI	CATATG	20 Units/µl	37°C	NEB 4
PstI	CTGCAG	20 Units/µl	37°C	NEB 3
RsaI	GTAC	10 Units/µl	37°C	NEB 1
SmaI	CCCGGG	10 Units/µl	25°C	NEB 4
StuI	AGGCCT	10 Units/µl	37°C	NEB 2

37

3.8 DNA-Klonierung

Zur Insertion amplifizierter DNA in einen Vektor wurde dieser mit dem entsprechenden PCR-Produkt ligiert. In der internen PCR amplifizierte Sequenzen einzelner Exone, die Muster bestimmter allelischer Varianten repräsentieren, wurden im pCR2.1-Vektor ( Mead et al. 1991) kloniert. Der Vektor liegt als lineare DNA mit beiderseits überhängendem 5‘-Thymidin vor. Das PCR-Produkt, an das die Taq-DNA-Polymerase beiderseits ein überhängendes 3‘-Adenosin synthetisiert, schließt die DNA zu einem ringförmigen Plasmid. Amplifizierte Sequenzen aus der externen PCR, die auffällige Haplotypen der gesamten kodierenden Sequenz eines SP-A-Gens enthalten, wurden im Vektor pUC19 ( Yanisch-Perron et al. 1985), der bereits als ringförmiges Plasmid vorliegt, kloniert. Mit Hilfe von Endonukleasen wurde der Vektor geöffnet und an den Enden der amplifizierten Gensequenz komplementäre Schnittstellen geschaffen, die die Ligation von Vektor und Plasmid ermöglichen.

Zur Transformation mit Plasmid-DNA wurden Escherichia coli des Stammes NM 522 (Serogruppe K12) verwendet. Sie waren durch Vorbehandlung auf Eis mit MgCl₂ und CaCl₂ in “kompetente Zellen“ ( Himeno et al. 1984) verwandelt worden, die in der Lage sind, Plasmid-DNA aus ihrer Umgebung aufzunehmen. Das Einbringen fremder DNA in einen Mikroorganismus und die Anzucht und Selektion dieser gentechnisch veränderten Organismen (GVOs) stellen einen genehmigungspflichtigen Eingriff im Sinne des Gentechnikgesetzes (GenG) dar. Die Arbeiten wurden in einem Genlabor der Sicherheitsstufe 1 durchgeführt und bei der zuständigen Behörde angemeldet. Die transformierten Klone wurden gegen Ampicillin, im Falle der Transformation mit pCR2.1 zusätzlich gegen Kanamycin, selektiert. Klone mit eingefügtem PCR-Produkt wurden anhand fehlender Laktaseaktivität identifiziert.

3.8.1 Insertion amplifizierter DNA in einen Vektor

5 µl PCR-Produkt wurden mit je 1 µl T4-DNA-Ligase, (10×)-Ligationspuffer und gelöstem Vektor pCR2.1 aus Tabelle 3-18 und 2 µl H₂O bei 14 °C etwa 18 Stunden inkubiert. Zur Ligation mit pUC19 wurden PCR-Produkt und Vektor mittels DNA-Restriktion präpariert und das PCR-Produkt mittels Gelexzision isoliert. Das Plasmid wurde in 1/10 Volumen 3-molarer Natriumacetatlösung (pH 4,8) und 2 Volumina 96 %igem Ethanol gefällt (30 Minuten bei - 20 °C), zentrifugiert (5 Minuten mit 13.000 Upm) und als getrocknetes Pellet in H₂O gelöst. Etwa 20 ng Vektor und PCR-Produkt wurden gemischt und mit 1 µl T4-DNA-Ligase und 2 µl (10×)-Ligationspuffer in 20 µl Volumen 18 Stunden bei 14 °C inkubiert. Die DNA-

38

Tabelle 3-18: Reagenzien zur Insertion von DNA in einen Vektor
Hersteller: New England Biolabs in Beverly (USA) außer 1): Invitrogen Corporation in Carlsbad, California

Reagenz	Konzentration	der Bestandteile
Ligase	4 Units/µl	T4-DNA-Ligase
(10×)-Ligationspuffer	500 mmol/l 100 mmol/l 100 mmol/l 10 mmol/l 500 µg/ml	TrisHCl (pH 7,8 bei 25°C) MgCl2 DTT ATP BSA
pCR2.1 1) ( Mead et al. 1991)	25 ng/µl	lineare Doppelstrang-DNA
pUC19 ( Yanisch-Perron et al. 1985)	40 ng/µl	Plasmid-DNA

3.8.2 Transformation mit Plasmid-DNA

Die kompetenten Zellen wurden in einer Suspension mit Glyzerin ( Tabelle 3-19 ) bei - 70 °C in Portionen von 100 µl gelagert. Sie wurden ½ Stunde auf Eis mit den ligierten Plasmiden sanft suspendiert. Zur Aufnahme der angelagerten Plasmide wurden die Zellen 2 Minuten bei 42 °C inkubiert und einige Minuten auf Eis gestellt. Zur Expression der Antibiotikaresistenzgene wurden sie in 1,5 ml LB-Medium 1 ½ Stunden bei 37 °C inkubiert.

Tabelle 3-19: Reagenzien zur Transformation kompetenter Zellen (GibcoBRL Life Technologies, Paisley, UK)

Reagenz	Konzentration	der Bestandteile
Kompetente Zellen (E. coli K12 strain NM 522)	88 µl 12 µl	Zellen in 100 mmol/l CaCl2; 10 mmol/l Tris-Base Glyzerin
LB-Medium (Lennox L Broth Base; pH 7,0)	10,0 g/l 5,0 g/l 5,5 g/l	SELECT Pepton 140 Hefe Extrakt NaCl

3.8.3 Anzucht und Selektion

Bei Zugabe des als Induktor wirksamen IPTG wird ein unvollständiges -Galactosidase-Protein exprimiert, das mit dem vom Vektor kodierten Teil der -Galactosidase ein aktives Enzym bildet (-Komplementation auf Proteinebene). Die Hydrolyse von X-Gal setzt ein blaugrünes Indoxylderivat frei. Die mit der in der PCR amplifizierten DNA transformierten Klone bleiben

39

Tabelle 3-20: Reagenzien zur Anzucht und Selektion der Klone (GibcoBRL Life Technologies, Paisley, Scotland)

Reagenz	Konzentration	der Bestandteile
LB-Agar	10 g/l 5 g/l 5 g/l 12 g/l	SELECT Pepton 140 Hefe Extrakt NaCl Agar
Ampicillin	100 mg/ml	Binotal®
Kanamycin	125 mg/ml	Kanamycinsulfat
IPTG-Lösung	500 mmol/l	Isopropyl--D-thiogalactopyranosid
X-Gal-Lösung	40 mg/ml	5-Brom-4-chlor-3-indolyl--D-galactosid in N, N-Dimethylformamid

250 ml LB-Agar wurden autoklaviert und nach Zugabe von je 100 µl der in Tabelle 3-20 gezeigten Antibiotika und je 250 µl IPTG und X-Gal auf zehn Petrischalen verteilt. Auf den abgekühlten Agarplatten wurden jeweils 100 µl der transformierten Zellkulturen mit einem Drigalskispatel verstrichen. Nach Inkubation bei 37 °C über Nacht wurden weiße Kolonien auf eine Agarplatte überimpft und in je 1,5 ml LB-Medium mit Antibiotikazusatz kultiviert. Nach Inkubation bei 37 °C über Nacht wurden die Agarplatten mit den selektierten Kolonien bei 4°C zur erneuten Anzucht aufbewahrt und die Kulturen zur Isolation der Plasmid-DNA verwendet.

3.9 Statistische Auswertung der DNA-Sequenzen

Die DNA-Sequenzen wurden mit Hilfe der WISCONSIN PACKAGE^®-Software (GCG Version 9.0) der Genetics Computer Group in Madison, Wisconsin (USA) bearbeitet. Die Numerierung der Nukleotide richtete sich nach den in der “GenBank“ des National Center for Biotechnology Information, Rockville Pike, Bethesda (USA) veröffentlichten, genomischen Sequenzen der SP-A-Gene. M30838 ( White et al. 1985) ist die später (wie in Abschnitt 5.1.4 erläutert) korrigierte Sequenz des Wildtypallels 6a2 (SP-A1) und M68519 ( Katyal und Singh 1992) die Sequenz des Wildtypallels 1a0 (SP-A2). Alle Polymorphismen wurde entsprechend den jüngsten Empfehlungen der Nomenclature Working Group ( den Dunnen und Antonarakis 2000) beschrieben. Dabei werden die Aminosäuren beginnend vom Methionin, das vom Startcodon kodiert wird, numeriert. Dies entspricht den Veröffentlichungen der Arbeitsgruppe um J. Floros, bei denen die Signalsequenz die Aminosäuren 1 - 20 umfasst und die Glutaminsäure am aminoterminalen Ende des prozessierten Peptids als Aminosäure 21 (21Glu) bezeichnet wird.

40

Die bei den statistischen Berechnungen verwendeten utility programs for analysis of genetic linkage^® ( Ott 1992) sind jeweils in Klammern angegeben. Zu den Häufigkeiten p und q einer Wildtypsequenz und ihrer allelischen Variante und der Proportion Heterozygoter h wurden die 95 %-Clopper-Pearson-Konfidenzgrenzen aus den Quantilen der F-Verteilung bestimmt (BINOM Version 1.76). Der Heterozygotiegrad, also die nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz erwartete Proportion Heterozygoter, wurde als unbiased estimation (Het) zusammen mit dem Gehalt an Polymorphismusinformation (PIC) nach Gleichung 3-3 aus den Zahlen der beobachteten Allele bestimmt (HET Version 1.80).

Gleichung 3-3: Formeln zur Berechnung von Heterozygotiegrad und PIC ( Ott 1992)
a: Zahl der verschiedenen Allele, n: Gesamtzahl beobachteter Allele, q_i: Häufigkeit des i-ten Allels

Die Konkordanz der Verteilung der beobachteten Genotypen mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz wurde mit Hilfe des Chi-Quadrat-Tests als Wahrscheinlichkeit P(₁²>²) errechnet, mit der die Prüfgröße überschritten wird. Fällt die Irrtumswahrscheinlichkeit unter ein Signifikanzniveau (gewöhnlich < 0,05), befinden sich die Genotypen nicht im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE Version 1.05). Die Häufigkeit der Haplotypen wurde nach der maximum likelihood-Methode mit 50 Iterationen aus der Zahl der beobachteten Genotypen unter Annahme der Kopplung beider SP-A-Gene geschätzt (ASSOCIATE Version 2.35).

In Subpopulationen voneinander abweichende Frequenzen wurden in einer 2×2-Kontingenztafel mit einem Freiheitsgrad im Chi-Quadrat-Test auf Signifikanz getestet (CONTING Version 2.71). Die Wahrscheinlichkeit P(₁²>²) entspricht der Irrtumswahrscheinlichkeit . Der einseitige, exakte Test nach Fisher (2BY2 Version 1.50) wurde angewandt, wenn eine der Feldhäufigkeiten Null, zwei kleiner als fünf oder n < 25 war. Der erforderliche Stichprobenumfang n‘ zum Test einer beobachteten gegen eine vorgegebene Proportion und die Umfänge n₁ & n₂ zum Vergleich zweier gleich großer Populationen wurden im Vorzeichentest von Lorenz ( Bock 1998) für eine power von 1 - 80 % mit Irrtumswahrscheinlichkeit < 5% errechnet (SAMPSI Version 6.0 der Stata Corporation, Texas, USA).

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.