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Kapitel 4. Ergebnisse

Es wurde eine nested PCR zur Isolation und Amplifikation der SP-A-Gensequenzen etabliert. Bei der Analyse der SP-A-Gensequenzen von vierzehn Patienten mit Verdacht auf Defekt eines Surfaktantproteins wurden zwei “stille“ Einzelbasensubstitutionen im SP-A1-Gen entdeckt, die neue Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen ( RFLP ) definieren. Ein bisher nur aus dem SP-A1-Gen bekannter Polymorphismus mit Aminosäureaustausch wurde erstmals im SP-A2-Gen belegt. Bei Berücksichtigung der Kopplung aller Polymorphismen war die Definition fünf neuer Allele möglich. Zur Suche (screening) nach weiteren Allelen wurden die beobachteten Varianten als Muster-DNA kloniert und zusammen mit DNA-Proben einer PCR-SSCP-Analyse zur Detektion des Einzelstrangkonformationspolymorphismus ( single strand conformation polymorphism) unterworfen. Eine Häufung bestimmter Varianten konnte bei der im Verhältnis zur genetischen Variabilität geringen Zahl von DNA-Proben nicht belegt werden.

4.1 Isolation und Amplifikation der SP-A-Gensequenzen

Interne Primer und Reaktionsbedingungen zur Amplifikation der einzelnen Exone, welche DNA-Abschnitte geeigneter Länge zur Sequenzierung oder SSCP-Analyse liefern, wurden experimentell ermittelt. Externe Primer und Reaktionsbedingungen zur Isolierung beider SP-A-Gene wurden ebenfalls experimentell optimiert und auf ihre Spezifität geprüft.

4.1.1 Interne Primer und Reaktionsbedingungen

Protokoll 4-1: Thermocycling der internen PCR

Reaktionsschritt	Temperatur	Dauer
initiale Denaturierung	95 °C	180 Sekunden
Denaturierung	94 °C	30 Sekunden
Hybridisierung	Ta	25 Sekunden	25 Zyklen
Extension	72 °C	30 Sekunden
finale Extension	72 °C	180 Sekunden

Die Primer zur PCR- SSCP -Analyse wurden möglichst nah an die Spleißregion (splicing consensus site) positioniert, um variable Intronsequenzen nicht mit zu amplifizieren. Die Primer zur DNA- Seq uenzierung mussten 60 bp vor dem Exon beginnen, da der erste DNA-Abschnitt,

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Tabelle 4-1: Primer und Amplifikationsbedingungen für die internen Polymerasekettenreaktionen
Legende: EX- bezeichnet das amplifizierte Exon, -SSCP die Primerpaare für die PCR-SSCP-Analyse, -Sequenz die Primerpaare für die Gewinnung von Amplifikaten zur DNA-Sequenzierung.

Bezeichnung	Position SP-A1	im Gen SP-A2	DNA-Basensequenz (vom 5‘-Ende zum 3‘ Ende)	T m [°C]	T a [°C]	( Mg ++) [mmol/l]
SPA-EX1-FW2	994-1016	1021-1043	AGATGGGCTCACGGCCATCCCTC	65,9	EX1	-SSCP
SPA-EX1-RE2	1241-1218	1268-1245	AGGGTGGGGTCTGCAGCACAGTAC	62,2	64	1,2
SPA-EX1-FW3	945-964	971-990	TTCCTGAGTCCTGACAGAGC	48,9	EX1	-Sequenz
SPA-EX1-RE3	1279-1261	1307-1289	AGATGGGCCTCCTGAAAAG	50,7	61	1,7
SPA-EX2-FW2	1508-1528	1528-1548	ATCCATGTCTCTTTTCTCTGC	55,9	EX2	-SSCP
SPA-EX2-RE	1693-1674	1712-1693	CTGTGCCCATGTTTCCACTG	53,6	61	1,5
SPA-EX2-FW	1451-1470	1471-1490	GATAATGGGCATCGAGTCTC	48,5	EX2	-Sequenz
SPA-EX2-RE2	1775-1757	1793-1775	CTTAGGTTGAGCCAAATGC	47,5	61	2,0
SPA-EX3-FW	2313-2331	2333-2351	TTCCAGGATTGCAGATGGC	53,2	EX3
SPA-EX3-RE	2533-2514	2555-2536	GAGGGGAATTTGTGGGAAAC	52,3	62	2,3
SPA-EX4-FW	2915-2934	2927-2946	ACAAAGTGGTCAGTGGCCTG	52,3	EX4	-SSCP
SPA-EX4-RE2	3354-3334	3366-3346	GTCCCATGGCCTAAATGCCTC	61,8	61	1,7
SPA-EX4-FW3	2874-2891	2886-2903	ATCTGGTAGCAGAGACCC	42,9	EX4	-Sequenz
SPA-EX4 RE	3413-3395	3427-3409	GCATCTCACAGACCAAGTG	45,2	61	2,2

4.1.2 Externe Primer und Reaktionsbedingungen

Die diskriminierend en Primer wurden in die genetisch stabilere 3‘-UT-Region von Exon 4 und die unmittelbare Umgebung der Exone A - D plaziert. Mogliche forward-Primer wurden unmittelbar vor Exon A, in und um Exon B sowie 100 bp vor Exon D identifiziert, reverse-Primer 150 bp nach dem Stoppcodon ( Tabelle 3-12 ). Kombinationen der Primer SPA-1-FW-01 mit SPA-1-RE-01, SPA-2-FW-01 mit SPA-2-RE-01, SPA-2-FW-02 mit SPA-2-RE-02, SPA-1-FW-05 mit SPA-1-RE-05, SPA-1-FW-04 mit SPA-1-RE-01, -05, -06 oder -07 und SPA-1-FW-11, - 12 oder -13 mit SPA-1-RE-8 amplifizierten DNA bei ( Mg ⁺⁺) = 2 - 2,5 mmol/l.

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Abbildung 4-1: Optimierung der externen PCR durch Modifikation des Reaktionspuffers
DNA-Qualität: frisch isoliert in Spur 1 und 2; gefrorene Proben in Spur 3 - 14.
Primer: SPA-1-FW-01/RE-01 in Spur 1, 3, 5 und 7-10; SPA-2-FW-01/RE-01 in Spur 2, 4, 6 und 11 - 14.
Magnesium[Mg⁺⁺]: 1 mmol/l in Spur 10 + 14; 1,5 mmol/l in 9 + 13; 2 mmol/l in 8 + 12; 2,5 mmol/l in 7 + 11.
Ammoniumsulfat: [(NH₄)₂SO₄] = 5 mmol/l in Spur 5 und 6, [(NH₄)₂SO₄] = 10 mmol/l in Spur 3 und 4.

Abbildung 4-2: Amplifikation der SP-A-Gene durch Polymerasen mit und ohne fehlerkorrigierende Aktivität
Primer: SPA-1-FW-01/RE-01 in Spur 1-4 und 9-12; SPA-2-FW-01/RE-01 in Spur 5-8 und 13-14.
Magnesium [Mg⁺⁺]: 2 mmol/l in 1+5+9+13; 3 mmol/l in 2+6+10+14; 4 mmol/l in 3+7+11; 5 mmol/l in 4+8+12.

Denaturierende Additiva sollten durch unspezifische Anlagerung (misannealing) der Primer

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Tabelle 4-2: Externe Primer zur Amplifikation der SP-A-Gene (diskriminierende Nukleotide sind unterstrichen)
*: Beim nichtdiskriminierenden Primerpaar ist nur die Position im SP-A1-Gen angegeben, R steht für A und G.

Bezeichnung	Nukleotide	Nukleotidsequenz (vom 5‘-Ende zum 3‘ Ende)	T m [°C]
SPA-1-FW-EXT	534-572	AGGTCGCTGATTTCTTGGAGCCTGAAAAGAAAGTAACAC	71,1
SPA-1-RE-EXT	3637-3606	AAGGAACTGGACCAGATGGGGAATAAGGAGGG	69,7
SPA-2-FW-EXT	560-597	GTCGCTGATTTCTTGGAGCCTGAAAAGAAGGTAACTGG	72,1
SPA-2-RE-EXT	3649-3618	5‘-AAGGAACTGGACCAGATGGGGAATAAGGAAGC	68,5
SPA-FW-EXT	532-570*	TCAGGTCGCTGATTTCTTGGAGCCTGAAAAGAARGTAAC	76,5
SPA-RE-EXT	3658-3625*	CACTGCTGCCATCTGTAAGTGAACGAACTGGACC	71,1

Durch die 5‘-terminale Verlängerung von SPA-1-FW-13 und SPA-2-FW-4 wurden die in Tabelle 4-2 charakterisierten externen, diskriminierend en Primer für SP-A1 und SP-A2 sowie korrespondierende reverse-Primer ermittelt. Bei [Mg⁺⁺] = 2,2 mmol/l und T_a = 70 °C herrschten optimale Reaktionsbedingungen. Das unspezifische Primerpaar diente Testzwecken. Nach Einbau eines hot start s durch die in Protokoll 4-2 gezeigte initiale Aktivierung der DNA-Polymerase bei 95 °C wurde in 50 Zyklen genug PCR-Produkt zur DNA-Sequenzierung gebildet. Durch RFLP-Analysen mit ApaI und PstI wurde die Identität der amplifizierten Gene anhand der in Abbildung 4-3 gezeigten invarianten Polymorphismen überprüft. Die DNA-Sequenzen in Abbildung 4-4 demonstrieren die klare Isolierung beider Gene in der nested PCR.

Protokoll 4-2: Thermocycling der externen PCR

Reaktionsschritt	Temperatur	Dauer
initial	95 °C	540 Sekunden	(Enzymaktivierung)
Denaturierung	94 °C	30 Sekunden
Hybridisierung	70 °C	25 Sekunden	50 Zyklen
Extension	74 °C	150 Sekunden
final	74 °C	450 Sekunden	(Elongation)

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Abbildung 4-3: Identifizierung der amplifizierten SP-A-Gene durch RFLP -Analyse
Die Größe der Restriktionsfragmente ist in der jeweiligen Spalte unterhalb des Gens angegeben. Das PstI-Fragment von 942 bp wird in einigen Allelen in Fragmente von 729 und 213 bp geschnitten. In Spur SP-A wurde das Produkt aus der PCR mit den nichtdiskriminierenden Primern SPA-FW-EXT und SPA-RE-EXT aufgetragen.

Abbildung 4-4: DNA-Sequenzierung von Exon 2 (Nukleotide 1596_1615 von SP-A1 bzw. 1616_1635 von SP-A2)
Links: SP-A-Exon 2 aus genomischer DNA mit Polymorphismus 1599A>G (Codon 61) und 1611T>C (Codon 65). Rechts: beide Gensequenzen isoliert aus Produkten der externen PCR amplifiziert und getrennt sequenziert.

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4.2 Analyse der SP-A-Gensequenzen

Die zum (bisher nur im SP-A1-Gen beobachteten) Aminosäureaustausch Val50Leu führende Einzelbasensubstitution 1220G>C wurde erstmals im SP-A2-Gen detektiert. Die neuen Polymorphismen 1162C>T und 3138T>C wurden bei mehreren Patienten im SP-A1-Gen nachgewiesen. Aus den DNA-Sequenzen aller Exone wurden die SP-A1- und SP-A2-Genotypen von 14 Patienten , bei denen nach differentialdiagnostischen Erwägungen der Verdacht auf einen Surfaktantproteindefekt bestand, abgeleitet. Die Häufigkeiten einzelner Polymorphismen wurden aus der Zahl der jeweils beobachteten DNA-Sequenzen berechnet.

4.2.1 Die neuen Polymorphismen 1162C>T und 3138T>C

Bei Patient 7 und Patient 10 wurde der Polymorphismus 1220G>C im SP-A2-Gen detektiert. Die Einzelbasensubstitution führt zum Aminosäureaustausch Val50Leu, der im SP-A1-Gen die häufigste Variante darstellt. Tabelle 4-3 zeigt die Häufigkeit der Variante 50Leu bei den 14 Patienten, deren SP-A2-Gen sequenziert wurde. Bei der in Tabelle 4-4 gezeigten Verteilung der Genotypen ist mit = 0,77 kein Verstoß gegen das Hardy-Weinberg-Gesetz nachweisbar.

Tabelle 4-3: Allelfrequenzen am Genort SP-A2-Codon 50
(In Klammern sind jeweils die 95 %-Clopper-Pearson-Konfidenzgrenzen angegeben)

Allel	Allelfrequenz	n = 28 Allele
1220G (50Val):	p = 92,9 (76,5-99,1) %	26 Allele
1220C (50Leu):	q = 7,1 (0,9-23,5) %	2 Allele

Tabelle 4-4: Genotypfrequenzen am Genort SP-A2-Codon 50
Die Konkordanz P(₁²>²) mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz beträgt im Chi-Quadrat-Test : P(₁²>²) = 77%.

Genotyp	Frequenz (N = 13 Patienten)
[1220G]+[1220G] (50Val/50Val):	84,6 % (P = 11 Patienten)
[1220C]+[1220G] (50Leu/50Val):	15,4 % (H = 2 Patienten)
[1220C]+[1220C] (50Leu/50Leu):	0,0 % (Q = 0 Patienten)

Bei Patient 8, Patient 12 und einem Mitarbeiter wurde in einem Allel des SP-A1-Gens der Polymorphismus 1162C>T in Codon 39, welches weiterhin Histidin kodiert, entdeckt. Die Substitution schafft eine Restriktionsschnittstelle für NcoI. Die RFLP -Analyse aller 31 Patienten

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Abbildung 4-5: RFLP-Analyse mit NcoI am Genort SP-A1-Codon 39
Heterozygote Träger der Variante 1162C>T sind kursiv gesetzt.

Abbildung 4-6: Familienanalyse am Genort SP-A1-Codon 39 (Amplifikate von SP-A-Exon 1 geschnitten mit NcoI)
ungerade Nummern: aus dem SP-A1-Gen; gerade Nummern aus dem SP-A2-Gen amplifiziert
Spuren 1 & 2: Vater, 3 & 4: Mutter, 5 & 6: Mitarbeiter mit Variante, 7 & 8: Mitarbeiter ohne Variante

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Tabelle 4-5: 2(2-Kontingenztafel mit Häufigkeit der Einzelbasensubstitution am Genort SP-A1-Codon 39
Die Signifikanz beträgt im Chi-Quadrat-Test : P(₁²>²) = 0,90.

Allele (n):	Gesamt (72 Allele)	Patientenallele (62)	Mitarbeiterallele (10)
1162C :	64	55	9
Frequenz p:	88,9 (79,3-95,1) %	88,7 (78,1-95,1) %	90,0 (55,5-99,7) %
1162T:	8	7	1
Frequenz q:	11,1 (4,9-20,7) %	11,3 (4,7-21,9) %	10,0 (0,3-44,5) %

Tabelle 4-6: Häufigkeit der beobachteten Genotypen am Genort SP-A1-Codon 39
Die Konkordanz P(₁²>²) mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz wurde im Chi-Quadrat-Test berechnet.

Genotypen (N):	Gesamt (36)	Patienten (31)	Mitarbeiter (5)
[1162C]+[1162C] (P):	75,0% (28)	74,2% (24)	80,0% (4)
[1162C]+[1162T] (H):	25,0% (8)	25,8% (7)	20,0% (1)
[1162T]+[1162T] (Q):	0,0% (0)	0,0% (0)	0,0% (0)
Konkordanz:	P(12>2) = 45 %	P(12>2) = 48 %	P(12>2) = 80 %

Die in einem Allel des SP-A1-Gens von Patient 15 entdeckte Variante 3138T>C deletiert eine NdeI-Restriktionsstelle. Das betroffene Codon 184 kodiert weiterhin Tyrosin. In der Kontingenztafel in Tabelle 4-7 wird der Vergleich der durch DNA-Sequenzierung (q 3,6 %) oder RFLP-Analyse bestimmten Frequenz (q 15,9 %) mit = 0,10 annähernd signifikant.

Tabelle 4-7: 2(2-Kontingenztafel n mit Häufigkeit der Einzelbasensubstitution am Genort SP-A1-Codon 184

Allele (n):	Gesamt (72)	Sequenz (28)	RFLP (44)	Patienten (62)	Mitarbeiter (10)
3138T:	64	27	37	54	10
p [%]:	88,9 (79,3-95,1)	96,4 (81,7-99,9)	84,1 (69,9-93,4)	87,1 (76,1-94,3)	100 (74,1-100)
3138C:	8	1	7	8	0
q [%]:	11,1 (4,9-20,7)	3,6 (0,1-18,3)	15,9 (6,6-30,1)	12,9 (5,7-23,9)	0 (0,0-25,9)
	Signifikanz:	Chi-Quadrat-Test :	P(12>2) = 0,10	ex. Fisher -Test:	P(a) = 0,28

Ursache war der unvollständige DNA-Verdau durch NdeI trotz verlängerter Inkubationszeit, wie bei den Proben von Mitarbeiter 3 und 5 sowie Patient 11 und 14 in Abbildung 4-7 zu sehen.

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Abbildung 4-7: Beispiel für unvollständigen DNA-Verdau durch NdeI (4 Stunden Inkubation mit 10 Units Enzym)
Alle Mitarbeiter waren homozygot für den Wildtyp. Die Patienten 2, 13, und 15 tragen die Variante.

Der Unterschied zwischen der bei den Patienten (q 12,9 %) und den Mitarbeitern (q 0 %) beobachteten Frequenz wurde im exakten Fisher -Test mit = 0,28 nicht signifikant. Aus der in Tabelle 4-8 wiedergegebenen Verteilung der Genotypen in den gebildeten Subpopulationen konnte kein Verstoß gegen das Hardy-Weinberg-Gesetz abgeleitet werden.

Tabelle 4-8: Häufigkeit der beobachteten Genotypen am Genort (SP-A1)-Codon 184
Die Konkordanz P(₁²>²) mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz wurde im Chi-Quadrat-Test berechnet.

Population (N):	Gesamt (36)	Patienten (31)	Probanden (5)	Sequenz (14)	RFLP (22)
[3138T]+[3138T]:	2,8% (P=1)	3,2% (P=1)	0,0% (P=0)	0,0% (P=0)	4,5% (P=1)
[3138C]+[3138T]:	16,7% (H=6)	19,4% (H=6)	0,0% (H=0)	7,1% (H=1)	22,7% (H=5)
[3138C]+[3138C]:	80,6% (Q=29)	77,4% (Q=24)	100,0% (Q=5)	92,9% (Q=13)	72,7% (Q=16)
Konkordanz:	P(12>2)=35%	P(12>2)=44%	P(12>2)=100%	P(12>2)=89%	P(12>2)=48%

4.2.2 SP-A1- und SP-A2-Genotypen von 14 Patienten

Von 14 Patienten, die nach den in Abschnitt 3.1.2 dargelegten Kriterien ausgewählt worden waren, wurden die DNA-Sequenzen aller Exone beider SP-A-Gene bestimmt. Da diploide Proben amplifiziert und sequenziert wurden, liegen an heterozygoten Genorten zwei verschiedene DNA-Basen vor, die ähnlich wie in der Sequenz auf der linken Seite in Abbildung 4-4 nebeneinander als Farbbanden auf der Membran auftauchen. In Tabelle 4-9 werden die

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Tabelle 4-9: Polymorphe Codons in den Exonsequenzen von SP-A1 und dementsprechende Allele der Patienten
Zur Orientierung ist die seltene Variante hervorgehoben. Neu beschriebene Polymorphismen sind kursiv gesetzt.
Unterstrichene Haplotypen wurden durch Klonierung gesichert.

SP-A1	Exon:	1	1	1	2	4	4	4
	Einzelbase:	1101T>C	1162C>T	1193G>C	1544A>G	2985A>G	3138T>C	3241C>T
Patient	Aminosäure:	Val19Ala	(39His)	Val50Leu	(62Pro)	(133Thr)	(184Tyr)	Arg219Trp
3	6a2 6a2	GTG GTG	CAC CAC	GTC GTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
4	6a2 6a2	GTG GTG	CAC CAC	GTC GTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
5	6a3 6a3	GTG GTG	CAC CAC	CTC CTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
6	6a 6a3	GCG GTG	CAC CAC	CTC CTC	CCG CCA	ACG ACA	TAT TAT	CGG CGG
7	6a2 6a3	GTG GTG	CAC CAC	GTC CTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
8	6a2 6a*	GTG GTG	CAC CAT	GTC CTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
9	6a2 6a3	GTG GTG	CAC CAC	GTC CTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
10	6a2 6a3	GTG GTG	CAC CAC	GTC CTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
12	6a2 6a*	GTG GTG	CAC CAT	GTC CTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
15	6a# 6a2 oder 6a3	GTG GTG	CAC CAC	CTC o. GTC GTC o. CTC	CCA CCA	ACA ACA	TAC TAT	CGG CGG
16	6a2 6a2	GTG GTG	CAC CAC	GTC GTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
17	6a2 6a2	GTG GTG	CAC CAC	GTC GTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
34	6a2 6a2	GTG GTG	CAC CAC	GTC GTC	CCA CCA	ACA ACA	TAT TAT	CGG CGG
37	6a3 6a4	GTG GTG	CAC CAC	CTC CTC	CCA CCG	ACA ACA	TAT TAT	CGG TGG

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Patient 15 besitzt ein unbekanntes Allel mit der Substitution 3138T>C und ist gleichzeitig heterozygot in Codon 50. Um zu bestimmen, ob dieses Allel in Exon 1 die Wildtypsequenz oder die Substitution 1193G>C trägt, musste fast die gesamte SP-A1-Sequenz kloniert werden. In den klonierten Sequenzen waren beide Kombinationen vorhanden, so dass die Frage nicht eindeutig beantwortet werden konnte (vergleiche dazu weiter unten den Hinweis auf das Phänomen der jumping PCR bei der Klonierung des SP-A2-Gens). Patient 15 trägt daher entweder ein Wildtypallel 6a2 und ein Allel 6a6 des Haplotyps [1193G>C + 3138T>C] oder ein Allel 6a3 des Haplotyps [1193G>C] und ein Allel 6a# des Haplotyps [3138T>C].

Tabelle 4-10 gibt die Ergebnisse der DNA-Sequenzierung der SP-A2-Amplifikate wieder. Da die Zahl der verschiedenen SP-A2-Allele größer ist, kann das in Tabelle 1-3 wiedergegebene Schema nicht jeden Genotyp aus einer diploiden Probe identifizieren. Nur Allel 1a ist durch die Substitution 1649G>C charakterisiert. Bei Nachweis der Sequenz [3018C>T + 3265C>A] in Exon 4 entscheidet die Anwesenheit der Substitution 1098A>C in Exon 1, ob Allel 1a1 oder Allel 1a3 vorliegt. Allel 1a2 liegt vor, wenn es sich abgesehen von der Substitution 1098A>C um die Wildtypsequenz handelt. Liegt wie bei Patient 4 sowohl in Exon 1 wie auch in Exon 4 Heterozygotie vor, kann der Genotyp nicht aus der diploiden Probe bestimmt werden.

Die bei Patient 7 und 10 entdeckte Substitution 1220G>C, die zum Aminosäureaustausch Val50Leu führt, lässt sich durch das Auftreten eines bisher nicht beschriebenen Allels erklären. Sieben erfolgreich mit der aus DNA von Patient 10 amplifizierten Sequenz von SP-A2-Exon 1 transformierte Klone wurden sequenziert. Während zwei die Wildtypsequenz und vier den Haplotyp [1098A>C + 1220G>C] aufwiesen, war der siebte (Klon 10.11 in Tabelle 4-14 ) mit dem Haplotyp [1118T>C + 1220G>C] offenbar als Polymerasefehler in der PCR entstanden.

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Tabelle 4-10: Polymorphe Codons in den Exonsequenzen von SP-A2 und dementsprechende Allele der Patienten
(Fragliche Allele bei Patient 4 und 12 gingen nicht in die Allel- und Haplotypfrequenzen in Abschnitt 5.2.3 ein)

SP-A2	Exon:	1	1	2	4	4
	Einzelbasensubstitution:	1098A>C	1220G>C	1649G>C	3018C>T	3265C>A
Patient	Aminosäureaustausch:	Asn9Thr	Val50Leu	Ala91Pro	(140Ser)	Gln223Lys
3	1a0 1a0	AAC AAC	GTC GTC	GCT GCT	TCC TCC	CAG CAG
(4)	(1a0 oder 1a2) (1a1 oder 1a3)	AAC oder ACC ACC oder AAC	GTC GTC	GCT GCT	TCC TCT	CAG AAG
5	1a0 1a2	AAC ACC	GTC GTC	GCT GCT	TCC TCC	CAG CAG
6	1a 1a2	ACC ACC	GTC GTC	CCT GCT	TCC TCC	CAG CAG
7	1a3 1a*	AAC ACC	GTC CTC	GCT GCT	TCT TCC	AAG CAG
8	1a2 1a#	ACC AAC	GTC GTC	GCT GCT	TCC TCT	CAG CAG
9	1a0 1a0	AAC AAC	GTC GTC	GCT GCT	TCC TCC	CAG CAG
10	1a* 1a#	ACC AAC	CTC GTC	GCT GCT	TCC TCT	CAG CAG
(12)	(1a§) (1a§)	ACC ACC	GTC GTC	CCT CCT	TCT TCT	AAG AAG
15	1a0 1a2	AAC ACC	GTC GTC	GCT GCT	TCC TCC	CAG CAG
16	1a0 1a0	AAC AAC	GTC GTC	GCT GCT	TCC TCC	CAG CAG
17	1a0 1a0	AAC AAC	GTC GTC	GCT GCT	TCC TCC	CAG CAG
34	1a3 1a3	AAC AAC	GTC GTC	GCT GCT	TCT TCT	AAG AAG
37	1a1 1a1	ACC ACC	GTC GTC	GCT GCT	TCT TCT	AAG AAG

Durch Restriktion eines SP-A2-Amplifikats aus der DNA von Patient 10 mit StuI in Exon C und Codon 168 wurde eine Sequenz von 2.302 bp (DNA-Basen 860C_3161G) gebildet und mit pUC19 ligiert. Nur 2 von 24 transformierten Klonen waren laktaseinaktiv. Da bei Restriktion mit BamHI keine Sequenz herausgeschnitten werden konnte, muss die Vielfach-Klonierungsstelle (multiple cloning site) dieser Plasmide samt komplementierendem -Galactosidasegen deletiert gewesen sein. Durch Kombination der StuI-Restriktion mit HindIII, welches nach Codon 155 schneidet, wurde ein überhängendes 3‘-Ende am SP-A2-Amplifikat (DNA-Basen 860C_3123A) gebildet. Von neun transformierten Klonen enthielten drei die SP-A2-Sequenz. Die DNA-Sequenzierung zeigte den Haplotyp [1098A>C + 1220G>C] mit der Wildtypsequenz “TCC“ in Codon 140 in zwei der Klone, der dritte Klon wies sowohl in Exon 1 als auch in Exon 4 die

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Paitient 7 und 10 tragen das neue Allel 1a7 des Haplotyps [1098A>C + 1220G>C], das aufgrund des Aminosäureaustausches Val50Leu ein SP-A1-Monomer mit neuer Primärstruktur kodiert. Bei Patient 7 ist das zweite Allel 1a3 mit dem Haplotyp [3018C>T + 3265C>A].

Bei Patient 10 hat das zweite Allel abweichend von der Wildtypsequenz lediglich die bekannte, “stille“ Einzelbasensubstitution in Codon 140. Dieses neue Allel 1a6 des Haplotyps [3018C>T] kodiert dasselbe Protein wie Wildtypallel 1a0 und wurde ebenfalls bei Patient 8 nachgewiesen.

Patient 12 ist homozygot für alle vier bisher bekannten Einzelbasensubstitutionen im SP-A2-Gen. Der beobachtete Haplotyp [1098A>C + 1220G>C + 3018C>T + 3265C>A] charakterisiert das neue Allel 1a§, das als Einzelbeobachtung in Abschnitt 5.2.2 näher diskutiert wird.

4.2.3 Häufigkeiten einzelner Polymorphismen

Aus den Zahlen der für eine bestimmte Substitution heterozygoten beziehungsweise homozygoten Proben wurde die beobachtete Häufigkeit q des entsprechenden Polymorphismus im untersuchten Patientenkollektiv sowie die beobachtete Proportion Heterozygoter h berechnet. Ein Vergleich mit dem erwarteten Heterozygotiegrad Het kann ebenso wie die Prüfung auf Konkordanz mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz im Chi-Quadrat-Test einen in der studierten Population vorherrschenden Heterozygotenvorteil aufdecken. Die in Tabelle 4-11 gezeigte Analyse der einzelnen Polymorphismen im SP-A1-Gen zeigte jeweils eine hohe Konkordanz mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz, die Zahl Heterozygoter entsprach dem Erwartungswert.

Im SP-A2-Gen lag die erwartete Häufigkeit Heterozygoter Het für die Substitution 3265C>A in Codon 223 mit 42,3 % am oberen Ende des 95 %-Konfidenzintervalls (1,8 - 42,8 %) der beobachteten Heterozygotie h. Sowohl bei diesem zum Aminosäureaustausch Gln223Lys

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Tabelle 4-11: Häufigkeiten der einzelnen Polymorphismen im SP-A1-Gen (n = 28 Allele)
Die Proportion Heterozygoter h wurde mit dem erwarteten Heterozygotiegrad Het verglichen.
Die Konkordanz P(₁²>²) mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz wurde im Chi-Quadrat-Test berechnet.

Variante	q [%]	h [%]	Het [%]	P(12>2)
1101T>C (Val19Ala)	3,6 (0,1 - 18,3)	7,1 (0,2 - 33,9)	7,1	89 %
1162C>T (39His)	7,1 (0,9 - 23,5)	14,3 (1,8 - 42,8)	13,8	77 %
1193G>C (Val50Leu)	42,9 (24,5 - 62,8)	42,9 (17,7 - 71,1)	50,8	64 %
1544A>G (62Pro)	7,1 (0,9 - 23,5)	14,3 (1,8 - 42,8)	13,8	77 %
2985A>G (133Thr)	3,6 (0,1 - 18,3)	7,1 (0,2 - 33,9)	7,1	89 %
3138T>C (184Tyr)	3,6 (0,1 - 18,3)	7,1 (0,2 - 33,9)	7,1	89 %
3241C>T (Arg219Trp)	3,6 (0,1 - 18,3)	7,1 (0,2 - 33,9)	7,1	89 %

Tabelle 4-12: Häufigkeiten der einzelnen Polymorphismen im SP-A2-Gen (n = 28 Allele)

Variante	q [%]	h [%]	Het [%]	P(12>2)
1098A>C (Asn9Thr)	42,9 (24,5-62,8)	42,9 (17,7 -71,1)	50,8	64 %
1220G>C (Val50Leu)	7,1 (0,9-23,5)	14,3 (1,8 - 42,8)	13,8	77 %
1649G>C (Ala91Pro)	10,7 (2,3-28,2)	7,1 (0,2 - 33,9)	19,8	1,9 %
3018C>T (140Ser)	35,7 (18,7-55,9)	28,6 (8,4 - 58,1)	47,6	15,7 %
3265C>A (Gln223Lys)	28,6 (13,2 - 48,7)	14,3 (1,8 - 42,8)	42,3	1,5 %

4.3 PCR-SSCP-Analyse

Die Elektrophoresebedingungen zum SSCP-Nachweis in den PCR-Amplifikaten wurden experimentell bestimmt. Die Klonierung von Mustersequenzen ermöglichte die wiederholte Amplifikation von DNA, deren Sequenz an den polymorphen Genorten den entsprechenden Abschnitten der einzelnen Allele entsprach. Zur Überprüfung der Sensitivität wurden Exonsequenzen mit weiteren artifiziellen Mutationen kloniert. SSCP-Gelelektrophoresen mit Patienten-DNA waren wegen der Heterozygotie nicht eindeutig zu interpretieren.

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4.3.1 Elektrophoresebedingungen zum SSCP-Nachweis

Die Reproduzierbarkeit der SSCP-Elektrophorese wird durch Temperatur , Geldichte sowie denaturierende Zusätze beeinflusst ( Orita et al. 1989). Einzelstrang-DNA wurde mit steigender Geldichte stärker im Gel zurückgehalten, die Mobilitätsunterschiede zur Doppelstrang-DNA verringerten sich, so dass in 3,5 % Polyacrylamid Doppelstrang- und Einzelstrang-DNA nicht mehr zu trennen sind. Abbildung 4-8 zeigt ein 5 %iges Polyacrylamidgel im Monoacrylamid-Bisacrylamid-Verhältnis von 99:1. Eine geringere Querverzweigung würde die Unterschiede wieder erhöhen, aber durch die Konsistenz des Gels die Handhabung zu sehr erschweren.

Tabelle 4-13 und Tabelle 4-14 aufgeführt.

Die Temperatur beeinflusst die DNA-Konformation ( Newton und Graham 1997). Bei 4°C sind einige Polymorphismen besser zu sehen, wie bei Klon 8.8 in Abbildung 4-9 . Klon 8.2 lässt sich jedoch besser in der bei 20° C durchgeführten Elektrophorese in Abbildung 4-8 differenzieren.

Abbildung 4-9: SSCP-Analyse mit klonierter DNA von SP-A-Exon 1
6% Polyacrylamid(99:1), Temperatur = 4°C, Laufzeit = 135 Minuten, DS = nicht denaturierte DNA.

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Abbildung 4-10: SSCP-Analyse mit klonierter DNA von SP-A-Exon 1
(0,25×) MDE ^® Gel Solution, Temperatur = 4°C, Laufzeit = 135 Minuten, DS = nicht denaturierte DNA.

Abbildung 4-11: SSCP-Analyse von SP-A1-Exon 2 mit DNA-Proben der Patienten 6, 8 und 12
5% Polyacrylamid(99:1) mit 5% Glycerol, Temperatur = 4°C, Laufzeit = 135 min, DS = Doppelstrang-DNA.

Abbildung 4-12: SSCP-Analyse von SP-A1-Exon 2 mit DNA-Proben der Patienten 6, 8 und 12
5% Polyacrylamid(99:1), Temperatur = 4°C, Laufzeit = 135 Minuten, DS = am unteren Gelrand (185 bp).

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4.3.2 Klonierung von Mustersequenzen

Aus amplifizierter DNA der heterozygoten Patienten 6, 8 und 10 konnten die den einzelnen Exonsequenzen entsprechenden Abschnitte aller Allele als Mustersequenzen im Vektor pCR2.1 kloniert werden. In einer PCR mit den internen Primern SPA-EX1-FW3 und SPA-EX1-RE3 wurden die Sequenzen von Exon 1 beider SP-A-Gene zusammen aus genomischer DNA eines dieser Patienten amplifiziert. Die Plasmid-DNA der erfolgreich transformierten Klone wurde in einer DNA-Restriktion mit PstI wie in Abbildung 4-13 auf das Vorliegen der bereits in Abschnitt 1.1.1 beschriebenen und invariant nur im SP-A2-Gen vorkommenden Einzelbasensubstitution 1018T>A oberhalb von Exon D getestet.

Abbildung 4-13: Restriktionsanalyse der Klone von Patient 10-SP-A-Exon 1
Amplifikate von SP-A1 (Klon 28, 30, 32 und 33) bilden Fragmente von 134, 82, 69 und 26 bp. SP-A2-Amplifikate (Klon 29 und 31) bilden je nach Orientierung im Vektor Fragmente von 203, 82 und 26 oder 177, 82 und 52 bp.

Mit den Universalprimer n M13(-29) und M13(-43) wurden gezielt Amplifikate beider Gene sequenziert, bis von jedem Allel wenigstens zwei klonierte Mustersequenzen identifiziert worden waren, die als Gefrierkultur konserviert wurden. Durch die in Abschnitt 1.1.1 zu diskutierenden Fehlermöglichkeiten waren in einige der Sequenzen bei der PCR falsche DNA-Basen eingefügt worden, die nun als artifizielle Mutationen mit kloniert wurden. Sie traten zum Teil in ohnehin polymorphen Codons auf (wie 1194T>C bei Klon 6.1) und sind in Tabelle 4-13 und Tabelle 4-14 hervorgehoben. Die entsprechenden Klone wurden auch konserviert, da sie gut geeignet

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Tabelle 4-13: Mustersequenzen für SP-A1-Exon 1 (kloniert aus einer PCR mit Taq-DNA-Polymerase)
Unterstrichene Klone wurden in einer Gefrierkultur als Muster für die angegebenen Allele konserviert.
Bei der PCR mutierte Genorte sind hervorgehoben. Anführungszeichen markieren die mutierten Allelsequenzen.

Aminosäure:		Val19Ala	(27Val)	(39His)	Val50Leu	Leu50Pro	(51Lys)
Patient	Klon	1101T>C	1126T>C	1162C>T	1193G>C	1194T>C	1198A>G	Allel
	1	GTG		CAC		CCC (Pro)		(6a3, 6a4)‘
	2	GTG		CAC	CTC			6a3, 6a4
	3	GCG		CAC	CTC			6a
	4	GTG		CAC	CTC			6a3, 6a4
6	6	GCG		CAC	CTC			6a
	7	GTG		CAC	CTC			6a3, 6a4
	8	GCG		CAC	CTC			6a
	9	GTG		CAC	CTC			6a3, 6a4
	10	GCG	GTC	CAC	CTC			(6a)‘
	12	GTG		CAC	CTC			6a3, 6a4
	1	GTG		CAT	CTC			6a*
	2	GTG		CAT	GTC			(6a2)‘
8	3	GTG		CAT	CTC			6a*
	5	GTG		CAC	GTC			6a2
	6	GTG		CAC	GTC			6a2
	8	GTG		CAC	GTC		AAG	(6a2)‘‘
	2	GTG		CAC	CTC			6a3, 6a4
10	3	GTG		CAC	GTC			6a2
	8	GCG		CAC	GTC			(6a2)‘‘‘
	10	GTG		CAC	CTC			6a3, 6a4

Mit den internen Primern SPA-EX2-FW und SPA-EX2-RE2 wurden die Sequenzen von Exon 2 beider SP-A-Gene aus genomischer DNA von Patient 6 amplifiziert. Die Plasmid-DNA der erfolgreich transformierten Klone wurde in einer DNA-Restriktion mit ApaI auf das Vorliegen der invariant nur im SP-A2-Gen vorkommenden Einzelbasensubstitution 1640G>A getestet. Wieder wurden gezielt so viele Amplifikate beider Gene sequenziert, bis von jedem Allel zwei klonierte Mustersequenzen identifiziert worden waren. Tabelle 4-16 und Tabelle 4-15 zeigen die Sequenzen der Klone an den polymorphen Genorten von SP-A1 und SP-A2.

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Tabelle 4-14: Mustersequenzen für SP-A2-Exon 1 (kloniert aus einer PCR mit PwoI-DNA-Polymerase)

Aminosäure:		Asn9Thr	Ser16Pro	Val50Leu
Patient	Klon	1098A>C	1118T>C	1220G>C	Allel
	29	ACC		GTC	1a, 1a1, 1a2, 1a§
8	31	ACC		GTC	1a, 1a1, 1a2, 1a§
	34	ACC		GTC	1a, 1a1, 1a2, 1a§
	4	ACC		CTC	1a*
	5	ACC		CTC	1a*
	7	ACC		CTC	1a*
10	9	AAC		GTC	1a0, 1a3, 1a#
	11	ACC	CCT	GTC	(1a, 1a1, 1a2, 1a§)‘
	14	AAC		GTC	1a0, 1a3, 1a#
	15	ACC		CTC	1a*

Tabelle 4-15: Mustersequenzen für SP-A2-Exon 2 (kloniert aus einer PCR mit Taq-DNA-Polymerase)

Aminosäure:		(Intron)	Ala91Pro	(Intron)	(Intron)	(Intron)
Patient	Klon	1526A>G	1649G>C	1690G>A	1696T>C	1745_1747delGGT	Allel
	5	ACGCA	GCT	GTGGG			1a0, 1a1-1a*, 1a#
	14		CCT	GTAGG			1a, 1a§
	17		CCT	GTAGG			1a, 1a§
	20		CCT	GTAGG			1a, 1a§
6	22		CCT	GTAGG			1a, 1a§
	24		CCT	GTAGG			1a, 1a§
	26		CCT	GTAGG	AGCGG		(1a, 1a§)‘
	27		GCT	GTGGG		(TGGGCAGA)	1a0, 1a1-1a*, 1a#
	28		CCT	GTAGG			1a, 1a§

Tabelle 4-16: Mustersequenzen für SP-A1-Exon 2 (kloniert aus einer PCR mit Taq-DNA-Polymerase)

Aminosäure:	(Intron)	(Intron)	(Intron)	(62Pro)	Gly72Pro
Patient	Klon	1507C>T	1515T>C	1526T>C	1544A>G	1632_1633GG>CC	Allel
	2				CCA		6a2, 6a3, 6a*, 6a#
	3	CATAT			CCG		(6a, 6a4)‘
	4			TCCGC	CCA		6a2, 6a3, 6a*, 6a#
	7				CCA	CCC	(6a2, 6a3, 6a*, 6a#)‘
6	8				CCA		6a2, 6a3, 6a*, 6a#
	9				CCG		6a, 6a4
	13		TGCCT		CCA		(6a2, 6a3, 6a*, 6a#)‘‘
	15				CCA		6a2, 6a3, 6a*, 6a#
	25				CCA		6a2, 6a3, 6a*, 6a#

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Mit den internen Primern SPA-EX3-FW und SPA-EX3-RE wurden die Sequenzen von Exon 3 beider SP-A-Gene aus genomischer DNA von Patient 7 amplifiziert. Da in diesem Exon keine in einem Gen varianten polymorphen Genorte bekannt sind, wurde bei der Sequenzierung an der invarianten Einzelbasensubstitution 2453T>C erkannt, ob eine amplifizierte Sequenz des SP-A1- oder des SP-A2-Gens vorliegt. Bei einer klonierten SP-A2-Sequenz (Klon 7.9) war zusätzlich Nukleotid 2517 im Intron deletiert, wie Tabelle 4-17 zeigt.

Tabelle 4-17: Mustersequenzen für SP-A-Exon 3 ( markiert die deletierte DNA-Base)

Aminosäure:		(94Phe)	(Intron)
Patient	Klon	2453T>C	2517delT	Gen
	3	TTT		SP-A1
	4	TTT		SP-A1
	5	TTT		SP-A1
7	6	TTT		SP-A1
	7	TTC		SP-A2
	9	TTC	CCCCGGGC	(SP-A2)‘
	10	TTT		SP-A1
	12	TTC		SP-A2

Mit den internen Primern SPA-EX4-FW3 und SPA-EX4-RE wurden die Sequenzen von Exon 4 beider SP-A-Gene aus genomischer DNA der Patienten 6 und 10 amplifiziert. Lediglich ein Klon war erfolgreich transformiert worden, was an der Größe des DNA-Fragments liegen kann. Dieser Klon hatte abweichend von der Sequenz von Allel 1a eine G-A-Transition in Codon 240. Aufgrund der im folgenden Abschnitt beschriebenen, unzureichenden Spezifität der SSCP-Analyse diploider Patientenproben wurde auf die weitere Klonierung verzichtet.

Tabelle 4-18: Mustersequenz für SP-A2-Exon 4 (kloniert aus einer PCR mit PwoI-DNA-Polymerase)

Aminosäure:		(140Ser)	Gln223Lys	Tyr240Cys
Patient	Klon	3018C>T	3265C>A	3305A>G	Allel
6		TCC	AAG	TGC	1a

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4.3.3 SSCP-Gelelektrophoresen mit Patienten-DNA

Abbildung 4-12 zeigte eine SSCP-Gelelektrophorese , bei der Amplifikate von SP-A2-Exon 2 aus Patienten-DNA gemeinsam mit klonierter Standard-DNA aufgetrennt wurden. Bei den DNA-Standards lässt sich das Wildtypallel 1a0 (Klon 6.27) von der Sequenz mit der Einzelbasensubstitution 1649G>C (Klon 6.14) und der in der PCR mutierten Sequenz mit der Transition 1696T>C (Klon 6.26) unterscheiden. Beim Vergleich der Muster von Klon 6.14 und Patient 12 wird die bei der Sequenzierung in Tabelle 4-10 nachgewiesene Homozygotie in Codon 91 für [1649G>C] + [1649G>C] deutlich. Patient 8 ist in Codon 91 homozygot für die Wildtypsequenz “GCT“. Das von Abweichen des Farbbandenmusters von dem bei Klon 6.27 zu sehenden ist durch die inkonstante Einzelbasensubstitution 1690G>A im Intron bedingt. Bei Patient 6 bilden sich durch die Heterozygotie andere Banden als in den homozygoten Proben, wobei es sich wahrscheinlich um Heteroduplexe handelt ( Humphries et al. 1997).

Bei der SSCP-Gelelektrophorese mit Amplifikaten von Exon 3 ließ sich die SP-A1-Gensequenz von der SP-A2-Gensequenz unterscheiden. Die in der PCR mutierte Sequenz von Klon 7.9 war ebenfalls zu differenzieren. Aufgrund der häufigen Polymorphismen war die Identifikation diploider Proben sehr schwierig. Selbst unter Berücksichtigung der hier nicht gezeigten Analysen aller Exone war die exakte Bestimmung des SP-A-Genotyps anhand der Beobachtung von Einzelstrangkonformationspolymorphismen nicht möglich.

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