Scholz, Dietmar: Analyse der Surfaktantprotein A-Gene bei Patienten mit Verdacht auf einen Surfaktantproteindefekt

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Kapitel 5. Diskussion

Eine Verfahren zur Analyse der SP-A-Gene wurde erarbeitet und bei Patienten mit Verdacht auf einen Surfaktantproteindefekt angewendet. Allelische Varianten des SP-A könnten für ihre Träger ein erhöhtes Risiko für Erkrankungen, bei denen Surfaktantproteine pathogenetisch beteiligt sind, bedeuten. Der Nutzen der Analyse der SP-A-Gene bei verschiedenen Krankheitsbildern wird diskutiert und ein Ausblick auf weitergehende Untersuchungen gewagt.

5.1 Verfahren zur Analyse der SP-A-Gene

Es gibt einfache Techniken zum schnellen Nachweis von bekannten Polymorphismen. Die in der Literatur veröffentlichten Analysen zur Allelverteilung beim SP-A untersuchten die bekannten polymorphen Genorte. Die Entdeckung und Beschreibung unbekannter genetischer Varianten erfordert ein schrittweises Vorgehen. Sensitivität und Spezifität waren neben der Durchführbarkeit wichtige Kriterien bei der Auswahl der Techniken. Zufällige und systematische Fehler der angewandten Methoden minderten die Aussagekraft einzelner Beobachtungen angesichts der hohen genetischen Variabilität der SP-A-Sequenzen.

5.1.1 Techniken

Zur Isolation und Amplifikation der zu untersuchenden DNA wurde wegen ihrer Einfachheit und Effektivität die Polymerasekettenreaktion (PCR) gewählt. Bei entsprechender Wahl der Primer ermöglicht sie die Amplifikation nahezu beliebiger Abschnitte der DNA. Die externe PCR diskriminiert zwischen den beiden Kopien des SP-A-Gens. Die interne PCR amplifiziert die kodierenden Sequenzen. Als nested PCR erhöhen sie gemeinsam die Effektivität.

Unbekannte Mutationen lassen sich in der denaturierenden Gradientengelelektrophorese (DGGE) und der Einzelstrangkonformationspolymorphismus-Analyse (SSCP) detektieren. Beide Verfahren reagieren auf Veränderungen an einer beliebigen Stelle der DNA-Sequenz. Bei der DGGE beeinflusst die veränderte Schmelztemperatur der mutierten DNA das Elektrophoreseverhalten ( Myers et al. 1985). Mit der Berechnung des Schmelzverhaltens der DNA können optimale Elektrophoresebedingungen geschaffen werden ( Abrams et al. 1990). Das Verfahren wird unter anderem zum Nachweis der Hämophilie A angewandt ( Higuchi et al. 1991). Bei der SSCP-Gelelektrophorese beeinflusst die individuelle Konformation (räumliche


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Anordnung) der als Einzelstrang vorliegenden DNA (single strand conformation) die Retention im Gel ( Orita et al. 1989). Für diese Technik existieren keine Algorithmen, um von der elektrophoretischen Mobilität der Einzelstrang-DNA auf die Konformation oder die Lokalisation der Mutation zu schließen; die Analyse beruht auf dem Vergleich der als Farbbanden sichtbaren sense- und antisense-Stränge mit den Mustern bekannter Kontrollen. Aufgrund der einfachen Durchführbarkeit hat die SSCP-Analyse ein breites Einsatzgebiet ( Humphries et al. 1997). Die Arbeitsgruppe um J. Floros erprobte die Technik zum Nachweis des Allels 6a ( Krizkova et al. 1994). in der SSCP-Gelelektrophorese kann in der Regel DNA von 150 - 400 bp Länge analysiert werden ( Newton und Graham 1997). Da die Exone der SP-A-Gene diese Länge haben, schien die Technik gut geeignet, wenn bei der Amplifikation von Exon 3 Teile des Introns eingeschlossen wurden, um ein größeres DNA-Fragment zu schaffen (siehe Abschnitt 4.1.1 ).

Die direkte DNA-Sequenzierung auffälliger Proben ist zur Charakterisierung neuer Mutationen erforderlich. Durch Sequenzierung der Exone wurden alle Polymorphismen in den SP-A-Genen der vierzehn nach den in Abschnitt 3.1.2 erwähnten Kriterien ausgewählten Patienten ermittelt. Zur Alleltypisierung Hetrozygoter ist die DNA-Klonierung wie in Abschnitt 4.2.2 nötig.

Eine Einzelbasensubstitution kann eine Restriktionsschnittstelle schaffen oder deletieren. In diesem Fall kann der Nachweis des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus ( RFLP ) zur schnellen Analyse einer großen Zahl von Proben eingesetzt werden. Je nach Vorhandensein oder Fehlen der Restriktionsschnittstelle entstehen DNA-Fragmente definierter Länge, die sich eindeutig in der Gelelektrophorese voneinander trennen lassen. Die Aminosäuresubstitutionen in den SP-A-Genen lassen sich nur mit den in Tabelle 5-1 aufgeführten, wenig gebräuchlichen Restriktionsendonukleasen detektieren. Daher wurde die RFLP-Analyse in Abschnitt 4.2.1 nur zum Nachweis der neu beschriebenen, “stillen“ Einzelbasensubstitutionen angewandt.

Tabelle 5-1: Restriktionsendonukleasen für die RFLP-Analyse der Aminosäuresubstitutionen im SP-A
Legende: n steht für eine beliebige DNA-Base, s für G oder C. Die substituierte DNA-Base ist hervorgehoben.

Variante:

Asn9Thr

Val19Ala

Val50Leu

Ala91Pro

Arg219Trp

Gln223Lys

Enzym:

HphI

Cac8I

BplI

Cac8I

(kein

TspRI

Sequenz:

GGTGA

GCnnGC

GAGnnnnnCTC

GCnnGC

Enzym)

CAsTG

Wird kein RFLP erzeugt, kann die sequenzspezifische Oligohybridisierung (SSO) dem Nachweis der charakterisierten Mutation dienen. Dazu werden Oligonukleotide konzipiert, die PCR-Primern ähneln, aber am polymorphen Genort hybridisieren. Sie sind radioaktiv markiert und entweder für das mutierte oder das Wildallel spezifisch. An der Intensität der Markierungen,


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die im Slot blot durch schlitzförmige Öffnungen auf eine Membran übertragen werden, erkennt man, welche Oligonukleotide zur untersuchten DNA-Sequenz komplementär sind. Die Arbeitsgruppe um J. Floros entwickelte ein PCR-SSO-Verfahren zur Bestimmung der in einer Probe vorliegenden SP-A-Allele anhand der identifizierten Polymorphismen ( Rishi et al. 1992). Alternativ könnte die allelspezifische PCR (ASPCR), bei der allelspezifische Oligonukleotide als Primer eingesetzt werden, welche nur das gewünschte Allel amplifizieren, zur Untersuchung polymorpher Genorte eingesetzt werden. Dieses Verfahren wurde zur Diagnose der Sichelzellanämie entwickelt ( Wu et al. 1989). Bei der allelspezifischen Ligasekettenreaktion (LCR) werden zwei am polymorphen Genort aneinander angrenzende Oligonukleotide nur ligiert, wenn sie exakt komplementär zur untersuchten DNA sind ( Barany 1991).

5.1.2 Sensitivität und Spezifität

Die direkte DNA-Sequenzierung der PCR-Produkte ist der Goldstandard zur Erfassung aller Polymorphismen. Die Empfindlichkeit anderer Techniken wird daran gemessen.

Bei der DGGE wird eine Tandemrepeatsequenz von 30 - 50 Wiederholungen des Dinukleotids “GC“ an die DNA-Probe gehängt. Dies erhöht die Schmelztemperatur der zu untersuchenden Sequenz und die Sensitivität bei der Detektion von Veränderungen. Mit Hilfe dieser “GC-Klammer“ werden etwa 50 % aller Mutationen in DNA von 30 - 1000 bp detektiert ( Sheffield et al. 1989). Die SSCP-Analyse soll über 90% der Mutationen in DNA von 250 - 400 bp detektieren ( Grace et al. 1995) und wurde daher zur Analyse ausgewählt. Schwierigkeiten entstehen bei polymorphen Sequenzen durch Bildung von Heteroduplexen, die neben informativen Einzelstrang-DNA-Banden weitere Farbbanden im Gel erzeugen ( Humphries et al. 1997).

Der Nachweis eines bekannten RFLP in der Gelelektrophorese ist eine sehr sensitive Methode, deren Treffsicherheit bei geeigneten Reaktionsbedingungen nahe 100 % liegt. Voraussetzung ist eine gute Aufreinigung der amplifizierten DNA und der Einsatz von Restriktionsendonukleasen mit hoher Aktivität. Bei der PCR-SSO kommt es in geringem Maße zu unspezifischen Bindungen nichtkomplementärer Oligonukleotide an die zu untersuchende DNA. Daher wird ein Signal erst dann als heterozygot positiv gewertet, wenn es 25 -75 % der Intensität eines bekannten Allels hat, welches vollständig hybridisiert. Sensitivität und Spezifität dieser Technik sind dementsprechend geringer ( Thein et al. 1993). Bei der ASPCR werden sogar drei diskriminierende Nukleotide am 3‘-Ende des Primers gefordert, um eine hochspezifische


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Primerbindung zu sichern. Für den Nachweis von Einzelbasensubstitutionen, wie sie in den SP-A-Genen vorliegen, ist diese Technik weniger geeignet ( Newton und Graham 1997). Die LCR hingegen startet nur, wenn die Primer absolut komplementär zur DNA sind. Sie wäre eine hoch sensitive und spezifische Technik zum Nachweis bekannter Einzelbasensubstitutionen.

5.1.3 Zufällige und systematische Fehler

Bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) baut die DNA-Polymerase mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit nicht komplementäre DNA-Basen ein. Die Polymerasefehler werden mit jedem Reaktionszyklus weiter amplifiziert. Die Fehlerrate der Taq-DNA-Polymerase beträgt f ap 1 × 10-4, so dass bei Elongation um 10.000 Nukleotide im Mittel ein nicht komplementäres in den DNA-Strang eingebaut wird. Bei der Amplifikation der Sequenz von Exon 1 des SP-A-Gens (DNA-Basen 994_1241) mit den internen Primern SPA-EX1-FW2 und SPA-EX1-RE2 mit einer Länge b von etwa 250 bp in einer PCR mit d = 35 Reaktionszyklen müssten nach der Formel F = 1 - e-(b×f×d) ( Cha und Thilly 1995) 58 % der Sequenzen eine solche Transition aufweisen. Die Analyse der klonierten SP-A1-Exon 1-Amplifikate in Tabelle 4-13 zeigt, dass es in fünf von zwanzig Sequenzen zu einer Transition kam. DNA-Polymerasen mit fehlerkorrigierender ( proof reading ) Aktivität verringerten den Anteil fehlerhafter Sequenzen auf 10% ( Tabelle 4-14 ). Bei der direkten Sequenzierung von PCR-Produkten ohne Zwischenklonierung bleiben diese zufällig über die gesamte Sequenz verteilten Polymerasefehler unsichtbar. Nur die Signale der korrekt amplifizierten Sequenzen summieren sich zur sichtbaren Konsensussequenz ( Newton und Graham 1997).

Die in Abbildung 4-1 und Abbildung 4-2 gezeigte Bildung von Nebenprodukten durch Abbruch der DNA-Synthese nach unspezifischer Bindung (misannealing) der Primer an homologen Sequenzen wie der falschen Kopie des SP-A-Gens oder am Pseudogen ( SP-A( ) ist ein typisches Problem der Amplifikation langer DNA-Sequenzen (long template PCR). Die Verwendung eines hot start s und besonders langer Oligonukleotide als diskriminierend e Primer in oder nahe der genetisch stabileren, translatierten Genregionen löste dieses Problem, wie RFLP-Analysen ( Abbildung 4-3 ) und DNA-Sequenzen ( Abbildung 4-4 ) zeigen.

Bei der DNA-Klonierung werden einzelne in der PCR generierte Sequenzen aus der Konsensussequenz herausgegriffen. Um zu vermeiden, dass Polymerasefehler als allelische Varianten interpretiert werden, einigt man sich im allgemeinen darauf, erst dann von einem neuen Haplotyp zu sprechen, wenn er unabhängig voneinander in drei Klonen vorliegt ( White et


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al. 1985). Neben Polymerasefehlern, die sich als Transitionen (Austausch einzelner Nukleotide) oder, insbesondere innerhalb C + G-reicher Sequenzen wie bei Klon 7.9 in Tabelle 4-17 oder Klon 6.27 in Tabelle 4-15 , als Deletionen bemerkbar machen, treten bei der Amplifikation heterozygoter DNA dem von der Meiose her bekannten Kreuzungsphänomen (crossing over) ähnliche Rekombinationen beider allelischer Sequenzen auf. Durch Anlagerung einer im Extensionsschritt nur teilweise synthetisierten DNA-Sequenz eines Allels während des nächsten Hybridisierungsschritts am anderen Allel wird eine Chimäre gebildet, die in den ersten Exonen die Sequenz eines Allels und in den 3‘-terminalen Exonen die Sequenz des anderen Allels besitzt und so einen neuen Haplotyp vortäuscht. (So würde die Rekombination einer Exon 1 und 2 von Allel 6a und Exon 3 und 4 von Allel 6a4 umfassenden DNA die Sequenz von Allel 6a5 bilden, wie sich in Tabelle 1-2 nachvollziehen lässt.) Dieses als Springen der PCR (jumping PCR) bezeichnete Phänomen wird besonders bei der Amplifikation langer DNA-Sequenzen beobachtet ( Colgan 1993) und gezielt zur Mutagenese von DNA-Sequenzen ausgenutzt ( Ørum et al. 1993). Klon 6.26 in Tabelle 4-15 ist eine Chimäre der mit den Primern SPA-EX2-FW und -RE2 aus genomischer DNA amplifizierten Sequenz (1451_1716) des SP-A1-Gens und (1735_1793) des SP-A2-Gens (Nukleotid 1716 des SP-A1-Gens entspricht Nukleotid 1734 des SP-A2-Gens). Aus den in einer PCR mit DNA von Patient 8 amplifizierten Sequenzen von Exon 1 des SP-A1-Gens wurde zweimal die Wildtypsequenz, achtmal die Sequenz des Haplotyps [1162C>T + 1193G>C] und einmal der Haplotyp [1162C>T] kloniert. Neben der Rekombination durch das jumping PCR-Phänomen ist auch eine C-T-Transition aufgrund eines Polymerasefehlers denkbar. Die Wahrscheinlichkeit für eine Transition an einer bestimmtes Stelle beträgt nach der Formel von Cha und Thilly etwa 0,3 %. Klon 6.1 in Tabelle 4-13 besitzt die Transition 1194T>C in Codon 50. Das Auftreten dieser Transitionen in als polymorph bekannten Codons könnte darauf hinweisen, dass dort mutation hotspots vorliegen, und wird in Abschnitt 5.3.4 diskutiert.

Bei der DNA-Sequenzierung kann es durch Unregelmäßigkeiten im Gel oder auf der Membran zum zufälligen Fehlen oder zur Verschiebung von Farbbanden kommen. Die nachlassende Intensität der zuletzt aus dem Gel austretenden Markierungen durch Diffusion verursacht weitere Unsicherheiten beim Lesen der Sequenz. Diese Fehler wurden durch routinemäßiges Sequenzieren in beiden Richtungen unter Verwendung einmal des forward- und im anderen Fall des reverse-Primers korrigiert. Die Substitution von Guanosin durch Inosin im Reaktionsmix in Tabelle 3-14 verhinderte das sogenannte Auflaufen der Nukleotide in der G-Spur.

Bei der SSCP-Gelelektrophorese können die von einer Probe gebildeten Farbbanden mit dem Muster einer nicht identischen Sequenz verwechselt werden. Die Gelelektrophorese derselben Proben bei verschiedenen Temperaturen verringert diese Fehlermöglichkeit, da jeweils andere


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Konformationen und neue Muster auftreten. Der von der Sequenz des Wildtypallels 6a2 durch die Einzelbasensubstitution 1162C>T in Codon 39 abweichende Klon 8.2 zeigt bei Raumtemperatur in Abbildung 4-8 ein auffälliges Muster, während der von der Sequenz des Wildtypallels 6a2 durch die Einzelbasensubstitution 1198A>G in Codon 51 abweichende Klon 8.8 sich besser bei 4 °C in Abbildung 4-9 von den anderen allelischen Varianten differenzieren lässt. Der informative Wert der Einzelstrang-DNA-Farbbanden wurde durch Hinzufügen denaturierender Additiva nicht verbessert. Mit Zunahme genetischer Variabilität und Heterozygotie werden Fehler wahrscheinlicher, da mehr Muster zu unterscheiden sind und Heteroduplexbanden die Interpretation der informativen Banden stören ( Humphries et al. 1997).

Bei der RFLP-Analyse kann eine unvollständige DNA-Restriktion das Vorliegen von Heterozygotie vortäuschen. In der PCR amplifizierte Nebenprodukte können ebenfalls schwache Signale hinterlassen. Probleme mit Restriktionsendonukleasen wie in Abbildung 4-7 gezeigt lassen sich nicht immer eliminieren. Auch die PCR- SSO ist anfällig für Fehlinterpretationen, da bereits Signale mit 25 % der Referenzintensität als Heterozygotie gewertet werden.

5.1.4 Aussagekraft einzelner Beobachtungen

Bei der erstmaligen Sequenzierung eines Gens nachgewiesene Polymorphismen müssen durch Resequenzierung bestätigt werden. So wurde in der von White et al. 1985 veröffentlichten und mit 6a0 bezeichneten Sequenz des SP-A-Gens in Codon 45 “CAC“ anstelle von “GAC“, in Codon 54 “CTG“ anstelle von “CCT“ und in Codon 203 “GGC“ anstelle von “GGG“ gelesen. Die Resequenzierung der damals verwendeten Klone zeigte das Fehlen der damals postulierten Polymorphismen 1178G>C, 1206_1207CT>TG und 3195G>C in der nun als Allel 6a3 bezeichneten Sequenz ( Floros et al. 1996). Einzelbeobachtungen wie das hier bei Patient 12 beschriebene neue Allel 1a§ sind daher mit einem Fragezeichen zu versehen, bis sie bei weiteren Patienten beobachtet werden. Wegen der hohen Frequenz, mit der die meisten Polymorphismen in den SP-A-Genen vorkommen, treten in fast allen Allelen mehrere kombiniert auf. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass die hier anhand der beobachteten Polymorphismen beschriebenen Allele nicht den bei den Patienten vorliegenden Haplotypen entsprechen. Der Versuch, die Haplotypen zu klonieren, wurde durch die Rekombination von Teilabschnitten beider Allele aufgrund des jumping PCR -Phänomens erschwert. Die Vermischung beider Kopien des Gens in der externen PCR konnte jedoch mit ziemlicher Sicherheit ausgeschlossen werden, da an beiden Enden des Genes diskriminierend e Primer eingesetzt wurden. (SPA-1-FW-EXT bildete kein PCR-Produkt mit SPA-2-RE-EXT und SPA-2-FW-EXT nicht mit SPA-1-RE-EXT.)


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Zwar verwenden Floros et al. nur einen diskriminierenden Primer am 5‘-Ende des Gens (“Oligo 326“ und “Oligo 327“) und das sowohl zu den DNA-Basen 3864_3845 des SP-A1- und 3887_3868 des SP-A2-Gens komplementäre “Oligo 68“ am 3‘-Ende. Wir fanden jedoch bei Verwendung des SP-A1-spezifischen Primers SPA-1-FW-EXT mit dem gemeinsamen Primer SPA-RE-EXT Kopien des SP-A2-Gens im PCR-Produkt, so dass die Kombination mit SP-A1- respektive SP-A2-spezifischen reverse-Primern vorgenommen wurde.

Die mit der PCR-SSCP-Analyse erzielten Ergebnisse waren gut reproduzierbar, solange homozygote Proben verglichen wurden. Alle bekannten Polymorphismen und die in der PCR generierten “Mutationen“ waren deutlich nachweisbar, wenn wie in Abbildung 4-8 und Abbildung 4-9 zwei Gelelektrophoresen bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt wurden. Da in diploiden Proben aufgrund des hohen Heterozygotiegrads der SP-A-Gene oftmals sowohl in Exon 1 als auch in Exon 4 zwei verschiedene Sequenzen vorliegen, ist es bei der hohen Zahl zu unterscheidender Muster sehr schwer, die in der Regel in Form von vier Banden im Gel sichtbaren Einzelstränge (beide werden in einen sense und einen antisense-Strang aufgetrennt) einer bekannten allelischen Variante zuzuordnen, selbst wenn diese wie in Abbildung 4-11 und Abbildung 4-12 in demselben Gel aufgetrennt wird. Die Spezifität bei der Entdeckung unbekannter Polymorphismen wird durch das Auftreten zusätzlicher nicht informativer Banden aufgrund von irrelevanten Polymorphismen im Intron oder der Bildung von Heteroduplexen aus den nicht vollständig komplementären Sequenzen beider Allele stark eingeschränkt.

Die Untersuchung des gesamten Patientenkollektivs auf die beiden hier erstmals beschriebenen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen im SP-A1-Gen wurde im Falle der Substitution 3138T>C infolge des unvollständigen DNA-Verdaus durch die Endonuklease NdeI erschwert, so dass die Sequenzierung der entsprechenden Sequenzen wahrscheinlich zuverlässigere Ergebnisse liefert (alpha = 0,10 beim Vergleich der Häufigkeiten nach beiden Methoden in Tabelle 4-7 ).

5.2 Allelische Varianten des SP-A

Die Existenz weiterer Polymorphismen in den SP-A-Genen wurde durch die DNA-Sequenzierung belegt. Das Vorliegen der Polymorphismen in neuen Kombinationen erlaubte die Charakterisierung bisher unbekannter Allele bei mehreren Patienten, so dass die genetische Variabilität des SP-A höher scheint als bisher angenommen. Der Vergleich der beobachteten Allelfrequenzen mit Literaturdaten zeigt, wie wichtig die exakte Auswahl einer großen Zahl von Patienten ist, um eine Assoziation zwischen SP-A-Genotyp und Phänotyp nachzuweisen.


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5.2.1 Die Existenz weiterer Polymorphismen in den SP-A-Genen

Im SP-A1-Gen wurden zwei neue polymorphe Genorte entdeckt. In Codon 39 und 184 gibt es jeweils eine Transition der Base des dritten Nukleotids von Cytosin nach Thymidin und umgekehrt ohne Einfluss auf die Aminosäuresequenz. Der Polymorphismus 1162C>T in Exon 1 wurde als konstantes Allel 6a6 des Haplotyps [1162C>T + 1193G>C] in der untersuchten Familie vererbt und ist mit einer bei Mitarbeitern wie Patienten beobachteten Allelfrequenz von etwa 11 % eine recht häufige Variante (alpha = 0,90 in Tabelle 4-5 ). Obwohl keine homozygoten Träger gefunden wurden, folgt die Verteilung der Genotypen dem Hardy-Weinberg-Gesetz (alpha = 0,45 in Tabelle 4-6 ), die Aminosäuresequenz entspricht Allel 6a2. Der Polymorphismus 3138T>C in Exon 4 wurde ebenfalls bei 11 % der Untersuchten detektiert. Obwohl keiner der untersuchten Mitarbeiter Träger von 3138T>C war, wurde der Unterschied zur Patientengruppe nicht signifikant (alpha = 0,28). Vergleicht man die Zahl der durch DNA-Sequenzierung nachgewiesenen Träger mit den Ergebnissen der RFLP-Analyse, zeigt sich eine methodisch bedingte Diskrepanz (3,6 % versus 15,9 %; alpha = 0,10 in Tabelle 4-7 ). Trotz falsch positiv Heterozygoter in der RFLP-Analyse ist in der kleinen Population keine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Gesetz nachweisbar (alpha = 0,35 in Tabelle 4-8 ). Wahrscheinlich ist Allel 6a#, dessen Haplotyp nicht exakt bestimmt werden konnte (entweder [1193G>C + 3138T>C] oder [1193G>C]) und dessen Aminosäuresequenz der von Allel 6a2 oder 6a3 entspricht, ebenfalls konstant mit niedriger Allelfrequenz in der Bevölkerung vorhanden.

Der Nachweis des Polymorphismus Val50Leu in den SP-A2-Genen zweier Patienten (bisher nur in SP-A1 beobachtet) ist ein Beleg für die Existenz von einem Allel 1a* des Haplotyps [1098A>C + 1220G>C], das ein SP-A2-Molekül mit veränderter Primärstruktur kodiert. Mit einer beobachteten Allelfrequenz von nahezu 8 % ist es keine seltene Variante ( Tabelle 4-3 ). Da es in zwei Proben nicht verwandter Patienten auftaucht, scheint es keine Spontanmutation zu sein. Eine Ursache, warum es bisher nicht in der Literatur beschrieben wurde, könnte die Verwendung des mit der Wildtypsequenz “GTC“ in Codon 50 hybridisierenden Oligonukleotids (“Oligo 96“ in den Arbeiten von Floros et al.) als Markermolekül für SP-A2-Sequenzen sein. Da dieses zu den DNA-Basen 1185_1201 des SP-A1-Gens beziehungsweise 1212_1228 des SP-A2-Gens komplementäre Oligonukleotid nicht an Sequenzen mit der G>C-Substitution hybridisiert, würden diese nicht als SP-A2-Allele erkannt und im ungünstigsten Fall von der Analyse ausgeschlossen. In der Studie von Floros et al. von 1996, deren Ergebnisse Tabelle 5-2 zeigt, kamen nur 490 SP-A2-Allele zur Auswertung, das sind 6,8 % weniger als die 526 SP-A1-Allele. Ob diese allelische Variante klinische Bedeutung hat, wird in Abschnitt 5.3.1 diskutiert.


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5.2.2 Charakterisierung bisher unbekannter Allele

Zusätzlich zu dem durch neue Polymorphismen definierten Allel 1a*, Allel 6a* und Allel 6a7 konnten zwei weitere Allele des SP-A2-Gens beschrieben werden. Die genetische Variabilität kommt durch die wechselnde Verbindung einzelner polymorpher Genorte zustande ( Floros et al. 1996). Das bei zwei Patienten gefundene Allel 1a# des Haplotyps [3018C>T] unterscheidet sich nur durch die aus den Allelen 1a1 und 1a3 bekannte “stille“ Einzelbasensubstitution in Codon 140 vom Wildtypallel 1a0. Das bei Patient 12 beobachtete Allel1a7 zeichnet sich durch die sonst in keinem Allel beobachtete Verbindung aller Einzelbasensubstitutionen aus. Bei der DNA-Gewinnung war der sehr geringe Gehalt an Leukozytensediment aufgefallen. Angesichts der Leukämie des Patienten kann es sich um eine somatische Mutation der Leukozyten-DNA handeln, die die hereditäre DNA der Leukozyten mengenmäßig verdrängte. Diese Erklärung für das homozygote Auftreten der weniger häufigen Substitutionen 1649G>C und 3265C>A bei diesem Patienten macht die in Tabelle 4-12 berechneten Abweichungen der kleinen Patientengruppe vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht plausibel. Auch die in der Literatur einmal beschriebenen Allele 1a4 und 6a5 waren homozygot in der Zelllinie eines Adenokarzinoms beobachtet worden ( Karinch et al. 1998).

5.2.3 Vergleich der beobachteten Allelfrequenzen mit Literaturdaten

Da bei den 14 Patienten, deren SP-A Genotypen bestimmt wurden, verschiedene Diagnosen den Verdacht auf einen Surfaktantproteindefekt begründeten, sind die hier erhobenen Daten nicht geeignet, eine Korrelation mit einem bestimmten Phänotyp herzustellen. Bei der weiteren Untergliederung in drei Gruppen von sieben Patienten mit Alveolarproteinose , vier Neugeborenen mit Atemnotsyndrom ( RDS ) und drei Säuglingen mit rezidivierender Pneumonie wären die einzelnen Zahlen zu klein für eine statistische Auswertung. Aus dem Vergleich der in unserem heterogenen Patientenkollektiv bestimmten Allelfrequenzen mit den von Floros et al. 1996 in einem ebenso heterogenen, aber weitaus größeren Kollektiv ermittelten Daten kann jedoch die Größe der Population geschätzt werden, in der die hier beobachteten Abweichungen signifikant würden. Die Zahlen der neuen Allele 6a* und 6a# wurden zu der Anzahl des am nächsten verwandten Allels 6a3 addiert (das zweite SP-A1-Allel von Patient 15 wurde als 6a2 gezählt). Ebenso wurden die Zahlen von Allel 1a0 und 1a# addiert. Bei der von Floros et al. angewandten Oligohybridisierung konnten die hier beschriebenen Einzelbasensubstitutionen, die diese Allele von den bekannten unterscheiden, nicht auffallen ( Floros und Hoover 1998). Die nur in Einzelfällen beobachteten Allele 6a5, 1a4 und 1a§ werden nicht bei der Berechnung der


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Allelfrequenzen berücksichtigt, da es noch keine Anhaltspunkte dafür gibt, dass es sich um konstant weitervererbte Allele handelt.

Tabelle 5-2: Vergleich der Allelfrequenzen und erforderliche Stichprobengröße im Vorzeichentest
Die Allelfrequenz q ist hervorgehoben; alpha ist die im Chi-Quadrat-Test errechnete Signifikanz.
n‘ ist der nötige Stichprobenumfang, um Signifikanz (alpha le 0,05) mit einer power von 80 % zu erreichen.
n1 & n2 ist der nötige Stichprobenumfang von zwei gleich großen Populationen im direkten Vergleich.

SP-A1-Allele

Scholz (n=28)

Floros 1996 (n=526)

alpha

n‘

n1 & n2

6a

3,6 (0,1-18,3) %

9,3 (7,0-12,1) %

0,30

122

259

6a2

57,1 (37,2-75,5) %

54,4 (50,0-58,7) %

0,77

1990

4046

6a3 (+ 6a* + 6a#)

35,7 (18,6-55,9) %

27,8 (24,0-31,8) %

0,36

206

447

6a4

3,6 (0,1-18,3) %

8,6 (6,3-11,3) %

0,35

153

322

SP-A2-Allele

Scholz (n=24)

Floros 1996 (n=490)

alpha

n‘

n1 & n2

1a0 (+ 1a#)

50,0 (29,1-70,9) %

56,5 (52,0-61,0) %

0,53

359

751

1a

4,2 (0,1-21,1) %

12,0 (9,3-15,3) %

0,24

80

172

1a1

8,3 (1,0-27,0) %

21,6 (18,1-25,5) %

0,12

47

103

1a2

16,7 (4,7-37,4) %

9,0 (6,6-11,9) %

0,21

104

259

1a3

12,5 (2,7-32,4) %

0,8 (0,2-2,1) %

< 0,001

(14)

72

1a*

8,3 (1,0-27,0) %

0,0 (0,0-0,6) %

< 0,001

(8)

93

Bei den SP-A1-Allelen war keine signifikanten Abweichung von in der Literatur angegebenen Häufigkeiten zu beobachten, die alle innerhalb der hier bestimmten 95 %-Konfidenzintervalle liegen. Auch bei den häufigeren SP-A2-Allelen wurde selbst eine scheinbare Verringerung der Allelfrequenz auf weniger als die Hälfte wie bei Allel 1a1 mit alpha = 0,12 in Tabelle 5-2 nicht signifikant. Um die Differenz der für 1a1 berechneten Allelfrequenz von q ap 8,3 (1,0 - 27,0) % zum Literaturwert von q = 21,6 % mit einer power von 1 - beta ge 80 % signifikant nachzuweisen, müssten mindestens n‘ = 47 Allele untersucht werden. Wenn zwei gleich große Gruppen von Patienten und Kontrollpersonen verglichen werden sollten, wären in jeder Gruppe n1 & n2 = 103 Allele, zusammen also mehr als 100 Probanden nötig. Nur das seltene Allel 1a3, mit q < 1% definitionsgemäß eine Mutation ( Floros und Hoover 1998), wurde trotz der niedrigen Zahl der Patienten mit q ap 2,7 - 32,4 % signifikant häufiger beobachtet (alpha < 0,001). Das in den Arbeiten von Floros et al. nicht detektierte Allel 1a* wurde mit q ap 1,0 - 27,0 % natürlich ebenfalls signifikant häufig beobachtet (alpha < 0,001). Die mögliche Bedeutung einzelner allelischer Varianten für ihre Träger wird in Abschnitt 5.3.1 diskutiert.

Aus den in der Literatur veröffentlichten Allelfrequenzen lässt sich auf die Häufigkeit der in den entsprechenden Studien beobachteten Polymorphismen innerhalb der SP-A-Gene zurückrechnen.


72

Wie aus Tabelle 1-2 und Tabelle 1-3 ersichtlich, entspricht die Allelfrequenz 6a der Häufigkeit des Polymorphismus 1101T>C, Allelfrequenz 6a4 entspricht der Frequenz von 3241C>T, die Häufigkeit von 1544A>G ist die Summe der Allelfrequenzen 6a + 6a4 und die Häufigkeit von 1193G>C im SP-A1-Gen ist die Summe aller Allelfrequenzen minus dem Wildtypallel 6a2. Im SP-A2-Gen entspricht die Allelfrequenz 1a der Häufigkeit der Substitution 1649G>C, die Häufigkeit von 3265C>A ergibt sich als Summe der Allelfrequenzen 1a1 + 1a3, die Frequenz von 3018C>T als Summe der Allelfrequenzen 1a1 + 1a3 + 1a# und die von 1098A>C als Summe der Allelfrequenzen 1a + 1a1 + 1a2 + 1a4. Die Substitutionen 1162C>T und 3138T>C im SP-A1- und 1220G>C im SP-A2-Gen wurden von Floros et al. nicht beschrieben. Die bei Patient 4 und 12 beobachteten Polymorphismen, bei denen lediglich die korrekte Bestimmung des Haplotyps unmöglich war, wurden in Tabelle 5-3 mitgezählt. Trotz auffälliger Abweichungen in der Häufigkeit einzelner Polymorphismen war die Zahl der untersuchten Allele zu gering. Erst bei Analyse von mindestens 63 Allelen, also etwa allen 31 Patienten, würde bei gleichbleibender Häufigkeit die Abweichung am polymorphen Genort Codon 62 mit einer der power von 1 - beta ge 80 % entsprechenden Wahrscheinlichkeit signifikant.

Tabelle 5-3: Vergleich der Häufigkeit einzelner Polymorphismen und erforderliche Stichprobengröße
Die Frequenz q des Polymorphismus ist hervorgehoben; die Signifikanz alpha wurde im Chi-Quadrat-Test errechnet.
n‘ ist der nötige Stichprobenumfang, um Signifikanz (alpha le 0,05) mit einer power von 80 % zu erreichen.
n1 & n2 ist der nötige Stichprobenumfang von zwei gleich großen Populationen im direkten Vergleich.

SP-A1-Varianten

Scholz (n=28)

Floros 1996 (n=526)

alpha

n‘

n1 & n2

1101T>C (Val19Ala)

3,6 (0,1-18,3) %

9,3 (6,9-12,1) %

0,30

122

259

1193G>C (Val50Leu)

42,9 (24,5-62,8) %

45,6 (41,3-50,0) %

0,77

1990

4046

1544A>G (62Pro)

7,1 (0,9-23,5) %

17,9 (14,7-21,4) %

0,14

63

135

2985A>G (133Thr)

3,6 (0,1-18,3) %

9,3 (7,0-12,1) %

0,30

122

259

3241C>T (Arg219Trp)

3,6 (0,1-18,3) %

8,6 (6,3-11,3) %

0,35

153

322

SP-A2-Varianten

Scholz (n=28)

Floros 1996 (n=490)

alpha

n‘

n1 & n2

1098A>C (Asn9Thr)

42,9 (24,5-62,8) %

42,7 (38,2-47,2) %

0,98

363250

727624

1649G>C (Ala91Pro)

10,7 (2,3-28,2) %

12,0 (9,3-15,3) %

0,83

3598

7235

3018C>T (140Ser)

35,7 (18,7-55,9) %

22,4 (18,8-26,4) %

0,11

68

159

3265C>A (Gln223Lys)

28,6 (13,2 - 48,7) %

22,4 (18,8-26,4) %

0,45

304

659

Beim Vergleich von Allelfrequenzen ist die Abstammung der Patienten zu beachten ( Floros und Hoover 1998). Rishi et al. beobachteten 1992 mit H = 18,6 versus 49,3 % eine signifikante Verminderung Heterozygoter bei Individuen indogermanischer (caucasian) Abstammung am einzigen damals als polymorph bekannten Genort Codon 50 im SP-A1-Gen (P(chi12>chi2) < 0,001 in Tabelle 5-4 ), die von Krizkova et al. 1994 in einer größeren Population nicht reproduziert wurde. Die bei Angehörigen der Ibo und Yoruba in Nigeria mit H = 21,0 versus 30,5 %


73

beobachtete Verminderung Heterozygoter (P(chi12>chi2) = 0,016) wurde angesichts der verringerten Allelfrequenz (q = 18,5 versus 32,9 % mit alpha = 0,006) durch einen Gründereffekt (founder effect) erklärt, da sie bei in den USA lebenden Afrikanern nicht auftrat. Bei letzteren war die Allelfrequenz sogar erhöht (q = 51,3 versus 32,9 % mit alpha = 0,006), nicht jedoch bei den Afrikanern in einer späteren Studie ( Kala et al. 1998). Kleine Populationen sind nicht im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht, da die spontane Gendrift verhindert, dass der als founder effect bezeichnete Beitrag eines Allels durch Vermischung kompensiert wird ( Sperlich 1988). Die Häufigkeit des Polymorphismus 1193G>C im SP-A1 bei unseren Patienten indogermanischer Abstammung entspricht mit q = 42,9 % versus 47,7 % der von Kala et al. an Individuen gleicher Abstammung ermittelten (alpha = 0,64). Über die anderen polymorphen Genorte lagen keine entsprechenden Daten vor.

Tabelle 5-4: Häufigkeit des Polymorphismus 1193G>C (Val50Leu) im SP-A1-Gen mit 95 %-Konfidenzintervall
Die Signifikanz alpha wurde jeweils gegen die indogerm. Population, bei * gegen die gesunden Individuen indogerm. Abstammung von Kala et al. getestet. Die Proportion Heterozygoter h wurde mit dem erwarteten Heterozygotiegrad Het verglichen. Die Konkordanz P(chi12>chi2) mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz wurde im Chi-Quadrat-Test berechnet.

Studie

Abstammung

n

q [%]

alpha

H [%]

h [%]

P(chi12>chi2)

Rishi

Indogermanisch

86

41,9 (31,3-53,0)

 

18,6 (8,4 - 33,4)

49,3

<0,001

1992

Nigerianisch

40

37,5 (22,7-54,2)

0,64

35,0 (15,4 - 59,2)

48,1

0,26

Krizkova

Indogermanisch

164

32,9 (25,8-40,7)

 

43,9 (33,0 - 55,3)

44,4

0,96

1994

Nigerianisch

124

18,5 (12,1-26,5)

0,006

21,0 (11,7 - 33,2)

30,5

0,016

 

Afrikanisch

78

51,3 (39,7-62,8)

0,006

35,9 (21,2 - 52,8)

50,6

0,08

Kala

Indogermanisch

172

47,7 (40,4-55,4)

 

keine Genotypen

 

 

1998

Afrikanisch

24

54,2 (32,8-74,4)

0,55

veröffentlicht

 

 

Scholz

Indogermanisch

28

42,9 (24,5-62,8)

*0,64

42,9 (17,7 - 71,1)

50,8

0,64

5.3 Nutzen der Analyse der SP-A-Gene

Assoziationsstudien können ein wichtiges Werkzeug sein, um postulierte genetische Einflüsse auf die Ätiologie multifaktorieller Erkrankungen aufzudecken. Der Effekt allelischer Varianten auf die Funktion des SP-A ist bisher wenig untersucht, jedoch könnten Parallelen zum homologen mannosebindenden Lektin (MBL) im Serum bestehen. Bei entsprechenden Patienten könnte das Überwiegen bestimmter SP-A-Genotypen als Risikofaktor für frühkindliche Pneumonien demonstriert werden. Der Heterozygotenvorteil ist an den Besitz von zwei ungleichen Allelen gebunden und könnte das häufige Auftreten der weniger aktiven genetischen Variante in der Normalpopulation erklären. Der ungewöhnlich hohe


74

Informationsgehalt der SP-A1-SP-A2-Haplotypen macht den Genort sftp1 zu einem nützlichen genetischen Marker.

5.3.1 Der Effekt allelischer Varianten auf die Funktion des SP-A

Die genetische und strukturelle Homologie des SP-A in der Lunge zum MBL im Serum scheint sich auch auf die funktionelle Ebene zu erstrecken. Die mögliche Wirkung der in bestimmten Patientenproben beobachteten Aminosäuresubstitutionen in SP-A1 und SP-A2 auf die Struktur und Funktion des SP-A soll unter diesem Blickwinkel diskutiert werden.

Auf die ähnliche Funktion und den gemeinsamen phylogenetischen Ursprung von SP-A und MBL deutet neben der strukturellen Übereinstimmung ( Drickamer et al. 1986) auch die in Abbildung 1-1 bereits skizzierte Anordnung ihrer Gene nahe dem des zweiten hydrophilen Surfaktantproteins SP-D (sftp3) auf dem langen Arm von Chromosom 10 hin ( Kölble et al. 1993). Sie alle werden als Kollektine bezeichnet, da sie einen Stiel aus aneinander gebundenen Tripelhelices (kollagenartige Domäne) besitzen, auf denen globuläre Domänen sitzen, die die hochkonservierte Kohlehydraterkennungsregion (carbohydrate recognition domain, CRD) enthalten, welche die spezifische Bindung an Oligosaccharide (Lektinaktivität) vermittelt. Hier befinden sich, durch die bereits in Abbildung 1-3 skizzierten Disulfidbrücken zwischen 224Cys und 238Cys sowie 155Cys und 246Cys räumlich stabilisiert, zehn invariante Aminosäuren von denen wenigstens vier an der Komplexbildung mit Mannose und einem Kalziumion beteiligt sind, wie mit Hilfe von röntgenspektografischen Messungen beim MBL gezeigt werden konnte. Beim SP-A sollen die entsprechenden Aminosäuren 215Glu, 222Glu, 234Asn und 235Asp diese Funktion übernehmen. Auch die Bindung an Typ-II-Pneumozyten, die Regulation des Surfaktanthaushalts sowie die Fähigkeit zur Lipidaggregation können durch Austausch einer dieser Aminosäuren gegen Alanin unterbunden werden ( McCormack 1998). Beim Austausch der Aminosäuren 214Gly234Asn gegen die entsprechende Domäne des MBL wurden anstelle der SP-A-spezifischen Bindung an Typ-II-Pneumozyten und Phospholipide Bindungsmuster des MBL ins chimäre Molekül eingeführt ( Chiba et al. 1999).

Eine Reihe der varianten Aminosäuresubstitutionen in SP-A1 und SP-A2 befinden sich in unmittelbarer Nachbarschaft zu den in Abbildung 5-1 und Abbildung 5-2 durch Sterne (*) gekennzeichneten Mannosebindungsstellen. Im SP-A1-Allel 6a4 (Arg219Trp) ist das zwischen den an der Mannosebindung beteiligten Aminosäuren 215Glu und 222Glu lokalisierte, basische Arginin durch das hydrophobe Tryptophan ersetzt. Dieser in der von Floros et al. untersuchten


75

Population mit einer Häufigkeit von 8,5 % seltenste Polymorphismus in den SP-A-Genen war in dem hier untersuchten Patientenkollektiv nur in einem Allel von Patient 37 zu detektieren. Bei diesem Erwachsenen mit idiopathischer Alveolarproteinose bestand darüber hinaus im SP-A2-Gen Homozygotie für die Substitution des zwischen der mannosebindenden Aminosäure 222Glu und der an der kleinen Disulfidschleife beteiligten Aminosäure 224Cys lokalisierten, hydrophoben Glutamins durch das basische Lysin (Gln223Lys). Dieser in den Allelen 1a1, 1a3 und 1a4 beobachtete Polymorphismus ist mit einer in der Literatur angegebenen Allelfrequenz von 22,4 % recht häufig. Homozygotie für Gln223Lys bestand ebenfalls bei Patient 34, einem Neugeborenen mit fataler “idiopathischer“ Alveolarproteinose, bei dem die “klassische“ kongenitale Alveolarproteinose (CAP) durch den Nachweis von SP-B in der BAL und die Analyse auf die bekannten Defekte sowohl des SP-B- als auch des GM-CSF-Rezeptorgens ausgeschlossen worden war, sowie bei Patient 12, bei dem genotypisch eine somatische Mutation der Leukozyten-DNA und phänotypisch das bei malignen hämatologischen Erkrankungen nicht ganz seltene sekundäre Auftreten der Alveolarproteinose als alternative Erklärung diskutiert werden kann. Bei Patient 34 hingegen lag der Polymorphismus als Bestandteil des mit einer in der Literatur veröffentlichten Frequenz von 0,9 % sehr seltenen Allels 1a3 vor. Falls dieses Allel außer Exon 1 (wie aus Tabelle 1-3 ersichtlich) auch die regulativen 5‘-UT-Sequenzen mit dem Wildtypallel 1a0 teilt, ließe sich spekulieren, dass es sich ebenso um ein schwach exprimiertes Allel handelt ( Karinch et al. 1997). Das seltene homozygote Auftreten eines Allels mit geringer mRNA-Expression und Kodierung eines möglicherweise strukturell veränderten Genprodukts könnte im Falle dieses Patienten die pathogenetisch noch wenig verstandene Alveolarproteinose zumindest mitverursacht haben. Der Polymorphismus Gln223Lys war ebenso auf einem Allel von Patient 4, einem älteren Kind mit idiopathischer Alveolarproteinose und einem Allel von Patient 7, einem Frühgeborenen mit konnataler Pneumonie beobachtet worden.

Abbildung 5-1: Lokalisation der allelischen Varianten im SP-A1 (erweitert nach Floros et al. 1996)
Die vier mannosebindenden Aminosäuren 215Glu, 222Glu, 234Asn und 235Asp sind mit einem * gekennzeichnet.


76

Patient 7 war abgesehen von der mit einer ausgeprägten Monozytose (22 % von insgesamt 17,5 Leukozyten/nl) einhergehenden konnatalen Pneumonie, die schlecht auf antibiotische Therapie ansprach, phänotypisch wenig auffällig. Der Genotyp jedoch war durch das Vorliegen der Substitution des hydrophoben Valin im achten Kollagentriplett durch die ein Kohlenstoffatom längere, verwandte Aminosäure Leucin (Val50Leu) in beiden SP-A-Genen in heterozygoter Ausprägung gekennzeichnet. (Die Vermischung der Sequenzen beider Gene wurde wie in Abschnitt 5.1.4 erläutert ausgeschlossen.) Auch Patient 10, ein Neugeborenes mit schwerem RDS , bei dem in einer BAL eine niedrige Konzentration von SP-A ermittelt worden war, war in beiden Genen heterozygot für Val50Leu. Die in Abschnitt 5.3.2 näher beschriebenen Mutationen des MBL befinden sich an vergleichbarer Lokalisation und stören durch den Austausch der für die Tripelhelixbildung obligaten Aminosäuren (Glycin) ohne gegen solche mit Seitenketten oder den Einbau einer Thiolgruppe (Substitution von Cystein) die Kollagenstruktur. Analoge Mutationen in den Kollagengenen sind Ursache der gestörten Kollagenbildung beim Ehlers-Danlos-Syndrom oder der Osteogenesis imperfecta ( Prockop 1985). Bei homozygoten Trägern einer Mutation im MBL werden ebenso wie bei kombiniert Heterozygoten (compound heterozygous) niedrige Serumkonzentrationen gemessen, da die Bildung intakter Oktadekamere gestört ist ( Lipscombe et al. 1995). Homozygot für Val50Leu im SP-A1-Gen waren außer Patient 37 (dem bereits erwähnten Erwachsenen mit idiopathischer Alveolarproteinose und Homozygotie für das seltene Allel 6a4) Patient 5 (ein Frühgeborenes mit kompliziertem, protrahiertem RDS) und Patient 6 (ein Neugeborenes mit fataler Alveolarproteinose, bei dem ebenfalls keiner der klassischen Gendefekte vorlag). Mit einer Häufigkeit von etwa 45 % im SP-A1- und immerhin 7 % im SP-A2-Gen ist Val50Leu die häufigste genetische Variante des SP-A überhaupt. Zwar ist eine massive Störung der Tripelhelixbildung durch diese Mutation unwahrscheinlich, doch könnte beispielsweise die Affinität der Bindung am Kollektinrezeptor der Phagozyten durch den Polymorphismus beeinflusst werden.

Abbildung 5-2: Lokalisation der allelischen Varianten im SP-A2 (erweitert nach Floros et al. 1996)


77

Für die übrigen Substitutionen, die den Austausch verwandter Aminosäuren betreffen, existieren keine Hinweise auf eine Beeinflussung der Struktur des Proteins. Im einundzwanzigsten Kollagentriplett des Allels 1a ist anstelle des in den anderen SP-A2-Allelen vorliegenden Alanins wie im SP-A1 die Aminosäure Prolin kodiert (Ala91Pro). Innerhalb der kollagenartigen Domäne gibt es zahlreiche Prolinmoleküle, die bei der Prozessierung hydroxyliert werden und in dieser Form für Wasserstoffbrückenbindungen zur Stabilisation der Tripelhelix zur Verfügung stehen ( McCormack 1998). In der Signalsequenz der SP-A2-Allele 1a, 1a1, und 1a2 ist Asparagin durch das ebenfalls hydrophile Threonin substituiert (Asn9Thr) und im SP-A1-Allel 6a Valin durch das ebenfalls hydrophobe Alanin (Val19Ala). Die “stillen“ Einzelbasen-Substitutionen ohne Einfluss auf die Primärstruktur sind aus den Abbildungen ersichtlich.

5.3.2 SP-A-Genotypen als Risikofaktor für frühkindliche Pneumonien

SP-A scheint Pathogene in der Lunge zu opsonisieren und so an der Aktivierung des Immunsystems beteiligt zu sein. Bei den Defektmutanten des MBL führen erst weitere Faktoren zur Manifestation des Opsonisierungsdefekts im Serum. Physiologischer IgG-Mangel bei Frühgeborenen und Säuglingen könnte einen mit bestimmten allelischen Varianten des SP-A assoziierten Opsonisierungsdefekt in der Lunge als Pneumonie offenbar werden lassen.

Die strukturell mit den Kollektinen verwandte Untereinheit C1q der ersten Komponente des Komplementsystems stellt ein Modell für die Aktivierung des Immunsystems durch Opsonine dar. Die globulären Domänen des C1q binden vernetzte Immunglobuline, während MBL und SP-A an entsprechend angeordnete Oligosaccharide oder andere in Abschnitt 1.1.4 genannte Oberflächenmarker binden. Wie Abbildung 5-3 zeigt, ist die kollagenartige Domäne aller drei Moleküle der Ligand für Kollektinrezeptoren (cC1qR und cC1qRp) auf Monozyten und Makrophagen ( Malhotra et al. 1992 und Nepomuceno et al. 1997), die die Phagozytose anregen. Die mit dem MBL assoziierte Serinprotease (MASP) aktiviert ebenfalls das Komplementsystem.

Super et al. erkannten 1989 den MBL-Mangel als Ursache eines 1968 erstmals beschriebenen Opsonisierungsdefekts im Serum, der vor allem bei Kindern durch Mittelohrentzündungen, rezidivierende Infektionen der Atemwege, Diarrhöe und atopische Erkrankungen auffällt ( Garred et al. 1996) und selbst Erwachsene zu Infektionen mit sonst von MBL opsonisierten Erregern disponiert ( Summerfield et al. 1995). Mutationen in der kollagenartigen Domäne des MBL wie die Substitution von Glycin durch Asparaginsäure in Codon 54 (Gly54Asp, Sumiya et al. 1991), durch Glutaminsäure in Codon 57 (Gly57Glu, Lipscombe et al. 1992) oder von Arginin in


78

Codon 52 durch Cystein (Arg52Cys, Madsen et al. 1994) stören die Tripelhelixbildung.

Abbildung 5-3: Vergleich der Opsonisierung von Krankheitserregern durch C1q, MBL und SP-A
Der cC1q-Rezeptor (auf Monozyten und Makrophagen) bindet die kollagenartige Domäne des C1q und der Kollektine. Die mit dem MBL assoziierte Serinprotease (MASP) aktiviert Komplement auf dem Lektinweg.


79

Bei den defekten MBL-Mutanten erfolgt trotz Bindung an Krankheitserreger keine Aktivierung des Komplementsystems über die MASP ( Matsushita et al. 1995). Der Opsonisierungsdefekt wird bei Hinzutreten anderer Immundefekte klinisch manifest. Die MBL-Mutationen wurden häufiger bei Mangel an Immunglobulin G der Subklasse 3 (IgG3) beobachtet ( Garred et al. 1996), welches insbesondere der Neutralisation von Viren dient. Da C1q nicht an IgG4 und nur schwach an IgG2 bindet ( Reid 1996), sind beim kombinierten Defekt MBL- und C1q-vermittelte Aktivierung von Komplement beeinträchtigt. Auch ein isolierter, selektiver IgA-Mangel verursacht selten typische Infektionen ( Tosi und Cates 1998). Erst das Fehlen eines Komplementfaktors (isolierter Mangel an C1q, C2 und C3, Densen 1995) oder der selektive Mangel an IgG2 ( Fassano et al. 1990), das eine besondere Affinität für Polysaccharidantigene zeigt, vermag die Elimination kapseltragender Bakterien wie Meningokokken, Pneumokokken und Haemophilus influenzae ernsthaft zu beeinträchtigen.

Physiologischer IgG-Mangel besteht nach Verlust der transplazentar übertragenen Antikörper im Alter von 6 - 24 Monaten. In den ersten drei Monaten fällt der Serumspiegel auf unter 40 % ab. Die frühe Synthese von IgG3 kann den Verlust nicht ausgleichen. Erst die Bildung von IgG1, das stärker an Proteinantigene bindet, führt zum Anstieg der Serumspiegel. Mit acht Monaten findet ein Subklassenwechsel zugunsten von IgG2 statt. Mit zwei Jahren erreicht die Aktivität dieses wichtigen Opsonins das Niveau Erwachsener. Auch die Komplementaktivität beträgt bei Geburt nur 50 - 70 % der Werte Erwachsener. Und obwohl die klassische Komplementkaskade (mit Aktivierung über C1q) bereits im Alter von drei bis sechs Monaten volle Aktivität erreicht, ist der alternative Weg (bei dem Endotoxine der Bakterien direkt C3 aktivieren) erst zu Beginn des zweiten Lebensjahres ausgereift ( Ferriani et al. 1990). Streptokokken der Serogruppe A und B, Haemophilus influenzae Typ b, Escherichia coli, Pneumokokken, Meningokokken und Salmonellen, die alle die Komplementkaskade nicht auf dem alternativen Weg aktivieren, verursachen in diesem Alter die meisten Infektionen ( Joiner 1988). Da auch die Abwehrzellen in den ersten Lebensjahren eine verminderte Chemotaxis und eingeschränkte Bakterizidie aufweisen und die Kapazität zur Bildung von Neutrophilen im Knochenmark noch gering ist, stellen Bakteriämien, Pyodermie und Pneumonie häufige Probleme dar ( Tosi und Cates 1998).

In den ersten beiden Lebensjahren erkranken jährlich etwa 40 von 1.000 Kindern an einer Pneumonie. Die häufigsten Erreger sind Viren, die entweder eine akute Bronchiolitis oder eine Bronchopneumonie auslösen. Die meisten bakteriellen Pneumonien im ersten Lebensjahr werden durch Haemophilus influenzae Typ b verursacht, einen nicht von SP-A opsonisierten Erreger ( McNeely und Coonrod 1994). Infektionen mit Typ a, c oder d, gegen die sich die opsonisierende Aktivität von SP-A richtet ( van Iwaarden et al. 1994), sind selten.


80

Pneumokokken sind bei älteren Kindern häufiger, Streptokokken der Serogruppe A und Staphylococcus aureus treten eher als bakterielle Superinfektion auf und können Pneumatozelen bilden ( Klein 1998). Ein relativer SP-A-Mangel wurde bei Infektionen mit grampositiven Erregern gezeigt ( Baughman et al. 1993). Wie in Tabelle 1-1 aufgeführt, opsonisiert SP-A neben Haemophilus influenzae Typ a auch Pneumokokken und Staphylococcus aureus ( McNeely und Coonrod 1993), Streptokokken der Serogruppen A ( Tino und Wright 1996) und B ( Korfhagen et al. 1998), sowie einige Escherichia coli- ( van Iwaarden et al. 1994) und Klebsiella-Stämme ( Kabha et al. 1997). Letztere verursachen bei Kindern, deren Immunabwehr beeinträchtigt ist, ernste Pneumonien ( Klein 1998). Auch Erreger atypischer Pneumonien wie Herpes simplex-Viren ( van Iwaarden et al. 1991) und Aspergillus fumigatus ( Madan et al. 1997a) werden von SP-A opsonisiert.

5.3.3 Der Heterozygotenvorteil

Der Nachweis einer Assoziation des häufigsten SP-A2-Allels 1a0 mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung des RDS bei Neugeborenen ab der 29. SSW ( Kala et al. 1998) und die Hinweise auf eine schwache Expression von mRNA durch dieses Allel ( Karinch et al. 1997) führten zur Annahme eines Heterozygotenvorteils, der die Nachteile für Träger dieses Allels im Neugeborenenalter auf einer anderen Ebene kompensiert ( Floros und Hoover 1998).

Das klassische Beispiel für einen solchen ausbalancierten Polymorphismus ist das Vorkommen des Sichelzellhämoglobins in Malariagebieten. Auch die zum MBL-Mangel führenden, mutierten Allele B, C und D des MBL-Gens unterliegen innerhalb von in den Tropen angesiedelten Populationen einem Selektionsvorteil. Bei Afrikanern beträgt die Häufigkeit aller drei mutierten Allele zusammen etwa 30 % versus 20 % bei Individuen indogermanischer Abstammung (Caucasian, Lipscombe et al. 1996). Möglicherweise mildert die relative Verminderung der MBL-vermittelten Opsonisierung bei heterozygoten Trägern in den Tropen häufiger auftretende parainfektiöse Komplikationen wie zum Beispiel das durch Komplementaktivierung ausgelöste Waterhouse-Friedrichson-Syndrom bei Meningokokkensepsis, wie es von Defekten des Komplementsystems bekannt ist ( Ross und Denson 1984). Gestützt wird diese Hypothese durch die Verteilung der Promotervarianten, deren mit einer hohen Expression von mRNA assoziierte (high expression) Variante in Afrika eine Häufigkeit von 8 %, bei Individuen indogermanischer Abstammung aber 33 % erreicht ( Madsen et al. 1995). Auch die Konzentrationen von IgG der Subklassen 2, 3 und 4 sind bei Afrikanern niedriger ( Wasserman und Sorensen 1999).


81

Beim SP-A mit seinen vielfältigen Aufgaben im Surfaktanthaushalt und bei der Abwehr von Krankheitserregern müssen diverse Einflüsse selektiv auf die verschiedenartigen allelischen Varianten einwirken. Das Vorliegen zweier unabhängig regulierter Kopien des SP-A-Gens mit mehreren allelischen Varianten erleichtert die Reaktion des SP-A-Genotyps auf Veränderungen der Umwelt im Sinne genetischer Ökonomie (parsimony, Floros und Hoover 1998).

5.3.4 Informationsgehalt der SP-A1-SP-A2-Haplotypen

Der SP-A-Genort sftp1 scheint einen der unregelmäßig im Genom verteilten mutation hotspots darzustellen ( Kölble et al. 1993). Aus den beobachteten Verbindungen einzelner Varianten lassen sich SP-A1-SP-A2-Haplotypen berechnen, die Information über regulative Elemente beinhalten. Ihr hoher Gehalt an Polymorphismusinformation ( PIC ) macht die SP-A-Gene zu wertvollen genetischen Markern bei der Analyse von Störungen des Surfaktantsystems selbst und der Lokalisation anderer defekter Gene auf demselben Chromosom in einer Kopplungsanalyse.

Genorte, an denen so häufig wie in den SP-A-Genen Polymorphismen beobachtet werden, nennt man mutation hotspots. In der Mehrzahl handelt es sich um C-T- oder T-C-Transitionen, die in vielen Genen regelmäßig als Neumutationen vorkommen. Wenn sie Einfluss auf die Proteinsequenz haben, können sie wie die zahlreichen Mutationen im Keratin 9-Gen hereditäre Erkrankungen wie die epidermiolytische Palmoplantarkeratose verursachen ( Reis et al. 1994). Der Polymorphismus 3018C>T in Codon 140 des SP-A2-Gens war bei der Sequenzierung der Allele 1a1 und 1a3 aufgefallen ( Floros et al. 1996). Wir fanden den Polymorphismus in einigen Allelen mit der Wildtypsequenz und definierten das neue Allel 1a# des SP-A2-Haplotyps [3018T>C]. Die neuen Polymorphismen 1162C>T und 3138T>C in Codon 39 und 184 des SP-A1-Gens sind ebenfalls C-T-Transitionen. Die bei der Amplifikation der DNA in vitro entstandenen Polymerasefehler waren oftmals in oder nahe der polymorphen Codons in den SP-A-Genen lokalisiert. So hat Klon 6.1 eine T-C-Transition in Codon 50 und Klon 8.2 die C-T-Transition in Codon 39 (beide hervorgehoben in Tabelle 4-13 ). Außerdem wurden bei Klon 8.8 eine A-G-Transition in Codon 51 und bei Klon 6.7 in Tabelle 4-16 zwei G-C-Transitionen in Codon 72 beobachtet. Lin et al. zeigten 1998, dass die häufigste mit hereditärem SP-B-Mangel verbundene Mutation 121ins2 und eine weitere Leserastermutation 122delT (g.2592delT) in einer als mutation hotspot bekannten Sequenz des SP-B-Gens liegen (g.2587_2593CCCCCTG), die durch das Motiv “CCTG“ in einer Kette von Cytosinbasen (poly(C) tract) charakterisiert ist. Der hier beschriebene Polymorphismus 1162C>T liegt in einer cytosinreichen Sequenz des


82

SP-A1-Gens (1151_1168CCTGGATCCCACGGCCTG), in der zweimal das Motiv “CCTG“ vorkommt. Weitere Untersuchungen werden zu klären haben, ob es sich bei den beobachteten Polymorphismen in den SP-A-Genen um wiederkehrende Spontanmutationen oder konstant in der Population vorhandene allelische Varianten handelt ( Floros und Hoover 1998).

Tabelle 5-5: Geschätzte Häufigkeit der beobachteten Haplotypen (N = 12 diploide Proben)
Unterstrichene
Haplotypen erreichten in der Studie von Floros et al. 1996 (N = 239) statistische Signifikanz.
Durch neu beschriebene Allele definierte Haplotypen sind kursiv gesetzt.

Haplotyp

1a

1a0

1a1

1a2

1a3

1a*

1a#

6a

0,04

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

6a2

0,00

0,33

0,00

0,00

0,13

0,00

0,08

6a3

0,00

0,08

0,04

0,08

0,00

0,08

0,00

6a4

0,00

0,00

0,04

0,00

0,00

0,00

0,00

6a*

0,00

0,00

0,00

0,04

0,00

0,00

0,00

6a#

0,00

0,00

0,00

0,04

0,00

0,00

0,00

Da die beiden Kopien des SP-A-Gens am Genort sftp1 gekoppelt weitergegeben werden ( Floros et al. 1996), konnte aus den beobachteten Genotypen die Häufigkeit einzelner SP-A1-SP-A2-Haplotypen errechnet werden. Patient 4 wurde wegen des ungeklärten SP-A2-Genotyps und Patient 12 wegen des fraglichen Allels 1a§ ausgeschlossen. Von elf beobachteten Haplotypen gehören vier zu den bei Floros et al. signifikant häufigen, 6a2/1a0 ist mit 33 % in Tabelle 5-5 wie in der Literatur häufigsten. Am zweithäufigsten war bei unseren Patienten 6a2/1a3 anstelle 6a3/1a1 ( Karinch et al. 1997). Die indirekt aus den diploiden Proben ermittelten Haplotypen umfassen zusätzlich zur in Abschnitt 5.3.1 diskutierten Aminosäuresequenz die innerhalb der nichttranslatierten DNA lokalisierten, regulativen und strukturbildenden Elemente.

Tabelle 5-6: Grad der Heterozygotie und Gehalt an Polymorphismusinformation in den SP-A-Genen
*: wegen des fraglichen Genotyps 6a2/6a# oder 6a3/6a# bei Patient 15 wurden zwei Werte berechnet

Studie

Genort

n

h [%]

Het [%]

PIC

Scholz

SP-A1

28

57 (29 - 82) %

62 bzw. 65 %*

0,55 bzw. 0,57*

 

SP-A2

24

50 (21 - 79) %

79 %

0,73

Floros

SP-A1

526

63 (57 - 69) %

61 %

0,55

1996

SP-A2

490

50 (44 - 57) %

61 %

0,56

Aus den Zahlen der beobachteten Allele lassen sich der in der untersuchten Population vorherrschende Gehalt an Polymorphismusinformation (PIC) und Heterozygotiegrad (Het) berechnen. Die fraglich inkonstanten Allele 6a5, 1a4 und 1a§ gingen nicht in die Berechnungen


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in Tabelle 5-6 ein, da die Allele eines Markers nur dann informativ sind, wenn sie mit ausreichender Frequenz und Konstanz in der zu untersuchenden Population vorkommen. Für das SP-A1-Gen wurden zwei Berechnungen durchgeführt, bei denen für Patient 15 einmal der Genotyp 6a2/6a# und einmal der Genotyp 6a3/6a# angenommen wurde. Aufgrund der neu beschriebenen Allele des SP-A2-Gens ist der Heterozygotiegrad mit Het = 79 % versus 61 % und der PIC mit 0,73 versus 0,56 deutlich höher als die von Floros et al. 1996 ermittelten Werte. Im menschlichen Genom beträgt der PIC im Mittel 0,21 ( Sperlich 1988). Ab einem PIC von 0,50 oder einem Heterozygotiegrad von 70 % gelten genetische Marker als ausreichend informativ, um in betroffenen Familien eine Kopplung mit Krankheitsgenen an benachbarten Genorten nachzuweisen ( Ott 1992).

5.4 Ausblick

Die Anwendung der beschriebenen Methodik produzierte interessante Einzelergebnisse bei einigen Patienten mit idiopathischer Alveolarproteinose. Um das Vorliegen eines bestimmten SP-A-Genotyps als Risikofaktor für einen Surfaktantproteindefekt in einem größeren Patientenkollektiv signifikant zu belegen, sind genaue Kriterien für den Ein- und Ausschluss der Patienten nötig ( Floros und Hoover 1998). Das mögliche Design einer Assoziationsstudie soll am Beispiel des Phänotyps der frühkindlichen Pneumonie diskutiert werden.

5.4.1 Anwendung der beschriebenen Methodik

Die durch die Existenz von zwei Kopien des SP-A-Gens im menschlichen Genom bedingten Schwierigkeiten bei der Analyse der kodierenden DNA-Sequenzen wurden durch die Etablierung der nested PCR mit externen, zwischen SP-A1 und SP-A2 diskriminierenden Primern an beiden Enden des SP-A-Gens überwunden. Die hohe Zahl allelischer Varianten erschwert jedoch die Anwendung eines Suchtests (screening) wie der SSCP -Analyse, die unspezifisch auf jede Veränderung der DNA-Sequenz reagiert. Bisher verborgene Varianten wie die in Abschnitt 4.2.1 beschriebenen Polymorphismen fallen am ehesten bei der DNA-Sequenzierung auf ( Floros und Hoover 1998). Zwar ist die Analyse von isolierten Polymorphismen mit spezifischen Oligonukleotiden (ASPCR, LCR, SSO ) oder Restriktionsenzymen ( RFLP -Analyse) möglich. Aufgrund des geringeren Informationsgehalts isolierter Genorte sind dann allerdings größere Populationen erforderlich, um eine Assoziation


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zwischen Genotyp und Phänotyp signifikant zu belegen, wie ein Vergleich der erforderlichen Stichprobenumfänge in Tabelle 0-2 mit 72 bis 4.046 Allelen und Tabelle 0-3 mit 135 bis 727.624 Allelen andeutet. Da die zahlreichen Polymorphismen in den SP-A-Genen in wechselnden Kombinationen auftauchen, sind die vollständigen Haplotypen weitaus informativer, zu ihrer exakten Bestimmung wird jedoch oftmals die aufwendige DNA-Sequenzierung klonierter Sequenzen nötig sein.

5.4.2 Design einer Assoziationsstudie

Eine Assoziation zwischen Phänotyp und Genotyp erfordert den direkten Vergleich der in einer Patientengruppe ermittelten Allelfrequenzen mit denen einer Kontrollgruppe. Beide müssen derselben Population entstammen, da die Abstammung wie in Tabelle 5-4 die Allelfrequenzen beeinflusst. Aufgrund der genetischen Variabilität sind sehr große Populationen erforderlich, um Differenzen bei einzelnen Varianten statistisch signifikant nachzuweisen. Tabelle 5-2 und Tabelle 5-3 zeigen einige Rechenbeispiele. Je exakter der erwartete Phänotyp eingegrenzt werden kann, desto häufiger wird der gesuchte Genotyp beobachtet werden.

Als ein möglicher Ausdruck eines SP-A-Defekts wird wie in Abschnitt 5.3.2 bereits erläutert ein bei Säuglingen mit physiologischem IgG-Mangel klinisch manifester Opsonisierungsdefekt in der Lunge angesehen ( Haagsman 1998). Kinder bis zum Alter von 18 oder 24 Monaten sollten in die Analyse eingeschlossen, reife Neugeborene bis zum Alter von sechs Monaten jedoch ausgeschlossen werden. Frühgeborene könnten eine besondere Untergruppe bilden. Im allgemeinen lässt erst das Auftreten von zwei bakteriellen Pneumonien innerhalb von 3 Jahren eine Evaluation der humoralen Immunität erwägen ( Wasserman und Sorensen 1999). Da das Zeitfenster, in dem die spezifische Immunität reift, sich jedoch nach achtzehn Monaten schließt, wäre die Erstdiagnose einer ambulanten Pneumonie ein gutes Einschlusskriterium. Bei hospitalisierten Patienten bestehen oftmals Risikofaktoren, so dass Patienten mit nosokomialer Pneumonie eine besondere Untergruppe bilden könnten. Die diagnostischen Merkmale müssen dem Alter angepasst werden. Neugeborene entwickeln nicht immer typische Symptome, zu denen neben Atemnot (mit erhöhter Atemfrequenz, inspiratorischem Flattern der Nasenflügel, interkostalen Einziehungen und gegebenenfalls Zyanose) auch Fieber und Husten gehören. Die Zeichen in der Röntgenaufnahme des Thorax (alveoläre oder interstitielle Infiltration, hiläre Verdichtung, Atelektasen, Bronchopneumogramme und Hyperinflation) sind uneinheitlich und gestatten die Diagnose einer Infektion der unteren Atemwege ohne sichere Differenzierung zwischen Pneumonie und Bronchiolitis ( Davies et al. 1996). Der Nachweis von Erregern im


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Rachenabstrich oder Sputum ist nicht signifikant, die Blutkultur zu wenig sensitiv und eine bronchoalveoläre Lavage ( BAL ) zu invasiv. Rezidivierende virale Erkrankungen sollen nicht mit einem Immundefekt assoziiert sein ( Wasserman und Sorensen 1999), doch da sich die opsonisierende Aktivität des SP-A wie in Tabelle 1-1 gegen alle wichtigen Erreger kindlicher Pneumonien und auch gegen Viren richtet, mag man auf den Erregernachweis verzichten. Zur Unterscheidung zwischen viraler und bakterieller Genese könnte ansonsten neben der Bestimmung von Akut-Phase-Parametern wie C-reaktivem Protein, einer Leukozytose mit Linksverschiebung im Differentialblutbild und der Erythrozytensedimentationsrate das Interferon-alpha im Serum dienen ( Moulin et al. 1996). Nicht auf die Lunge beschränkte Infektionen mit pyogenen Bakterien und Pilzen weisen auf einen Defekt des phagozytären Systems hin ( Yang und Hill 1996) und wären ein sinnvolles Ausschlusskriterium.

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