Scholz, Dietmar: Analyse der Surfaktantprotein A-Gene bei Patienten mit Verdacht auf einen Surfaktantproteindefekt

Aus dem Otto-Heubner-Centrum für Kinder- und Jugendmedizin der
Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Analyse der Surfaktantprotein A-Gene bei Patienten mit Verdacht auf einen Surfaktantproteindefekt

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Herrn Dietmar Scholz ,
aus: Münster in Westfalen

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
PD Dr. med. Paul A. Stevens (Berlin)
Prof. Dr. Peter von Wichert (Marburg)
Prof. Dr. med. Ludwig Gortner (Giessen)

Einreichung: August 2000

Datum der Promotion: 18. Juni 2001

Zusammenfassung

Viele Untersuchungen deuten darauf hin, dass das Surfaktantprotein A (SP-A) sowohl an der Regulation des Surfaktanthaushalts als auch als unspezifisches Opsonin an der Abwehr von Pathogenen in der Lunge beteiligt ist. Zahlreiche Polymorphismen kennzeichnen die Gene der Proteinuntereinheiten SP-A1 und 2. Die häufigste Aminosäuresubstitution Val50Leu befindet sich in der kollagenartigen Domäne, die an den Kollektinrezeptor der Phagozyten bindet. Weitere existieren in der an der Bindung an Lipopolysaccharide, Surfaktantbestandteile und Rezeptoren auf Pneumozyten beteiligten Kohlehydraterkennungsregion (CRD) der globulären Domäne. Träger des schwach exprimierten Wildtypallels 1a0 des SP-A2-Gens haben ein erhöhtes Risiko, am Atemnotsyndrom des Neugeborenen (RDS) zu erkranken. Bei der Alveolarproteinose akkumulieren die hydrophilen Surfaktantproteine A und D in den Alveolen.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine nested PCR zur isolierten Amplifikation beider SP-A-Gene etabliert. 31 Patienten mit Verdacht auf einen Surfaktantproteindefekt wurden auf neue Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) im SP-A1-Gen untersucht. Der in einer Familie konstante NcoI-Polymorphismus 1162C>T in Codon 39 und der NdeI-Polymorphismus 3138T>C in Codon 184 wurden mit einer Allelfrequenz von etwa 11 % detektiert. Die Sequenzen der entsprechenden Allele wurden kloniert. Bei 14 Patienten mit idiopathischer Alveolarproteinose, therapierefraktärem Surfaktantmangel oder rezidivierender Pneumonie wurden die SP-A-Gene sequenziert. Der bisher nur SP-A1 zugeschriebene Aminosäureaustausch Val50Leu wurde als Substitution 1220G>C bei zwei Patienten im SP-A2-Gen nachgewiesen.

Drei Patienten mit Alveolarproteinose waren homozygot für die Substitution Gln223Lys in der CRD des SP-A2. Bei einem Patienten handelte es sich möglicherweise um eine somatische Mutation der Leukozyten-DNA im Rahmen einer Leukämie mit sekundärer Alveolarproteinose. Ein anderer war heterozygoter Träger des seltenen Allels 6a4 mit der Aminosäuresubstitution Arg219Trp in der CRD des SP-A1 und hatte die Alveolarproteinose erst im Erwachsenenalter entwickelt. Der dritte war homozygoter Träger des sehr seltenen Allels 1a3 des SP-A2 und verstarb im Alter von 6 Wochen an konnataler Alveolarproteinose (CAP), ohne dass ein bekannter Defekt des SP-B- oder des GM-CSF-Rezeptorgens vorlag.

Die SSCP-Analyse konnte allelische Varianten als Einzelstrangkonformationspolymorphismen unterscheiden, war jedoch als Suchtest in heterozygoten Proben zu unspezifisch. Der hohe Gehalt an Polymorphismusinformation (PIC) macht den SP-A-Genort sftp1 zu einem nützlichen Marker bei der Untersuchung der Surfaktantproteine und anderer auf Chromosom 10 lokalisierter Gene.

Schlagwörter:
Allelfrequenz, Alveolarproteinose, Genpolymorphismus, surfaktantassoziiertes Protein A

Abstract

Many studies give evidence of the role of surfactant protein A (SP-A) in the regulation of surfactant homeostasis and the defence from pathogens in the lung by opsonisation. The genes for the two protein subunits SP-A1 and SP-A2 are characterised by numerous polymorphisms. The most frequently substituted amino acid Val50Leu is located within the collagen-like region, which is recognised by the collectin-receptor on phagocytes. Further amino acids are substituted in the globular region, which is involved into the binding to lipopolysaccharides, surfactant particles, and receptors on pneumocytes by its carbohydrate recognition domain (CRD). Individuals carrying the weakly expressed wild-type allele 1a0 of SP-A2 have an increased risk of developing the respiratory distress syndrome (RDS) of the new-born. Alveolar proteinosis is a disease with accumulation of the hydrophilic surfactant proteins SP-A and SP-D in the alveoli.

In this study a nested PCR for separate amplification of the two SP-A genes has been established. 31 patients with suspected deficiency of a surfactant protein has been investigated for new restriction fragment length polymorphisms (RFLP) in the SP-A1 gene. The NcoI-polymorphism 1162C>T in codon 39, which was constantly inherited in one family, and the NdeI-polymorphism 3138T>C in codon 184 have been detected with an allele frequency of around 11 %. The DNA sequences of these alleles have been cloned. In 14 patients suffering from idiopathic alveolar proteinosis, therapy-refractory surfactant deficiency, or recurrent pneumonia the SP-A genes have been sequenced. The substituted amino acid Val50Leu, which was previously considered exclusively in SP-A1, has been detected in SP-A2 in two patients.

Three patients with alveolar proteinosis proved to be homozygous for the substitution Gln223Lys within the CRD of SP-A2. One of these patients might have a somatic mutation in the DNA of his leucocytes, with alveolar proteinosis developing secondary to his leukaemia. Another one developed alveolar proteinosis as an adult and was heterozygous for the rare allele 6a4 which includes the substituted amino acid Arg219Trp in the CRD of SP-A1. The third one proved to be homozygous for the very rare allele 1a3 of SP-A2 and died at 6 weeks of age from congenital alveolar proteinosis (CAP) without having one of the known mutations responsible for this condition within the genes for surfactant protein B (SP-B) or the GM-CSF receptor protein.

The allelic variants could be differentiated by single strand conformation polymorphism but the SSCP-analysis was not enough specific for the screening of heterozygous DNA. Due to its high polymorphism information content (PIC), the SP-A gene locus sftp1 is a useful genetic marker for the analysis of the surfactant proteins and other genes located on chromosome 10.

Keywords:
allele frequency, genetic polymorphism, pulmonary alveolar proteinosis, pulmonary surfactant-associated protein A


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteAnalyse der Surfaktantprotein A-Gene bei Patienten mit Verdacht auf einen Surfaktantproteindefekt
Einleitung Vorbemerkung
1 Einleitung
1.1Aufbau und Funktion des Surfaktantprotein A (SP-A)
1.1.1SP-A-Genort (sftp1)
1.1.2Die molekulare Struktur des SP-A
1.1.3Funktion der einzelnen SP-A-Domänen
1.1.4SP-A als unspezifisches Opsonin
1.1.51.1.5 SP-A in der bronchoalveolären Lavage ( BAL )
1.2Studien zur genotypischen Variabilität des SP-A
2 Aufgabenstellung
3 Material und Methoden
3.1Patienten-DNA
3.1.1Indikation zur Untersuchung der Surfaktantproteine
3.1.2Differentialdiagnostische Erwägungen
3.2Geräte und Chemikalien
3.3Gelelektrophorese
3.3.1Agarosegelelektrophorese
3.3.2Polyacrylamidgelelektrophorese
3.3.3SSCP-Gelelektrophorese
3.3.4Farbnachweis der DNA im Gel
3.4DNA-Isolation
3.4.1Genomische DNA aus Leukozyten
3.4.2Plasmid-DNA
3.4.3Amplifizierte DNA-Sequenzen
3.5Polymerasekettenreaktion (PCR)
3.5.1nested PCR
3.5.2Berechnung geeigneter Primersequenzen
3.5.3Optimierung der Reaktionsbedingungen
3.6DNA-Sequenzierung
3.6.1cycle sequencing reactions
3.6.2direct blotting
3.6.3Farbreaktion
3.7DNA-Restriktion
3.8DNA-Klonierung
3.8.1Insertion amplifizierter DNA in einen Vektor
3.8.2Transformation mit Plasmid-DNA
3.8.3Anzucht und Selektion
3.9Statistische Auswertung der DNA-Sequenzen
4 Ergebnisse
4.1Isolation und Amplifikation der SP-A-Gensequenzen
4.1.1Interne Primer und Reaktionsbedingungen
4.1.2Externe Primer und Reaktionsbedingungen
4.2Analyse der SP-A-Gensequenzen
4.2.1Die neuen Polymorphismen 1162C>T und 3138T>C
4.2.2SP-A1- und SP-A2-Genotypen von 14 Patienten
4.2.3Häufigkeiten einzelner Polymorphismen
4.3PCR-SSCP-Analyse
4.3.1Elektrophoresebedingungen zum SSCP-Nachweis
4.3.2Klonierung von Mustersequenzen
4.3.3SSCP-Gelelektrophoresen mit Patienten-DNA
5 Diskussion
5.1Verfahren zur Analyse der SP-A-Gene
5.1.1Techniken
5.1.2Sensitivität und Spezifität
5.1.3Zufällige und systematische Fehler
5.1.4Aussagekraft einzelner Beobachtungen
5.2Allelische Varianten des SP-A
5.2.1Die Existenz weiterer Polymorphismen in den SP-A-Genen
5.2.2Charakterisierung bisher unbekannter Allele
5.2.3Vergleich der beobachteten Allelfrequenzen mit Literaturdaten
5.3Nutzen der Analyse der SP-A-Gene
5.3.1Der Effekt allelischer Varianten auf die Funktion des SP-A
5.3.2SP-A-Genotypen als Risikofaktor für frühkindliche Pneumonien
5.3.3Der Heterozygotenvorteil
5.3.4Informationsgehalt der SP-A1-SP-A2-Haplotypen
5.4Ausblick
5.4.1Anwendung der beschriebenen Methodik
5.4.2Design einer Assoziationsstudie
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Bibliographie Literatur
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1-1: Effekte von SP-A auf die Abwehr diverser Krankheitserreger in der Lunge (nach Haagsman 1998)
Unterstrichen
sind die Erreger, deren Abwehr durch SP-A verbessert wird.
Hervorgehoben sind die Erreger, deren Abwehr möglicherweise durch SP-A gestört wird
Tabelle 1-2: Polymorphe Codons in den Allelen des SP-A1-Gens (nach Floros und Hoover 1998)
Angegeben sind die drei DNA-Basen des polymorphen Codons und gegebenenfalls die ausgetauschte Aminosäure.
Das kursiv gesetzte Allel wurde in der Zelllinie eines Adenokarzinoms beobachtet.
Tabelle 1-3: Polymorphe Codons in den Allelen des SP-A2-Gens (nach Floros und Hoover 1998)
*: Die Substitution des Cytosin für Thymidin an dritter Position in Codon 202 kennzeichnet sonst das SP-A1-Gen.
Tabelle 3-1: Patientendaten mit Angaben zur Indikation und Alter zum Zeitpunkt der Blutabnahme
ARDS = akutes Atemnotsyndrom, BPD = bronchopulmonale Dysplasie, CMV = Zytomegalievirus, ECMO = extrakorporale Membranoxygenierung, PAS+ = PAS -positives Material in BAL oder Biopsat (pathognomonisch für Alveolarproteinose), RDS = Atemnotsyndrom, SSW = vollendete Schwangerschaftswochen bei Frühgeburt, Surf = Zahl der Surfaktantgaben (falls bekannt), verst = verstarb im Alter von: Ta(gen), Wo(chen), Mo(naten) oder J.(ahren). * = aufgrund dieser Diagnose wurde eine vollständige Sequenzierung der SP-A-Gene durchgeführt.
Tabelle 3-2: Geräte
Tabelle 3-3: Verbrauchsmaterial
Tabelle 3-4: Reagenzien für die Gelelektrophorese
Tabelle 3-5: Lösungen für die Gelelektrophorese
Tabelle 3-6: Lösungen für die SSCP-Gelelektrophorese
Tabelle 3-7: Lösungen zum Farbnachweis der DNA im Gel
1): Biozym Diagnostik GmbH in Hessisch Oldendorf
2): silver stain kit der Bio-Rad Laboratories in Richmond, California
Tabelle 3-8: Lösungen zur Isolation chromosomaler DNA
Puregene®DNA-Isolation Kit: Volumina zur DNA-Isolation aus 300µl Vollblut und Zusammensetzung nach Angaben des Herstellers: Gentra Systems, Inc. in Minneapolis (USA)
Tabelle 3-9: Lösungen zur Isolation von Plasmid-DNA
Tabelle 3-10: Materialien zur Aufbereitung amplifizierter DNA
1): Reagent pack for use with Sequencing Kit Nr. US 70995 von Amersham in Cleveland, Ohio (USA)
2): Reagenzien zur DNA-Extraktion von der QIAGEN GmbH in Hilden (BRD)
Tabelle 3-11: Reagenzien für die PCR
1): Promega® oder TaKaRa®, Boehringer Ingelheim Bioproducts in Heidelberg (BRD)
2): Expand®-Long Template PCR-System von Boehringer in Mannheim (BRD)
3): PerkinElmer Weiterstadt, 4): PAN-Systems GmbH Aidenbach, 5): Braun® Melsungen (BRD)
Tabelle 3-12: Getestete diskriminierende Primer
Miteinander amplifizierende Primer sind unterstrichen, Einzelheiten siehe in Abschnitt 4.1.2 .
Tabelle 3-13: Universalprimer zur Amplifikation klonierter DNA
1): Position in pCR2.1 ( Mead et al. 1991); 2): Position in pUC19 ( Yanisch-Perron et al. 1985)
Tabelle 3-14: Lösungen für die cycle sequencing reaction
BioCycle Sequencing Kit von GATC in Konstanz (BRD) außer 1): Amersham in Cleveland, Ohio (USA).
ddNTP steht für jeweils eins der vier Didesoxynukleotide, die durch eine Biotinylierung markiert sind.
sieheProtokoll 3-1: cycle sequencing reaction
Tabelle 3-15: Lösungen für das denaturierende Harnstoffgel
1): BioCycle Sequencing Kit von GATC in Konstanz (BRD)
Tabelle 3-16: Lösungen zum Nachweis der biotinylierten DNA auf der Membran
1): GATC GmbH in Konstanz; 2): Boehringer in Mannheim; 3): Bio-Rad Laboratories GmbH in München
Tabelle 3-17: Restriktionsendonukleasen
Gezeigt werden die Schnittstelle darr innerhalb der palindromischen Erkennungssequenz, die gelieferte Konzentration, die optimale Temperatur und der verwendete, vom Hersteller mitgelieferte Restriktionspuffer.
Tabelle 3-18: Reagenzien zur Insertion von DNA in einen Vektor
Hersteller: New England Biolabs in Beverly (USA) außer 1): Invitrogen Corporation in Carlsbad, California
Tabelle 3-19: Reagenzien zur Transformation kompetenter Zellen (GibcoBRL Life Technologies, Paisley, UK)
Tabelle 3-20: Reagenzien zur Anzucht und Selektion der Klone (GibcoBRL Life Technologies, Paisley, Scotland)
sieheProtokoll 4-1: Thermocycling der internen PCR
Tabelle 4-1: Primer und Amplifikationsbedingungen für die internen Polymerasekettenreaktionen
Legende: EX- bezeichnet das amplifizierte Exon, -SSCP die Primerpaare für die PCR-SSCP-Analyse, -Sequenz die Primerpaare für die Gewinnung von Amplifikaten zur DNA-Sequenzierung.
Tabelle 4-2: Externe Primer zur Amplifikation der SP-A-Gene (diskriminierende Nukleotide sind unterstrichen)
*: Beim nichtdiskriminierenden Primerpaar ist nur die Position im SP-A1-Gen angegeben, R steht für A und G.
sieheProtokoll 4-2: Thermocycling der externen PCR
Tabelle 4-3: Allelfrequenzen am Genort SP-A2-Codon 50
(In Klammern sind jeweils die 95 %-Clopper-Pearson-Konfidenzgrenzen angegeben)
Tabelle 4-4: Genotypfrequenzen am Genort SP-A2-Codon 50
Die Konkordanz P(chi12>chi2) mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz beträgt im Chi-Quadrat-Test : P(chi12>chi2) = 77%.
Tabelle 4-5: 2(2-Kontingenztafel mit Häufigkeit der Einzelbasensubstitution am Genort SP-A1-Codon 39
Die Signifikanz beträgt im Chi-Quadrat-Test : P(chi12>chi2) = 0,90.
Tabelle 4-6: Häufigkeit der beobachteten Genotypen am Genort SP-A1-Codon 39
Die Konkordanz P(chi12>chi2) mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz wurde im Chi-Quadrat-Test berechnet.
Tabelle 4-7: 2(2-Kontingenztafel n mit Häufigkeit der Einzelbasensubstitution am Genort SP-A1-Codon 184
Tabelle 4-8: Häufigkeit der beobachteten Genotypen am Genort (SP-A1)-Codon 184
Die Konkordanz P(chi12>chi2) mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz wurde im Chi-Quadrat-Test berechnet.
Tabelle 4-9: Polymorphe Codons in den Exonsequenzen von SP-A1 und dementsprechende Allele der Patienten
Zur Orientierung ist die seltene Variante hervorgehoben. Neu beschriebene Polymorphismen sind kursiv gesetzt.
Unterstrichene Haplotypen wurden durch Klonierung gesichert.
Tabelle 4-10: Polymorphe Codons in den Exonsequenzen von SP-A2 und dementsprechende Allele der Patienten
(Fragliche Allele bei Patient 4 und 12 gingen nicht in die Allel- und Haplotypfrequenzen in Abschnitt 5.2.3 ein)
Tabelle 4-11: Häufigkeiten der einzelnen Polymorphismen im SP-A1-Gen (n = 28 Allele)
Die Proportion Heterozygoter h wurde mit dem erwarteten Heterozygotiegrad Het verglichen.
Die Konkordanz P(chi12>chi2) mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz wurde im Chi-Quadrat-Test berechnet.
Tabelle 4-12: Häufigkeiten der einzelnen Polymorphismen im SP-A2-Gen (n = 28 Allele)
Tabelle 4-13: Mustersequenzen für SP-A1-Exon 1 (kloniert aus einer PCR mit Taq-DNA-Polymerase)
Unterstrichene
Klone wurden in einer Gefrierkultur als Muster für die angegebenen Allele konserviert.
Bei der PCR mutierte Genorte sind hervorgehoben. Anführungszeichen markieren die mutierten Allelsequenzen.
Tabelle 4-14: Mustersequenzen für SP-A2-Exon 1 (kloniert aus einer PCR mit PwoI-DNA-Polymerase)
Tabelle 4-15: Mustersequenzen für SP-A2-Exon 2 (kloniert aus einer PCR mit Taq-DNA-Polymerase)
Tabelle 4-16: Mustersequenzen für SP-A1-Exon 2 (kloniert aus einer PCR mit Taq-DNA-Polymerase)
Tabelle 4-17: Mustersequenzen für SP-A-Exon 3 (Delta markiert die deletierte DNA-Base)
Tabelle 4-18: Mustersequenz für SP-A2-Exon 4 (kloniert aus einer PCR mit PwoI-DNA-Polymerase)
Tabelle 5-1: Restriktionsendonukleasen für die RFLP-Analyse der Aminosäuresubstitutionen im SP-A
Legende: n steht für eine beliebige DNA-Base, s für G oder C. Die substituierte DNA-Base ist hervorgehoben.
Tabelle 5-2: Vergleich der Allelfrequenzen und erforderliche Stichprobengröße im Vorzeichentest
Die Allelfrequenz q ist hervorgehoben; alpha ist die im Chi-Quadrat-Test errechnete Signifikanz.
n‘ ist der nötige Stichprobenumfang, um Signifikanz (alpha le 0,05) mit einer power von 80 % zu erreichen.
n1 & n2 ist der nötige Stichprobenumfang von zwei gleich großen Populationen im direkten Vergleich.
Tabelle 5-3: Vergleich der Häufigkeit einzelner Polymorphismen und erforderliche Stichprobengröße
Die Frequenz q des Polymorphismus ist hervorgehoben; die Signifikanz alpha wurde im Chi-Quadrat-Test errechnet.
n‘ ist der nötige Stichprobenumfang, um Signifikanz (alpha le 0,05) mit einer power von 80 % zu erreichen.
n1 & n2 ist der nötige Stichprobenumfang von zwei gleich großen Populationen im direkten Vergleich.
Tabelle 5-4: Häufigkeit des Polymorphismus 1193G>C (Val50Leu) im SP-A1-Gen mit 95 %-Konfidenzintervall
Die Signifikanz alpha wurde jeweils gegen die indogerm. Population, bei * gegen die gesunden Individuen indogerm. Abstammung von Kala et al. getestet. Die Proportion Heterozygoter h wurde mit dem erwarteten Heterozygotiegrad Het verglichen. Die Konkordanz P(chi12>chi2) mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz wurde im Chi-Quadrat-Test berechnet.
Tabelle 5-5: Geschätzte Häufigkeit der beobachteten Haplotypen (N = 12 diploide Proben)
Unterstrichene
Haplotypen erreichten in der Studie von Floros et al. 1996 (N = 239) statistische Signifikanz.
Durch neu beschriebene Allele definierte Haplotypen sind kursiv gesetzt.
Tabelle 5-6: Grad der Heterozygotie und Gehalt an Polymorphismusinformation in den SP-A-Genen
*: wegen des fraglichen Genotyps 6a2/6a# oder 6a3/6a# bei Patient 15 wurden zwei Werte berechnet

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1-1: Orientierung der SP-A-Gene am Kollektingenort (nach Floros und Hoover 1998)
Der Pfeil (larr) kennzeichnet die Richtung der Transkription
Abbildung 1-2: Struktur einer Kopie des SP-A-Gens (nach McCormack 1998)
Dargestellt ist die Intron-Exon-Struktur eines SP-A-Gens, die kodierenden Exone sind hell hinterlegt.
Abbildung 1-3: Invariant von SP-A1 nach SP-A2 ausgetauschte Aminosäuren (nach Floros et al. 1996)
N bezeichnet die aminoterminale Region des Proteins, beschrieben werden die Domänen in Abschnitt 1.1.2 .
Abbildung 1-4: Die Domänen des SP-A-Monomers (nach McCormack 1998)
Abbildung 1-5: Aggregation der SP-A-Monomere zu Tripelhelices (nach Voss et al. 1991)
Abbildung 1-6: Aggregation der SP-A-Tripelhelices zum Oktadekamer (nach Voss et al. 1991)
Abbildung 1-7: Funktionen des SP-A-Moleküls
CRD = Kohlehydraterkennungsregion (carbohydrate recognition domain); zu den Domänen vgl. Abbildung 1-4 .
Abbildung 3-1: Getrennte Amplifikation der SP-A-Gene mittels nested PCR
sieheGleichung 3-1: Schmelztemperatur von DNA-Oligomeren (nach Rychlik et al. 1990)
Legende: DeltaH ist die Enthalpie und DeltaS die Entropie der Helixbildung. R ist die Gaskonstante (1.987 cal/°C/mol).
c ist die Primer- und [K+] die Kaliumionenkonzentration
sieheGleichung 3-2: Schmelztemperatur von DNA-Oligomeren (vereinfacht nach Newton und Graham 1997)
Legende: n ist die Zahl der Nukleotide und (%G+C) der Anteil der DNA-Basen Guanin und Cytosin
sieheGleichung 3-3: Formeln zur Berechnung von Heterozygotiegrad und PIC ( Ott 1992)
a: Zahl der verschiedenen Allele, n: Gesamtzahl beobachteter Allele, qi: Häufigkeit des i-ten Allels
Abbildung 4-1: Optimierung der externen PCR durch Modifikation des Reaktionspuffers
DNA-Qualität: frisch isoliert in Spur 1 und 2; gefrorene Proben in Spur 3 - 14.
Primer: SPA-1-FW-01/RE-01 in Spur 1, 3, 5 und 7-10; SPA-2-FW-01/RE-01 in Spur 2, 4, 6 und 11 - 14.
Magnesium[Mg++]: 1 mmol/l in Spur 10 + 14; 1,5 mmol/l in 9 + 13; 2 mmol/l in 8 + 12; 2,5 mmol/l in 7 + 11.
Ammoniumsulfat: [(NH4)2SO4] = 5 mmol/l in Spur 5 und 6, [(NH4)2SO4] = 10 mmol/l in Spur 3 und 4.
Abbildung 4-2: Amplifikation der SP-A-Gene durch Polymerasen mit und ohne fehlerkorrigierende Aktivität
Primer: SPA-1-FW-01/RE-01 in Spur 1-4 und 9-12; SPA-2-FW-01/RE-01 in Spur 5-8 und 13-14.
Magnesium [Mg++]: 2 mmol/l in 1+5+9+13; 3 mmol/l in 2+6+10+14; 4 mmol/l in 3+7+11; 5 mmol/l in 4+8+12.
Abbildung 4-3: Identifizierung der amplifizierten SP-A-Gene durch RFLP -Analyse
Die Größe der Restriktionsfragmente ist in der jeweiligen Spalte unterhalb des Gens angegeben. Das PstI-Fragment von 942 bp wird in einigen Allelen in Fragmente von 729 und 213 bp geschnitten. In Spur SP-A wurde das Produkt aus der PCR mit den nichtdiskriminierenden Primern SPA-FW-EXT und SPA-RE-EXT aufgetragen.
Abbildung 4-4: DNA-Sequenzierung von Exon 2 (Nukleotide 1596_1615 von SP-A1 bzw. 1616_1635 von SP-A2)
Links: SP-A-Exon 2 aus genomischer DNA mit Polymorphismus 1599A>G (Codon 61) und 1611T>C (Codon 65). Rechts: beide Gensequenzen isoliert aus Produkten der externen PCR amplifiziert und getrennt sequenziert.
Abbildung 4-5: RFLP-Analyse mit NcoI am Genort SP-A1-Codon 39
Heterozygote Träger der Variante 1162C>T sind kursiv gesetzt.
Abbildung 4-6: Familienanalyse am Genort SP-A1-Codon 39 (Amplifikate von SP-A-Exon 1 geschnitten mit NcoI)
ungerade Nummern: aus dem SP-A1-Gen; gerade Nummern aus dem SP-A2-Gen amplifiziert
Spuren 1 & 2: Vater, 3 & 4: Mutter, 5 & 6: Mitarbeiter mit Variante, 7 & 8: Mitarbeiter ohne Variante
Abbildung 4-7: Beispiel für unvollständigen DNA-Verdau durch NdeI (4 Stunden Inkubation mit 10 Units Enzym)
Alle Mitarbeiter waren homozygot für den Wildtyp. Die Patienten 2, 13, und 15 tragen die Variante.
Tabelle 4-13 und Tabelle 4-14 aufgeführt.
Abbildung 4-9: SSCP-Analyse mit klonierter DNA von SP-A-Exon 1
6% Polyacrylamid(99:1), Temperatur = 4°C, Laufzeit = 135 Minuten, DS = nicht denaturierte DNA.
Abbildung 4-10: SSCP-Analyse mit klonierter DNA von SP-A-Exon 1
(0,25×) MDE ® Gel Solution, Temperatur = 4°C, Laufzeit = 135 Minuten, DS = nicht denaturierte DNA.
Abbildung 4-11: SSCP-Analyse von SP-A1-Exon 2 mit DNA-Proben der Patienten 6, 8 und 12
5% Polyacrylamid(99:1) mit 5% Glycerol, Temperatur = 4°C, Laufzeit = 135 min, DS = Doppelstrang-DNA.
Abbildung 4-12: SSCP-Analyse von SP-A1-Exon 2 mit DNA-Proben der Patienten 6, 8 und 12
5% Polyacrylamid(99:1), Temperatur = 4°C, Laufzeit = 135 Minuten, DS = am unteren Gelrand (185 bp).
Abbildung 4-13: Restriktionsanalyse der Klone von Patient 10-SP-A-Exon 1
Amplifikate von SP-A1 (Klon 28, 30, 32 und 33) bilden Fragmente von 134, 82, 69 und 26 bp. SP-A2-Amplifikate (Klon 29 und 31) bilden je nach Orientierung im Vektor Fragmente von 203, 82 und 26 oder 177, 82 und 52 bp.
Abbildung 5-1: Lokalisation der allelischen Varianten im SP-A1 (erweitert nach Floros et al. 1996)
Die vier mannosebindenden Aminosäuren 215Glu, 222Glu, 234Asn und 235Asp sind mit einem * gekennzeichnet.
Abbildung 5-2: Lokalisation der allelischen Varianten im SP-A2 (erweitert nach Floros et al. 1996)
Abbildung 5-3: Vergleich der Opsonisierung von Krankheitserregern durch C1q, MBL und SP-A
Der cC1q-Rezeptor (auf Monozyten und Makrophagen) bindet die kollagenartige Domäne des C1q und der Kollektine. Die mit dem MBL assoziierte Serinprotease (MASP) aktiviert Komplement auf dem Lektinweg.

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