zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Pharmazie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Martina Scholz,
geboren am 28.09.1971
in Boizenburg/Elbe

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. M. Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Sigrid Keipert
2. Prof. Dr. Uwe Pleyer
3. Prof. Dr. Andreas Langner

Tag der mündlichen Prüfung:

Inhaltsverzeichnis
Titelseite	In vitro-Permeationsstudien von hydrophilen und lipophilen Arzneistoffen an okularen Geweben und Zellkulturen
Widmung
Danksagung
Abkürzungsverzeichnis	Abkürzungsverzeichnis
1	EINLEITUNG
2	PROBLEMSTELLUNG
3	THEORETISCHE GRUNDLAGEN
3.1	Anatomie, Physiologie und Funktionalität des Auges
3.1.1	Cornea
3.1.2	Sklera
3.1.3	Konjunktiva
3.2	Arznei- und Hilfsstoffe
3.2.1	Arzneistoffe
3.2.1.1	Pilocarpin
3.2.1.1.1	Eigenschaften
3.2.1.1.2	Pharmakologie
3.2.1.2	Diclofenac-Natrium
3.2.1.2.1	Eigenschaften
3.2.1.2.2	Pharmakologie
3.2.1.3	Mycophenolatmofetil
3.2.1.3.1	Eigenschaften
3.2.1.3.2	Pharmakologie
3.2.2	Hilfsstoffe
3.2.2.1	Benzalkoniumchlorid (BAC)
3.2.2.1.1	Eigenschaften
3.2.2.1.2	Anwendung und Wirkungsweise
3.2.2.2	Natriumedetat (EDTA)
3.2.2.2.1	Eigenschaften
3.2.2.2.2	Anwendung und Wirkungsweise
3.2.2.2.3	Anwendungsbeispiele für BAC und EDTA in Augentropfen
3.2.2.3	Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP--CD)
3.2.2.3.1	Cyclodextrine allgemein
3.2.2.3.2	HP--CD in Ophthalmika
4	Ergebnisse und Diskussion
4.1	Voruntersuchungen
4.1.1	Löslichkeitsversuche
4.1.1.1	Diclofenac-Na
4.1.1.2	Mycophenolatmofetil
4.1.2	Charakterisierung der Donatorlösungen
4.1.2.1	Pilocarpinhydrochlorid-Lösungen
4.1.2.2	Diclofenac-Natrium-Lösung
4.1.2.3	Mycophenolatmofetil- und Mycophenolsäure-Lösung
4.1.2.4	Verteilungskoeffizienten der Arzneistoffe
4.1.3	Proteinbestimmung von okularen Geweben
4.1.3.1	Allgemeines
4.1.3.2	Schweinecornea und Schweinesklera
4.1.4	Hydratationsstudien an okularen Geweben
4.1.4.1	Allgemeines
4.1.4.2	Schweinecornea
4.1.4.3	Schweinesklera
4.1.5	Wirkstoffpenetration
4.1.5.1	Allgemeines
4.1.5.2	Pilocarpin-HCl
4.1.5.3	Diclofenac-Na
4.2	In vitro-Wirkstoffpermeation
4.2.1	Literaturübersicht zur okularen Permeabilität
4.2.1.1	Corneale Permeabilität
4.2.1.2	Sklerale Permeabilität
4.2.1.3	Konjunktivale Permeabilität
4.2.2	Permeationsmechanismen
4.2.2.1	Parazelluläre Permeation
4.2.2.2	Transzelluläre Permeation
4.2.3	Effektiver Permeabilitätskoeffizient (Peff)
4.2.4	Pilocarpin-HCl
4.2.4.1	Corneale Pilocarpin-Permeation
4.2.4.2	Sklerale Pilocarpin-Permeation
4.2.4.3	Vergleich von P-HCl- und P-Base-Permeation
4.2.4.4	Konjunktivale Pilocarpin-Permeation
4.2.4.4.1	Bioelektrische Parameter
4.2.4.4.2	Permeationsstudie
4.2.5	Diclofenac-Na
4.2.5.1	Corneale und sklerale Permeation
4.2.5.2	Vergleich von D-Na- und P-HCl-Permeation
4.2.5.3	Permeation durch eine synthetische Membran
4.2.6	Mycophenolatmofetil
4.2.7	Permeation durch gelaserte Schweinecornea
4.2.7.1	Laserchirurgie
4.2.7.2	Pilocarpin-HCl-Permeation
4.2.7.3	Diclofenac-Na-Permeation
4.2.7.4	Raster-Elektronenmikroskopie (REM)
4.3	Zellkulturen
4.3.1	Allgemeines
4.3.2	Kaninchencornea-Epithelzellkultur (KCEZ)
4.3.2.1	Bioelektrische Parameter
4.3.2.2	Permeationsstudie
4.3.3	Kaninchenkonjunktiva-Epithelzellkultur (KKEZ)
4.3.3.1	Bioelektrische Parameter
4.3.3.2	Permeationsstudie
5	Experimenteller Teil
5.1	Substanzen
5.1.1	Arzneistoffe
5.1.2	Hilfsstoffe
5.1.3	Weitere Chemikalien
5.1.4	HPLC-Fließmittel
5.1.5	Pufferlösungen
5.2	Methoden
5.2.1	Physikalisch-chemische Charakterisierung
5.2.1.1	Löslichkeitsstudien
5.2.1.1.1	Diclofenac-Na
5.2.1.1.2	Mycophenolatmofetil
5.2.1.2	Bestimmung der Oberflächenspannung und CMC1)
5.2.1.3	Viskosität
5.2.1.4	Dichte
5.2.1.5	Brechungsindex
5.2.1.6	Osmolalität
5.2.1.7	pH-Wert
5.2.1.8	Verteilungskoeffizient
5.2.2	Gehaltsbestimmungen
5.2.2.1	Pilocarpin-HCl
5.2.2.2	Diclofenac-Na
5.2.2.3	Mycophenolatmofetil und Mycophenolsäure
5.2.3	Proteinbestimmung
5.2.3.1	Präparation der Schweinecornea1)
5.2.3.2	Präparation der Schweinesklera
5.2.3.3	Proteinbestimmung nach Lowry1)
5.2.4	Hydratationsstudien
5.2.5	Penetrationsstudien
5.2.6	Permeation durch isolierte Cornea/Sklera und Nephrophan®
5.2.6.1	Permeationsapparatur1)
5.2.6.2	Versuchsdesign
5.2.6.3	Integritäts- und Vitalitätsprüfung von Schweinecornea
5.2.7	Permeation durch isolierte Kaninchenkonjunktiva
5.2.7.1	Gewebeisolierung und Permeationsapparatur
5.2.7.2	Bioelektrische Messungen
5.2.7.3	Permeationsstudien
5.2.8	Permeation nach Excimer-Laser-Behandlung
5.2.8.1	Excimer-Laser
5.2.8.2	Lasern der Hornhaut
5.2.9	Raster-Elektronenmikroskopie (REM)
5.2.9.1	Aufbau und Funktion des Gerätes
5.2.9.2	Probenpräparation1)
5.2.10	Permeation durch Zellkulturen
5.2.10.1	Kultivierung von Kaninchenkonjunktiva-Epithelzellkultur
5.2.10.2	Kultivierung von Kaninchencornea-Epithelzellkultur
5.2.10.3	Bioelektrische Messungen
5.2.10.4	Permeationsstudien
5.2.11	Statistik
6	Zusammenfassung
Bibliographie	Literaturverzeichnis
Anhang A	Publikationen, die aus vorliegender Arbeit hervorgegangen sind:
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:	Pilocarpinsäure [%] in Cornea, Kammerwasser und Iris/Ziliarkörper nach topischer Applikation einer 0.01 M Pilocarpinlösung [67]
Tabelle 2:	Anwendung von BAC und EDTA in Augentropfen [126], exklusive Filmbildner-präparate
Tabelle 3:	Eigenschaften und Toxizität modifizierter -CDe [138]
Tabelle 4:	In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur ophthalmologischen Anwendung von Wirkstoff/HP--CD Komplexen
Tabelle 5:	Beispiele von CMC-Werten (experimentell ermittelt)
Tabelle 6:	Geradenanstieg tan , Korrelationskoeffizienten R2 und apparente Komplex- stabilitätskonstanten KStab der Systeme MMF/HP--CD und MPA/HP--CD
Tabelle 7:	Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen P-HCl-Lösungen
Tabelle 8:	Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen D-Na-Lösung
Tabelle 9:	Physikalisch-chemische Kenngrößen wässriger MMF/HP--CD- und MPA/HP--CD-Lösungen
Tabelle 10:	Verteilungskoeffizienten VK (Octanol/GBR) für die angewendeten Arzneistoffe
Tabelle 11:	Wassergehalt (WG) und Wasseraufnahme (WA) in [mg/mg Gewebe] von Schweinecornea (1) unbehandelt, (2) 50% Epithel und (3) ohne Epithel nach Inkubation in Wasser, GBR oder GBR/PG
Tabelle 12:	Wassergehalt (WG) und Wasseraufnahme (WA) in [mg/mg Gewebe] von Schweinesklera nach Inkubation in Wasser, GBR oder GBR/PG
Tabelle 13:	Permeationsdaten der 2%igen P-HCl -Lösungen für Schweinecornea
Tabelle 14:	Permeationsdaten der 2%igen P-HCl-Lösungen für Schweinesklera
Tabelle 15:	Permeationsdaten von P-HCl und P-Base durch Schweinecornea und -sklera
Tabelle 16:	Bioelektrische Parameter isolierter Kaninchenkonjunktiva
Tabelle 17:	Permeationsdaten der P-HCl-Lösungen durch Kaninchenkonjunktiva
Tabelle 18:	Permeationsdaten der D-Na-Lösung durch Schweinecornea und -sklera
Tabelle 19:	Permeationsdaten von D-Na und P-HCl aus GBR/PG durch Schweinecornea
Tabelle 20:	Permeationsdaten der D-Na- und P-HCl-Lösungen durch Nephrophan®
Tabelle 21:	Permeationsdaten von MPA aus einer MMF-Lösung 1% (= 0.43% MPA) und aus einer MPA-Lösung 0.74%
Tabelle 22:	Permeationsdaten von 2%igen P-HCl-Lösungen durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke
Tabelle 23:	Permeationsdaten der D-Na-Lösung durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke
Tabelle 24:	Vorteile von Zellkulturen [344]
Tabelle 25:	Nachteile von Zellkulturen [344]
Tabelle 26:	Bioelektrische Parameter der cornealen Zellkultur
Tabelle 27:	Permeationsparameter von P-HCl aus BR durch corneale Epithelzellkultur
Tabelle 28:	Bioelektrische Parameter der konjunktivalen Zellkultur
Tabelle 29:	Permeationsparameter von P-HCl aus BR durch konjunktivale Epithelzellkultur

Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:	Aufbau des Augapfels und seiner Anhangsgebilde [29]
Abb. 2:	Aufbau der Cornea [37]; Epi = Epithel, Endo = Endothel
Abb. 3:	Seitenansicht eines Menschenauges [41]
Abb. 4:	Sklerafaserbündel [50]
Abb. 5:	Bindehautbereiche im menschlichen Auge [55]
Abb. 6:	Zersetzung von Pilocarpin [61]
Abb. 7:	A: weiter Kammerwinkel; B: enger Kammerwinkel; 1=Ziliarkörper, 2=Iris, 3=Trabekelmaschenwerk, 4=Schlemm‘scher Kanal, 5=Vene, 6=Hornhaut [69]
Abb. 8:	Hemmung der Prostaglandinsynthese durch Pharmaka [83]
Abb. 9:	Abbauprodukte von MMF [91]; 1=MPA, 2=MMF, 3=N-Oxid des MMF, 4=2- Morpholino-ethanol, 5=MPA-Lactonanalogon, 6=MPA-Hydroxylactonanalogon, 7- 9=unbenannt
Abb. 10:	Ablauf der Immunkaskade mit Angriffsorten von Ciclosporin und MMF [26], Hemmung durch MMF
Abb. 11:	Struktur eines EDTA-Metall(II)ion-Komplexes [60]
Abb. 12:	Corneale Permeationswege für Wirkstoffe in Anwesenheit von CDen [141]; (Df ) freier Wirkstoff, (CDf) freies CD, (D.CD) Wirkstoff-CD-Komplex, (C) Komponenten des Tränenfilms, (K) Komplexstabilitätskonstante
Abb. 13:	Löslichkeitsverbesserung von D-Na in GBR (pH 7.4) mittels Solubilisatoren
Abb. 14:	Löslichkeitsverbesserung von MMF in GBR (pH 7.4) mittels Solubilisatoren
Abb.15:	Sättigungskonzentrationen von MMF, gemessen als unverändertes MMF und dem Hydrolyseprodukt MPA nach Zusatz von HP--CD
Abb. 16:	Löslichkeit von MMF (links) und MPA (rechts) in GBR (pH 7.4) in Abhängigkeit von der HP--CD-Konzentration (nach Autoklavieren, 15 min, 200kPa, 121° C)
Abb. 17:	Schema der Bewegung von Arzneistoffen und Augenflüssigkeiten und deren Zusammensetzung im vorderen Bereich des Auges [34]
Abb. 18:	Proteingehalt von Schweinecornea und -sklera [µg/mg Gewebe], n=12
Abb. 19:	Schema der Wasseraufnahme und -abgabe in der Cornea (Endothel = Barriere und Pumpe) [38]
Abb. 20:	Versagen der Endothelfunktion führt zur ungehinderten Flüssigkeitsaufnahme in das Stroma und Epithel [38]
Abb. 21:	Hydratation von Schweinecornea (unbehandelt, 50% Epithel, ohne Epithel) nach Inkubation in Wasser, GBR bzw. GBR/PG, n=4, (*) p<0.05 verglichen mit SC
Abb. 22:	Hydratation von Schweinesklera nach Inkubation in Wasser, GBR bzw. GBR/PG, n=4, (*) p<0.05 verglichen mit GBR
Abb. 23:	Aufnahme von P-HCl in isolierte Schweinecornea und -sklera, n = 6, (*) p<0.05verglichen mit Sklera
Abb. 24:	Aufnahme von D-Na in isolierte Schweinecornea und -sklera, n = 6, (*) p<0.05 verglichen mit Sklera
Abb. 25:	Schematische Darstellung der okularen Absorption nach topischer okularer Arzneistoffadministration [195]
Abb. 26:	Der parazelluläre Permeationsweg [242]
Abb. 27:	Tight junction Struktur Modelle [200]; A: Fusionsmodell (Plasmamembranen angrenzender Zellen verschmelzen); B: integrierende Membranproteine sind Hauptstrukturelemente der Tight junctions
Abb. 28:	Potentieller Mechanismus für eine passive transzelluläre Diffusion [251]
Abb. 29:	Permeationsprofil von P-HCl durch Schweinecornea unter Einfluss von BAC und EDTA, n = 9-10
Abb. 30:	Permeationsprofil von P-HCl durch Schweinesklera unter Einfluss von BAC und EDTA, n=12
Abb. 31:	Vergleich der Permeation von P-Base und P-HCl durch Schweinecornea und -sklera, n = 5 -12, (*) p<0.05 im Vergleich zu P-HCl
Abb. 32:	Permeationsprofil von P-HCl 2% durch Kaninchenkonjunktiva, n=5-9
Abb. 33:	Permeation von D-Na durch isolierte Schweinecornea und -sklera, n=11-12
Abb. 34:	Permeation von P-HCl und D-Na aus GBR/PG durch Schweinecornea, n=10-12
Abb. 35:	Peff von P-HCl und D-Na durch Nephrophan®, n=5
Abb. 36:	Permeation von MPA aus einer MMF-Lösung 1% (= 0.43% MPA) und aus einer MPA-Lösung 0.74%, n = 9-10
Abb. 37:	Permeation von P-HCl durch Schweinecornea mit unterschiedlichen Epitheldicken unter Einfluss von BAC und EDTA, n=8-13, (*) p<0.05 verglichen mit P-HCl 2% der jeweiligen Ablationsstufe (%-Angabe der Epithellaserung; o.E = ohne Epithel; o.B = ohne Bowman-Membran)
Abb. 38:	Permeation von D-Na durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke, n=8-12, (*) p<0.05 verglichen mit unbehandelter SC
Abb. 39:	links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: nach Inkubation in GBR/0.01% BAC, Aufsicht; x 500
Abb. 40:	links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: nach Inkubation in GBR/0.01% BAC, Aufsicht; x 5000
Abb. 41:	links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: mit 75% Epithel, Querschnitt; x 50
Abb. 42:	links: Schweinecornea mit 50%Epithel, rechts: mit 25% Epithel, Querschnitt; x 50
Abb. 43:	Schweinecornea ohne Epithel, Querschnitt; x 50
Abb. 44:	links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: mit 50% Epithel, Querschnitt, x 1000
Abb. 45:	links: Schweinecornea mit 75% Epithel, rechts: mit 50% Epithel, Aufsicht; x 5000
Abb. 46:	links: Schweinecornea mit 25% Epithel, rechts: ohne Epithel, Aufsicht; x 5000
Abb. 47:	Peff (Kolumne) durch corneale Epithelzellkultur und TEER (final) (Punkt), n=5-8, (*) p<0.05 verglichen mit Referenz (P-HCl 2%, pH 7.4, 300 mOsmol/kg)
Abb. 48:	Peff (Kolumne) durch konjunktivale Epithelzellkultur und TEER (final) (Punkt), n=3-6, (*) p<0.05 verglichen mit Referenz (P-HCl 2%, pH 7.4, 300 mOsmol/kg)
Abb. 49:	Permeationszelle
Abb. 50:	Permeationsapparatur für Schweinecornea, -sklera und Nephrophan®
Abb. 51:	Präparation von Kaninchenkonjunktiva [256], Pfeile kennzeichnen Schneiderichtung
Abb. 52:	6.5 mm Clear Transwell mit permeabler Filtereinlage [344]
Abb. 53:	Peff von P-HCl durch Schweinecornea, -sklera und Kaninchenkonjunktiva, n = 5-12, (*) p<0.05 verglichen mit der jeweiligen 2%igen P-HCl-Lösung; A: Permeationsmodell und Provenienz der Gewebe identisch; B: anderes Modell und andereTierspezies
Abb. 54:	Korrelation der Peff von P-HCl durch isolierte Gewebe und Zellkulturen, n=3-12, (*) p<0.05 verglichen mit isolierten Geweben
Abb. 55:	Veränderung [%] der Peff von P-HCl durch corneale und konjunktivale Epithelzellkultur unter Einfluss unterschiedlicher Formulierungsparameter
Abb. 56:	Permeation von D-Na (aus GBR/PG) und P-HCl (aus GBR) durch gelaserte Schweinecornea

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.