Scholz, Martina: In vitro-Permeationsstudien von hydrophilen und lipophilen Arzneistoffen an okularen Geweben und Zellkulturen

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Kapitel 4. Ergebnisse und Diskussion

4.1 Voruntersuchungen

4.1.1 Löslichkeitsversuche

4.1.1.1 Diclofenac-Na

D-Na ist im wässrigen Milieu nur wenig löslich [153], woraus sich eine relativ geringe Sät-tigungskonzentration von 0.57% Arzneistoff in GBR, der Pufferlösung für sämtliche Per-meationsversuche durch SS und SC, ergibt. Die Löslichkeitsstudien dienten hauptsächlich zur Vorbereitung der Permeationsuntersuchungen durch verschiedene okulare Gewebe und Zell-kulturen, da nur Wirkstoffmoleküle, die gelöst vorliegen, biologische Barrieren passieren kön-nen. Erfahrungsgemäß ist jedoch die Menge Arzneistoff, die durch ein intaktes okulares Ge-webe permeiert, gering. Um zu gewährleisten, dass eine nachweisbare Arzneistoffkonzen-tration im Akzeptor zu detektieren war, musste die Ausgangskonzentration an gelöstem Arz-neistoff entsprechend hoch gewählt werden.

Primär gelangten tensidische Verbindungen als Solubilisatoren zur Verbesserung der Löslich-keit von D-Na in GBR zur Testung. Oberhalb der kritischen Mizellkonzentration (CMC) eines Tensids kann es durch Zusatz zu einer wässrigen Arzneistoffsuspension zu einem mizel-laren Einschluss des Arzneistoffs und somit zu dessen Solubilisierung kommen. Ein Über-schreiten der CMC wurde durch die Konzentrationen 1, 5 und 10% der gewählten Tenside gewährleistet (vgl. Tabelle 5).

Tabelle 5: Beispiele von CMC-Werten (experimentell ermittelt)

Solubilisator

CMC [g/l]

BAC

0.11-0.7

Tween® 80

0.54

Cremophor® EL

0.5

Bei der Auswahl der löslichkeitsverbessernden Tenside (Abb. 13) stand die Verträglichkeit dieser Verbindungen im Vordergrund. Besonders bei Tween® 80 [114] und Synperonic® F 68 (SF 68) konnte auf Erfahrungen durch den Einsatz in ophthalmologischen Rezepturen zurück-


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gegriffen werden. SF 68 erwies sich in Verträglichkeitsstudien in Konzentrationen zwischen 10 und 20% als reizlos verträglich am Auge [154].

In den vorliegenden Studien wurde auf vergleichsweise niedrige Solubilisatorkonzentrationen (1, 5 und 10%) orientiert, da die Verweilzeit der tensidhaltigen Donatorlösung während der durchgeführten Permeationsversuche wesentlich länger war als unter in vivo-Bedingungen. Außerdem muss beachtet werden, dass Faktoren, die zum Abtransport von Augenzuberei-tungen nach topischer Applikation führen, z.B. nasolacrimale Drainage, während der in vitro-Permeationsversuche nicht zum Tragen kommen und somit 100% des eingesetzten Tensids während der gesamten Experimentdauer mit dem okularen Gewebe in Kontakt steht.

Abb. 13: Löslichkeitsverbesserung von D-Na in GBR (pH 7.4) mittels Solubilisatoren

Abb. 13 verdeutlicht, dass alle Tenside mit steigender Konzentration die Löslichkeit von D-Na in GBR erhöhen. SF 68 und Cremophor® EL (Cr EL) weisen eine vergleichbar hohe Solu-bilisierungskapazität auf. Bereits ein 1%iger Zusatz der beiden Tenside führte nahezu zur Verdoppelung der Löslichkeit von D-Na, und bei einer weiteren Erhöhung der Tensidkonzen-tration auf 5% resultierte eine Löslichkeitssteigerung um das 3.3 bis 3.5-fache. Mit einem Zusatz von 10% der beiden Solubilisatoren stieg die Löslichkeit auf das 3.7 bis 4fache.

1% Cremophor® RH 40 (Cr RH 40) verdoppelte die D-Na-Löslichkeit. Tensidkonzentrationen von 5 und 10% zeigten relativ geringe weitere Löslichkeitsverbesserung (jeweils ca. 2 mg/ml im Vergleich zum vorhergehenden Wert).


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Tween® 80 zeigte lediglich in 5- und 10%iger Konzentration löslichkeitsverbessernde Effekte, indem die Sättigungslöslichkeit von 0.57% D-Na in GBR auf 1 bzw. 1.3% erhöht wurde.

An Hand orientierender Permeationsversuche durch Schweinecornea unter Einsatz von je-weils 10% SF 68 bzw. Cr EL wurde festgestellt, dass der Arzneistoff bereits nach 30 min Versuchszeit quantitativ permeiert war. Dieser Befund ließ vermuten, dass innerhalb kurzer Zeit eine tensidbedingte Schädigung der Cornea erfolgt war, die zu einer gesteigerten Arznei-stoffpermeation führte. Es ist eine Wechselwirkung der Testemulgatoren mit den Lipiden der Zellmembran, verbunden mit einer Störung der Integrität dieser Barrieren, anzunehmen, die zu einem raschen Durchtritt großer Mengen an D-Na führte. Aufgrund dessen wurde die weitere Arbeit mit tensidischen Lösungsvermittlern eingestellt.

In Betracht kamen weiterhin Lösungsmittel (LM), wie Glycerol, Propylenglykol (PG), Mittel-kettige Triglyceride und Rizinusöl. Außer PG ergaben diese LM jedoch lediglich eine Lös-lichkeit von D-Na < 20 mg/ml, was nicht ausreichend für nachfolgende Permeationsstudien war. Dagegen erwies sich eine Mischung von 4.5 Teilen PG und 5.5 Teilen GBR mit einer D-Na-Sättigungslöslichkeit von 25.62 mg/ml als geeignet für die Durchführung von Per-meationsversuchen. Das hydrophile LM PG erhöht den Unordnungsgrad des Wassers und dadurch die Wasserstoffbrückenbindungsmöglichkeiten zum D-Na-Molekül. Als Folge wird die Wasserlöslichkeit des Arzneistoffs erhöht (Hydrotropierungseffekt).

4.1.1.2 Mycophenolatmofetil

MMF, das bisher nur systemisch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und zur Ver-hinderung von Transplantatabstoßungen eingesetzt wurde (vgl. 3.2.1.3.2), sollte im Rahmen dieser Dissertation als eine am Auge topisch applizierbare, wässrige Zubereitung formuliert und getestet werden. Die extrem geringe Löslichkeit von MMF in Wasser bei pH 7.4 (43 µg/ml) und GBR pH 7.4 (72 µg/ml) erforderte Maßnahmen zur Löslichkeitsverbesserung, um eine applikationsfähige, wässrige Lösung mit therapeutisch relevanter Konzentration zu kon-zipieren und, ähnlich wie bei D-Na, analytisch erfassbare Permeationsraten zu erzielen. Dabei gelangten zunächst die bereits unter 4.1.1.1 getesteten Tenside zur Überprüfung.


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Auch bei MMF ist eine deutliche Abhängigkeit der Löslichkeitsverbesserung von der Tensid-konzentration zu erkennen, die in diesem Fall jedoch eine direkte Proportionalität zeigte (Abb. 14).

Abb. 14: Löslichkeitsverbesserung von MMF in GBR (pH 7.4) mittels Solubilisatoren

Wie Abb. 14 zu entnehmen, erwiesen sich Tween® 80 und Cr EL als besonders geeignete Solubilisatoren. Bereits mit 1%igem Zusatz der beiden Tenside erfolgte eine Erhöhung der Sättigungskonzentration von MMF um das Vierfache. Eine weitere Steigerung der Tensid-konzentration auf 5% verbesserte die Löslichkeit ca. um den Faktor 17, und 10% Tensid in GBR führten zu einer Verbesserung ca. um den Faktor 36.

Cr RH 40 erbrachte durchschnittlich nur ein Drittel der lösungsvermittelnden Potenz von Tween® 80 und Cr EL. So konnte die Löslichkeit bei 1%igem Zusatz von Cr RH 40 im Vergleich zu tensidfreiem GBR-Puffer lediglich verdoppelt werden. Eine Konzentration von 5% des Solubilisators verfünffachte die Löslichkeit, und 10% erhöhten die Löslichkeit um das Elffache.

SF 68 erwies sich für MMF als am wenigsten zur Löslichkeitsverbesserung geeignet. Während mit 1% des Tensids keine nennenswerten Effekte resultierten, verdoppelten 5% des Solubilisators den gelösten Anteil des Arzneistoffs und 10% führten zu einer Verdreifachung.

Obwohl Tween® 80 und Cr EL als relevante Löslichkeitsvermittler für MMF zu bewerten sind, musste mit Blick auf die erhebliche Membranschädigung (vgl. 4.1.1.1), die innerhalb


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dieser Untersuchungen auch für Tween® 80 mittels Permeationsversuch getestet wurde, und mit dem Ziel einer anzustrebenden therapeutischen Konzentration von 1% MMF auf andere potentielle Lösungsvermittler orientiert werden.

Als weitere Möglichkeit zur Erhöhung des gelösten Anteils an Wirkstoff in der wässrigen MMF-Zubereitung wurde der Einsatz von CDen in Betracht gezogen. Die Wahl fiel auf HP-beta-CD, das neben einem hohen Potential zur Bildung von molekularen Einschlussverbin-dungen mit diversen Wirkstoffen [77,143,144,145], verbunden mit einer Erhöhung deren Lös-lichkeit, eine gute Verträglichkeit am Auge aufweist (vgl. 3.2.2.3.2). Abb. 15 gibt die Resul-tate der Löslichkeitstestung von MMF mit verschiedenen HP-beta-CD-Konzentrationen wieder.

Abb.15: Sättigungskonzentrationen von MMF, gemessen als unverändertes MMF und dem
Hydrolyseprodukt MPA nach Zusatz von HP-beta-CD

Wie in Abb. 15 dokumentiert, werden bei der analytischen Ermittlung der Sättigungslöslich-keit nach 12-stündigem Schütteln sowohl der Ester MMF als auch die freie Säure MPA erfasst. Das Verhältnis MMF : MPA schwankt ohne CD in GBR zwischen 5.4 : 1 bis 7.6 : 1 und verschiebt sich unter Zusatz von CD zugunsten des Hydrolyseproduktes.

Außerdem zeigt Abb. 15, dass mit zunehmender HP-beta-CD-Konzentration eine nicht-lineare Steigerung der Löslichkeit sowohl von MMF als auch des Hydrolyseprodukts MPA erfolgte. Im Konzentrationsbereich von 2.5-7.5% HP-beta-CD wurde etwa eine Verdoppelung der ge-lösten Esterkonzentration erzielt, die mit 10% des CDs um 1.6 mg/ml zu steigern war. Der Anteil der gefundenen Säure steigt kontinuierlich mit zunehmender CD-Konzentration, wobei


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ein sprunghafter Anstieg auf das 16- bzw. fast 20fache gegenüber dem Ansatz mit CD-freiem GBR bei Einsatz von 7.5 bzw. 10% HP-beta-CD erfolgte.

Da der löslichkeitsverbessernde Effekt für MMF durch HP-beta-CD nach diesen Versuchen als unbefriedigend hinsichtlich der erzielten Konzentrationen zu beurteilen war, folgten Unter-suchungen bei erhöhter Temperatur, entsprechend den Bedingungen der Autoklavierung (121°C, 200 kPa, 15 min).

Auch Loftsson [155] berichtete, dass ein Erhitzen von Arzneistoff und CD in einem Auto-klaven bei 120-140° C für 20-40 min die Komplexbildung erheblich fördert. Er beobachtete außerdem, dass wasserlösliche Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon und Hydroxypropyl-methylcellulose, das Ausmaß der Komplexierung erhöhen und sich dadurch die erforderliche Menge an CD verringern lässt. Darüber hinaus wird die Bioverfügbarkeit der Arzneistoffe erhöht [155].

Abb. 16: Löslichkeit von MMF (links) und MPA (rechts) in GBR (pH 7.4) in Abhängigkeit von
der HP-beta-CD-Konzentration (nach Autoklavieren, 15 min, 200kPa, 121° C)

Durch das Erhitzen der Suspensionen im Autoklaven wurde die Esterspaltung in Anwesenheit von HP-beta-CD weiter gefördert (vgl. 3.2.1.3.1). Die Hydrolyse erfolgte in allen Ansätzen in vergleichbarer Quantität, wobei der Ester noch zu ca. 44% vorlag und die Säure die restlichen ca. 56% ausmachte. Die nach dem Autoklavieren ermittelten Sättigungslöslichkeiten, sowohl für MMF als auch für MPA, verhalten sich annähernd proportional zur CD-Konzentration (Abb. 16).

Hervorzuheben ist, dass durch das Autoklavieren der Suspensionen die MMF-Löslichkeit im Vergleich zum Schütteln bei Raumtemperatur entscheidend verbessert werden konnte. So wurde eine Esterkonzentration von über 1% bei Zusatz von 10% HP-beta-CD erreicht, die


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geeignet für weitergehende Untersuchungen war. Die MPA-Konzentration betrug in diesem Ansatz 1.6%, was für folgende Untersuchungen aber eine untergeordnete Rolle spielte.

Die folgende Gleichgewichtsreaktion gilt, wenn ein Arzneistoffmolekül [D] einen Komplex mit einem beta-CD-Molekül [betaCD] bildet [156]:

Dabei beschreibt [DbetaCD] den Arzneistoff-beta-CD (1:1)-Komplex und [K1:1] die apparente Stabilitätskonstante des Komplexes. Durch das Lösen von MMF bzw. MPA im Autoklaven wurde die Komplexierungs-Effizienz von HP-beta-CD stark erhöht, welche als molares Verhält-nis des [DbetaCD]-Komplexes zur freien Konzentration an [betaCD] definiert werden kann [156]:

Wenn die Zubereitung mit dem Arzneistoff gesättigt ist, so ist die Konzentration an [D] gleich der Sättigungskonzentration des Arzneistoffs [S0]. Eine Steigerung der Komplex-ierungs-Effizienz kann also durch die Erhöhung von [K1:1] und [S0] oder beider Parameter erfolgen.

Für die jeweiligen CD-Komplexe in der wässrigen GBR-Lösung wurden die apparenten Stabilitätskonstanten KStab nach Higuchi und Connors [157] berechnet. Wie in Abb. 16 zu er-kennen, verlaufen die Löslichkeitsisothermen (nach Autoklavieren) sowohl für MMF als auch für MPA linear, so dass ein Typ AL-Verlauf anzunehmen ist, d.h. es handelt sich um Löslich-keitsdiagramme, bei denen der Löslichkeitsanstieg linear in Abhängigkeit von der CD-Kon-zentration erfolgt.

Auf der Berechnungsgrundlage von 1:1-Komplexen lassen sich der Geradenanstieg tan alpha und KStab [l/mol] nach


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und

ermitteln, wobei [G] und [G]T die Sättigungskonzentrationen des Arzneistoffs in Wasser ohne bzw. mit CD in mol/l angeben. [CD]T repräsentiert die jeweilige CD-Konzentration in mol/l.

Tabelle 6: Geradenanstieg tan alpha, Korrelationskoeffizienten R2 und apparente Komplex-
stabilitätskonstanten KStab der Systeme MMF/HP-beta-CD und MPA/HP-beta-CD

Komplex

tan alpha

R2

Kstab [l/mol]

MMF/HP-beta-CD

0.276

0.983

206.733

MPA/HP-beta-CD

0.746

0.970

6302.592

Folgende Einschränkungen müssen hinsichtlich der berechneten KStab gemacht werden:

Ausgehend von den berechneten KStab-Werten für MMF/HP-beta-CD und MPA/HP-beta-CD (Tabelle 6) lässt sich schlussfolgern, dass MPA einen stabileren Einschlusskomplex mit HP-beta-CD bildet. Wahrscheinlich ist die Größe der Kavität von HP-beta-CD (beta-CD = 0.78 nm, _) für das kleinere MPA-Molekül besser geeignet, Komplexe zu bilden, als für das vergleichs-weise große MMF.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Methode, HP-beta-CD einer MMF-Suspen-sion zuzusetzen und diese Mischung zu autoklavieren, am effektivsten war hinsichtlich einer Verbesserung der Löslichkeit des Arzneistoffs. Da eine Konzentration von bis zu 12.5% HP-beta-CD am Auge als reizlos verträglich beurteilt wird, sind 10% des CDs durchaus vertretbar. Die Solubilisierung mittels Tensiden und der Einsatz von HP-beta-CD ohne zusätzliches Auto-klavieren waren dagegen im Sinne der Zielstellung uneffektiv und der Einsatz der Tenside darüber hinaus bedenklich.


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4.1.2 Charakterisierung der Donatorlösungen

Aufgrund des vorgesehenen Einsatzes der o.g. Arznei- und Hilfsstoffe in Form wässriger Lösungen wurden für die Formulierungen, die in den Permeationsstudien als Donatormedien zur Testung gelangten, ophthalmologisch relevante physikalisch-chemische Kenngrößen, wie Viskosität, Osmolalität, Brechungsindex (RI), Dichte und Oberflächenspannung (OS), ermittelt, um vor allem die Akzeptanz gegenüber den zu untersuchenden Geweben sicherzu-stellen. Zur Beurteilung der Polarität der verwendeten Arzneistoffe wurde der Verteilungs-koeffizient (VK) (Octanol/LM) bestimmt.

4.1.2.1 Pilocarpinhydrochlorid-Lösungen

Die für sämtliche in vitro-Studien verwendeten P-HCl-Lösungen können an Hand der phy-sikalisch-chemischen Daten (Tabelle 7) als verträglich für das okulare Gewebe angesehen werden.

Tabelle 7: Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen P-HCl-Lösungen

Wirk-/Hilfsstoffe

Medium

Viskosität
eta [mPas]

Osmolalität
[mOsmol/kg]

RI

Dichte rho
[g/cm
3]

OS sigma [mN/m]

pH

 

Wasser

0.893

0

1.330

0.995

70.49

6.54

 

GBR

0.825

364

1.332

1.001

58.45

7.32

P-HCl (2%)

GBR

0.722

373

1.336

1.004

57.61

6.72

+ BAC 0.01%

GBR

0.768

388

1.366

1.005

38.32

6.45

+ EDTA 0.05%

GBR

0.746

370

1.345

1.005

55.34

6.66

Die gemessene Osmolalität der Lösungen liegt leicht über dem isotonischen Bereich (290-310 mOsmol/kg), jedoch ist das Auge durchaus in der Lage, schwach hypertonische Lösungen bis etwa 445 mOsmol/kg zu tolerieren [159]. Cowle and Anderson [160] geben ferner an, dass hypertonische Lösungen am unverletzten Auge besser toleriert werden und weniger Schäden bzw. Permeabilitätsänderungen hervorrufen als hypotonische Lösungen.


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Der RI und die Dichte rho der untersuchten Lösungen stimmen gut mit den für die Tränen-flüssigkeit angegebenen Bereichen überein (RI: 1.336 - 1.357, rho: 1.004 - 1.005) [161].

Die Oberflächenspannungen aller Lösungen sind gegenüber dem Wasserwert (70.49 mN/m) [162] erniedrigt (Tabelle 7), können aber gut vom Auge vertragen werden, da die Tränen-flüssigkeit selbst oberflächenaktive Verbindungen enthält [30], die Werte zwischen 37-50 mN/m hervorrufen. Die gegenüber dem Wasserwert erniedrigte Oberflächenspannung des GBR-Puffers wird auf das enthaltene Glutathion zurückgeführt, das als Tripeptid (L-gamma-Glutamyl-L-cysteinylglycin) tensidische Eigenschaften aufweist. Die weitere Absenkung der Oberflächenspannung in der Lösung, die BAC enthält, ist dem amphiphilen Charakter dieses Konservierungsmittels zuzuschreiben und verbessert die Spreitung auf der Augenoberfläche.

Das Auge ist gegen Abweichungen vom pH-Wert der Tränenflüssigkeit nicht allzu empfind-lich, so dass Lösungen zwischen pH 7-9 reizlos vertragen werden. Auch pH-Werte zwischen 5-10 (ungepuffert) verursachen noch keine deutliche Steigerung des Tränenflusses oder Schä-digung der Gewebe [2], wobei saure Lösungen als weniger verträglich gelten als alkalische. Die gemessenen Viskositäten werden reizlos vom Auge vertragen.

4.1.2.2 Diclofenac-Natrium-Lösung

Wie schon erwähnt, wurde zur Löslichkeitsverbesserung von D-Na in GBR PG eingesetzt (vgl. 4.1.1.1). Dieses LM findet vor allem in der Dermopharmazie vielfältige Anwendung; es fördert die Emulsionsbildung, wirkt als Weichmacher, Konservierungs- und Feuchthalte-mittel, ferner als LM für etherische Öle und diverse Wirkstoffe bzw. sorgt für deren gute Dispergierung. Laut Fiedler [163] verursacht unverdünntes PG lediglich eine geringe Reizung an der Kaninchenaugenschleimhaut, wobei beachtet werden muss, dass in vorliegender Arbeit das PG mit GBR verdünnt wurde (4.5 : 5.5).

Der Zusatz von PG führte zu einer deutlichen Erhöhung der Viskosität eta (25° C) der D-Na-Lösung gegenüber GBR (Tabelle 8), was mit der hohen Eigenviskosität dieses LMs (55 mPas) zu begründen ist [163]. Jedoch liegt der gemessene Wert im Bereich der für die Trä-nenflüssigkeit angegeben Grenzen (1.3 - 5.9 mPas [161] bzw. 1.05 - 1.93 mPas [164]). Eine Erhöhung der Viskosität von wässrigen Augentropfen kann zu einer verlängerten Verweilzeit der Formulierung sowie zur Verringerung der Reizwirkung beitragen [165].


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Die gemessene Tonizität in Anwesenheit von PG ist negativ zu beurteilen, da sie deutlich oberhalb der angegebenen Toleranzgrenze [159] liegt und damit die Eigenschaften der oku-laren Gewebe hinsichtlich Penetration und Permeation verändern kann. Hypertone Lösungen weisen wasserentziehende (entquellende) Eigenschaften auf, so dass ein Wasserverlust der Gewebe möglich ist (vgl. 4.1.4). Die Bewegung des Wassers aus dem Gewebe in die prä-corneal applizierte GBR/PG-Zubereitung zum Ausgleich des osmotischen Drucks ist der Arz-neistoffbewegung in das Gewebe entgegen gerichtet. Resultierend könnten Behinderungen der Diffusion von D-Na auftreten. Jedoch musste dieser Kompromiss aus Gründen der ana-lytischen Erfassbarkeit (vgl. 4.2.5) eingegangen werden.

Tabelle 8: Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen D-Na-Lösung

Wirkstoff

Medium

Viskosität
eta [mPas]

Osmolalität
[mOsmol/kg]

RI

Dichte rho
[g/cm
3]

OS sigma [mN/m]

pH

 

GBR

0.825

364

1.332

1.001

58.45

7.32

D-Na (2%)

GBR/PG

3.454

2518

1.384

1.037

44.16

9.30

Dichte und RI der Donatorlösung (D-Na in GBR/PG) (Tabelle 8) liegen etwas höher als die für die Tränenflüssigkeit angegebenen Werte (s.v.), wiederum verursacht durch das PG (rho = 1.0364 g/cm3 und RI = 1.4328) [163].

Die gemessene Oberflächenspannung kann als tolerabel betrachtet werden [30]. Der pH-Wert der 2%igen D-Na-Lösung wurde zur Verwendung bei den Permeationsversuchen von 9.30 mit Hilfe von 0.1N HCl auf pH 7.4 korrigiert.

4.1.2.3 Mycophenolatmofetil- und Mycophenolsäure-Lösung

Die physikalisch-chemischen Kenngrößen der MMF- bzw. MPA-Lösung, die in Permeations-studien als Donatorlösung getestet wurden, sind in Tabelle 9 aufgelistet. Daraus sind keine negativen Auffälligkeiten der bestimmten Parameter ersichtlich, so dass diese Formulierungen bedenkenlos eingesetzt werden können.

Erwartungsgemäß steigen, verursacht durch den Zusatz von 10% HP-beta-CD, die Tonizität und Viskosität der Lösungen im Vergleich zu GBR leicht an (Tabelle 9). RI und rho der untersuchten Lösungen zeigen lediglich geringe Veränderungen, die vom Auge toleriert werden.


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Eine minimale Abnahme der Oberflächenspannung durch den Einsatz von HP-beta-CD (Tabelle 9), kann auf die oberflächenaktiven Eigenschaften dieses Hilfsstoffs zurückgeführt werden (hydro-phile äußere Oberfläche und hydrophobe zentrale Kavität) [166]. Auch hier sind die Werte der Oberflächenspannung denen der Tränenflüssigkeit sehr ähnlich (vgl. 2.1.2.1). Die Ausgangs-pH-Werte werden durch Arznei- und Hilfsstoffzusatz kaum verändert.

Tabelle 9: Physikalisch-chemische Kenngrößen wässriger MMF/HP-beta-CD- und MPA/HP-beta-CD-Lösungen

Wirkstoff/CD

Medium

Viskosität
eta [mPas]

Osmolalität
[mOsmol/kg]

RI

Dichte rho
[g/cm
3]

OS sigma [mN/m]

pH

 

GBR

0.825

364

1.331

1.001

58.45

7.32

MMF (1%*)/
HP-beta-CD (10.0%)

GBR

0.990

410

1.348

1.035

55.13

7.28

MPA (0.74%)/
HP-beta-CD (10.0%)

GBR

0.998

397

1.337

1.030

50.91

7.20

*MMF-Ausgangskonzentration; nach Autoklavierung lagen 0.43% MMF und 0.57% MPA vor

4.1.2.4 Verteilungskoeffizienten der Arzneistoffe

Durch die Bestimmung des VK können Aussagen über das Ausmaß der Verteilung eines Stoffs zwischen einer lipophilen, nicht mit Wasser mischbaren Phase (z.B. Octanol) und einer hydro-philen, wässrigen Phase getroffen werden. Dementsprechend sind vergleichende Aussagen über die Polarität und mögliche Auswirkungen auf das Resorptionsverhalten der untersuchten Verbin-dungen möglich.

Tabelle 10 gibt einen Überblick über die VK der in dieser Arbeit verwendeten Arzneistoffe in GBR. Auf die Bestimmung von VK in GBR/PG (D-Na-Zubereitungen) wurde verzichtet, da PG die Mischbarkeit von Octanol mit Wasser bzw. GBR fördert und die Ergebnisse nicht aussagekräftig wären.

Der niedrige VK von P-HCl in GBR spricht für den hydrophilen Charakter dieses Arzneistoffs (Tabelle 10), wohingegen die P-Base deutlich lipophiler ist. Zusätzlich muss angemerkt wer-den, dass der VK einer ionischen Verbindung, wie P-HCl, in hohem Maße vom pH-Wert der verwendeten Pufferlösung und dem daraus resultierenden Ionisationsgrad alphaa abhängig ist.


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D-Na weist als Salz eine relativ hohe Lipophilie auf, was der hohe VK in GBR verdeutlicht (Tabelle 10) und zusätzlich durch die relativ schlechte Wasserlöslichkeit (vgl. 4.1.1.1) zum Ausdruck kommt.

Tabelle 10: Verteilungskoeffizienten VK (Octanol/GBR) für die angewendeten Arzneistoffe

Substanz

VK

P-HCl (2%)

0.229

P-Base (2%)

1.03

D-Na (2%)

13.46

MMF (0.88%), (RT)

23.41

MPA (0.12%), (RT)

3.73

MMF (0.43%), HP-beta-CD (10%)(A)

12.25

MPA (0.57%),HP-beta-CD (10%)(A)

0.46

RT=Raumtemperatur, A=autoklaviert

Auch bei MMF ließ sich eine ausgeprägte Lipophilie in Form eines hohen VK in GBR feststellen (Tabelle 10). Vermessen wurde der Überstand einer 1%igen MMF-Suspension in GBR, die bei Raumtemperatur zubereitet wurde bzw. eine 1%ige MMF-Lösung in GBR/HP-beta-CD, die unter Autoklavierung hergestellt wurde (vgl. 4.1.1.2). Dabei trat sowohl bei Raum-temperatur als auch beim Erhitzen eine Esterhydrolyse auf, so dass MPA neben MMF vorlag und der VK von beiden Komponenten bestimmt werden musste (Tabelle 10). Durch den Zusatz von 10% HP-beta-CD und anschließendes Autoklavieren der Suspension konnte der VK von MMF um ca. die Hälfte reduziert werden. Es ist anzunehmen, dass der verringerte VK durch den Einschluss von MMF in die HP-beta-CD-Kavität verursacht wird, denn die CDe selbst haben einen niedrigen VK (0.020-0.123) [158] aufgrund ihres hydrophilen Charakters. Bei MPA erfolgte durch den Zusatz von 10% HP-beta-CD und anschließendem Autoklavieren der Suspension eine Senkung des VK auf ein Achtel.

Es sei angemerkt, dass CDe in ihre kanalartigen Strukturen auch Octanolmoleküle einschlies-sen können [128], so dass dadurch eine Beeinflussung des VK erfolgen kann.


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4.1.3 Proteinbestimmung von okularen Geweben

4.1.3.1 Allgemeines

Die Tränenflüssigkeit des Menschen enthält etwa 10% der Proteinmenge des Serums. Neben Albuminen und Globulinen findet sich Lysozym. Weiterhin muss beachtet werden, dass sämtliche Augengewebe Proteine enthalten, die in der Lage sind, einen Arzneistoff mehr oder weniger zu binden (Abb. 17).

Abb. 17: Schema der Bewegung von Arzneistoffen und Augenflüssigkeiten und deren
Zusammensetzung im vorderen Bereich des Auges [34]

Arzneistoffmoleküle, die an Proteine des Tränenfilms oder an okulare Gewebe gebunden wer-den, können ihre Wirkung nur verzögert oder nicht mehr entfalten. Diesbezüglich unter-suchten z.B. Mikkelson et al. [34] Pilocarpinnitrat, Sulfafurazol und Methylprednisolon. Aus


51

dieser Studie geht hervor, dass ein Zusatz von 3% Protein in Form von Serumalbumin den miotischen Effekt des Pilocarpins am Kaninchenauge auf etwa die Hälfte herabsetzt, ein Zusatz von 1% Serumalbumin vermindert die Miosis um 25%.

Im Hinblick auf die in dieser Arbeit durchgeführten Penetrations- und Permeationsunter-suchungen erschien es unerlässlich, die Proteingehalte der untersuchten okularen Gewebe zu bestimmen, da sie einen Einfluss auf die Arzneistoffdiffusion durch die Gewebe haben. Miller et al. [167] ermittelten mittels Ultrazentrifugation, dass 0.27 Pilocarpinanteile an Rinder-serumalbumin gebunden werden. Mikkelson et al. [34] bestimmten mittels Gleichgewichts-dialyse die Bindung von radioaktiv markiertem Pilocarpinnitrat an die Proteinfraktion des Ka-ninchenkammerwassers und fanden in Abhängigkeit von der eingesetzten Wirkstoffkonzen-tration (0.5 - 4 x 10-7 mol/l) zwischen 0.55 und 0.44 gebundene Wirkstoffanteile. Der gebun-dene Pilocarpinanteil ist als gering einzuschätzen, könnte aber für D-Na und MMF einen höheren Wert aufweisen.

4.1.3.2 Schweinecornea und Schweinesklera

Die Proteinbestimmung von exzidierter SC und SS erfolgte nach der Methode von Lowry. Basis dieser sehr häufig eingesetzten Proteinbestimmungsmethode ist die Molybdänblau-Reaktion. Hierbei wird sechswertiges Molybdän, eingesetzt als Heteropolyphosphorsäure, durch die Tyrosin-, Tryptophan-, Cystein- und Histidinreste des Proteins zum kolloidal gelösten Mischoxid (MoO2+MoO3) von blauer Farbe reduziert. In Anwesenheit von Cu2+ wird die Empfindlichkeit dieser Reaktion beträchtlich erhöht. Die Aufarbeitung der Gewebe ist unter 5.2.3.3 beschrieben.

Cornea und Sklera sind vorrangig kollagene Gewebe [168,169], unterscheiden sich aber in der Größe und Orientierung der Kollagenfasern, dem Wassergehalt und dem Mucopolysaccharid-gehalt [45] (vgl. 3.1.1/2).

Der für die SC ermittelte Proteingehalt von 118.96 µg/mg Gewebe (Feuchtgewicht) (Abb. 18) steht einem Referenzwert von 73 µg/mg Feuchtgewicht für Rinderaugen gegenüber [170]. Dieser Referenzwert wurde ebenfalls mit der Methode nach Lowry bestimmt, ungeachtet der Tatsache, dass kollagene Gewebe eigentlich mit kolorimetrischen Methoden erschwert zu bestimmen sind und die Gefahr besteht, einen zu geringen Proteingehalt zu erfassen [171]. Da Rinderaugen für die zitierte Studie [170] genutzt wurden, könnten sich die Abweichungen zu dem eigenen bestimmten Proteingehalt erklären.

Eine Alternative zum vollständigen Lösen der Hornhäute in Natronlauge (vgl. 5.2.3.3) mit anschließender Proteinbestimmung nach Lowry wäre die Fragmentierung der Gewebe in Na-acetat [170]. Das nicht filtrierbare Material bestünde dann hauptsächlich aus Kollagen, und der Rest wäre die sogenannte lösliche Proteinfraktion, die nach Abfiltrieren der unlöslichen Bestandteile bestimmt werden könnte.


52

Die Cornea besteht zu 75-80% aus Wasser, von dem sich die größte Menge im Stroma befindet, welches den Hauptteil der Cornea ausmacht [172]. Die restlichen 20-25% der Cornea bestehen aus einer zellulären Matrix (Epithel, Endothel) und einer extrazellulären Matrix. Letztere ist hauptsächlich aus Kollagen, Mucoproteinen und -polysacchariden (Stro-ma, Bowman-Membran, Descemet-Membran) aufgebaut [172] (vgl. 3.1.1). Ein ermittelter Proteingehalt von ca. 10%, bezogen auf das Feuchtgewicht stimmt relativ gut mit den An-gaben zum Aufbau der Cornea überein (vgl. 3.1.1), obgleich sich die Literaturangaben zur prozentualen Zusammensetzung der Hornhaut auf Humanaugen beziehen und in vorliegender Arbeit Schweinegewebe untersucht wurden.

Abb. 18: Proteingehalt von Schweinecornea und -sklera [µg/mg Gewebe], n=12

In isolierter SS beträgt die ermittelte Proteinkonzentration etwa nur die Hälfte (60.64 µg/mg Feuchtgewicht) verglichen mit der Cornea (Abb. 18). Die Sklera ist frei von zellulärem Gewebe, und der Wassergehalt beträgt 65-75% (vgl. 3.1.2). Kollagen, welches einen hohen Hydroxyprolingehalt aufweist, macht 75% des Trockengewichts der Sklera aus, der Rest besteht aus nichtkollagenen Proteinen und Mucopolysacchariden [56].

Schlussfolgernd aus dieser Studie wäre ein größerer Anteil gebundenen Arzneistoffs bei der Corneapassage verglichen mit dem skleralen Permeationsweg, verbunden mit einer stärkeren Verzögerung des Wirkungseintritts bzw. einem höheren Wirkungsverlust, zu vermuten, da die Proteinkonzentration der Cornea ca. doppelt so hoch ist, wie die der Sklera. Eine Bestimmung der Proteinbindung der Arzneistoffe an SC und SS ist jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht erfolgt.


53

4.1.4 Hydratationsstudien an okularen Geweben

4.1.4.1 Allgemeines

Der Hydratationsgrad der okularen Gewebe spielt insbesondere bei der Cornea eine große Rolle, da das Hornhautstroma nur transparent bleibt, wenn es sich in einem relativ dehydra-tisierten, durch Kollagen, Mucopolysaccharide und Salze bedingten hypertonen Zustand befindet. Dieser kommt in vivo dadurch zustande, dass die Grenzschichten der Hornhaut, nämlich Epithel und Endothel, den Einstrom von Wasser regulieren [173,174,175,176,177, 178].

Abb. 19: Schema der Wasseraufnahme und -abgabe in der Cornea (Endothel = Barriere und Pumpe) [38]

Das fünf- bis sechsschichtige Plattenepithel der Hornhaut ist besonders in seinen äußeren Schichten durch dichte, interzelluläre Verknüpfungen, die Zonulae occludentes, verbunden und bildet eine stabile Schutzschicht [179]. Die Zellen des Endothels sind nicht so lückenlos von Zonulae occludentes umgeben [180,181,182], so dass es nicht nur für Wasser, sondern auch für höher molekulare Substanzen leichter interzellulär passierbar ist [175,183]. Beiden Schichten ist ihre Funktion sowohl als Barriere als auch semipermeable Membran gemein-sam, wobei das Epithel weniger für Wasser, Ionen und andere Substanzen durchlässig ist als das Endothel. Die Wasserdurchlässigkeit ist an der normalen menschlichen Hornhaut für das Endothel 3.4mal größer als für das Epithel [184].


54

Unter physiologischen Bedingungen fließen aus dem Kammerwasser kontinuierlich 5 µl/cm2 Flüssigkeit pro Stunde [176] in das Stroma und versorgen auf diese Weise das Gewebe mit Substraten für den Energie- und Baustoffwechsel [185]. Zum Ausgleich wird durch aktiven Bikarbonat-Transport der Endothelzellen kontinuierlich Wasser aus dem Stroma in das Kam-merwasser abgeführt, wobei gleichzeitig Stoffwechselprodukte in das Kammerwasser abge-geben werden (Abb. 19).

Sofern die Regulation dieses Wasseraustausches auf der endothelialen Seite versagt, nimmt das Stroma vermehrt Wasser auf, das in Richtung Epithel fließt. Dabei wird die geordnete Struktur der kollagenen Fibrillen verändert (Abb. 20), so dass Lichtstreuung und Hornhaut-trübung die Folge sind.

Abb. 20: Versagen der Endothelfunktion führt zur ungehinderten Flüssigkeitsaufnahme in das Stroma und Epithel [38]

Fließt das Wasser weiter in Richtung Epithel, kommt es wegen dessen geringer Durch-lässigkeit zur subepithelialen und intraepithelialen Wasseransammlung, also dem klinischen Bild der bullösen Keratopathie.

4.1.4.2 Schweinecornea

Die Hydratation von SC spielte bei den Penetrations- und Permeationsstudien dieser Arbeit insofern eine Rolle, da der Quellungszustand des Gewebes einen Einfluss auf den Arzneistoff-transport in und durch das Gewebe hat.

Zur Untersuchung gelangten intakte isolierte Hornhäute (SC), Hornhäute mit 50% Epithel (SC 50%) und ohne Epithel (SCo.E). Die Gewebe wurden jeweils über unterschiedlich lange


55

Zeiträume in Wasser, GBR oder GBR/PG inkubiert (vgl. 5.2.4), um den Einfluss der Inku-bationsmedien auf die Hydratation der Gewebe zu bestimmen.

Die durchschnittliche Hydratation unbehandelter Hornhäute direkt nach dem Isolieren vom Auge des Schlachttiers betrug 78.86 ± 2.07% und bestätigte damit die in der Literatur ange-gebenen Werte von 75-80% [172]. Frisch isolierte Hornhäute, denen vor dem Exzidieren 50% des Epithels mit Hilfe eines Excimer-Lasers abladiert wurden (vgl. 5.2.8.2), wiesen eine Hy-dratation von 79.19 ± 0.26% auf. 80.26 ± 0.77% Hydratation zeigten frisch isolierte corneale Gewebe, die einer mechanischen, totalen Epithelabrasio mittels Skalpell unterlagen. Der be-rechnete Wassergehalt betrug zwischen 3.77 und 4.12 mg/mg Gewebe und ist mit den von Doughty [170] gefundenen Werten von 3.62 mg/mg Gewebe vergleichbar.

Zunächst soll der Einfluss unterschiedlicher Epitheldicke auf die Hydratation bzw. Wasser-aufnahme über einen definierten Zeitraum in den drei wässrigen Testmedien diskutiert werden.

In allen drei Inkubationsmedien war nach 5-stündiger Aufbewahrung eine statistisch signifi-kante Veränderung der Hydratation der Hornhäute gegenüber dem Ausgangswert zu verzeich-nen (Abb. 21). Im Medium Wasser steigerte sich die Hydratation aller Gewebe innerhalb der ersten Stunde um ca. 10% (Abb. 21A), gefolgt von einem nur noch minimalen Anstieg (3-5%) bis auf ~ 93% zu Versuchsende. Hierbei spielte es keine wesentliche Rolle, ob das Epithel intakt, zu 50% abladiert oder völlig entfernt war. Allerdings ergab sich lediglich für Hornhäute ohne Epithel eine über den gesamten Zeitraum signifikant erhöhte Hydratation, verglichen mit SC.

Bei Betrachtung des Wassergehaltes und der Wasseraufnahme (Tabelle 11) kann festgestellt werden, dass zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied zwischen SC und SC 50% im Medium Wasser auftrat, wohl aber zwischen SC und SCo.E. Nach 1, 2 und 5 h wiesen Horn-häute ohne Epithel einen signifikant höheren Wassergehalt auf, und die Wasseraufnahme er-folgte in erhöhtem Ausmaß.

Ein ähnlicher Kurvenverlauf ist für GBR zu beobachten, wobei die Zunahme der Hydratation bis zur ersten Stunde nicht so sprunghaft verläuft (Abb. 21B) wie in Wasser. Hier erfolgt eine mäßige Zunahme der Hydratation um 3-6%. Ähnlich wie bei Wasser als Inkubationsmedium


56

unterscheiden sich die Hydratationswerte von SC und SC 50% nur nach 1 h signifikant und weisen danach fast identische Zahlenwerte auf. Ebenfalls wie in Wasser erfolgte in GBR eine signifikant stärkere Hydratisierung der epithelfreien SC im Vergleich zu intakter Hornhaut, ausgenommen nach 5 h.

Abb. 21: Hydratation von Schweinecornea (unbehandelt, 50% Epithel, ohne Epithel) nach Inkubation in Wasser, GBR bzw. GBR/PG, n=4, (*) p<0.05 verglichen mit SC

Der Wassergehalt von SC 50% ist in Korrelation zur Hydratation nur nach 1 h signifikant höher als in SC (Tabelle 11). Die Wasseraufnahme ist zu jedem Zeitpunkt geringer, außer nach 4 h, als bei intakter Cornea. Das Fehlen des Epithels bei SCo.E zeigt sich deutlich in einem höheren Wassergehalt zu fast jedem Zeitpunkt, verglichen mit SC, ähnlich wie die Wasseraufnahme, die in allen Fällen signifikant erhöht ist.


57

Anders gestaltet sich der Kurvenverlauf für das Medium GBR/PG (Abb. 21C). Auch hier ver-ändert sich die Hydratation sowohl der unbehandelten als auch behandelten Hornhäute über den Versuchszeitraum von 5 h signifikant, jedoch ist das Vorzeichen der Änderung negativ, d.h., die Hydratation sinkt im Vergleich zum Ausgangswert. Dabei weisen corneale Gewebe mit nur 50% Epithel die größte Hydratation auf, so dass keine Korrelation mit der Epithel-dicke zu erkennen ist. So wies unbehandelte SC nach 5 h einen Hydratationsgrad von ~ 55%, SC 50% von ~ 69% und SCo.E von ~ 58% auf. SC und SCo.E erreichen nach 1-stündiger Inkubation in GBR/PG den niedrigsten Wert (Verringerung des Wassergehalts um ca. die Hälfte). Die Wasseraufnahme (Tabelle 11) hat für SC und SC 50% durchgängig ein negatives Vorzeichen, was bedeutet, dass Wasser dem Gewebe entzogen wird, wofür das PG im Lö-sungsmedium verantwortlich sein dürfte.

Aus Abb. 21 und Tabelle 11 wird deutlich, dass das Epithel bei der Regulierung des Wasser-gehaltes der Cornea, in Abhängigkeit vom kontaktierendem Medium, durchaus eine Rolle spielt. Auch wenn die Reduktion der Epitheldicke um die Hälfte, zumindest unter Einfluss von Wasser und GBR als Inkubationsflüssigkeit, kaum Effekte hervorbrachte, so waren deut-liche Einflüsse auf den Wassergehalt der cornealen Gewebe ohne Epithel zu erfassen, obwohl das Epithel vorrangig als Barriere dient und nicht aktiv an den Transportprozessen des Was-sers beteiligt ist (vgl. 4.1.4).

Im Folgenden sollen die gefundenen Hydratationseffekte der drei Inkubationsmedien auf die cornealen Gewebe (Tabelle 11) vergleichend betrachtet und interpretiert werden.

Auffällig ist die starke Hydratation während der ersten Inkubationsstunde in Wasser, was mit der hypertonen Natur der Cornea gegenüber Wasser erklärbar ist (vgl. 3.1.1). Demnach rufen die Mucopolysaccharide, das Kollagen und vor allem die darin gelösten Salze des Stromas einen osmotischen Druck hervor, der die Wasseraufnahme bewirkt, um einen Konzentrations-ausgleich herbeizuführen. Nach der ersten Stunde verringerte sich die Wasseraufnahme, und damit nahm die Quellung der Hornhäute nur noch geringfügig zu. Zwischen den Inkuba-tionszeiten 3, 4 und 5 h war kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Wassergehaltes mehr feststellbar, unabhängig von der Vorbehandlung des Gewebes.


58

Die Quellung der Hornhäute in GBR erfolgte dagegen über den gesamten Zeitraum von 5 h in signifikant geringerem Ausmaß (Tabelle 11). GBR wird in isotonisierter Form verwendet, d.h. die Tonizität liegt im physiologischen Bereich der Tränen- bzw. der Gewebeflüssigkeit. Es wird angenommen, dass die Flüssigkeit des Stromas eine Mischung von Salzen mono- und divalenter Kationen mit einer Osmolalität von ca. 300 mOsmol/kg und einem pH zwischen 6.5 und 8.8 darstellt [186]. Somit sollte GBR keine Wasseraufnahme bzw. -abgabe in das Ge-webe verursachen, besonders da für das natürliche Puffersystem eine Bicarbonat/Kohlen-säure-Basis postuliert wird [187] und damit eine ähnliche Zusammensetzung von GBR (vgl. 5.1.5) und intrastromaler Flüssigkeit gegeben ist [170]. Gefundene Hydratationseffekte, be-

sonders an SCo.E, lassen sich darauf zurückführen, dass die cornealen Gewebe isoliert vorlie-gen und damit das Endothel seine aktive Funktion als Pumpe und seine passive Funktion als Barriere nicht einwandfrei erfüllen kann. Außerdem fehlen umliegende Gewebe, wie z.B. die Sklera, die ein Eindringen von Wasser über die Seitenränder verhindern.

Tabelle 11: Wassergehalt (WG) und Wasseraufnahme (WA) in [mg/mg Gewebe] von Schweinecornea (1) unbehandelt, (2) 50% Epithel und (3) ohne Epithel nach Inkubation in Wasser, GBR oder GBR/PG

 

 

Wasser

GBR

GBR/PG

 

t[h]

WG

WA

WG

WA

WG

WA

1

0

3.77 (0.43)2

02

3.77 (0.43)

0

3.77 (0.43)2

02

1

6.98 (0.27)

3.19 (0.26)

4.52 (0.33)1

1.31 (0.27)

1.24 (0.16)

-1.00 (0.15)

2

9.06 (1.54)

4.93 (1.55)

5.54 (0.64)

2.21 (0.31)

1.23 (0.07)

-0.73 (0.05)

3

10.51 (1.20)

6.21 (0.98)

6.16 (0.61)

2.97 (0.57)

1.15 (0.06)

-0.53 (0.12)

4

11.04 (1.75)

6.53 (1.30)

6.25 (0.70)

3.04 (0.33)

1.29 (0.11)

-0.09 (0.19)1

5

12.03 (1.34)

7.84 (1.19)

7.56 (1.46)

4.11 (0.83)

1.24 (0.10)

-0.01 (0.07)1

2

0

3.81 (0.06)2

02

3.81 (0.06)

0

3.81 (0.06)2

02

1

6.82 (0.61)

2.35 (0.44)

5.15 (0.15)3

1.02 (0.03)3

1.63 (0.05)3

-1.18 (0.07)3

2

8.33 (0.59)

4.16 (0.51)

5.42 (0.25)

1.71 (0.05)3

1.92 (0.15)3

-0.96 (0.18)3

3

9.58 (0.93)

5.20 (0.71)

5.99 (0.22)

2.29 (0.19)3

1.86 (0.30)3

-0.43 (0.15)

4

9.33 (0.47)

5.30 (0.34)

6.55 (0.52)

2.84 (0.05)

2.22 (0.25)3

-0.53 (0.19)3

5

12.14 (0.60)

7.86 (0.55)

7.03 (0.13)

3.22 (0.13)3

2.21 (0.09)3

-0.22 (0.02)3

3

0

4.12 (0.20)2

02

4.12 (0.20)

0

4.12 (0.20)2

02

1

10.61 (1.76)3

6.10 (1.75)3

6.58 (0.26)3

2.10 (0.10)3

1.33 (0.05)

-0.26 (0.05)3

 

2

11.98 (0.32)3

7.24 (0.52)3

7.60 (0.38)3

3.14 (0.30)3

2.40 (0.02)3

0.16 (0.06)13

3

11.18 (1.28)

6.69 (1.24)

8.29 (0.31)3

4.01 (0.25)3

1.58 (0.13)3

0.01 (0.22)13

4

13.15 (1.61)

8.02 (1.57)

8.63 (0.22)3

4.51 (0.29)3

1.48 (0.17)

0.16 (0.17)1

5

14.28 (0.85)3

9.70 (0.70)3

8.79 (0.23)

5.03 (0.29)3

1.40 (0.19)

0.41 (0.06)3

n=4, (1) p>0.051) verglichen mit 0 h, (2) p>0.051) verglichen mit GBR, (3) p<0.05 verglichen mit SC, SD in Klammern

Während das im Vergleich zu Puffer hypotone Wasser eine Verdreifachung des Wasserge-haltes im Gewebe nach 5 h verursachte, führte GBR nur zu einer Verdoppelung. Auch in GBR erfolgte die größte Wasseraufnahme innerhalb der ersten Stunde, jedoch verlief die an-schließende Quellung in geringerem Ausmaß. Die Wassergehalte unterscheiden sich nach der ersten Stunde teilweise nicht mehr signifikant.


59

Wie erwartet, erfolgte in dem Inkubationsmedium GBR/PG eine Entquellung der Hornhäute (Tabelle 11). Ursache ist die deutlich erhöhte Tonizität dieses Mediums (2518 mOsmol/kg), verglichen mit der Gewebeflüssigkeit. Nach 5 h ist der Wassergehalt der Cornea auf die Hälfte (SC 50%) bzw. auf ein Drittel (SC, SCo.E) des Ausgangswertes reduziert. Der größte Teil des Wassers wird den Hornhäuten innerhalb der ersten Stunde entzogen, danach ändert sich der Hydratationsgrad kaum noch. Im Vergleich zum Inkubationsmedium Wasser beträgt der Wassergehalt nach 5 h nur ca. 10-20% und im Vergleich zum Inkubationsmedium GBR ca. 20-30%. Anzumerken ist allerdings, dass die erschwerte Trocknung der in GBR/PG inku-bierten Gewebe eine Fehlerquelle darstellen kann.

Als Fazit dieser Hydratationsstudie erwies sich GBR als am besten geeignetes Versuchs-medium für die nachfolgenden Permeationsstudien, da der Einfluss auf den Wasserhaushalt der cornealen Gewebe am geringsten war. Allgemein werden bevorzugt CO2-gesättigte, bicar-bonathaltige Salzlösungen eingesetzt, um Gewebe nach der Isolierung so lange wie möglich nahe dem physiologischen Niveau zu halten [170].

Wasser als Inkubationsmedium verursachte eine deutlich stärkere Quellung der Hornhäute innerhalb der Versuchszeit von 5 h gegenüber GBR und GBR/PG. Ähnliches fand Doughty [170], der verschiedene Inkubationsmedien testete. Eine 35 mM Bicarbonat-Salzlösung, die mit CO2 abgesättigt war und Glucose enthielt, rief nur eine geringe stromale Quellung hervor (z.B. im Vergleich zu einer physiologischen Salzlösung oder phosphatgepufferten Kochsalz-lösung), während Wasser die deutlich stärkste Gewebequellung im Vergleich mit verschiedenen Puffersystemen verursachte. Innerhalb der Hydratationsstudien dieser Arbeit verrin-gerte GBR/PG die Hydratation um ca. 50-65% und verursachte damit eine Entquellung der Hornhäute.

Aus diesen Untersuchungen ist abzuleiten, dass sowohl Wasser als auch GBR/PG Einfluss auf das Penetrations- und Permeationsverhalten durch diese Gewebe nehmen könnten, da die Hy-dratationsniveaus außerhalb der physiologischen Grenzen liegen (vgl. 4.1.4.1).

4.1.4.3 Schweinesklera

Auch für die Sklera spielt der Hydratationszustand eine Rolle bezüglich des Arzneistoff-transportes durch dieses Gewebe. So berichteten Boubriak et al. [188], dass der Diffusions-


60

koeffizient und der VK von Arzneistoffen auf veränderte Hydratation reagieren; beide Koeffi-zienten zeigten größere Werte bei steigender Hydratation.

In der vorliegenden Arbeit wurden die skleralen Gewebe mit den o.g. Inkubationsmedien über den gleichen Zeitraum behandelt wie die Hornhäute (vgl. 4.1.4.2). Die Bestimmung der Para-meter erfolgte ebenfalls in Analogie zu den cornealen Geweben (vgl. 5.2.4).

Die experimentell ermittelte Hydratation von frisch isolierter SS (Referenz), die keiner Inku-bation in einem Medium unterlag, betrug 67.09 ± 1.03%. In der Literatur [188] findet sich eine Angabe von 71.3 ± 3.9% Hydratation (vgl. 3.1.2). Der ermittelte Wassergehalt des Re-ferenzgewebes (2.04 ± 0.10 mg/mg SS) ist ebenfalls mit Literaturangaben (2.6 ± 0.4 mg/mg Gewebe, Kaninchen) [188] und (2.9 ± 0.2 mg/mg Gewebe, Mensch) [189] vergleichbar.

Abb. 22: Hydratation von Schweinesklera nach Inkubation in Wasser, GBR bzw. GBR/PG, n=4, (*) p<0.05 verglichen mit GBR

Die Effekte der verschiedenen Inkubationsmedien auf die Hydratation von SS sind vergleich-bar mit den Ergebnissen, die für corneale Gewebe gefunden wurden (Abb. 22). Im Ergebnis der SS-Studie resultierte über den Versuchszeitraum von 5 h eine signifikante Erhöhung der Hydratation durch Wasser und GBR (Abb. 22). Allerdings war der Effekt von Wasser gerin-ger (ca. 5%) gegenüber SC (ca. 13%), und die Hydratation blieb in physiologischen Grenzen. Im Gegensatz zu cornealen Geweben differierten jedoch Wasser und GBR nicht; tendenziell verursachte GBR sogar eine stärkere Zunahme der Hydratation. Die Quellung der Gewebe er-folgte hauptsächlich innerhalb der ersten Stunde und blieb dann auf dem gleichen Niveau.


61

Nach der Inkubation in GBR/PG weist die Wasseraufnahme in sklerale Gewebe ein negatives Vorzeichen auf, ausgenommen der 5 h-Wert, was einem Wasserentzug aus dem Gewebe ent-spricht. Bei Permeationsuntersuchungen an der Sklera könnte dieses Medium insofern den Arzneistofftransport beeinträchtigen.

Tabelle 12: Wassergehalt (WG) und Wasseraufnahme (WA) in [mg/mg Gewebe] von Schweinesklera nach Inkubation in Wasser, GBR oder GBR/PG

 

Wasser

GBR

GBR/PG

t[h]

WG

WA

WG

WA

WG

WA

0

2.04 (0.10)2

02

2.04 (0.10)

0

2.04 (0.10)2

02

1

2.46 (0.25)2

0.37 (0.06)2

2.47 (0.09)

0.50 (0.25)

0.76 (0.07)

-0.23 (0.07)

2

2.50 (0.25)2

0.32 (0.08)

2.53 (0.15)

0.53 (0.13)

0.80 (0.02)

-0.19 (0.06)

3

2.34 (0.17)

0.34 (0.12)

2.67 (0.23)

0.63 (0.19)

0.76 (0.03)

-0.16 (0.03)

4

2.44 (0.14)2

0.29 (0.04)

2.61 (0.15)

0.51 (0.09)

0.76 (0.06)

-0.05 (0.05)

5

2.34 (0.12)

0.20 (0.12)

2.55 (0.08)

0.47 (0.24)

0.86 (0.04)

0.02 (0.07)

n=4, (1) p>0.051) verglichen mit 0 h, (2) p>0.051) verglichen mit GBR, SD in Klammern

In Bezug auf die Hydratation der Sklera scheinen sowohl Wasser als auch GBR als Versuchs-medium geeignet zu sein. In beiden Fällen bleibt die Hydratation während 5 h im physio-logischen Bereich. Nicht auszuschließen ist allerdings ein Verlust an Proteinen durch Wasser. Darüber wurde zwar bisher nur für corneales Stroma berichtet [170], ist jedoch auch für die Sklera aufgrund der ähnlichen Morphologie denkbar. Doughty [170] fand nach 9-stündiger Inkubation von Rinderstroma in Wasser einen Proteinverlust von 25.7%, während in einem bicarbonathaltigen Puffer, der mit CO2 abgesättigt war, lediglich 2.7%Verlust festgestellt wurden. Unter diesem Gesichtspunkt ist GBR für Untersuchungen an der Sklera der Vorzug zu geben.

4.1.5 Wirkstoffpenetration

4.1.5.1 Allgemeines

Die Bestimmung der Wirkstoffaufnahme aus einer wässrigen Wirkstofflösung in das Gewebe spielt nicht nur nach Applikation am Auge (in vivo) eine erhebliche Rolle, sondern auch nach Applikation am isolierten Gewebe (in vitro). Auf diese Art und Weise ist es möglich, die Affinität des Arzneistoffs zum jeweiligen Gewebe abzuschätzen. In Anlehnung an den Ver-suchsablauf der Permeationsstudien (vgl. 5.2.6) wurden die isolierten SC und SS in die Ussing-Kammer gespannt und mit den gleichen Arzneistofflösungen behandelt wie bei den Permeationsuntersuchungen. Nach Versuchsende wurde der Arzneistoff aus den Geweben, deren Feuchtgewicht vorher bestimmt worden war (vgl. 5.2.5), isoliert und der Arzneistoff-gehalt in [mg/mg] berechnet.


62

Eine andere Möglichkeit zur Erfassung der in vitro-Arzneistoffaufnahme in die isolierten Gewebe, deren Feuchtgewichte ebenfalls vorher zu bestimmen sind, besteht in der Inkubation mit wirkstoffhaltiger Lösung unter konstanten Versuchsbedingungen durch Schütteln der Gewebeproben. Nach Zentrifugieren der Inkubationslösung wird der Wirkstoffgehalt im Überstand bestimmt. Aus der Differenz zwischen Wirkstoffausgangskonzentration und gefun-dener Konzentration nach Inkubation ließe sich die im Gewebe verbliebene Wirkstoff-konzentration, bezogen auf das Gewebefeuchtgewicht, berechnen.

Im Folgenden wurden die Aufnahme von P-HCl aus GBR und D-Na aus GBR/PG in SC und SS untersucht.

4.1.5.2 Pilocarpin-HCl

Abb. 23 gibt einen Überblick über den P-HCl-Gehalt in SC und SS nach Beendigung von Permeationsversuchen zu unterschiedlichen Zeiten. Zunächst ist auffällig, dass sich der P-HCl-Gehalt, sowohl in SC als auch in SS, über einen Gesamtzeitraum von 5 h nicht signifikant verändert, auch wenn bei SC ein Abwärtstrend der ermittelten Arzneistoff-konzentration zu verzeichnen ist. Das bedeutet, dass sich bereits nach der ersten Stunde des Experimentes ein Steady state zwischen dem Gewebe und den Flüssigkeitskompartimenten eingestellt hat. Im Steady state wird gleich viel Arzneistoff in das Gewebe aufgenommen wie abgegeben, so dass zu jeder Zeit der gleiche Arzneistoffgehalt im Gewebe gemessen wird.

Wie aus Abb. 23 weiter zu ersehen ist, weist SS generell einen höheren Gehalt an P-HCl auf als SC. Diese Tatsache ist mit der Struktur beider Gewebe zu begründen. Die Cornea ist im Vergleich zur Sklera ein lipophiles Gewebe, hauptsächlich bedingt durch das Epithel, und stellt gerade für hydrophile Arzneistoffe wie P-HCl die Hauptbarriere dar [190]. Für das kleine Wirkstoffmolekül ist es leichter, in die mit wässriger Flüssigkeit gefüllten Zwischen-


63

räume der Kollagenfasern der Sklera zu penetrieren. Abb. 23 zeigt, dass nach zwei Stunden der P-HCl-Gewebespiegel in der Sklera statistisch signifikant höher ist als in der Cornea.

Abb. 23: Aufnahme von P-HCl in isolierte Schweinecornea und -sklera, n = 6, (*) p<0.05verglichen mit Sklera

Lazare und Horlington [191] untersuchten ebenfalls die in vitro-Penetration von Pilocarpin, allerdings in Kaninchen- und Affenaugengeweben. In diesen Studien wurden die Gewebe (Iris und Ziliarkörper) in Inkubationslösung eingelegt und danach zur Arzneistoffgehaltsbestim-mung aufgearbeitet (s. S. 62). Allerdings konnten für die genannten Gewebe nur Konzentra-tionen im µg/g-Bereich gefunden werden, was auf unterschiedliche Versuchsbedingungen (Arzneistoffkonzentration, Tierspezies, Aufarbeitungsmethode, Inkubationsbedingungen) zurückzuführen sein dürfte. Auf ähnliche Weise untersuchten Miller et al. [167] das Aufnahme-vermögen von Pilocarpinnitrat in Kaninchencornea, Iris-Ziliarkörper und Linse. Sie ermit-telten dabei die höchste Wirkstoffaffinität zum Iris-Ziliarkörper, gefolgt von der Cornea und der Linse und gaben das unterschiedliche Bindungsvermögen der einzelnen Gewebe als Grund für diese Resultate an.

4.1.5.3 Diclofenac-Na

Im Vergleich zu P-HCl ist der sehr viel niedrigere Gehalt an D-Na [µg/mg] in cornealen und skleralen Geweben augenfällig. Verantwortlich dafür dürfte PG im Versuchsmedium GBR sein, das, verursacht durch eine erhöhte Tonizität (vgl. 4.1.2.2), einen Wasserentzug aus dem Gewebe (vgl. 4.1.4) bewirkt. Die Aufnahme von D-Na in das jeweilige Gewebe erfolgt entgegen dem Wasserstrom und wird offensichtlich insgesamt behindert. Außerdem ist die Affinität von D-Na zum Inkubationsmedium relativ hoch, so dass das Bestreben des Arznei-


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stoffs, in ein wässriges Medium ohne PG (corneales Stroma, Gewebeflüssigkeit von SS) überzuwechseln, als gering einzuschätzen ist.

Abb. 24: Aufnahme von D-Na in isolierte Schweinecornea und -sklera, n = 6, (*) p<0.05 verglichen mit Sklera

Während sich für P-HCl sowohl in SC als auch in SS innerhalb der ersten Stunde ein Gleich-gewichtszustand einstellte (Abb. 23), erfolgt dieser Prozess für D-Na lediglich in SS (Abb. 24). Im cornealen Gewebe steigt die D-Na-Konzentration dagegen linear an, was für eine Affinität des relativ lipophilen Arzneistoffs zum Corneaepithel spricht.

Die D-Na-Gewebespiegel der SC unterscheiden sich signifikant zu den unterschiedlichen Zeiten (außer 2 h verglichen mit 3 h), während für SS kein signifikanter Unterschied zu verifi-zieren ist (Abb. 24). Nach 5 h waren die Gewebekonzentrationen in SC und SS identisch (Abb. 24).

Die D-Na-Aufnahme in Kaninchencornea in vivo wurde von Palmero et al. [192] getestet. Dazu wurden den Kaninchen Augentropfen verabreicht und zu unterschiedlichen Zeiten nach der Tötung die Gewebe entnommen, aufbereitet und die D-Na-Konzentration vermessen. Trotz der völlig unterschiedlichen Versuchsbedingungen wurden in der Größenordnung [µg/mg] vergleichbare Ergebnisse in beiden Studien erhalten. Palmero ermittelte eine D-Na-Höchstkonzentration von 8.73 ± 0.56 µg/mg in der Cornea nach ca. 1.5 h. Der in dieser Studie nach 5 h gefundene Wert in SC betrug 3.41 ± 0.56 µg/mg.


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4.2 In vitro-Wirkstoffpermeation

4.2.1 Literaturübersicht zur okularen Permeabilität

Die verbreitetste Methode, eine Augenerkrankung zu behandeln, ist die Applikation von wässrigen Augentropfen in den unteren Konjunktivalsack. Der Wirkort kann auf der Gewebe-oberfläche sein (z.B. Konjunktivitis), aber die meisten Arzneistoffe müssen durch die oku-laren Gewebebarrieren (Cornea, Sklera und Konjunktiva) permeieren, um therapeutisch wirk-sam zu sein (u.a. Glaukom, intraokulare Entzündung, Infektion). Nach der Applikation von Augentropfen werden weniger als 5% der applizierten Dosis in die intraokularen Gewebe aufgenommen [193]. Das ist auf die Undurchlässigkeit des cornealen Epithels, die Tränen-produktion, die schnelle Ableitung über die nasolacrimalen Kanäle, den Lidschlag und die nicht-produktive Absorption in die Konjunktiva zurückzuführen (Abb. 25).

Eine Vielzahl unterschiedlicher in vitro-Modelle kann zur Erfassung einer hauptsächlich dif-fusionsbedingten Arzneistofffreisetzung aus festen, halbfesten und flüssigen Zubereitungen herangezogen werden. Grundsätzlich ist dabei zwischen reinen Dissolution-Modellen und Freisetzungsmodellen mit Membranen zu unterscheiden, wobei erstere vor allem bei der Prüfung der Arzneistoffliberation aus festen peroralen Arzneiformen von Relevanz sind [194]. Membranmodelle können entweder in Modelle mit künstlicher und/oder natürlicher Membran bzw. in Modelle mit horizontaler oder vertikaler Membrananordnung eingeteilt werden. Sie kommen vorrangig zur Anwendung, wenn der Einfluss einer ausgewählten Diffusionsbarriere auf den Freisetzungsprozess zu klären ist. Darüber hinaus kann der Einfluss unterschiedlicher Hilfsstoffzusätze und Formulierungsparameter auf den Liberations- und Permeationsvorgang unter konstanten Versuchsbedingungen beurteilt werden. Eine unmittelbare Vergleichbarkeit von Permeationsdaten verschiedener Provenienz ist angesichts der großen Anzahl an unter-schiedlichen in vitro-Versuchsanordnungen problematisch.

In vitro erhaltene Daten sind nur unter Vorbehalt auf in vivo-Situationen am Auge über-tragbar, da sämtliche Faktoren, die zum Verlust von Arzneistoff führen, wie z.B. der Lid-schlag (siehe oben) im in vitro-Modell vernachlässigt werden. In vitro-Permeationsstudien sind somit in erster Linie eine Orientierungshilfe zur Bewertung von Formulierungen, aber trotz der genannten Einschränkungen von erheblicher Bedeutung.


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Abb. 25: Schematische Darstellung der okularen Absorption nach topischer okularer Arzneistoffadministration [195]

4.2.1.1 Corneale Permeabilität

Im Allgemeinen stellt die Permeation durch die Cornea den Hauptweg für die Aufnahme von Arzneistoffen aus der Tränenflüssigkeit in das Innere des Auges dar [196,197]. Das lipophile Epithel ist dabei die Hauptbarriere für hydrophile Arzneistoffe [11,198], denn die Zonulae occludentes mit den Tight junctions umgeben vollständig die Oberflächenzellen des Epithels und versiegeln weitgehend den parazellulären Raum [199]. Damit limitieren die Tight junctions die Permeation von Molekülen zwischen den Zellen [199,200], sofern keine aktiven Transportmechanismen von den hydrophilen Substanzen genutzt werden [201,202]. Eine entsprechende Lipophilie der Arzneistoffe ist Voraussetzung für die transzelluläre Permeation im cornealen Epithel [203].


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Über die corneale Permeation von Arzneistoffen liegen bereits zahlreiche Untersuchungen vor. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Arzneistoffe determinieren den Permea-tionsweg und die Permeationsrate durch die Cornea. Ein wichtiger Parameter ist u.a. der VK [203]; in der Regel nimmt die Permeabilität mit steigender Lipophilie des Wirkstoffs bzw. höherem VK zu, jedoch wurde ein optimaler VK für die corneale Permeation zwischen 10 und 100 gefunden. Ein weiteres Ansteigen des VK reduziert die Permeation des Arzneistoffs [3]. Chien et al. [204] berichteten über einen parabolischen und Wang et al. [205] bzw. Saha et al. [206] über einen sigmoidalen Zusammenhang zwischen der Lipophilie des Pharmakons und dessen Bewegung durch die Cornea.

Molekülgröße und -form des Arzneistoffs sind weitere wichtige Faktoren, die die Permeation beeinflussen. Liaw und Robinson [207] bestimmten für hydrophiles Polyethylenglykol ein Cut-off für die corneale Permeation bei einer Mrel von 400-600. Sasaki et al. [208] berichten, dass die Permeation von hydrophilen Molekülen, wie Thyrotropin releasing hormon (Mrel 362), p-Nitrophenyl-beta-Zellopentaosid (Mrel 950), Fluoreszein-Isothiozyanat-Dextrine-4 (Mrel 4400) und Fluoreszein-Isothiozyanat-Dextrane-10 (Mrel 9400), eine signifikante Korre-lation mit der Molekülmasse zeigen. Im Allgemeinen war die corneale Permeabilität jedoch als gering einzuschätzen.

Für hydrophile Moleküle ist die corneale Arzneistoffpassage durch die äußersten Schichten des Epithels reglementiert. Dieses konnte mittels zweier unterschiedlicher Methoden gezeigt werden. Große, hydrophile Moleküle, wie Fluoreszein-Isothiozyanat-Dextrane, permeieren nicht via parazellulärem Zwischenraum von der Tränenseite in das Kammerwasser [209], aber sie bewegen sich aus dem Kammerwasser durch die gesamte Cornea, mit Ausnahme der Penetration in die äußersten Schichten des Epithels. Das zeigt, dass die Tight junctions in der Oberflächenschicht des cornealen Epithels die Molekülgrößen-limitierende Barriere der Cornea darstellen.

Ein weiterer Parameter, der den Arzneistofftransport durch die Cornea beeinflusst, ist der Ionisationsgrad des Arzneistoffs [210,211,212,213]. Die nichtionisierte Form des Arzneistoffs passiert das Epithel in der Regel leichter als die ionisierte Form. So permeiert z.B. die freie Pilocarpinbase 2-3mal leichter durch die Cornea als die ionisierte Form [214]. Bei einem pH-Wert über dem isoelektrischen Punkt der Cornea (pH 3.2) trägt das Gewebe negative Ladun-gen. Deshalb ist der Interzellularraum leichter permeabel für positiv geladene Moleküle [215],


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was bedeutet, dass bei physiologischem pH kationische Moleküle leichter die Cornea pas-sieren können als anionische. Bei einem pH unter dem isoelektrischen Punkt der Cornea ist die Ladungsselektivität umgekehrt. Dementsprechend war die Cornea in einer Untersuchung 2-3mal mehr durchlässig für die kationische Aminosäure L-Lysin als für die anionische Aminosäure L-Glutaminsäure [212]. Rojanasakul und Robinson [209] zeigten durch Scanning confocal microscopy, dass ein negativ geladenes Peptid (Insulin, Mrel ~ 5700) von der para-ellulären Permeationsroute ausgeschlossen war, während die Permeation eines positiv gela-enen Peptids (Poly-L-Lysin, Mrel 15000-30000) durch die Interzellularräume möglich war.

Das corneale Epithel stellt nicht nur eine Permeationsbarriere dar, sondern ist auch meta-bolisch aktiv, was die Permeation einiger Arzneistoffe limitieren könnte. Diese enzymatische Barriere besteht hauptsächlich aus Peptidasen, Proteasen und Esterasen [216,217]. Z.B. werden Pilocarpin (vgl. 3.2.1.1), Epinephrin und Levobunolol teilweise während oder nach der okularen Applikation metabolisiert. Bei Peptiden kann der enzymatische Abbau die Wirk-samkeit der Substanzen völlig ausschalten [216].

Aufgrund der relativ offenen morphologischen Struktur des hydrophilen Stromas können Arzneistoffe mit einer Molekülmasse bis zu 500 000 in diese Gewebeschicht diffundieren [218]. Die stromale Permeabilität (Peff = 8.0 x 10-9 - 5.7 x 10-5 cm/s) zeigte keine sichtbare Abhängigkeit vom VK (Testbereich 0.19 - 2511.9), aber eine strenge Abhängigkeit vom Molekülradius (0.4 - 5.0 nm) [203]. Ist ein Molekül ausreichend lipophil, um das Epithel leicht zu passieren, gewinnt das Stroma an Bedeutung, d.h., das Stroma kann u.U. die limi-tierende Gewebeschicht für lipophile Substanzen sein.

Das Endothel ist aus nur einer zellulären Schicht aufgebaut und hat deshalb lipophile Eigen-schaften [11]. Die Tight junctions des Endothels sind größer als die des Epithels. Die Permea-bilität durch die endotheliale Schicht der Cornea (Peff = 8.3 x 10-9 - 1.7 x 10-4 cm/s) zeigte eine strenge Abhängigkeit sowohl vom VK (Testbereich 2 x 10-5 - 302) als auch vom Molekül-radius (0.1 - 6.6 nm), was auf eine Bedeutung des transzellulären, aber auch des parazel-lulären Transportweges durch das Endothel, abhängig von den Arzneistoffeigenschaften, hinweist [203].

Zusätzlich zur Pumpenfunktion des Endothels, die die corneale Transparenz aufrecht erhält, spielt das Endothel eine aktive Rolle beim Transport von bestimmten Proteinen (z.B. durch


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absorptive Endozytose) zur Versorgung des Stromas mit Nährstoffen und zur Entfernung von Metaboliten [219].

Die physiologische Barriere Cornea hat sehr ausgeprägte Eigenschaften hinsichtlich der Per-meationsontrolle von Arzneistoffen. Bezeichnenderweise erreicht weniger als 1% der appli-zierten Dosis das Kammerwasser [220]. Nach Erreichen des Kammerwassers kann sich der Arzneistoff in den umliegenden Geweben, wie Iris, Ziliarkörper und Linse, verteilen. Eine kleine Fraktion des Arzneistoffs könnte auch weiter in die hintere Augenkammer und in den Glaskörper diffundieren [218]. Die Arzneistoffe penetrieren leicht in die Iris und den Ziliar-körper, da diese Gewebe eine poröse, durchlässige Oberfläche haben. Die Linse ist weniger durchlässig als die Iris und der Ziliarkörper, so dass die Arzneistoffkonzentrationen typischer-weise in der Linse geringer sind als in der vorderen Uvea [221].

4.2.1.2 Sklerale Permeabilität

Die intraokulare Permeation über den nicht-cornealen Weg erfolgt über die bulbäre Konjunk-tiva und die Sklera zu Iris und Ziliarkörper. Dieser Weg spielt eine entscheidende Rolle für hydrophile und/oder große Moleküle, welche die Cornea nur schwer passieren können. Die konjunktivale und sklerale Permeabilität wurde bisher, verglichen mit der Permeation durch die Cornea, nur wenig untersucht [222].

Die sklerale Barriere ähnelt der des cornealen Stromas, sie ist ein hartes und dickfaseriges Gewebe. Bei der skleralen Diffusion spielen zwei Mechanismen eine Rolle:

Beide Mechanismen sind bis heute noch nicht vollständig geklärt.

In der Literatur wird von einigen Untersuchungen des nicht-cornealen Transportweges für Arzneistoffe berichtet. Ahmed und Patton [224] bewiesen, dass die konjunktivale/sklerale Permeation der Hauptweg für die Aufnahme des großen, hydrophilen Moleküls Inulin in die Iris und in den Ziliarkörper ist. Chien et al. [204] fanden den gleichen Permeationsweg für das hydrophile p-Aminoclonidin. Olsen et al. [189] bestimmten die in vitro-Permeabilität der menschlichen Sklera für hydrophile Stoffe mit unterschiedlicher Molekülmasse (Mrel 130 - 70000). Es wurde eine indirekte Proportionalität zwischen der skleralen Permeabilität (Peff


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= 1.9 x 10-6 - 4.0 x 10-6 cm/s) und der Molekülmasse herausgefunden. Prausnitz und Noonan [203] schlussfolgerten aufgrund ihrer gesammelten Daten über die sklerale Permeabilität, dass diese (Peff = 1.3 x 10-7 - 7.1 x 10-5 cm/s) nicht vom VK (2 x 10-4 - 10965) der jeweiligen Sub-stanz abhängt, sondern vom Molekülradius (0.1 - 6.4 nm). Ahmed et al. [225] berichteten, dass die Molekülgröße des zu transportierenden Stoffs einen deutlicheren Effekt auf die Per-meabilität der Sklera als auf die der Cornea ausübt. In dieser Publikation wurde u.a. die Inulinpermeation mit der Saccharosepermeation verglichen. Dabei betrug der Peff für Sac-charose durch die Sklera das 16fache und durch die Cornea das 8fache, verglichen mit dem Peff von Inulin. Kao et al. [226] fanden heraus, dass die Sklera 11mal besser permeabel für einen topischen Carboanhydrasehemmer ist als die Cornea.

Im Gegensatz zur Cornea sind sowohl die sklerale als auch die konjunktivale Permeation weniger anfällig für Veränderungen in der Lipophilie des Permeanten [205,227,228].

4.2.1.3 Konjunktivale Permeabilität

Elektronenmikroskopische Studien des konjunktivalen Epithels haben ergeben, dass die Inter-zellularräume viel größer sind als im cornealen Epithel [229]. Außerdem weist die Konjunk-tiva geringere metabolische Aktivität auf, ist weniger lipophil, dünner und hat eine geringere Mikrovillidichte als die Cornea [230,231].

Auch die Konjunktiva diente in Permeationsstudien als natürliche Membran. Hayakawa et al. [232] untersuchten die konjunktivale Permeabilität für das hydrophile Atenolol (Mrel 266), das lipophile Timolol (Mrel 433) und von Insulin (Mrel ~5700). Die konjunktivale Permeabilität für Insulin (Peff = 0.46 x 10-5 cm/s) war nur halb so groß wie die für Atenolol (Peff = 0.95 x 10-5 cm/s) und betrug nur ein Fünftel der Permeabilität für Timolol (Peff = 2.21 x 10-5 cm/s). Sasaki et al. [228] beobachteten, dass der Beta-Blocker-Transport durch die Konjunktiva, mit und ohne Enhancer, größer war als durch die Cornea. Die geringere Sensibilität der Konjunk-tiva gegenüber der Lipophilie von Substanzen, verglichen mit der Cornea, wurde von Wang et al. [205] nachgewiesen. Z.B. zeigten verschiedene Beta-Blocker mit sehr unterschiedlichen VK nur einen 8fachen Unterschied im Peff durch die Konjunktiva (Peff = 2.4 x 10-5 - 6.2 x 10-5 cm/s) verglichen mit einem bis zu 48fachen Unterschied der cornealen Peff (Peff = 0.1 x 10-5 - 3.2 x 10-5 cm/s).


71

Resümierend ist festzustellen, dass die Konjunktiva eine durchlässigere Membran für hydro-phile Arzneistoffe darstellt als die Cornea und die Sklera [208,228,233] und die sklerale Per-meabilität für hydrophile Arzneistoffe höher ist als die corneale Permeabilität [225,233]. Die Sklera ist aber weniger durchlässig für lipophile Arzneistoffe als die Cornea [233].

4.2.2 Permeationsmechanismen

4.2.2.1 Parazelluläre Permeation

Vorwiegend kleine, hydrophile Moleküle, wie P-HCl, welche sowohl in ionischer als auch in nicht-ionischer Form vorliegen können, bevorzugen den parazellulären Weg, der vom wässri-gen Interzellularraum gebildet wird, um das corneale Epithel zu passieren. Das Epithel weist mit wässrigem Medium gefüllte Poren auf, die sich an der Oberfläche zwischen den Tight junctions befinden [199,234,235] (Abb. 26).

Andere Substanzen der Kontaktstellen zwischen den Zellen schließen die Zonula adherens ein, wie z.B. das Ca2+-abhängige Zelladhäsionsmolekül Uvomorulin und die Desmosomen [200]. Die Zonulae occludentes sind eines der typischen Kennzeichen des absorptiven Epi-thels. Sie kontrollieren die Diffusion von Ionen und neutralen Molekülen via parazellulärer Route [200]. Eine komplette Versiegelung durch die Zonulae occludentes ist nicht gegeben, da sowohl Wasser als auch gelöste Moleküle in geringem Umfang diese Barriere passieren können [8,236]. Von Madin-Darby-Canine-Kidney-Zellepithel wird berichtet, dass Wasser nicht konvektiv durch die Tight junctions fließt [237]. Verschiedene intrazelluläre Proteine kontrollieren die Funktion der Tihgt junctions [238,239]. Das versiegelnde, interzelluläre Protein wurde von Furuse et al. [240] entdeckt und Occludin genannt. Der Grad der Occludin-Expression bestimmt den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) [235], und des-halb repräsentieren die parazellulären Poren wahrscheinlich den offenen Raum zwischen den Occludinansammlungen des Epithels (Abb. 26). Die Integrität der epithelialen Zonulae occlu-dentes ist z.B. abhängig von der extrazellulären Ca2+-Konzentration [200].

Die parazelluläre Oberfläche ist klein, verglichen mit der transzellulären Oberfläche. Hydro-phile Substanzen permeieren via parazellulärer Route, dem Hauptweg für die passive Ionen-permeation. Die Ladung und Molekülgröße beeinflussen dabei den parazellulären Arznei-stofftransport [241].


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Abb. 26: Der parazelluläre Permeationsweg [242]

Das aktuelle Modell für die Tight junctions ist in Abb. 27 B dargestellt.

Abb. 27: Tight junction Struktur Modelle [200]; A: Fusionsmodell (Plasmamembranen angrenzender Zellen verschmelzen); B: integrierende Membranproteine sind Hauptstrukturelemente der Tight junctions

Tonjum [243] fand heraus, dass die äußerste Zellschicht des Epithels impermeabel für die Meerrettich-Peroxidase war und damit die parazellulären Poren der Cornea kleiner als 3.0 nm sein müssen. Grass und Robinson [244] ermittelten ebenfalls eine limitierende Molekülgröße von ca. 3.0 nm für die parazelluläre Permeation durch die Cornea. Weitere Literaturangaben konstatieren 1.2 nm (Moleküldurchmesser von Glycerol) [244], oder 3.0 nm (Moleküldurch-messer von Inulin) [245]. Vergleichsweise sind die wässrigen Poren im Nasenepithel zwi-schen 0.4 - 0.8 nm groß, im Jejunum 0.7 - 1.6 nm, im Rektum 0.6 - 1.7 nm [246], und im Alveolarepithel wurden zwei Größenordnungen von Poren gefunden: nämlich 0.6 - 1.0 nm bzw. 7.0 - 12.0 nm [247].


73

Die Zahl der Tight-junction-Zonen in den Zonulae occludentes scheint der wichtigste Para-meter für den TEER der verschiedenen epithelialen Gewebe des Organismus zu sein [235]. Epitheliale Gewebe (wie z.B. das renale Epithel) mit elektrisch undichten Tight junctions (TEER ca. 5 Omegacm2), bilden wahrscheinlich nur eine einzige zusammenhängende Zone von Tight junctions. Ein sehr dichtes Epithel (TEER > 1000 Omegacm2) könnte dagegen bis zu acht solcher Zonen aufweisen, die parallel liegen und die Zonulae occludentes von der obersten bis zur untersten Zellschicht umgeben [199]. Es ist bisher nicht vollständig geklärt, ob die Tight junctions auf transmembrane Proteine zurückzuführen sind oder spezialisierte Lipidstrukturen bilden. Allerdings fanden Stevenson et al. [248], dass der Widerstand nicht immer mit der Zahl der Zonen korreliert. Der Widerstand hängt vielmehr auch davon ab, wie gut die benach-barten Plasmamembranen miteinander verbunden sind sowie von dem Öffnungsgrad der Poren [235].

Rojanasakul et al. [211] haben den Membranwiderstand verschiedener Epithelien von Kanin-chen gemessen. Der höchste TEER wurde in der Haut bestimmt (9703 Omegacm2), gefolgt vom TEER der Mundschleimhaut (1803 Omegacm2) und dem cornealen Epithel (1012 Omegacm2). Den nie-drigsten Widerstand zeigte das Intestinum (200-300 Omegacm2). Der Widerstand ist abhängig von der Dimension der Poren, den Windungen im Interzellularraum und auch von der Permea-bilität des Epithels insgesamt [235]. Die parazelluläre Permeabilität hängt von der Zahl der offenen parazellulären Poren pro Barriere ab [235].

4.2.2.2 Transzelluläre Permeation

Die meisten ophthalmologisch genutzten Arzneimittel, vor allem die mit hohem VK wie D-Na (vgl. Tabelle 10), permeieren transzellulär durch die vorderen okularen Gewebe. Zunächst sollen deshalb einige allgemeine Prinzipien der transzellulären Passage im Organismus allge-mein dargelegt werden.

Der transzelluläre Weg besteht hauptsächlich aus zwei Barrieren, die obere und untere Zell-membran (Abb. 28) [249]. Die Tight junctions beteiligen sich an der Polarisation der epithe-lialen Plasmamembran in die unterschiedlich zusammengesetzten apikalen und basolateralen Abschnitte. Es wird angenommen, dass diese Abschnitte als Hindernis in der Plasmamembran dienen [200].


74

Arzneistoffe permeieren transzellulär wahrscheinlich sowohl über aktive als auch passive Mechanismen [250]. Im Falle der passiven, transzellulären Diffusion permeieren die Arznei-stoffe durch verteilungskontrollierte Prozesse [10,197]. Die Verteilung erlaubt eine Äquili-brierung des Arzneistoffs in die lipiden Bilayer der epithelialen Membran (Abb. 28). Neben der Verteilung ist die Arzneistoffdiffusion durch die Bilayer entscheidend bei der transzel-lulären Permeation, womit Grenzen hinsichtlich der Molekülgröße und -form gesetzt sind. Arzneistoffmoleküle müssen in die Lipidbilayer passen [250] und sie passieren können.

Abb. 28: Potentieller Mechanismus für eine passive transzelluläre Diffusion [251]

Für große hydrophile Arzneistoffe, die sich nicht gut in den Zellmembranen verteilen (einige Peptide und Proteine), könnte die transzelluläre endozytotische Flüssig-Phasen-Pinozytose ein möglicher Transportmechanismus sein [211].

Ionen können aktiv durch das corneale Epithel und Endothel transportiert werden. Aktive Ionentransportmechanismen sind essentiell für die Erhaltung der normalen stromalen Hydra-tation, der Corneaform und der Transparenz. Das corneale Epithel enthält Ionenkanäle, die selektiv für Kationen sind [252], außerdem einen auswärts gerichteten Anionenkanal in der apikalen Membran und einen stark leitenden K+-Kanal in den Basalzellen. Na+ und Cl- sind die am aktivsten transportierten Ionen im cornealen Epithel. Na+ permeiert aus der Tränen-flüssigkeit in das Epithel per passiver Diffusion, aber es wird aktiv vom Epithel in das Stroma transportiert. Cl- wird aktiv vom Stroma in die Tränenflüssigkeit gepumpt [253]. Die Na+/K+-ATP-ase ist am Transport von Na+ und Cl- beteiligt. Ionentransportpumpen spielen wahr-scheinlich eine Rolle im aktiven Transport von Peptiden [253].


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Das corneale Endothel enthält ebenfalls Na+- und K+-selektive Kanäle sowie Ionenkanäle, die für Anionen selektiv sind [252]. Außerdem wird angenommen, dass Ca2+-Kanäle in den Plas-mamembranen der Endothelzellen vorhanden sind [254]. Spezifische Ionen werden vom Stroma aktiv in das Kammerwasser durch das Endothel transportiert [254].

Weiterhin wurde bewiesen, dass Na+ [255], Cl- [256] sowie einige Arzneistoffe aktiv durch die Konjunktiva transportiert werden. Ein Na+-Aminosäuren-Cotransport wurde als einer der Mechanismen für Mucus-Aminosäuren verifiziert, um in die epithelialen Zellen der pigmen-tierten Kaninchenkonjunktiva zu gelangen [201,202,257]. Auch Na+-abhängige und Na+-unabhängige Nucleosidtransporter wurden auf der mucösen Seite der Kaninchenkonjunktiva lokalisiert [202]. Ein Resultat der Untersuchungen von Basu et al. [258] war, dass die Auf-nahme des Dipeptids L-Carnosin in corneale Kaninchenepithelzellkultur durch einen von Protonen gesteuerten Dipeptid-Transporter vermittelt wird. Deshalb spielen aktive Transport-mechanismen wahrscheinlich eine größere Rolle in der okularen Pharmakokinetik als vormals angenommen [258]. In der Kaninchenkonjunktiva existiert möglicherweise eine von p-Glyco-protein vermittelte Efflux-Pumpe auf der apikalen Seite, um die Aufnahme von Cyclosporin A und anderen lipophilen Arzneistoffen einzuschränken [259].

4.2.3 Effektiver Permeabilitätskoeffizient (Peff)

Der effektive Permeabilitätskoeffizient (Peff), der identisch ist mit dem apparenten Permea-bilitätskoeffizienten (Papp), lässt vergleichende Aussagen zum Permeationsverhalten unter-schiedlicher Zubereitungen in verschiedenen Permeationsmodellen zu, da er sowohl die unter-schiedlichen Ausgangskonzentrationen der Zubereitungen als auch die verschieden großen Gewebeoberflächen, durch die die Permeation erfolgt, in die Kalkulation einbezieht. Er berechnet sich, abgeleitet vom 1. Fick‘schen Diffusionsgesetz nach folgender Gleichung [3,260,261]:

In der Gleichung stellt Peff den effektiven Permeabilitätskoeffizienten [cm/s], DeltaQ die gesamte permeierte Wirkstoffmenge [µg], t die Zeit [min], 60 den Divisor zur Umrechnung von Minuten in Sekunden und der Quotient DeltaQ/Deltat die Permeationsrate (Steady-state-Flux)


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[µg/min] dar. Der Steady-state-Flux ergibt sich unter Annahme einer Freisetzungskinetik 0. Ordnung durch lineare Regression. A bezeichnet die Diffusionsfläche des jeweiligen Gewebes [cm2] und c0 die anfängliche Wirkstoffkonzentration [µg/ml] der zu applizierenden Arznei-stofflösung.

Die Berechnung von Peff ist an folgende Bedingungen geknüpft:

Diese Bedingungen wurden bei den nachfolgenden Permeationsstudien weitgehend erfüllt. Bei Auftreten einer Lagtime, d.h. eines anfänglich nahezu parallelen Verlaufs der Kurve zur Abszisse im Freisetzungs-Zeit-Diagramm, bevor der lineare Anstieg beginnt, wurden die Peff nur an Hand des linear ansteigenden Abschnitts der Kurve berechnet. Die Lagtime wurde durch Extrapolation des linearen Abschnitts auf die Abszisse bestimmt [262].

4.2.4 Pilocarpin-HCl

4.2.4.1 Corneale Pilocarpin-Permeation

In der nachfolgend vorgestellten Studie wurde die Permeabilität von P-HCl durch isolierte SC untersucht. Neben der Untersuchung der 2%igen wässrigen Wirkstofflösung erfolgten Ver-suche mit Zusätzen von 0.01% BAC bzw. 0.05% EDTA als praxisrelevante Formulierungs-parameter. Abb. 29 zeigt das Permeationsprofil des Arzneistoffs, wobei die Akzeptorkonzen-tration gegen die Zeit aufgetragen wurde.

P-HCl als polarer und im Donatormedium größtenteils ionisch vorliegender Arzneistoff (Ionisationsgrad alpha = 21.98, pH 7.4) kann die Cornea als Barriere nur in geringem Umfang passieren, und so erreichten nach 300 min lediglich 2.35% des applizierten Arzneistoffs das Akzeptormedium (Tabelle 13). Der berechnete Peff von 2.54 x 10-6 cm/s (Tabelle 13) in GBR (pH 7.4) korreliert gut mit dem von Prausnitz und Noonan [203] ermittelten Koeffizienten


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von 2.8 x 10-6 cm/s (pH 7.65), obwohl Kaninchencornea anstatt Schweinecornea verwendet wurde.

Abb. 29: Permeationsprofil von P-HCl durch Schweinecornea unter Einfluss von BAC und EDTA, n = 9-10

Sowohl der Zusatz von BAC als auch von EDTA führte zu einer Steigerung der Permeabilität durch isolierte SC (Abb. 29), wobei sich allerdings der für EDTA errechnete Peff nicht signi-fikant von der Referenz unterschied. Dagegen resultierten für beide Hilfsstoffe nach 300 min signifikant von der hilfsstofffreien P-HCl-Lösung verschiedene kumulative Endwerte (Tabel-le13).

Tabelle 13: Permeationsdaten der 2%igen P-HCl -Lösungen für Schweinecornea

Zubereitung

Peff
[10
-6 cm/s]

log Peff

Q300

[µg]

[%]

P-HCl 2%

2.54 (0.75)

-5.60

470.16 (107.63)

2.35

+ BAC 0.01%

7.79 (2.22)*

-5.11

1631.94 (237.59)*

8.16*

+ EDTA 0.05%

3.79 (1.43)

-5.42

838.66 (292.74)*

4.19*

n=9-10, (*) p<0.05 im Vergleich zu P-HCl 2%, SD in Klammern

Es ist bekannt, dass BAC ausgeprägte Enhancereigenschaften bezüglich der Permeation durch die Cornea besitzt [263,264,265,266]. Als tensidische Substanz ist es in der Lage, Lipide aus Zellmatritzen zu lösen und dadurch z.B. Erosionen des cornealen Epithels hervorzurufen, die die Permeation von Substanzen fördern. So wurde z.B. nachgewiesen, dass eine Konzen-tration von 0.02% BAC die Permeabilität von Fluoreszein erhöht [267,268]. Diese Erosionen des Epithels wurden von Ichijama et al. [269] mittels Tandem scanning confocal microscopy


78

in vivo an Kaninchencornea nachgewiesen und per Raster-Elektronenmikroskopie (REM) bestätigt. Sofort nach der Applikation von 0.01 und 0.02% BAC konnten keine normalen oberflächlichen Epithelzellen mehr in vivo mit Hilfe der Tandem scanning confocal micros-copy ausfindig gemacht werden. Die Applikation von weniger als 0.005% BAC verursachte eine Schwellung und Abschuppung der obersten Zellschicht, wobei letzteres Phänomen mit zunehmender BAC-Konzentration verstärkt wurde.

Die vorhandene Literatur [164,270,271] erlaubt eine Einteilung der Effekte von Tensiden auf die corneale Penetration in (a) Emulsifizierung der Lipidschicht der Lacrimalflüssigkeit [272] und (b) vor allem Emulsifizierung der Lipide des cornealen Epithels [273,274].

Ein weiterer Aspekt im Hinblick auf die Schädigung der Cornea und der damit möglicher-weise verbundenen Permeabilitätssteigerung ist die Senkung der Oberflächenspannung durch Tenside (vgl. 4.1.2.1). So weist z.B. das Fertigarzneimittel Carbachol® 3%, welches mit 0.01% BAC konserviert ist, eine Oberflächenspannung von 34.5 mN/m auf, die deutlich unter der physiologischen Oberflächenspannung von 46 mN/m liegt und u.a. eine Ursache für nachgewiesene Irritationen sein könnte [257]. Viele Präparationen, die BAC oder BAC/EDTA-Kombinationen enthalten, weisen eine deutlich geringere Oberflächenspannung als die Tränenflüssigkeit auf [275].

Weiterhin wird angenommen, dass ein Mizellassoziat durch das Tensid BAC mit dem Arzneistoff gebildet wird [276]. Die hohe Affinität dieses Mizellassoziates zu den Lipiden des cornealen Epithels verursacht deren Solubilisierung sowie eine Störung im Lipidfilm der Tränenflüssigkeit. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Mizellen können z.B. über die CMC, den HLB-Wert und die Oberflächenbestimmung pro Mizelle bestimmt wer-den.

Außerdem ist bekannt, dass quartäre Ammoniumverbindungen, wie BAC, als kompetitive Inhibitoren der Eiweißbindung gegenüber Pilocarpin-Kationen wirken und auch auf diese Weise ihre Enhancerwirkung entfalten können. In Gegenwart von 0.02% Cetylpyridinium-chlorid erreichten Mikkelson et al. [34] mit 0.05 ml einer Lösung von 10-2 mol/l Pilocarpin-nitrat etwa die gleiche Pupillenverengung wie mit 0.05 ml einer Lösung von 10-1 mol/l dessel-ben Wirkstoffs ohne Zusatz des als Konservierungsmittel bekannten Cetylpyridiniumchlorids.


79

Untersuchungen zur kompetitiven Bindung von P-HCl und BAC an Referenzeiweiß, z.B. Schweineserumalbumin, die eine Aussage über die Quantität der Verdrängung von P-HCl durch BAC aus der Eiweißbindung erwarten ließen, waren nicht Anliegen dieser Arbeit.

Auch EDTA als Ca2+-Chelator ist für seine permeationsfördernden Eigenschaften durch die Cornea bekannt [277,278,279]. Ca2+ ist wesentlich an der Erhaltung der Interzellular-Matrix des cornealen Epithels beteiligt [280] und deshalb wahrscheinlich einer der Hauptfaktoren, die den parazellulären Transportweg für Arzneistoffe definieren. Es wird angenommen, dass EDTA die Tight junctions des Epithels lockert [220]. Wie bereits erwähnt, ist die Integrität der Zonulae occludentes von der extrazellulären Ca2+-Konzentration abhängig (vgl. 4.2.2.1). Andere Wissenschaftler berichten, dass der Ca2+-Entzug sich nicht direkt auf die Tight junc-tions auswirkt, sondern eher globale Veränderungen der Zellen hervorruft, inkl. eines Reißens der Aktinfilamente und der umliegenden Junctions. Darüber hinaus wird eine Aktivierung von Proteinkinasen postuliert.

4.2.4.2 Sklerale Pilocarpin-Permeation

Vergleichend zu SC wurden Permeationsstudien mit SS mit analogem Versuchsdesign (vgl. 4.2.4.1) durchgeführt. Die erhaltenen Permeationsdaten sind in Tabelle 14 zusammengefasst.

Tabelle 14: Permeationsdaten der 2%igen P-HCl-Lösungen für Schweinesklera

Zubereitung

Peff
[10
-6 cm/s]

log Peff

Q300

[µg]

[%]

P-HCl 2%

5.92 (1.21)

-5.23

1436.23 (328.97)

7.18

+ BAC 0.01%

7.34 (1.54)*

-5.13

1310.85 (279.66)

6.55

+ EDTA 0.05%

5.62 (1.17)

-5.25

1047.83 (238.82)*

5.24*

n=12, (*) p<0.05 im Vergleich zu P-HCl 2%, SD in Klammern

Die Permeation von P-HCl durch isolierte SS erfolgte in signifikant größerem Ausmaß als durch SC (Peff = 5.92 : 2.54 x 10-6 cm/s), was auf den Aufbau der SS zurückzuführen ist (vgl. 3.1.2). Der Hauptmechanismus der P-HCl-Permeation ist die Diffusion durch die interzel-lulären wässrigen Medien [281], wobei die relativ geringe Molekülmasse (Mrel 244.7), der kleine Molekülradius (4.3Å) und der hydrophile Charakter (VK 0.2) die Sklerapassage erleichtern.


80

Wie o.g., berichteten Olsen et al. [189] von einer indirekten Proportionalität zwischen der Molekülmasse einer Substanz und ihrer Permeation durch die Sklera (vgl. 4.2.1.2). Weiterhin fanden Maurice und Polgar [282], dass die Sklera generell der Arzneistoffdiffusion weniger Widerstand entgegenbringt als die Cornea.

Der Einfluss von BAC und EDTA auf die sklerale Permeation war geringer ausgeprägt als auf die corneale Permeation (Abb. 30). Lediglich der Peff für die Formulierung mit BAC 0.01% war signifikant erhöht, verglichen mit der Referenzlösung (P-HCl 2%). Jedoch fällt auf, dass sich der permeationssteigernde Effekt von BAC an der SS nur wie 1:1.2 verhält, während im cornealen Gewebe der Peff-Wert durch das Konservierungsmittel im Verhältnis 1:1.3 erhöht wird (Tabelle 13 bzw. 14). Die permeierte Arzneistoffmenge (Q300) war sogar geringer als für die P-HCl-Permeation ohne Hilfsstoffzusatz (Tabelle 14).

Die moderate Wirkung von BAC als Enhancer hinsichtlich der skleralen P-HCl-Diffusion ist mit dem Wirkmechanismus des Konservierungsmittels zu erklären. Wie oben beschrieben, werden hauptsächlich Lipidstrukturen aus Zellverbänden herausgelöst und letztere dadurch aufgelockert. Da aber zelluläre Strukturen in der Sklera fehlen, ist die Enhancerwirkung, ver-glichen mit der Cornea, limitiert.

Abb. 30: Permeationsprofil von P-HCl durch Schweinesklera unter Einfluss von BAC und EDTA, n=12

Ähnliches gilt für die Wirkung von EDTA. Es wird eine die Tight junctions lockernde Wirkung des Synergisten angenommen. Die Sklera verfügt aber nicht über Tight junctions und damit ist kein Angriffspunkt für eine transportfördernde Wirkung gegeben.


81

Gleiches fanden Podder et al. [283], die die Penetration von Timolol in Kaninchensklera untersuchten. Weder ein Zusatz von 0.025% BAC noch ein Zusatz von 0.5% EDTA zur Arzneistofflösung förderten die Penetration von Timolol. Von Lee und Lee [278] konnten diese Ergebnisse nur teilweise bestätigt werden. Während die Atenolol-Konzentration in Kaninchensklera durch die Konservierung der Arzneistofflösung mit 0.025% BAC nicht verändert wurde, erhöhte sich die Arzneistoffmenge im Vergleich zur Referenzlösung durch 0.5% EDTA um mehr als das Dreifache im Gewebe.

4.2.4.3 Vergleich von P-HCl- und P-Base-Permeation

In die Permeationsstudien wurde auch die P-Base einbezogen, die lipophiler ist (VK 1.03) als das Hydrochlorid (VK 0.23). Um die Vergleichbarkeit mit den Versuchen mit P-HCl (vgl. 4.2.4.1/2) zu sichern, wurde die gleiche Ausgangskonzentration des wirksamen Arzneistoffes (1.65% P-Base) vorgelegt.

Abb. 31: Vergleich der Permeation von P-Base und P-HCl durch Schweinecornea und -sklera,
n = 5 -12, (*) p<0.05 im Vergleich zu P-HCl

Wie Abb. 31 zu entnehmen, ist die Permeation der P-Base sowohl durch SC als auch durch SS signifikant erhöht. Die Arzneistoffdiffusion durch SC wurde durch den Einsatz der P-Base sogar verdoppelt. Das entspricht den Erfahrungen von Mitra and Mikkelson [214], die eine 2-3fach gesteigerte Permeation der freien Base gegenüber der ionisierten Form des Arzneistoffs feststellten. Die P-Base passierte zwar auch die SS in größerem Ausmaß, jedoch war der Unterschied zwischen der Base und dem Hydrochlorid nicht so ausgeprägt wie bei der Per-meation durch SC (Tabelle 15). Die Steigerung des Arzneistofftransports erfolgte lediglich um den Faktor 1.5. Es ist anzunehmen, dass das Fehlen einer lipophilen Barriere (Epithel) in der Sklera diesen Unterschied verursacht.


82

Das Hydrochlorid muss bei der Penetration in die Cornea zunächst das Epithel überwinden, welches für hydrophile Stoffe ein großes Hindernis ist und den limitierenden Faktor bei der Gewebepassage darstellt. Mit zunehmender Lipophilie der permeierenden Substanzen nimmt die Barrierefunktion des Epithels ab, so dass die P-Base durch SC wesentlich ungehinderter diffundieren kann als P-HCl.

Tabelle 15: Permeationsdaten von P-HCl und P-Base durch Schweinecornea und -sklera

Gewebe

Zubereitung

Peff
[10
-6 cm/s]

log Peff

Q300

[µg]

[%]

SC

P-HCl 2%

2.54 (0.75)

-5.60

470.16 (107.63)

2.35

P-Base 1.65%

4.88 (4.06)*

-5.31

680.29 (47.34)*

4.12*

SS

P-HCl 2%

5.92 (1.21)

-5.23

1436.23 (328.97)

7.18

P-Base 1.65%

8.70 (1.76)*

-5.06

1620.05 (437.17)

9.82*

n=5-12, (*) p<0.05 im Vergleich zu P-HCl 2%, SD in Klammern

Erwartet wurde, dass das Hydrochlorid die Sklera aufgrund der höheren Hydrophilie sogar leichter passieren kann als die freie Base, was in dieser Studie aber nicht gezeigt werden konnte.

4.2.4.4 Konjunktivale Pilocarpin-Permeation

4.2.4.4.1 Bioelektrische Parameter

In der folgenden Versuchsreihe wurden die in den Permeationsversuchen genutzten konjunk-tivalen Gewebe pigmentierter Kaninchen hinsichtlich ihrer Vitalität geprüft. Zur Bestimmung der Lebensfähigkeit und Integrität der isolierten KK erfolgte die Messung des TEER [kOmegacm2] und des Kurzschlussstroms (ISC) [µA/cm2] sowohl vor dem Permeationsexperiment (initial) als auch danach (final). Tabelle 16 gibt einen Überblick über die gemessenen bioelektrischen Parameter.

Isc und TEER erreichten innerhalb 1 h nach Einbringen der isolierten KK in die Ussing- Kammer, die im Donator- und Akzeptorkompartiment zunächst mit BR befüllt war, das Steady state (Initialwert). Erst nach dieser elektrophysikalischen Stabilisierung der KK in BR wurde die Pufferlösung gegen die Arzneistofflösung in der Donatorkammer ausgetauscht.


83

Die erhaltenen bioelektrischen Messwerte (Tabelle 16) sind vergleichbar mit bereits in der Literatur veröffentlichten Daten isolierter KK [257,284,285] und daher die Gewebe als vital und integer zu betrachten. Die Diskussion der Parameter findet im Rahmen der Auswertung der Permeationsstudie (vgl. 4.2.4.4.2) statt.

Tabelle 16: Bioelektrische Parameter isolierter Kaninchenkonjunktiva

 

TEER (initial)

[kOmegacm2]

TEER (final)

[kOmegacm2]

ISC (initial)

[µA/cm2]

ISC (final)

[µA/cm2]

P-HCL 2%

1.07 (0.63)

0.40 (0.17)*

2.25 (0.91)

5.8 (2.49)*

+ BAC 0.01%

0.88 (0.57)

0.057 (0.011)*

2.83 (1.15)

35.9 (7.00)*

+ EDTA 0.05%

0.91 (0.56)

0.79 (0.48)

2.51 (0.89)

2.51 (0.89)

n=5-9, (*) p<0.05 verglichen mit dem initialen Wert, SD in Klammern

4.2.4.4.2 Permeationsstudie

Ähnlich wie in den vorangegangenen Studien an SC und SS wurde in diesem Teil der Arbeit die Permeation von P-HCl unter Einfluss von BAC und EDTA durch KK untersucht (Abb. 32, Tabelle 17).

Abb. 32: Permeationsprofil von P-HCl 2% durch Kaninchenkonjunktiva, n=5-9

Von den isolierten Geweben (SC, SS, KK) erwies sich KK als am geringsten permeabel für den hydrophilen Modellarzneistoff, auch wenn der Arzneistofftransport in vergleichbarem Ausmaß wie durch die Cornea erfolgte (vgl. 4.2.4.1/2). Aufgrund der größeren Interzel-lularräume, der geringeren Dicke und Lipophilie sollte die Konjunktiva prinzipiell durch-lässiger für hydrophile Substanzen sein als die Cornea (vgl. 3.1.3) [203]. Einschränkend für die vorliegende Studie muss jedoch bedacht werden, dass unterschiedliche Tierspezies ver-wendet wurden, die eine gewisse Differenzierung der Gewebe erwarten lassen. Darüber


84

hinaus könnten auch die verschiedenen Ussing-Kammer-Modelle, die für SC und SS (vgl. 5.2.6) bzw. KK (vgl. 5.2.7) eingesetzt wurden, von Einfluss auf das Ausmaß der unterschied-lichen P-HCl-Diffusion gewesen sein.

Dagegen lässt sich der Einfluss von BAC und EDTA auf den Arzneistoffgehalt im Akzep-tormedium vergleichen und entspricht etwa den Resultaten für die Cornea (Tabelle 13/17), was zu erwarten war, da beide Gewebe einen ähnlichen Grundaufbau aufweisen (vgl. 3.1.1/3). In beiden Fällen wurde der Peff durch den Zusatz von BAC signifikant erhöht. Die o.g. durch BAC hervorgerufenen epithelialen Erosionen (vgl. 4.2.4.1) wurden an der KK mittels Wider-standsbestimmung überprüft. Innerhalb der ersten 30 min nach Applikation der Arznei-stofflösung mit 0.01% BAC sank der TEER der konjunktivalen Gewebe drastisch von 0.88 auf 0.057 kOmegacm2 (Tabelle 16), so dass die Integrität der Gewebe nach kurzer Zeit bereits nicht mehr gegeben war. Die ermittelte Lagtime (Abb. 32) im Arzneistoffkonzentrations/Zeit-Dia-gramm von ~38 min lässt sich ebenfalls mit dem initial wesentlich höheren TEER erklären. Die Diffusion von P-HCl erfolgt zunächst durch eine intakte Membran, die die Permeation einschränkt, bis die Auflockerung des Gewebes durch BAC eintritt und die Diffusion er-leichtert. Korrespondierend zu dem gesunkenen TEER wurde, besonders als Finalwert, ein erhöhter Stromfluss durch KK gemessen (Tabelle 16).

Auch andere Wissenschaftler stellten eine auflockernde Wirkung von BAC an der Konjunk-tiva fest, wie z.B. Ubels et al. [286]. Diese Arbeitsgruppe beobachtete, dass in Regionen, in denen Schädigungen durch 0.01% BAC stattgefunden haben, nur noch eine einzige Zell-schicht vom Epithel übrigblieb bzw. das Epithel vollständig gerissen war. Ashton et al. [227] untersuchten den Einfluss unterschiedlicher BAC-Konzentrationen auf die Permeabilität von vier Betablockern durch isolierte KK. Unabhängig von den physikalisch-chemischen Eigen-schaften der Arzneistoffe, nahm die Permeation mit wachsender BAC-Konzentration durch das Gewebe zu.

Eine Addition von 0.05% EDTA zur Arzneistofflösung führte tendenziell zur Erhöhung des Peff (Tabelle 17), zeigte aber keine statistische Signifikanz. Dieses Resultat korreliert mit dem gemessenen TEER (Tabelle 16), der sich ebenfalls nicht signifikant änderte. Das bedeutet: über die gesamte Experimentdauer von 180 min diffundierte P-HCl, auch in Anwesenheit von EDTA, durch konjunktivales Gewebe mit intakten Zonulae occludentes bzw. Tight junctions, die die parazelluläre Permeation einschränkten. Dieser Befund erklärt die moderate bis feh-


85

lende Wirkung von EDTA als Enhancer. Ashton et al. [227] konnten für Levobunolol und Betaxolol eine ähnliche Situation feststellen. Durch Stabilisierung der Arzneistofflösung mit 0.1 bzw. 0.5 % EDTA wurde die Permeation der beiden Arzneistoffe durch isolierte KK nicht beeinflusst. Sasaki et al. [228] bestätigen diese Ergebnisse für Carteolol, Tilisolol und Befunolol.

Tabelle 17: Permeationsdaten der P-HCl-Lösungen durch Kaninchenkonjunktiva

Zubereitung

Lagtime
[min]

Peff
[10
-6 cm/s]

log Peff

Q180

[µg]

[%]

P-HCL 2%

0

1.72 (0.69)

-5.76

518.61 (226.30)

0.43

+ BAC 0.01%

38.06 (8.71)

5.63 (1.01)*

-5.25

858.65 (411.06)

0.83*

+ EDTA 0.05%

0

2.50 (0.74)

-5.60

509.36 (172.09)

0.42

n=5-9, (*) p<0.05 im Vergleich zu P-HCl 2%, SD in Klammern

Der Vergleich von SC, SS und KK hinsichtlich der Peff ergab, dass SS die größte Permea-bilität für P-HCl aufwies. Der Peff durch SS war 2.3mal höher verglichen mit SC und 3.4mal verglichen mit KK. Zusammenfassend kann für alle isolierten Gewebe festgestellt werden, dass ein Zusatz von 0.01% BAC als Formulierungsparameter im Vergleich zu 0.05% EDTA den wesentlich stärkeren Einfluss auf die P-HCl-Diffusion ausübte. Für alle drei Gewebe war der Peff durch 0.01% BAC signifikant erhöht im Vergleich zur unkonservierten Arzneistoff-lösung.

4.2.5 Diclofenac-Na

4.2.5.1 Corneale und sklerale Permeation

Vergleichend zum hydrophilen P-HCl wurde die Permeabilität des lipophilen Arzneistoffs D-Na durch isolierte SC und SS untersucht. Da jedoch aufgrund der unterschiedlichen Träger-medien in den Kompartimenten der Ussing-Kammer (GBR für P-HCl und GBR/PG für D-Na) kein direkter Vergleich möglich war, wurden Pilocarpin-Versuche in GBR/PG nachgestellt (vgl. 4.2.5.2).


86

Zunächst ergab die Untersuchung, dass die Permeabilität isolierter SC für D-Na erhöht ist gegenüber der SS-Permeabilität (Tabelle 18). Dieses Ergebnis bestätigt die Arbeit von Sasaki et al. [233], der eine geringere sklerale Permeabilität für lipophile Stoffe im Vergleich zur Cornea postulierte. Die Ursachen sind wiederum im unterschiedlichen Aufbau der beiden Gewebe zu suchen. Die Sklera, die hauptsächlich aus Kollagenfibrillen und gelartigen Muco-polysacchariden besteht, ist vergleichsweise hydrophiler und stellt daher für lipophile Stoffe wie D-Na (VK 13.46) eine starke Barriere dar. Wie erwähnt, ist die Cornea deutlich lipophiler als die Sklera und damit die Affinität von lipophilen Arzneistoffen zu diesem Gewebe erhöht. Die Barrierefunktion der Cornea ist gegenüber lipophilen Stoffen entsprechend weniger aus-geprägt als für hydrophile Substanzen.

Tabelle 18: Permeationsdaten der D-Na-Lösung durch Schweinecornea und -sklera

Gewebe

Lagtime
[min]

Peff
[10
-6 cm/s]

log Peff

Q300

[µg]

[%]

SC

119.16 (11.04)

1.77 (0.25)

-5.75

255.38

1.13

SS

118.58 (36.34)

0.84 (0.35)

-6.08

128.83

0.53

n=11-12, SD in Klammern

Wie Abb. 33 und Tabelle 18 verdeutlichen, stellt sich der Gleichgewichtszustand zwischen dem dem Gewebe zugeführten und abgeführten Arzneistoff verzögert ein, denn sowohl bei der Arzneistoffbewegung durch SC als auch durch SS war eine Lagtime zu verzeichnen. Diese könnte dadurch hervorgerufen werden, dass den Geweben sowohl vom Donator- als auch vom Akzeptormedium, die beide aus dem GBR/PG-Gemisch bestehen (vgl. 5.2.6.2), Wasser entzogen wird (vgl. 4.1.4.2/3). Der Arzneistofftransport aus dem Donator in das Gewebe verläuft in die entgegengesetzte Richtung des Wassertransports aus dem Gewebe und wird durch diesen Vorgang behindert. Entsprechend den Hydratationsstudien erfolgt dieser Wasserentzug hauptsächlich innerhalb der ersten Stunde, so dass sich danach das Steady state ungehindert einstellen kann.

Reer et al. [77] publizierten Lagtimes von 37.7 ± 15.5 min für die Permeation von D-Na durch SC aus einem Puffer pH 7.4, der nicht mit PG versetzt war. Dieses Resultat lässt vermuten, dass die Lagtime bei der Permeation durch SC nicht nur durch das eingesetzte Versuchs-medium verursacht wurde. Wahrscheinlich hat die Lipophilie des Arzneistoffs selbst einen nicht zu unterschätzenden Einfluss auf das Permeationsprofil (Abb. 33). So könnte eine mögliche Anreicherung des lipophilen D-Na im lipophilen Epithel der Cornea vor dem eigentlichen Diffusionsprozess ebenfalls eine Lagtime induzieren. Vermutlich verhalten sich die Effekte, die auf die Lipophilie von D-Na zurückzuführen sind, und die des LMs additiv.


87

Abb. 33: Permeation von D-Na durch isolierte Schweinecornea und -sklera, n=11-12

Bezüglich des Permeationsmediums spielt nicht nur die wasserentziehende Eigenschaft des PGs eine Rolle, sondern auch die durch PG bedingte erhöhte Tonizität von GBR/PG (Tabelle 8). Während Reer et al. [77] einen log Peff von -4.63 ± 0.01 durch Kaninchencornea fanden, errechnete sich in dieser Studie lediglich ein log Peff von -5.75 durch SC. Für D-Na wäre durch isolierte SC, aufgrund seiner Lipophilie, ein höherer Peff als für P-HCl zu erwarten gewesen, aber das Gegenteil ist der Fall. Während P-HCl einen Peff von 2.54 x 10-6cm/s aufweist, konnte für das lipophile D-Na lediglich ein Peff von 1.77 x 10-6cm/s gefunden werden. Diese Tatsache ist mit hoher Wahrscheinlichkeit auf die veränderte Hydratation des Gewebes (vgl. 4.1.4.2) und auf den osmotischen Druck, der durch GBR/PG ausgeübt wird, zurückzuführen. Hierfür erfolgt die Bestätigung durch nachfolgende Versuche mit P-HCl und D-Na im gleichen Permeationsmedium.

4.2.5.2 Vergleich von D-Na- und P-HCl-Permeation

Beim Vergleich der Permeation von P-HCl und D-Na aus dem gleichen Permeationsmedium bestätigte sich, dass lipophile Substanzen die Cornea leichter passieren als hydrophile Stoffe (Abb. 34).


88

Abb. 34: Permeation von P-HCl und D-Na aus GBR/PG durch Schweinecornea, n=10-12

Der Peff von D-Na betrug das 8fache, verglichen mit dem Peff von P-HCl (Tabelle 19). Zudem erbrachte diese Untersuchung, dass die Permeation von P-HCl aus GBR/PG im Vergleich zu GBR (vgl. 4.2.4.1) deutlich eingeschränkt war. Die P-HCl-Permeation aus GBR (Peff = 2.54 x 10-6cm/s) ist ca. um den Faktor 11 größer als aus GBR/PG (Peff = 0.22 x 10-6cm/s). Damit wird die Vermutung aus 4.2.5.1 bestätigt, dass sich die erhöhte Tonizität von GBR/PG und die daraus resultierende Dehydratation der Gewebe limitierend auf die Permeation von Arzneistoffen auswirken.

Tabelle 19: Permeationsdaten von D-Na und P-HCl aus GBR/PG durch Schweinecornea

Zubereitung

Lagtime
[min]

Peff
[10
-6 cm/s]

log Peff

Q300

[µg]

[%]

D-Na 2%

119.16 (11.04)

1.77 (0.25)

-5.75

265.43

1.13

P-HCl 2%

0

0.22 (0.08)

-6.66

42.24

0.21

n=10-12, SD in Klammern

Eine weitere Möglichkeit, diese Hypothese zu bestätigen, wären Permeationsstudien durch Barrieren, die kein Wasser enthalten (vgl. 4.2.5.3)


89

4.2.5.3 Permeation durch eine synthetische Membran

Um weitere Erkenntnisse über den Einfluss der Zusammensetzung von Donator- und Akzep-torlösung auf den Arzneistofftransport durch eine Membran zu gewinnen, wurde eine hydrophile synthetische Membran (Nephrophan® = NP) als Permeationsbarriere für P-HCl und D-Na eingesetzt, für die keine relevante Beeinflussung durch die Permeationsmedien zu erwarten war.

Abb. 35: Peff von P-HCl und D-Na durch Nephrophan®, n=5

Aus Untersuchungen von Krase et al. [287] geht hervor, dass die getesteten, hydrophilen Substanzen, ungeachtet der Molekülgröße und des VK, einen Peff von 2.7 x 10-5cm/s durch diese Membran aus regenerierter Zellulose erbrachten. Der in der vorliegenden Versuchsreihe ermittelte Peff für P-HCl (Tabelle 20) ist mit diesem referierten Koeffizienten vergleichbar. Geringfügige Unterschiede sind den unterschiedlichen Permeationsapparaturen zuzuschrei-ben.

Tabelle 20 weist einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Peff von D-Na und P-HCl aus. D-Na war nach 300 min in geringerer Konzentration im Akzeptor zu detektieren. Während für D-Na wieder das PG enthaltende Puffersystem als Permeationsmedium diente, kam für P-HCl nur GBR zum Einsatz.

Neben der stark erhöhten Tonizität von GBR/PG gegenüber GBR, könnte auch die durch den PG-Zusatz erhöhte Viskosität (3.454 mPas) verglichen mit GBR (0.722 mPas) eine Rolle bei der Arzneistoffliberation spielen. Ist ein Arzneistoff in einem LM gelöst, so kann die Dif-fusion in dem LM zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt für die Liberation werden. Der Diffusionskoeffizient einer Substanz ist u.a. abhängig von der Viskosität des umgebenden


90

Mediums; je größer die Viskosität, desto kleiner ist der Diffusionskoeffizient. Natürlich spielt dieser Viskositätseffekt nicht nur bei Permeationen durch NP, sondern auch bei biologischen Membranen eine Rolle, jedoch ist dieser im vorliegenden Fall gegenüber dem osmotischen Druck zu vernachlässigen.

Tabelle 20: Permeationsdaten der D-Na- und P-HCl-Lösungen durch Nephrophan®

Zubereitung

Peff
[10
-6 cm/s]

log Peff

Q300

[µg]

[%]

P-HCl 2%

22.27 (1.70)

-4.65

4990.55 (182.16)

24.95

D-Na 2%

19.75 (0.96)*

-4.70

3551.18 (126.78)*

17.76*

n=5, (*) p<0.05 verglichen mit P-HCl, SD in Klammern

Beim Vergleich der Peff von P-HCl aus GBR bzw. GBR/PG durch SC, stellte sich eine Dezi-mierung des Koeffizienten durch GBR/PG heraus (vgl.4.2.5.2). Der wasserentziehende Effekt von GBR/PG fehlt bei den Versuchen mit NP, da die synthetische Membran kein Wasser bzw. wässriges Medium mit niedrigerer Tonizität als GBR/PG enthält. Folglich sind Einflüs-se, wie osmotischer Druck und Arzneistofftransport entgegen dem Wasserstrom ausgeschaltet und der Einfluss von GBR/PG auf die Diffusion durch NP wird als moderat angenommen.

Als Resümee dieser Studie kann postuliert werden, dass die Permeation durch NP wesentlich weniger durch die Zusammensetzung der Donator-/Akzeptorlösung beeinflusst wird als die Permeation durch okulare Gewebe. Effekte der Versuchsmedien bzw. Einflüsse der Arznei-formulierung auf die Gewebe und daraus resultierende Veränderungen im Permeations-verhalten sind unter Verwendung von NP ausgeschaltet. Aufgrund dieser Tatsache ist NP geeignet, Wechselwirkungen zwischen dem Arzneistoff und dem Versuchsmedium bzw. mit zugesetzten Hilfsstoffen der Arzneistofflösung, die zu einer veränderten Permeation führen können, zu erfassen [288].

4.2.6 Mycophenolatmofetil

Die extrem geringe Löslichkeit von MMF (vgl. 4.1.1.2) erforderte Maßnahmen zur Löslich-keitsvermittlung. Die unter Zusatz von HP-beta-CD entwickelten Formulierungen sind in Tabel-le 9 charakterisiert. Zur Testung gelangte eine Zubereitung mit 1% MMF, das zunächst in


91

GBR, versetzt mit 10% HP-beta-CD, suspendiert wurde. Diese Suspension wurde dann bei 121° C und 200 kPa für 15 min autoklaviert, um das schwerlösliche MMF in Lösung zu bringen (vgl. 4.1.1.2). Bei dieser Bearbeitung fand eine teilweise Hydrolyse des Esters MMF statt, so dass in der Lösung auch MPA zu detektieren war (vgl. 4.1.1.2). Beide Substanzen lagen nach dem Autoklavieren in einem Verhältnis von 43.34 ± 5.36 % MMF : 56.67 ± 5.36 % MPA (n=13) vor.

Ausgehend von dieser Lösung wurde die Permeation beider Komponenten durch isolierte SC erfasst. In drei von zehn Ussing-Kammern war MMF während der gesamten Experimentdauer nicht im Akzeptormedium zu detektieren. Für die restlichen sieben Ansätze errechnete sich eine minimale Permeabilität von 0.23% MMF nach 5 h, was einer Konzentration von 0.38 µg/ml entsprach. Die Peff wurden aufgrund der Tatsache, dass teilweise erst nach geraumer Zeit (t > 210 min) MMF-Konzentrationen im Akzeptormedium messbar waren, nicht berech-net. Es ist also anzunehmen, dass die metabolische Aktivität des isolierten Gewebes erhalten blieb und das im Donator vorliegende Prodrug bei der Membranpassage nahezu vollständig enzymatisch gespalten wurde.

Wird bereits der aktive Metabolit MPA im Donatorkompartiment vorgelegt (hier in stöchio-metrischer Konzentration zu 1% MMF in GBR/10% HP-beta-CD, d.h. 0.74% MPA) ergibt sich eine um 78% erhöhte Permeationsrate (5 h-Wert) gegenüber MPA, das aus der MMF-Präpara-tion freigesetzt wird (Abb. 36, Tabelle 21).

Trotz der größeren Hydrophilie von MPA (VK 0.46) passierte dieser Wirkstoff die Cornea in größerem Ausmaß als MMF (VK 12.25), welches deutlich lipophiler ist und damit eigentlich favorisiert für den Durchtritt durch das Gewebe sein sollte. Eine Ursache für dieses uner-wartete Phänomen könnte neben der Metabolisierung zu MPA die höhere Molekülmasse von MMF (Mrel 433.5), verglichen mit MPA (Mrel 320.3), sein. Wie bereits erwähnt, bestimmten Liaw and Robinson [207] für Polyethylenglykol ein Cut-off für die corneale Permeation bei einer Molekülmasse von 400-600. Sasaki et al. [208] berichteten, dass die Permeabilität von hydrophilen Molekülen eine signifikante Korrelation zur Molekülmasse zeigte.

An Hand dieser in vitro-Resultate war zu schlussfolgern, dass das Prodrug MMF keine Vor-teile hinsichtlich der Verfügbarkeit bei der topischen okularen Anwendung gegenüber MPA bietet. Allerdings wurde bei in vivo-Verteilungsstudien an Kaninchenaugen, durchgeführt in


92

unserer Arbeitsgruppe [289], eine größere MPA-Konzentration in der Cornea bei topischer Applikation von 1%iger MMF-Lösung gefunden als bei der Anwendung von MPA-Lösung gleicher Konzentration (Sörensen-Phosphat-Pufferlösung pH 7.4, 10% HP-beta-CD, Autokla-vieren).

Abb. 36: Permeation von MPA aus einer MMF-Lösung 1% (= 0.43% MPA) und aus einer MPA-Lösung 0.74%, n = 9-10

Auch von anderen Wissenschaftlern konnte bewiesen werden, dass MPA eine zweimal größere Bioverfügbarkeit aufgrund verstärkter Absorption hatte, wenn es oral als MMF an nicht-menschliche Primaten verabreicht wurde [290]. Jedoch lässt sich dieser Befund aus der durchgeführten in vitro-Studie mit SC nicht verifizieren.

Tabelle 21: Permeationsdaten von MPA aus einer MMF-Lösung 1% (= 0.43% MPA) und aus einer MPA-Lösung 0.74%

Zubereitung

Peff
[10
-6 cm/s]

log Peff

Q300

[µg]

[%]

MMF 1.0%

2.81 (1.03)

-5.55

132.02 (49.79)

4.57

MPA 0.74%

5.48 (1.96)

-5.26

337.89 (105.35)

2.57

n=9-10, SD in Klammern

Als Nachteil hinsichtlich der Verwendung von MMF-Lösung ist die mehr oder weniger un-kontrollierte Hydrolyse des Wirkstoffs während des Autoklavierens und ggf. bei der Lagerung anzusehen. Obwohl sich das Ausmaß der Esterhydrolyse von MMF sofort nach der Herstel-lung in definierten Grenzen (43.34 ± 5.36 % MMF : 56.67 ± 5.36 % MPA) bewegt, muss mit unterschiedlichen Verfügbarkeiten gerechnet werden. Die Esterhydrolyse von MMF findet


93

auch bei Raumtemperatur ohne vorherige Autoklavierung und Lagerung im verwendeten Puf-fersystem statt. Nach 24 h wurden 88.35 ± 0.38% des gelösten MMF als Ester wieder-gefunden, die restlichen 11.65 ± 0.38% waren als MPA zu identifizieren. Weiterführende Stabilitätstests der MMF- und MPA-Lösungen sind notwendig, um geeignete, praxisrelevante Formulierungen zu erhalten.

Gemäß den vorliegenden Ergebnissen kann der Einsatz von MPA anstatt MMF in Augen-tropfen in Erwägung gezogen werden, da erstens eine höhere in vitro-Verfügbarkeit erzielt wurde, zweitens eine Spaltung von MPA nicht nachgewiesen werden konnte und drittens MPA besser wasserlöslich ist als MMF. Allerdings sollten die Resultate der in vivo-Unter-suchungen an Kaninchenaugen unserer Forschungsgruppe [289] kritisch in die Bewertung der Ergebnisse der in vitro-Studie einbezogen werden.

4.2.7 Permeation durch gelaserte Schweinecornea

4.2.7.1 Laserchirurgie

Die refraktive Chirurgie der Cornea lässt sich bis in das vorletzte Jahrhundert verfolgen. Schiötz war 1884 der erste Chirurg, der einen postoperativen Astigmatismus durch Einschnit-te in die Cornea senken konnte [291].

In der Ophthalmochirurgie gewinnt die refraktive Chirurgie zunehmend an Bedeutung. Immer mehr Patienten mit stärkeren Brechungsfehlern wenden sich hilfesuchend an den Augenarzt, da sie weder Brille noch Kontaktlinsen tolerieren. Auch wenn ein Teil der Patienten vornehm-lich kosmetische Gründe für den Wunsch nach einer derartigen Operation angibt, so ist der Prozentsatz derer, die tatsächlich aus augenärztlicher Sicht berechtigte Probleme haben, nicht zu unterschätzen.

Schon seit Jahren existieren eine Reihe von Operationsverfahren zur Behandlung von Ame-tropien (= Fehlsichtigkeiten infolge einer Brechungsanomalie des Auges), so z.B. die Photore-fraktive Keratektomie [292,293,294], die Phototherapeutische Keratektomie [295], die Radi-äre Keratotomie [295,296] und die Laser Intrastromale Keratomileusis [297,298]. Allerdings darf nicht vergessen werden, dass allen diesen bisher weltweit angewandten Methoden noch mehr oder weniger Unsicherheiten anhaften.


94

Seit Einführung des Excimer-Lasers in die Ophthalmochirurgie durch Trokel et al. [299] haben sich neue Möglichkeiten für die refraktive Chirurgie ergeben, so zuerst die Korrektur des Astigmatismus durch lineare Schnitte mit dem Excimer-Laser [300,301,302]. Im Juni 1988 haben McDonald et al. [303] den Excimer-Laser der Wellenlänge 193 nm erstmals er-folgreich bei der Behandlung eines sehenden myopen Auges angewendet. Bereits im Oktober 1989 [304,305] wird über weitere Ergebnisse bei der Behandlung kurzsichtiger Augen mit dem Excimer-Laser berichtet. Die Resultate dieser neuen Technik, die Laserkeratomileusis, Shaping oder aber auch Photoablative Keratektomie (PRK) genannt wird, wurden hinsichtlich Abheilung und refraktiver Korrektur als gut bezeichnet. Diese Lasertechnik fand in einigen Versuchsreihen Anwendung und soll deshalb näher erläutert werden.

Die PRK wird hauptsächlich zur Behandlung des Astigmatismus und der Myopie ange-wendet. Beim Astigmatismus handelt es sich um eine Fehlsichtigkeit, bei der eine der brech-enden Flächen, insbesondere die Hornhautvorderfläche, unregelmäßig gekrümmt ist. Bereits beim Normalsichtigen weist die Hornhaut in vertikaler Richtung eine etwas stärkere Krüm-mung als in horizontaler Richtung auf, die jedoch durch entgegengesetzte Unterschiede in der Linsenkrümmung weitgehend kompensiert wird. Bestehen stärkere Differenzen der Hornhaut-krümmung in verschiedenen Ebenen, so wird ein kreisrunder Gegenstand auf der Retina ellip-tisch verzerrt abgebildet. Ein solcher regulärer Astigmatismus erfordert eine Korrektur durch ein zylindrisch geschliffenes Brillenglas.

Bei der Myopie liegt meist eine Verlängerung des Augenbulbus oder seltener eine verstärkte Brechkraft des dioptrischen Apparates vor. Als Folge davon vereinigen sich die Strahlen bei fernakkommodierten Augen bereits vor der Retina, so dass auf der Retina ein unscharfes Bild entsteht. Nahe Gegenstände können jedoch bei entsprechender Akkomodation auf der Netz-haut scharf abgebildet werden. Der Kurzsichtige benötigt für die Betrachtung entfernter Ge-genstände eine Brille mit einer (konkav geschliffenen) Zerstreuungslinse, welche die Brech-kraft des dioptrischen Apparates reduziert und dadurch die Bildebene auf die Netzhaut verla-gert. Sowohl für das Ausgleichen eines Astigmatismus als auch einer Kurzsichtigkeit sind Kontaktlinsen geeignet.

Mit Hilfe der PRK ist es möglich, die beschriebenen Refraktionsanomalien zu reduzieren bzw. zu beseitigen, indem die Korrekturlinse in die Cornea gelasert wird. Dazu wird zunächst


95

mechanisch das Epithel der Cornea entfernt, um dann Teile des Stromas mit Hilfe des Ex-cimer-Lasers zu entfernen. Der Excimer-Laser emittiert ultraviolette Strahlen mit einer Wel-lenlänge von 193 nm und verursacht eine spezifische photochemische Reaktion, die zu einer Ablation des Stromas führt, ohne die umliegenden Gewebe thermisch zu belasten [306,307]. Je nach der myopischen Korrektur werden unterschiedliche Mengen des Hornhautstromas ab-getragen; so werden z.B. zur Korrektur von -3 bis -15 dpt, 30-130 µm des zentralen Stromas in einer bearbeiteten optischen Zone von 5 mm Durchmesser entfernt [292]. Durch diese Operation wird die Corneaoberfläche abgeplattet [307,308,309], was der konkaven Zerstreu-ungslinse entspricht, die die Brechkraft des dioptrischen Apparates reduziert. Dabei ist es möglich, bis zu einer Dioptrienstärke von -10, eine postoperative Korrektur zwischen -1 und +1 dpt nach drei Monaten zu erreichen.

Durch den Epitheldefekt nach der Operation kann es in den ersten 3-4 Tagen, solange das Epithel noch nicht vollständig abgeheilt ist, zur vermehrten Tränenbildung, einem Lidödem und/oder einer Corneaentzündung kommen [292]. Nach abgeschlossener epithelialer Wund-heilung, zumeist innerhalb von 4 Tagen, kann weiterhin eine Epitheltrübung auftreten, die sich in der Regel innerhalb von 1-2 Wochen wieder vollständig aufklart [292]. Vier Wochen nach der Behandlung besteht die Möglichkeit einer stromalen Trübung, die hinsichtlich Inten-sität und Rückbildung verschiedene Verläufe aufzeigen kann. Weitere negative Effekte, die den Erfolg der PRK mindern können, sind die Narbenbildung nach der Operation, die eine Verschlechterung der Sehschärfe mit sich bringt, eine vermehrte Blendempfindlichkeit am Tag, wie auch bei Dämmerung und Dunkelheit und die Wahrnehmung eines weißen Schlei-ers, der tagsüber als störend von den Patienten empfunden wird.

Darüber hinaus muss darauf hingewiesen werden, dass es bereits innerhalb eines halben Jah-res, je nach Höhe der Korrektur, zu Regressionsraten von 2-5 dpt kommen kann [292].

Das Ziel dieser Studie war es, die Permeation von P-HCl und D-Na durch isolierte, gelaserte SC zu untersuchen. Wie o.g., findet nach erfolgter PRK eine zeitabhängige, vollständige Re-epithelisierung der Cornea statt, so dass im Verlauf der Wundheilung unterschiedliche Epi-theldicken auftreten können, die u.U. Einfluss auf die Permeabilität der Cornea für Arznei-stoffe haben. Diese unterschiedlichen Epitheldicken wurden mit Hilfe des Excimer-Lasers si-muliert, indem der Cornea jeweils 25, 50, 75 und 100% des Epithels bzw. die Bowman-Membran abladiert wurden. Dazu wurde der komplette Augapfel in eine spezielle Halterung ge-bracht und die Laserung im Hornhautepithel vorgenommen (vgl. 5.2.8.2).


96

Nach erfolgter Ablation der Epithelschichten wurden die Hornhäute isoliert und für Permea-bilitätsstudien in die Ussing-Kammer eingespannt (vgl. 5.2.6). Der Einfluss verschiedener Epitheldicken auf die Permeabilität der Cornea gewinnt Bedeutung bei der Dosisanpassung in topischen Zubereitungen, die zur Nachbehandlung der PRK relevant sind. Das wiederum könnte eine unnötige Belastung des Patienten mit Wirkstoffen vermeiden und evtl. Nebenwir-kungen reduzieren.

4.2.7.2 Pilocarpin-HCl-Permeation

Obwohl ca. 400 000 PRKs pro Jahr durchgeführt werden, ist wenig über die Arzneistoffper-meation durch gelaserte Hornhäute bekannt. P-HCl diente auch in dieser Studie als hydro-philer Modellarzneistoff, der selten 1%-ig zur Vorbeugung des entstehenden erhöhten IOP während der Operation eingesetzt wird.

Abb. 37: Permeation von P-HCl durch Schweinecornea mit unterschiedlichen Epitheldicken unter Einfluss von BAC und EDTA, n=8-13, (*) p<0.05 verglichen mit P-HCl 2% der jeweiligen Ablationsstufe (%-Angabe der Epithellaserung; o.E = ohne Epithel; o.B = ohne Bowman-Membran)

Zunächst soll auf die Ergebnisse der Ussing-Kammer-Experimente eingegangen werden, die mit der hilfsstofffreien P-HCl-Lösung erzielt wurden. Nach der Excimer-Laser-Behandlung waren signifikante Unterschiede in der P-HCl-Permeation durch SC zu verzeichnen. Die Peff -Werte für P-HCl durch Hornhäute unterschiedlicher Epitheldicke zeigten einen signifikanten Anstieg zur jeweils darauffolgenden Ablationsstufe (Tabelle 22). Die Entfernung der Bowman-Membran führte zu keinem weiteren Anstieg (Tabelle 22). Laut Shih und Lee [310] erstreckt sich die Barrierefunktion der Cornea für hydrophile Substanzen durch alle Epithel-schichten hindurch, was durch diese Untersuchungen bestätigt werden konnte.


97

Die Ablation von 25% des Epithels (SC 25%) führte zu einer Verdoppelung der Permeation von P-HCl, da die oberen beiden Zellschichten des Epithels die durchlässigkeitsbestim-menden Barrieren bei der parazellulären Permeation darstellen [24]. Die anderen Peff nahmen kontinuierlich um das 1.5fache pro Ablationsstufe zu. Interessanterweise führte eine Entfer-nung der Bowman-Membran (SCo.E, o.B) zu keiner weiteren Steigerung der Corneapermea-bilität, verglichen mit SCo.E. Dies spielt insofern eine Rolle, da sich die Bowman-Membran bei PRK-behandelten Augen nicht erneuert, sondern durch eine feine Schicht von etwas stärker reflektierendem Stroma (Narbengewebe) ersetzt wird [311].

Tabelle 22: Permeationsdaten von 2%igen P-HCl-Lösungen durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke

Zubereitung

Ablation
[µm]

abladiertes Epithel [%]

Peff
[10
-6 cm/s]

log Peff

Q300

[µg]

[%]

P-HCl 2%

0

0

2.54 (0.75)

-5.60

470.16

2.35

12.5

25

5.80 (0.93)

-5.24

1134.32

5.67

25.0

50

7.81 (0.92)

-5.11

1586.72

7.93

37.5

75

10.4 (1.56)

-4.98

2134.48

10.67

o.E

100

16.5 (1.31)6

-4.78

3656.02

18.28

o.E, o.B

100

16.6 (1.58)5

-4.78

3552.95

17.76

+ BAC 0.01%

0

0

7.79 (2.22)

-5.11

1631.94

8.16

12.5

25

11.7 (2.00)

-4.93

2402.93

12.02

25.0

50

15.4 (1.54)

-4.81

3108.22

15.54

37.5

75

17.2 (1.93)5

-4.76

3802.18

19.41

o.E

100

18.5 (2.77)4

-4.73

4695.24

23.48

+ EDTA 0.05%

0

0

3.79 (1.43)2

-5.42

838.66

4.19

12.5

25

4.08 (1.25)1

-5.39

970.90

4.98

25.0

50

9.16 (0.90)4

-5.04

2081.93

10.53

37.5

75

10.3 (1.66)3

-4.99

2427.73

12.30

o.E

100

19.7 (1.90)

-4.71

4444.14

22.07

n=8 - 12, p>0.051) verglichen mit 0 µm (1); 12.5 µm (2); 25 µm (3); 37.5 µm Ablationstiefe (4); o.E (5); o.E, o.B (6), SD in Klammern

An dieser Stelle sei erwähnt, dass durch die PRK irreversible, strukturelle Veränderungen des Hornhautepithels und -stromas im Heilungsprozess auftreten können. Neben der fehlenden Bowman-Membran als Grenzschicht zwischen Epithel und Stroma wurden von Böhnke et al. [311] intraepitheliale, runde, reflektierende Strukturen beobachtet, die teilweise die Größe einer Basalzelle erreichten. Außerdem fanden sich im Stroma erhöhte Zelldichten und un-


98

regelmäßige Anordnungen der Keratozyten. Besonders auffällig waren lineare, dichte Struk-turen, die nur im Bereich der Keratektomie vorkamen und in abnehmender Intensität ebenfalls noch in den tieferen Schichten des Stromas gefunden wurden [312]. Auch diese Veränder-ungen, die in dieser Studie nicht simuliert werden konnten, da es zu keiner echten Wund-heilung kam, haben möglicherweise einen Einfluss auf die Arzneistoffpermeation.

In in vivo-Untersuchungen nach Applikation von Fluoreszein-Na, eine ebenfalls hydrophile Substanz, wurde gefunden, dass die Permeabilität von PRK-Hornhäuten innerhalb der ersten Woche nach der Operation für den Teststoff signifikant erhöht war, um nach zwei Wochen wieder den präoperativen Stand zu erreichen [313]. Kim et al. [314] beobachteten, dass die epitheliale Barrierefunktion nach PRK innerhalb der ersten zwei Wochen beeinträchtigt war, obwohl das Epithel das gelaserte Stroma während der Rückbildung vollständig überdeckte. Tiefere Laserabtragungen führten zu einer höheren Carboxyfluoreszein-Penetration für länge-re Zeit als geringere Ablationstiefen.

Weiterhin dürfte auch eine bei der PRK erfolgende Dickeveränderung der Cornea eine Rolle bei der Arzneistoffdiffusion spielen. So wurde im Kaninchenmodell ermittelt, dass das erneu-erte Epithel eine Woche nach erfolgter PRK ca. 30% dünner (32 ± 8µm) war im Vergleich zur präoperativen Dicke von 46 ± 2 µm. Nach zwei Wochen wurden allerdings keine signifi-kanten Unterschiede bezüglich der Epitheldicke mehr gefunden [315]. Messungen der Stro-madicke haben ergeben, dass sich innerhalb der ersten Woche nach der Operation ein corne-ales Ödem entwickelte, welches nach zwei Wochen wieder abgeklungen war [315]. Ebenfalls zwei Wochen nach erfolgter PRK setzte ein progressives Anwachsen der stromalen Dicke ein. Nach 6 Monaten war das Ödem zurückgebildet und die präoperative Dicke wieder erreicht [315]. In dieser Arbeit wurde kein Bezug auf die Dickeänderung des Stromas genommen; es wurden lediglich unterschiedliche Epitheldicken durch Ablation mit dem Excimer-Laser simuliert.

In das Versuchsprogramm an gelaserter Cornea wurden in Analogie zu den Untersuchungen an intakten Geweben (vgl. 4.2.4.1) die Einflussparameter 0.01% BAC und 0.05% EDTA ein-bezogen. Trotz der bekannten desintegrierenden Wirkung, besonders von BAC, auf das Horn-hautepithel, werden diese Hilfsstoffe zur Konservierung und Stabilisierung von postoperativ applizierten Augentropfen verwendet. 0.01% BAC bzw. 0.1% EDTA, viermal täglich nach PRK in Kaninchenaugen appliziert, ließen keinen signifikanten Effekt auf die Hornhaut-


99

heilung oder epitheliale Migrationsrate erkennen [316]. Eine Kombination aus 0.01% BAC und 0.1% EDTA retardierte die Wundheilung nur leicht, aber 0.02% BAC verhinderten die Genese vollständig [316].

Wie in Abb. 37 dargestellt, hat BAC auf jede Zellschicht des Epithels eine Enhancerwirkung bezüglich der P-HCl-Permeation. Die Permeation durch gelaserte Hornhäute war, unabhängig von der Ablationstiefe im Epithel, signifikant erhöht durch die Konservierung mit 0.01% BAC. Auffällig ist, dass die Enhancerwirkung von der apikalen Seite des Epithels zum Inne-ren der Hornhaut abnimmt. Dies wiederum korreliert mit der Tatsache, dass die obersten Epi-thelschichten die ausgeprägteste Barrierefunktion haben [24] und damit eine Auflockerung dieser Zellverbände die größte permeationsfördernde Wirkung zeigt. Ähnlich wie bei der un-konservierten P-HCl-Zubereitung unterschieden sich die Peff von Ablationsstufe zu Ablations-stufe signifikant, mit Ausnahme von SCo.E.

Bei Verwendung von 0.05% EDTA konnte nur teilweise eine Enhancerwirkung festgestellt werden (Abb. 37). Während bei Ablation von 25% Epithel eine Erniedrigung des Peff, ver-glichen mit der EDTA-freien Lösung, erfolgte, waren signifikante Erhöhungen des Peff bei Entfernung von 50% und des gesamten Epithels zu registrieren. Die partielle Steigerung der Permeabilität, bedingt durch EDTA, war deutlich geringer ausgeprägt als durch BAC. Im Ge-gensatz zur unkonservierten und mit BAC konservierten Lösung blieb die Ablation von 25% des Epithels ohne Einfluss auf die P-HCl-Konzentration im Akzeptor unter Verwendung von EDTA. Zwischen den Ablationsstufen 50 und 75% war ebenfalls kein signifikanter Unter-schied messbar.

Madhu et al. [317] untersuchten den Einfluss von 0.01%BAC/0.1%EDTA auf die Ketorolac-tromethamin-Bioverfügbarkeit nach Applikation in Kaninchenaugen mit normaler und deepi-thelisierter Hornhaut in vitro. Dabei wurde eine signifikante Erhöhung der Verfügbarkeit durch BAC/EDTA für letztere gefunden.


100

4.2.7.3 Diclofenac-Na-Permeation

D-Na wird zur Nachbehandlung der PRK eingesetzt, um den postoperativen Schmerz zu lin-dern und eine mögliche Entzündung zu unterdrücken [318,319,320]. Nach erfolgter PRK er-fahren einige Patienten eine klinisch signifikante myopische Regression und corneale Trü-bung (siehe oben). Die Intensität der beiden unerwünschten Effekte korreliert miteinander [321,322,323] und resultiert aus der stromalen Wundheilung [322,323,324], die mit der Proli-feration der Keratozyten in der Cornea direkt unter dem Epithel einhergeht [325].

Üblicherweise werden postoperativ Steroide für 3-6 Monate verabreicht, um die stromale Wundheilung zu modulieren. Ihre Fähigkeit, myopische Regression und corneale Trübung zu reduzieren, wird immer noch kontrovers diskutiert [321,322]. Außerdem besteht bei Langzeit-anwendung von Kortikosteroiden die Gefahr der Ausbildung eines Kataraktes, Glaukoms oder einer Infektion.

NSAID bieten eine Alternativtherapie mit geringerer Nebenwirkungsgefahr. Ihr Wirkungs-mechanismus unterscheidet sich von den Steroiden, indem sie selektiv die Lipoxygenase bzw. Cyclooxygenase hemmen (vgl. 3.2.1.2.2), anstatt die Phospholipase A2. Zusätzlich zum anti-inflammatorischen Effekt zeigten sie mehr Potenz in der Reduktion der Tenon‘s Fibroplasten-Proliferation in Zellkultur [326,327]. Sie haben weiterhin den Vorteil, den postoperativen Schmerz nach der PRK zu senken [18,328], u.a. durch die Senkung der Prostaglandin E2-Aus-schüttung in das Kammerwasser [329]. Nassaralla et al. [330] bewiesen die signifikante Re-duktion der cornealen Trübung nach PRK an Kaninchen durch Applikation von D-Na-Augen-tropfen.

Allerdings weist D-Na bei der Anwendung als Augenzubereitung auch Nachteile auf, wie z.B. die erhöhte Permeabilität von Hornhäuten nach Langzeitapplikation des Arzneistoffs nach PRK [331], die wahrscheinlich durch punktuelle Epitheliopathie verursacht wird [332,333].

Im Gegensatz zu P-HCl konnten für D-Na nur geringfügige Unterschiede zwischen den Peff der einzelnen Ablationsstufen des Epithels festgestellt werden. Tendenziell wurden die Koef-fizienten größer mit abnehmender Epitheldicke (Abb. 38). Ähnliches fanden McDermott et al. [334], die die intraokulare Penetration von Dexamethason, eine relativ lipophile Substanz, ähnlich wie D-Na, untersuchten. Es konnte keine signifikante Differenz zwischen PRK-be-


101

handelten und unbehandelten Hornhäuten hinsichtlich der Konzentration an Steroid in der Cornea und im Kammerwasser gefunden werden.

Abb. 38: Permeation von D-Na durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke, n=8-12, (*) p<0.05 verglichen mit unbehandelter SC

In der vorliegenden Studie bewirkte lediglich die Ablation des gesamten Epithels eine signifi-kante Steigerung des Peff, verglichen mit intakter SC (Abb. 38). Im Falle des lipophilen D-Na stellt das corneale Stroma die Hauptbarriere dar [11], und die gefundene, kaum veränderte Permeabilität des Arzneistoffs durch unterschiedlich dickes Corneaepithel bestätigt die unter-geordnete Bedeutung des Epithels als Barriere. Ähnlich wie bei P-HCl hatte auch hier die Bowman-Membran keinen erfassbaren Einfluss auf die Arzneistoffkonzentration im Akzep-tormedium.

Im Permeationsprofil von D-Na (vgl. 4.2.5.1) war der erste Abschnitt der Kurve, der an-nähernd parallel zur Abszisse verläuft, als Lagtime zu verzeichnen. Aus Tabelle 23 geht her-vor, dass die Lagtime mit steigender Ablationstiefe bis auf 0 min sinkt, wenn der Arzneistoff direkt auf das Stroma trifft. Daraus könnte geschlossen werden, dass vor dem Transport von D-Na via transzellulärer Permeation eine Verteilung des Arzneistoffs im Epithel stattfindet (vgl. 4.2.5.1). Mit zunehmendem Abtrag des Epithels nimmt die Verteilung in dem dünner werdenden Gewebe ab und folglich wird auch die Lagtime geringer.

Eine andere Begründung könnte die o.g. Verwendung von GBR/PG mit den bereits disku-tierten Effekten sein (vgl. 4.1.4). Das Entfernen der Bowman-Membran bewirkt eine völlige Offenlegung des Stromas, so dass ein ungehinderter Wasserentzug aus diesem erfolgen kann.


102

Innerhalb kürzester Zeit kann der Tonizitätsunterschied zwischen Gewebe und Versuchs-medium ausgeglichen werden, da das Epithel als semipermeable Membran und Barriere fehlt. Der Gegenstrom zur Arzneistoffdiffusion ist damit unterbunden, und die Diffusion von D-Na kann nahezu sofort nach Beginn des Permeationsexperimentes erfolgen, so dass keine Lag-time auftritt.

Tabelle 23: Permeationsdaten der D-Na-Lösung durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke

Ablation
[µm]

abladiertes Epithel [%]

Peff
[10
-6 cm/s]

Lagtime
[min]

Q300

[µg]

[%]

0

0

1.77 (0.25)5,6

119.16

255.38

1.13

12.5

25

1.73 (0.23)5,6

109.46

265.43

1.33

25.0

50

1.86 (0.30)5,6

98.75

317.75

1.59

37.5

75

2.02 (0.13)5,6

74.83

319.95

1.60

o.E

100

2.87 (0.33)1,2,3,4

57.10

520.67

2.56

o.E, o.B

100

2.51 (0.58)1,2,3,4

0

446.28

2.31

n=8-12, p<0.05 verglichen mit 0 µm (1); 12.5 µm (2); 25 µm (3); 37.5 µm Ablationstiefe (4); o.E (5); o.E, o.B (6), SD in Klammern

Aus den Untersuchungen der mittels Excimer-Laser abladierten SC ist zu schlussfolgern, dass die Arzneistoffpermeation in Abhängigkeit von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Arzneistoffe z.T. erheblich erhöht sein kann und folglich Überdosierungen nicht auszu-schließen sind. In der aktuellen Untersuchung wurde dieser Effekt vor allem für das kleine und hydrophile Wirkstoffmolekül P-HCl gefunden. Im Gegensatz dazu wird die Permeation von lipophilen Arzneistoffen offensichtlich weniger beeinflusst, wie am D-Na gezeigt. Darü-ber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch die Hilfsstoffe der Formulierung den Wirkstoff-transport z.T. eminent beeinflussen. Die postoperative Anwendung von Augentropfen sollte in jedem Fall gut überwacht werden, um Nebenwirkungen, verursacht durch Permeabilitäts-änderung der Cornea, auszuschließen

4.2.7.4 Raster-Elektronenmikroskopie (REM)

Mit Hilfe der REM sollten Veränderungen der Epitheloberfläche, hervorgerufen durch das Lasern des Epithels sowie durch die Applikation von BAC, manifestiert werden. Es ist be-kannt, dass einige pharmazeutisch verwendete Substanzen Veränderungen der Hornhaut her-vorrufen, so verursacht z.B. Tetracain, neben vielen anderen ophthalmologischen Pharmaka,


103

einen Verlust von Oberflächenmikrovilli [335], eine Störung im Aufbau der Zellmembranen und ein Klumpen der Tonofilamente [336], was durch REM sichtbar gemacht werden konnte.

Zunächst soll der Einfluss von BAC auf die Epithelmorphologie der Cornea untersucht werden. Abb. 39 zeigt die Aufsicht auf intaktes Epithel unbehandelter Cornea (links), in der die Epithelzellen ein polygonales Mosaik formen. Deutlich zu erkennen sind die Begren-zungen zwischen den einzelnen Zellen. Rechts (Abb. 39) ist eine Cornea abgebildet, die 5 h in GBR, versetzt mit 0.01% BAC, inkubiert wurde. In dieser Aufnahme wird ersichtlich, dass sich einige Ecken der Oberflächenzellen von der darunterliegenden Epithelschicht abgelöst bzw. abgeschuppt haben, wodurch die darunterliegende Zellschicht Zellkernbeulen aufweist (Bläschen auf dem gesamten Epithel). Pfister et al. [337] beobachteten an Kaninchenaugen bereits 15 min nach Applikation von 0.01% BAC eine Loslösung der Oberflächenepithel-zellen voneinander und ein gleichzeitig einsetzendes Schuppen.

Abb. 39: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: nach Inkubation in GBR/0.01% BAC, Aufsicht; x 500

In Abb. 40 sind die gleichen Gewebeausschnitte wie in Abb. 39, aber in stärkerer Vergrös-serung (1:10), dargestellt. Im linken Bild ist deutlich eine Zellbegrenzung zu erkennen, und die Mikrovilli erscheinen als weiße Pünktchen. Die rechte Abb. zeigt eine Zellkernerhebung, die durch die Inkubation mit BAC hervorgerufen wurde. Die erste Zellschicht hat sich bereits abgeschält, und die darunterliegende Schicht mit der Erhebung wird sichtbar. In Nachbar-schaft zu dem erhabenen Zellkern befindet sich eine Vertiefung, die die Lokalisierung des Zellkerns einer Zelle der bereits abgeschälten, vormals darüberliegenden Schicht kennzeich-net. Ähnlich wie in der Arbeit von Pfister et al. [337] wurde ein Verlust sowie eine Verklei-nerung der Mikrovilli beobachtet. Nach 30 min stellte die Arbeitsgruppe Pfister [337] bei ihren in vivo-Untersuchungen eine aktive Migration von cornealen Epithelzellen fest, verbun-


104

den mit einer starken Membrandegeneration, und nach 3 h fand ein Abrollen der ersten Zell-schicht statt.

Schädigungen des cornealen Epithels können jedoch vom Gewebe selbst repariert werden. Die Reparatur in vivo ist ein biphasischer Prozess, bei dem zunächst über 5-6 h keine Epithel-zellmigration auftritt (latente Phase) und dann das bloße Stroma von den noch vorhandenen, in Migration befindlichen Epithelzellen bedeckt wird [338]. Die Zellproliferation wird nach-folgend initiiert und die normalen 4-6 Zellschichten des Epithels werden wieder hergestellt.

Abb. 40: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: nach Inkubation in GBR/0.01% BAC, Aufsicht; x 5000

Schlussfolgernd aus den BAC-Versuchen ist eine Anwendung von BAC als Konservierungs-mittel in Augentropfen nur unter Vorbehalt zu empfehlen. Für die gefundenen Permeations-steigerungen (vgl. 4.2.4.1) ergibt sich aus den durch REM sichtbar gemachten Epithelschä-digungen eine plausible Erklärung.

Im Folgenden sollen die REM-Aufnahmen, die von gelaserter Cornea aufgenommen wurden, interpretiert werden. Die Abb. 41-43 zeigen Querschnitte gelaserter Hornhaut mit den jeweili-gen Ablationsstufen 25, 50, 75 und 100%. Mit Zunahme der Ablationstiefe ist deutlich eine Reliefbildung zu verifizieren. Der Excimer-Laser rastert die Hornhaut ab und setzt seine Laserpulse bei jedem Durchlauf an die gleiche Position auf der Cornea, so dass die Hornhaut nur unregelmäßig entfernt wird und ein Streifenmuster entsteht. Durch eine höhere Auflösung ließe sich dieses Phänomen allerdings verringern. Bei höherer Auflösung überlappen sich die Pixel, die der Laser pulsweise abrastert, stärker, und die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von ungelaserten Flächen wird geringer.


105

Abb. 41: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: mit 75% Epithel, Querschnitt; x 50

Abb. 42: links: Schweinecornea mit 50%Epithel, rechts: mit 25% Epithel, Querschnitt; x 50

Abb. 43: Schweinecornea ohne Epithel, Querschnitt; x 50

In Abb. 43 ist eine Cornea ohne Epithel dargestellt, in der erwartungsgemäß kein Streifen-muster mehr zu identifizieren ist. Lediglich die Kollagenfasern des Stromas sind zu erkennen.


106

Eine weitere Aussage, die aufgrund der Querschnitte getroffen werden kann, ist, dass die Laserstrahlung tatsächlich nur Auswirkungen auf die Oberfläche des Epithels hat. Unter der Oberfläche liegende Zellschichten werden von der Laserstrahlung nicht erfasst, wie Quer-schnitte stärkerer Vergrößerung belegen (Abb. 44). Den REM-Aufnahmen kann entnommen werden, dass sich die Integrität der einzelnen Zellschichten unter der Oberfläche des Epithels von unbehandelter Cornea und Cornea, der 50% des Epithels abladiert wurde, nicht unter-scheiden. Dieses war auch nicht zu erwarten, denn die Eindringtiefe des Laserstrahls in ein Gewebe ist geringer als der durchschnittliche Zelldurchmesser. Ähnliches beobachteten Pulia-fito et al. [339], die Excimer-Laserstrahlung an entnommenen Kälberhornhäuten testeten und nur minimale strukturelle Veränderungen feststellten.

Abb. 44: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: mit 50% Epithel, Querschnitt, x 1000

Ob die Laserstrahlung intrazelluläre Auswirkungen hat, ist anhand dieser Aufnahmen nicht zu verifizieren. In diesem Zusammenhang sei aber auf die mutagene und kanzerogene Wirkung von UV-Strahlung hingewiesen [340]. Seiler et al. [341] untersuchten den Effekt von Ex-cimer-Laserstrahlung an Hefezellen mit Hilfe von Fotoreaktivierungsversuchen und fanden eine signifikante Reparaturrate der DNA in den Zellen. Aufgrund der Ähnlichkeit der Hefe-zellen mit cornealen Epithelzellen wird eine gute Korrelation angenommen. Es besteht die Möglichkeit eines Zelltodes oder einer Mutation der Epithelzellen durch eine DNA-Zer-störung, die durch die Laserstrahlung hervorgerufen wird.

Die gelaserten Hornhäute (Abb. 45/46) ähneln, unabhängig von der Ablationstiefe, den Horn-häuten, die in GBR/BAC 0.01% inkubiert wurden (Abb. 39/40). Hervorgerufen durch die Laserstrahlung, die jeweils die Oberflächenschicht abdampft, schält sich die neue Oberfläche teilweise ab und rollt sich zusammen. Außerdem sind deutliche Membranschädigungen durch Löcher in der obersten Zellschicht zu erkennen, die durch eine starke Aktivität der Retrak-tionsfibrillen verursacht sein könnte, wie sie z.B. durch den Zusatz von BAC ebenfalls auftritt [337]. Die rechte REM-Aufnahme in Abb. 46 zeigt eine Hornhaut ohne Epithel und ohne Bowman-Membran mit den typischen Kollagenfasern des Stromas.


107

Abb. 45: links: Schweinecornea mit 75% Epithel, rechts: mit 50% Epithel, Aufsicht; x 5000

Abb. 46: links: Schweinecornea mit 25% Epithel, rechts: ohne Epithel, Aufsicht; x 5000

Resultierend aus den Ergebnissen der REM-Untersuchungen von gelaserten Hornhäuten wird postuliert, dass das Lasern in cornealem Epithel zu wenig sichtbaren Veränderungen dieser Zellschichten führt und deshalb prinzipiell geeignet ist, die Schichtdicke zu verringern. Es findet lediglich eine Auflockerung und Schädigung der Epithelzellen statt, die nach dem Lasern als neue Oberfläche fungieren.


108

4.3 Zellkulturen

4.3.1 Allgemeines

Gewebekulturen wurden erstmalig am Anfang des letzten Jahrhunderts gezüchtet [342,343], um das Verhalten von tierischen Zellen frei von systemischen Einflüssen zu studieren. Zell-kulturen werden aus dispergierten Zellen von einem Originalgewebe, von einer Primärkultur oder einer Zelllinie durch enzymatische, mechanische oder chemische Deaggregation gewon-nen [344]. Die so gewonnene Zellsuspension kann dann als eine zusammenhängende Mono-layer auf einem festen Substrat oder als Suspension in einem Medium kultiviert werden.

Die Kultivierung von Zellen bietet eine große Anzahl von Vorteilen gegenüber in vivo- und in vitro-Tiermodellen, aber auch einige Nachteile. Beide Aspekte sind in den Tabellen 24 und 25 dargestellt.

Tabelle 24: Vorteile von Zellkulturen [344]

Kategorie

Beispiele

Physikalisch-chemische Umgebung

Kontrolle des pH, der Temperatur, der Osmolarität, der gelösten Gase

Physiologische Bedingungen

Kontrolle der Hormone und Nährstoffe

Mikroumgebung

Regulation der Matrix, Zell-Zell-Interaktion, Gasdiffusion

Zelllinienhomogenität

Angebot selektiver Medien, Klonung

Charakterisierung

Zytologie und Immunfärbung einfach durchführbar

Konservierung

Aufbewahrung in Flüssigstickstoff möglich

Validierung und Akkreditierung

Abstammung, Geschichte, Reinheit ist protokollierbar

Reproduktion und Variabilität

Quantifizierung ist einfach

Reagenzieneinsparung

Reduktion der Volumina, geringere Kosten

Kontrolle von Konzentration und Temperatur

Möglichkeiten der Dosis -, Konzentrations- und Zeitbestimmung beim in vivo-modeling

Mechanisierung

Mikrotitration und Roboter

Senkung des Tierverbrauchs

Zytotoxizitätskontrolle und Screening von Pharmaka, Kosmetika usw.

Weitere, eher negative Aspekte, die in den Tabellen nicht erwähnt wurden, sind die Unter-schiede im Verhalten der Zellen von Zellkulturen und ihrer Stammzellen in vivo. Die Zellen vom Spendergewebe haben eine dreidimensionale Geometrie, während die Zellkultur sich zweidimensional ausbreitet. Spezifische Merkmale von Zellinteraktionen gehen verloren, die


109

die Histologie des Gewebes definieren. Die Kulturumgebung lässt zudem einige systemische Komponenten vermissen, die in die homoeostatische Regulation in vivo involviert sind (endo-krines System und Nervensystem). Aufgrund dessen werden den Kulturmedien in der Regel Hormone zugesetzt. Der Energiemetabolismus erfolgt in vitro hauptsächlich durch Glykolyse, und obwohl der Zitronensäurezyklus immer noch abläuft, spielt er nur eine untergeordnete Rolle.

Tabelle 25: Nachteile von Zellkulturen [344]

Kategorie

Beispiele

Notweniges Fachwissen

Handling; chemische, mikrobielle und Cross-Kontamination

Kontrolle der Umgebung

Arbeitsplatz, Inkubation, pH-Kontrolle, Vorkommen und Entsorgung von biologischen Gefahren

Quantität und Kosten

Kostenintensive Ausrüstung, Verbrauchsmaterialien, Medien, Serum

Genetische Instabilität

Heterogenität, Variabilität

Phenotypische Instabilität

Dedifferenzierung, Adaptierung, Selektion

Identifizierung des Zelltypus

Expression von Markern, Histologie, Zytologie, Geometrie und Mikroumgebung

Obwohl die o.g. und weitere Unterschiede zwischen isolierten Geweben und Zellkulturen be-stehen, sind viele spezialisierte Funktionen in der Zellkultur ausgebildet, so dass sie ein sehr wertvolles Werkzeug sein kann, um isolierte Gewebe zu ersetzen.

In der folgenden Studie wurde die Permeation von P-HCl durch Kaninchenkonjunktiva- (KKEZ) und Kaninchencorneaepithelzellkultur (KCEZ) unter Einfluss verschiedener Formu-lierungsparameter untersucht.

4.3.2 Kaninchencornea-Epithelzellkultur (KCEZ)

4.3.2.1 Bioelektrische Parameter

Ähnlich wie bei isolierter KK (vgl. 4.2.4.4) wurden die Lebensfähigkeit und Integrität der Zellkultur durch die Messung des TEER und der PD (vgl. 5.2.10.3) sowohl vor als auch nach dem Permeationsexperiment und während der Kultivierung überprüft.


110

Die in dieser Studie initial gemessenen TEER- und PD-Werte (Tabelle 26) sind in vergleich-barer Größenordnung bereits veröffentlicht worden [345]. In Tabelle 26 sind sowohl der initiale als auch der finale Messwert dokumentiert, um den Einfluss der verschiedenen Para-meter auf die Lebensfähigkeit und Integrität der Monolayer zu untersuchen. Die Integrität der Zellkultur hat großen Einfluss auf die Permeabilität der Membran, besonders für Arzneistoffe wie P-HCl, die über den parazellulären Diffusionsweg die Kultur passieren. Auffällig war der Anstieg des TEER während des Permeationsexperimentes bei Formulierungsparametern, die keine Schädigung der Monolayer hervorriefen, wie z.B. eine Variation des pH-Werts (Tabelle 26). BR (pH 7.4, vgl. 5.1.5) scheint über die Dauer des Experimentes zellverdichtend auf die Kultur zu wirken. Der Einfluss der verschiedenen Parameter auf die Integrität der Monolayer wird im Zusammenhang mit den Ergebnissen der Permeationsstudie diskutiert.

Tabelle 26: Bioelektrische Parameter der cornealen Zellkultur

Basiszube-reitung

Formulierungs-parameter

TEER (initial) [kOmegacm2]

TEER (final) [kOmegacm2]

PD(initial) [mV]

PD(final) [mV]

P-HCl 2%,

pH 7.4,

300 mOsmol/kg

Referenz

2.30 (0.42)

2.71 (0.63)

19.45 (2.32)

9.48 (3.93)

BAC 0.005%

2.15 (0.51)

2.50 (1.04)*

16.78 (5.16)

4.92 (2.27)

BAC 0.01%

2.32 (0.43)

0.39 (0.08)

19.62 (3.36)

1.26 (2.00)

EDTA 0.025%

2.17 (0.22)

2.73 (0.28)

11.62 (1.35)

26.70 (7.17)

EDTA 0.05%

2.36 (0.57)

2.13 (0.82)*

17.45 (5.28)

5.03 (3.93)

BAC 0.01% + EDTA 0.05%

1.83 (0.57)

0.23 (0.05)

13.90 (6.72)

0.50 (0.67)

P-HCl 2%, 300 mOsmol/kg

pH 6.4

2.69 (0.31)

2.92 (0.28)*

19.04 (3.43)

51.75 (5.79)

pH 8.4

2.75 (0.27)

2.75 (0.33)*

25.25 (1.89)

31.76 (6.04)

P-HCl 2%,

pH 7.4

80 mOsmol/kg

2.36 (0.20)

1.44 (0.38)

16.25 (1.28)

0.20

600 mOsmol/kg

2.26 (0.19)

1.85 (0.18)

13.67 (1.16)

11.25 (4.57)*

n=5-8, (*) p>0.051) verglichen mit dem jeweiligen initialen Wert, SD in Klammern

4.3.2.2 Permeationsstudie

Abb. 47 gibt einen Überblick über den Einfluss unterschiedlicher Formulierungsparameter auf den Peff der P-HCl-Lösung unter Einbeziehung des finalen TEER, der Aussagen über die Dichtigkeit der Monolayer zulässt. Dabei wurde für die Zellkulturen eine indirekte Propor-tionalität zwischen TEER und Peff festgestellt (Abb. 47). Die Addition von 0.005% BAC zur P-HCl-Lösung führte zu keiner signifikanten Steigerung des Peff, verglichen mit der Referenz-lösung, während ein Zusatz von 0.01% BAC einen ca. 4fach erhöhten Peff zur Folge hatte.


111

Tabelle 26 belegt, dass 0.01% BAC den TEER drastisch minimiert, was auf eine Auflok-kerung der Monolayer hindeutet und die erhöhte Permeabilität begründet. Chang et al. [346] bewiesen, dass BAC konzentrationsabhängig Lecks in der Membran von kultivierten cor-nealen Epithelzellen verursacht. Diese Lecks in den einzelnen Membranen wirken sich nega-tiv auf die Integrität des gesamten Zellverbandes aus.

Weder ein Zusatz von 0.025% noch 0.05% EDTA konnte die P-HCl-Konzentration auf der Akzeptorseite erhöhen (Tabelle 27). Dies wiederum korreliert mit den dazugehörigen TEER- Werten, die sich während des Experimentes nicht signifikant veränderten. Meyer and Mc Culley [347] untersuchten den Effekt von Chelatoren auf die pH-Toleranz von cornealer Epithelzellkultur. Die Addition von 0.05% bzw. 0.1% EDTA zu einer physiologischen Salz-lösung (pH 7.5) verursachte keine Veränderungen der Zellkultur hinsichtlich Gewebeverlust bzw. Verletzungen des Gewebes, und die Formulierungen wurden als nicht-toxisch eingestuft. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den Resultaten dieser Arbeit, wonach EDTA ebenfalls keinen erfassbaren Einfluss auf die KCEZ ausübte (Tabelle 26).

Eine Kombination aus 0.01% BAC und 0.05% EDTA verursachte die markanteste Störung der Integrität der Monolayer (Tabelle 26), verbunden mit einer ca. 5.3fach erhöhten Permea-bilität der Zellkultur gegenüber der Referenz (Abb. 47). Der Unterschied des Peff zur Zuberei-tung mit 0.01% BAC ohne EDTA ist jedoch nicht signifikant, so dass EDTA vermutlich nicht zu einer weiteren Erhöhung der P-HCl-Passage führt. Nach Literaturhinweisen ist es sogar möglich, dass EDTA die Biotoleranz von BAC erhöht [347] und dadurch die Membran-stabilität fördert. Dafür geben die vorliegenden Befunde allerdings keinen Hinweis.

Ein weiterer getesteter Formulierungsparameter war der pH-Wert der P-HCl-Lösung. Mit zunehmendem pH wurde ein Ansteigen des Peff durch KCEZ beobachtet (Abb. 47). Pilocarpin gehört zur Gruppe der ionisierbaren Stoffe mit basischen Eigenschaften (pKa1=6.85). Da die Cornea leichter für lipidlösliche Substanzen passierbar ist als für wasserlösliche, kann die nicht-ionisierte (lipidlöslichere) Form des Arzneistoffs das Gewebe leichter passieren als die ionisierte (wasserlöslichere) Form [63]. Der log VK von Pilocarpin steigt von -0.22 (pH 6.6) auf 0.46 (pH 7.65) [203], was auf eine direkte Proportionalität zwischen dem pH der Arzneistofflösung, der Konzentration an nicht-ionisiertem Arzneistoff und der Lipophilie des Arzneistoffs hinweist. Gemäss der Henderson-Hasselbalch-Gleichung liegen bei einem pH


112

von 6.4 26.2% Pilocarpin in nicht-ionisierter Form vor, während sich 78% bei pH 7.4 bzw. 97.3% bei pH 8.4 als undissoziierter Anteil berechnen.

Abb. 47: Peff (Kolumne) durch corneale Epithelzellkultur und TEER (final) (Punkt), n=5-8, (*) p<0.05 verglichen mit Referenz (P-HCl 2%, pH 7.4, 300 mOsmol/kg)

Interessanterweise wurde eine Korrelation zwischen der sinkenden P-HCl-Permeation und der donatorseitig ansteigenden Tonizität der Arzneistofflösung festgestellt (Abb. 47) (80>300>600 mOsmol/kg). Eine Tonizität unterhalb des physiologischen Niveaus wurde schlecht von KCEZ toleriert, was durch eine signifikante Senkung des TEER nach dem Transportexperiment, verglichen zum TEER vor dem Versuch, angezeigt wird (Tabelle 26). Daraus resultierte eine messbar erhöhte P-HCl-Konzentration im Akzeptormedium trotz des höheren osmotischen Drucks in der basolateralen Flüssigkeit, der mit einem Fluss von Mole-külen in Richtung Donatorkammer einhergeht.


113

Die Wirkstoffpenetration in bzw. -permeation durch Corneaepithel wurde durch eine Osmo-lalität der Donatorlösung von 80 mOsmol/kg tendenziell gesteigert, verglichen mit einer iso-tonen Lösung von 300 mOsmol/kg (Abb. 47). Eine Erhöhung der Tonizität der applizierten Tropfen (600 mOsmol/kg) führte, wie in der Studie dieser Arbeit (Abb. 47), zu einer Senkung der Arzneistoffaufnahme und nachfolgenden Permeation. Obwohl Lee und Lee [278] einen signifikant erniedrigten finalen TEER nach der Permeation von Atenolol aus einer Lösung von 600 mOsmol/kg, verglichen mit dem initialen Widerstand, fanden, resultierte auch in ihrem Zellkulturversuch ein Peff der gegenüber einer Atenolol-Lösung von 300 mOsmol/kg gesenkt war. Wahrscheinlich konkurrieren die Pufferelektrolyte und P-HCl um den parazel-lulären Weg, die Zellkultur zu passieren, um den Konzentrationsgradienten zwischen Dona-tor- und Akzeptorlösung auszugleichen. Podder et al. [283] untersuchten in vivo die Aufnah-me von Timolol in verschiedene okulare Gewebe des Kaninchens nach topischer Applikation in Abhängigkeit von verschiedenen Formulierungsparametern und kamen zum gleichen Er-gebnis.

Tabelle 27: Permeationsparameter von P-HCl aus BR durch corneale Epithelzellkultur

Basiszube-reitung

Formulierungsparameter

Peff
[10-6 cm/s]

log Peff

Q240
[µg]

P-HCl 2%,

pH 7.4,

300 mOsmol/kg

Referenz

2.19 (0.47)

-5.66

30.56 (6.55)

BAC 0.005%

3.36 (0.92)

-5.47

48.12 (14.31)

BAC 0.01%

8.62 (1.64)*

-5.06

120.96 (24.39)*

EDTA 0.025%

2.22 (0.17)

-5.65

31.22 (2.16)

EDTA 0.05%

2.03 (0.23)

-5.69

29.06 (4.25)

BAC 0.01% + EDTA 0.05%

11.51 (2.76)*

-4.94

162.50 (40.31)*

P-HCl 2%, 300 mOsmol/kg

pH 6.4

1.37 (0.18)

-5.86

19.58 (2.49)

pH 8.4

2.62 (0.21)

-5.58

38.25 (2.80)

P-HCl 2%,

pH 7.4

80 mOsmol/kg

2.84 (0.21)

-5.55

39.80 (3.72)

600 mOsmol/kg

1.70 (0.11)

-5.77

23.48 (1.36)

n=5-8, (*) p<0.05 verglichen mit Referenz, SD in Klammern


114

4.3.3 Kaninchenkonjunktiva-Epithelzellkultur (KKEZ)

4.3.3.1 Bioelektrische Parameter

Die bioelektrischen Parameter von KKEZ, gemessen in dieser Studie (Tabelle 28), stimmen gut mit bereits veröffentlichten Daten überein [206,258,348]. Wie bei KCEZ wird der Einfluss der Formulierungsparameter auf die Integrität der Monolayer im Zusammenhang mit den Ergebnissen der Permeationsstudie diskutiert.

Tabelle 28: Bioelektrische Parameter der konjunktivalen Zellkultur

Basiszube-reitung

Formulierungs-parameter

TEER (initial)
[kOmegacm
2]

TEER (final)
[kOmegacm
2]

PD(initial)
[mV]

PD(final)
[mV]

P-HCl 2%,

pH 7.4,

300 mOsmol/kg

Referenz

0.66 (0.21)

0.22 (0.11)

7.78 (4.29)

0.50 (0.01)

BAC 0.005%

0.85 (0.21)

0.01

9.60 (3.78)

0.78 (0.64)

BAC 0.01%

0.69 (0.13)

0.02

10.63 (2.55)

0.32 (0.28)

EDTA 0.025%

0.78 (0.56)

0.01

8.79 (1.64)

0.51 (0.05)

EDTA 0.05%

0.46 (0.25)

0.03

8.69 (2.30)

0.31 (0.01)

BAC 0.01% + EDTA 0.05%

0.91 (0.34)

0.01

11.74 (3.51)

1.03 (0.58)

P-HCl 2%, 300 mOsmol/kg

pH 6.4

0.90 (0.44)

0.68 (0.24)*

8.69 (4.50)

16.78 (3.81)

pH 8.4

0.76 (0.20)

0.75 (0.10)*

10.11 (2.51)

15.31 (2.49)

P-HCl 2%,

pH 7.4

80 mOsmol/kg

0.76 (0.19)

0.31 (0.14)

9.55 (0.11)

0.20

600 mOsmol/kg

0.85 (0.41)

0.44 (0.31)*

10.55 (0.73)

9.39 (0.64)*

n=3-6, (*) p>0.051) verglichen mit dem jeweiligen initialen Wert, SD in Klammern

4.3.3.2 Permeationsstudie

Deutlich höhere Peff für die P-HCl-Permeation durch KKEZ (Tabelle 29) im Vergleich zu KCEZ (Tabelle 27), weisen auf eine geringer ausgeprägte Barrierefunktion von KKEZ hin. Dieses Ergebnis steht im Zusammenhang mit den unterschiedlichen TEER-Werten der Zell-kulturen (Tabellen 26 und 28) und korreliert mit den jeweiligen Geweben in vivo. Klyce und Crosson [253] berichteten über einen Widerstand von 15 kOmegacm2 an Kaninchencornea, wäh-rend der TEER von Kaninchenkonjunktiva nur mit 1.3 kOmegacm2 [256] bzw. 1.2 kOmegacm2 [255] angegeben wurde.


115

In der vorliegenden Studie war die Permeation von P-HCl durch KKEZ empfindlicher gegen-über einer Änderung der Hilfsstoffkonzentration als die Permeation durch KCEZ (vgl. Abb. 47 und 48). Wie aus Abb. 48 und Tabelle 29 entnommen werden kann, führte jeglicher Zusatz von BAC und/oder EDTA zu einem Enhancement der Arzneistoffpermeation, was wahr-scheinlich auf die Absenkung des TEER-Wertes auf den Nullpunkt zurückzuführen ist. KKEZ reagierte damit deutlich empfindlicher auf einen BAC- und/oder EDTA-Zusatz als KCEZ. Dabei führte die Addition von 0.005% BAC zur Donatorlösung zu einer weitaus höheren Stei-gerung der Permeabilität von KKEZ als eine Konzentration von 0.01% BAC (p<0.05). In-teressanterweise verursachte die Kombination 0.01%BAC/0.05%EDTA die geringste Permea-bilitätssteigerung innerhalb der Hilfsstoffkompositionen, verglichen mit der Referenzlösung (Abb. 48). Warum die P-HCl-Lösung mit der niedrigeren BAC-Konzentration (0.005%), die größte Enhancerwirkung auf KKEZ ausübte, konnte nicht geklärt werden. In diesem Fall wäre es sinnvoll gewesen, die bioelektrischen Parameter auch während des Permeationsexperi-mentes zu messen, um festzustellen, wann die Schädigung der Zellkultur eingesetzt hatte, also der TEER signifikant gesunken war. Resultierend daraus hätte u.U. besser eingeschätzt wer-den können, warum bei einem finalen TEER von nahezu Null deutlich unterschiedliche Peff resultierten.

De Saint Jean et al. [349] untersuchten die Toxizität von 0.01% BAC an einer humanen kon-junktivalen Zelllinie und stellten eine schnelle Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen (40-60%) sofort nach der Applikation fest. Nach 24 h betrug die Abnahme der Lebensfähigkeit bereits 85%. Dieses Ergebnis lässt sich gut auf die hier untersuchte Zellkultur übertragen. Die gleiche Arbeitsgruppe [350] demonstrierte, dass BAC konzentrationsabhängig unterschied-liche Arten des Zelltodes in der gleichen Zelllinie induzieren kann: einen Wachstumsstopp bei sehr geringen Konzentrationen, Apoptose bei 0.01% BAC und Nekrose, wenn höhere Kon-zentrationen appliziert werden.

Eine Konzentration von 0.05% EDTA erzwang eine stärkere Permeabilitätssteigerung von KKEZ für P-HCl als 0.025% (Abb. 48). Ähnliches fanden Ashton et al. [227], allerdings in Konjunktiva in vivo. 0.05% EDTA in der Arzneistofflösung verursachte eine 2.2fach erhöhte


116

Permeation von Atenolol durch KK und die 10fache Dosis EDTA führte zu einer Verdrei-fachung der Atenolol-Permeation.

Die Änderung des pH-Wertes der P-HCl-Lösung hatte keinen Einfluss auf KKEZ. Es änderte sich weder die Integrität der Monolayer (Tabelle 28) noch die Permeabilität für den Arznei-stoff (Abb. 48). Die Peff der Zubereitungen unterschieden sich nicht signifikant. Die Studien von Lee und Lee [278], die ebenfalls Arzneistofflösungen mit den pH-Werten von 6.4, 7.4 und 8.4 untersuchten, führten auch bei Atenolol zu einem vergleichbaren Ergebnis. Dabei war die Atenolol-Konzentration in der KK bei pH 8.4 zwar leicht erhöht, die Werte unterschieden sich aber untereinander nicht signifikant.

Abb. 48: Peff (Kolumne) durch konjunktivale Epithelzellkultur und TEER (final) (Punkt), n=3-6, (*) p<0.05 verglichen mit Referenz (P-HCl 2%, pH 7.4, 300 mOsmol/kg)

Bei der Variation der Tonizitäten der Arzneistofflösungen führte nur die Hypotonizität (80 mOsmol/kg) zur Steigerung des Arzneistofftransports, nämlich um das 2fache, verglichen mit der Referenzlösung (Abb.48). Auch dieses Resultat korrelierte mit den Ergebnissen von Lee und Lee [278], die ebenfalls Tonizitäten von 80 und 600 mOsmol/kg untersuchten und


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lediglich eine signifikant erhöhte Atenolol-Konzentration im konjunktivalen Gewebe unter Nutzung einer Arzneistofflösung von 80 mOsmol/kg feststellten.

Tabelle 29: Permeationsparameter von P-HCl aus BR durch konjunktivale Epithelzellkultur

Basiszube-reitung

Formulierungsparameter

Peff
[10-5 cm/s]

log Peff

Q240
[µg]

P-HCl 2%,

pH 7.4,

300 mOsmol/kg

Referenz

6.43 (0.60)

-4.19

940.62 (58.68)

BAC 0.005%

14.77 (2.04)*

-3.83

2882.84 (294.67)*

BAC 0.01%

9.72 (0.36)*

-4.01

1847.91 (69.62)*

EDTA 0.025%

11.63 (1.27)*

-3.93

1834.75 (165.94)*

 

EDTA 0.05%

13.31 (1.48)*

-3.88

2521.71 (223.25)*

BAC 0.01% + EDTA 0.05%

8.94 (0.74)*

-4.05

1508.69 (142.30)*

P-HCl 2%, 300 mOsmol/kg

pH 6.4

4.93 (1.62)

-4.31

728.02 (232.76)

pH 8.4

5.93 (0.99)

-4.23

866.80 (134.18)

P-HCl 2%,

pH 7.4

80 mOsmol/kg

12.25 (0.91)*

-3.91

1934.87 (110.75)*

600 mOsmol/kg

6.54 (1.19)

-4.18

1170.53 (164.01)

n=3-6, (*) p<0.05 verglichen mit Referenz, SD in Klammern

Aus den Ergebnissen der Permeationsstudien von P-HCl durch KCEZ und KKEZ kann ge-schlussfolgert werden, dass die Permeation durch verschiedene Formulierungsparameter unterschiedlich beeinflusst wird. Qualitativ sind die Effekte der genannten Formulierungs-parameter auf beide Zellkulturen als ähnlich einzuschätzen, quantitativ waren jedoch Unter-schiede zu verzeichnen.

Das Konservierungsmittel BAC bewirkte in beiden Zellkulturen in den eingesetzten Konzen-trationen eine Erhöhung der Peff von P-HCl. Durch KCEZ war eine BAC-konzentrations-abhängige Steigerung des Peff zu verzeichnen, während 0.05% BAC durch KKEZ eine Stei-gerung des Peff um ca. 130% verursachte und 0.01% BAC lediglich eine Steigerung um ca. 50%, verglichen mit der Referenzlösung.


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EDTA hatte keinen signifikanten Einfluss auf KCEZ, während für KKEZ eine konzen-trationsabhängige Permeabilitätssteigerung der Zellkultur für P-HCl beobachtet wurde. 0.025% EDTA führte zu einer Erhöhung des Peff um ca. 80% und 0.05% EDTA verdoppelte den Peff im Vergleich zur hilfsstofffreien Präparation. Eine Kombination aus 0.01% BAC/ 0.05% EDTA, die praxisrelevant ist, rief eine Steigerung der P-HCl-Diffusion um 425% durch KCEZ hervor. Im Gegensatz dazu war der Einfluss dieser Kombination auf die P-HCl-Diffusion durch KKEZ lediglich als 40%ige Steigerung zu verzeichnen.

Die Sensibilität beider Zellkulturen gegenüber pH-Veränderungen war gering.

Tonizitätsänderungen der Donatorlösungen hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Arzneistoffdiffusion durch die Zellkulturen, abgesehen von einer Permeabilitätserhöhung von KKEZ durch eine hypotone Arzneistofflösung (80 mOsmol/kg).


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Tue Sep 16 16:33:54 2003