Scholz, Martina: In vitro-Permeationsstudien von hydrophilen und lipophilen Arzneistoffen an okularen Geweben und Zellkulturen

119

Kapitel 5. Experimenteller Teil

5.1 Substanzen

5.1.1 Arzneistoffe

Pilocarpin-HCl

P-HCl

E. Merck (Darmstadt)

Pilocarpin-Base

P-Base

E. Merck (Darmstadt)

Diclofenac-Na

D-Na

E. Merck (Darmstadt)

Mycophenolatmofetil

MMF

Roche Bioscience1) (Palo Alto, USA)

Mycophenolsäure

MPA

Roche Bioscience1) (Palo Alto, USA)

5.1.2 Hilfsstoffe

Benzalkoniumchlorid

BAC

Caelo (Hilden)

Natriumedetat

EDTA

Caelo (Hilden)

Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin

BETA W7 HP 0.9®

Wacker2) (München)

5.1.3 Weitere Chemikalien

Löslichkeitsuntersuchungen

Propylenglykol

 

Wasserfuhr (Bonn)

Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat (HLB18.2)

Tween® 80

E. Merck (Darmstadt)

Polyoxyethylenrizinolat (HLB 13.0)

Cremophor® EL

Caelo (Hilden)

Macrogol-Glycerol-hydroxystearat (HLB 13.3)

Cremophor® RH 40

Caelo (Hilden)

Polyoxypropylen-polyoxy-ethylen-Blockpolymer (HLB 22-29)

Synperonic® F 68

Serva (Heidelberg)


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Proteinbestimmung

Natriumcarbonat

Na2CO3

E. Merck (Darmstadt)

Kupfersulfat (Pentahydrat)

CuSO4 x 5H2O

Fluka Chemika (Neu-Ulm)

Weinsäure

 

E. Merck (Darmstadt)

Folin-Ciocalteau-Reagenz

 

E. Merck (Darmstadt)

Phenolphthalein

 

E. Merck (Darmstadt)

Schweineserumalbumin

 

Sigma (Steinheim)

Vitalitätsprüfung von Schweinecornea- und sklera

Trypanblau-Lösung (0.4%)

 

Sigma (Steinheim)

Fluoreszein

 

E. Merck (Darmstadt)

Triton® X-100-Lösung

 

Ferrak Laborat (Berlin)

Zellkultivierung (KKEZ und KCEZ

Ca2+/Mg2+-freie Hanks‘ physiologische Salzlösung

HBSS

GIBCO (Gaithersburg, USA)

Protease XIV

 

Sigma (St. Louis, USA)

Minimum essential medium with Earl‘s salts

S-MEM

GIBCO (Gaithersburg, USA)

L-Glutamin

 

GIBCO (Gaithersburg, USA)

DNA-ase I

 

Sigma (St. Louis, USA)

fötales Rinderserum

FBS

GIBCO (Gaithersburg, USA)

PC-1-Medium

 

Bio Wittaker (Walkersville, USA)

Dulbecco‘s modifiziertes Eagle‘s Medium

DMEM

GIBCO (Gaithersburg, USA)

Ham‘s Nährstoff F12 Medium

F12

GIBCO (Gaithersburg, USA)

Penicillin

 

Bio Wittaker (Walkersville, USA)

Streptomycin

 

Bio Wittaker (Walkersville, USA)

Gentamycin

 

GIBCO (Gaithersburg, USA)

Fungizone®

 

GIBCO (Gaithersburg, USA)


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Kollagen

 

Collaborative Biomedical (Bedford, USA)

Fibronectin

 

Collaborative Biomedical (Bedford, USA)

Rinderserumalbumin

BSA

GIBCO (Gaithersburg, USA)

Insulin-transferrin-selenium-Premix

ITS+ Premix

Collaborative Biomedical (Bedford, USA)

Rinder-Hypophysenextrakt

BPE

Collaborative Biomedical (Bedford, USA)

Epidermaler Wachstumsfaktor

EGF

Sigma (St. Louis, USA)

Hydrocortison

 

Sigma (St. Louis, USA)

5.1.4 HPLC-Fließmittel

Acetonitril (HPLC)

 

J.T. Baker (Deventer, NL)

Methanol (HPLC)

 

J.T. Baker (Deventer, NL)

Triethylamin

 

J.T. Baker (Deventer, NL)

Phosphorsäure 85%

 

Laborchemie (Apolda)

Wasser (HPLC)

 

E. Merck (Darmstadt)

5.1.5 Pufferlösungen

Glutathion-Bicarbonat-Ringerlösung

GBR (pH 7.4)

 

Bicarbonat-Ringerlösung

BR (pH 7.4)

 

erforderliche Chemikalien

Natriumchlorid

NaCl

Wasserfuhr (Bonn)

Natriumdihydrogenphosphat (Dihydrat)

NaH2PO4 x 2 H2O

E. Merck (Darmstadt)

Natriumhydrogencarbonat

NaHCO3

Ferrak Laborat (Berlin) -->

Kaliumchlorid

KCl

Ferrak Laborat (Berlin)


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Calciumchlorid (Dihydrat)

CaCl2 x 2 H2O

E. Merck (Darmstadt)

Magnesiumchlorid (Hexahydrat)

MgCl2 x 6 H2O

Ferrak Laborat (Berlin)

Oxidiertes Glutathion

 

Sigma (Steinheim)

Glukose

 

Caelo (Hilden)

Natriumhydroxid

NaOH

Merck (Darmstadt)

konzentrierte Salzsäure

HCl

J.T. Baker (Deventer, NL)

5.2 Methoden

5.2.1 Physikalisch-chemische Charakterisierung

5.2.1.1 Löslichkeitsstudien

5.2.1.1.1 Diclofenac-Na

Unter Rühren (RCT B, IKA Labortechnik, Staufen) wurden die unter 4.1.1 genannten Solubi-lisatoren in Konzentrationen von 1, 5 und 10% (m/m) in GBR bzw. in einer Mischung aus 4.5 Teilen PG und 5.5 Teilen GBR (m/m) gelöst. Nach Zusatz von überschüssigem D-Na (Vor-versuche) wurde die Mischung zunächst 30 min im Ultraschallbad (Sonorex RK 100, Ban-delin electronic, Berlin) vorbehandelt, dann über 12 h bei Raumtemperatur bis zur Einstellung des Lösungsgleichgewichts geschüttelt (Thys 2, VEB MLW Labortechnik, Ilmenau) und anschließend 10 min mit einer Eppendorf-Zentrifuge (Hermle Z 230, Hermle AG, Gosheim) zentrifugiert. Die Gehaltsbestimmung von D-Na in der überstehenden Lösung erfolgte photo-metrisch (vgl. 5.2.2.2) (n=4).

5.2.1.1.2 Mycophenolatmofetil

Die Löslichkeitsuntersuchungen mit Solubilisatoren erfolgten gemäß der Anleitung 5.2.1.1.1. Für die Studien mit HP-beta-CD wurde das Cyclodextrin zu jeweils 2.5, 5, 7.5 und 10% (m/m) in GBR unter leichtem Erwärmen (50°C) und Rühren (RCT basic, IKA Labortechnik, Stau-fen) gelöst und dann der Arzneistoff nach Abkühlen auf Raumtemperatur im Überschuss zu-gegeben. Diese Mischung wurde entweder bei 25° C 12 h im Schüttelinkubator (GFL 3032, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) geschüttelt oder bei 121° C und 200 kPa, 15 min lang autoklaviert und anschließend zentrifugiert (Hermle Z 230, Hermle AG, Gosheim). Die überstehende Lösung wurde mittels HPLC auf den Gehalt von MMF und MPA (vgl. 5.2.2.3) untersucht (n=4).


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5.2.1.2 Bestimmung der Oberflächenspannung und CMC1)

Die Oberflächenspannung sigma [mN/m] wurde unter Verwendung eines Ringtensiometers TE1C (Lauda, Lauda Königshofen) bei 33.5° C ermittelt. Jede Lösung wurde fünfmal vermessen und der Mittelwert gebildet.

Die CMC der Tenside (vgl. 4.1.1) wurde an Hand der konzentrationsabhängigen Senkung der Oberflächenspannung sigma der Lösungen bei 25° C ermittelt. Durch das Lauda-Tensiometer wurden automatisch 0.01 bis 30 ml der Tensidstammlösung (2.0 g/l) zur vermessenden Lösung titriert und sigma bestimmt. Die CMC war erreicht, wenn die Oberflächenspannung der Tensidlösung nur noch geringfügig oder gar nicht mehr abnahm. Die Oberflächenspannung wurde dabei für jede Tensidkonzentration (zwischen 25 und 35 Werte pro Solubilisator) 5malig bestimmt.

5.2.1.3 Viskosität

Die Bestimmung der kinematischen Viskosität ny [cm2/s] der genannten Zubereitungen er-folgte mittels Kapillarviskosimeter nach Ubbelohde mit hängendem Kugelniveau (Schott Geräte, Hofheim a. Ts.) bei einer Versuchstemperatur von 33.5 ± 0.1° C (Durchsichtther-mostat CT 1450/2 und AVS 350, Schott, Hofheim a. Ts.) unter Verwendung der Kapillare Nr. I. Die gemessene Viskosität wurde mit der Viskosität des Wassers verglichen. Unter Einbe-ziehung der Dichte rho (vgl. 5.2.1.4) ließ sich aus der kinematischen Viskosität ny die jeweilige dynamische Viskosität eta [mPas] berechnen. Es wurden jeweils 10 Messungen durchgeführt.

5.2.1.4 Dichte

Das Densiometer DMA 38 (Paar, Graz, A) wurde zur Bestimmung der Dichte der verwen-deten Zubereitungen genutzt. Dabei wird die zu untersuchende Flüssigkeit bei einer Messtem-peratur von 33.5° C in einem U-förmig gebogenen Rohr in Schwingungen versetzt. Je höher die Dichte der Flüssigkeit, desto größer ist die an der Schwingung beteiligte Masse und desto länger dauert die Schwingung. Aus der gemessenen Schwingungsdauer kann, nach vorausge-gangener Kalibrierung mit bidestilliertem Wasser, die Dichte der Untersuchungslösung mit einer


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Messgenauigkeit von ± 10-3 g/cm3 errechnet werden. Die Formulierungen wurden je-weils zweimal vermessen.

5.2.1.5 Brechungsindex

Die RI der in den Tabellen 7-9 angegebenen Lösungen wurden bei 33.5° C mit Hilfe eines Abbé-Refraktometers bestimmt.

5.2.1.6 Osmolalität

Die Messungen der Osmolalität wurden mittels automatischem Halbmikroosmometer (Knau-er, Berlin) durchgeführt, welches nach dem Prinzip der Bestimmung der Gefrierpunktser-niedrigung arbeitet. Die Kalibrierung des Gerätes erfolgte mit bidestilliertem Wasser (0 mOsmol/kg) und einer 1.2687%igen wässrigen Natriumchloridlösung (400 mOsmol/kg) (Knauer, Berlin). Es wurden jeweils 5 Messungen durchgeführt und der Mittelwert berechnet.

5.2.1.7 pH-Wert

Der pH-Wert sämtlicher Pufferlösungen und Zubereitungen wurde mittels pH-Meter Typ CG 825 (Schott-Geräte GmbH, Hofheim a. Ts.), pH-Meter Typ 766 Calimatic (Knick GmbH, Deutschland) und dem pH-Meter pH 522 (Wissenschaftlich-Technische Werkstätten WTW, Weilheim i. OB) bestimmt. Die Kalibrierung der Messinstrumente erfolgte mit drei pH-Pufferlösungen (pH 4.01, pH 7.00 und pH 9.21 bei Raumtemperatur, Mettler Toledo GmbH, Steinbach).

5.2.1.8 Verteilungskoeffizient

Zur Charakterisierung des Verteilungsverhaltens eines Stoffs zwischen einer hydrophilen Pha-se (GBR, GBR/PG bzw. GBR, versetzt mit 2.5, 5.0, 7.5 und 10% HP-beta-CD) und einer lipo-philen Phase, (1-Octanol; Merck, Darmstadt) kann die Bestimmung des VK herangezogen werden. Dazu wurde zunächst die zu verwendende hydrophile Phase mit 1-Octanol und die lipophile Phase mit der hydrophilen Phase abgesättigt (Schütteln im Scheidetrichter und Abtrennen der Phase, mit der gesättigt werden soll). Dann wurden 10.0 ml einer Lösung des zu untersuchenden Stoffs (siehe Tabelle 10) im Scheidetrichter mit demselben Volumen puf-


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fergesättigten Octanols versetzt (Fünffachbestimmung) und 12 h im Schüttelinkubator (GFL 3032, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) bei 33.5° C und 100 U/min geschüt-telt. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und anschließend einem geeigneten Verfahren zur Bestimmung des Wirkstoffgehalts unterzogen (vgl. 5.2.2).

Der (scheinbare) VK wurde mit Hilfe folgender Gleichung berechnet:

VK

 

V2 = Volumen der wässrigen Phase [ml]
V1 = Volumen der organischen Phase [ml]
c20 = Ausgangskonzentration in der wässrigen Phase [µg/ml]
c2t = Endkonzentration in der wässrigen Phase [µg/ml]

5.2.2 Gehaltsbestimmungen

5.2.2.1 Pilocarpin-HCl

HPLC-Gehaltsbestimmung (P-HCl)

Pumpe

Pump L 6000, E. Merck-Hitachi (Tokio, J)

Thermostat

L-5020 Column Thermostat, E. Merck (Darmstadt)

Integrator

L-2500 Chromo Integrator, E. Merck-Hitachi (Tokio, J)

Detektor

UV/VIS- Detektor L 4250, E. Merck-Hitachi (Tokio, J)

Injektionsvolumen

10 µl Rheodyne® 7125 Standardsechswegeinjektionsventil, (Cotati, CA, USA)

Stationäre Phase

LiChrospher®100 RP-18, 5 µm, 125 x 4 mm oder 250 x 4 mm (I.D.), (20°C), E. Merck (Darmstadt)

Mobile Phase

800 ml Wasser werden mit 6 ml (0.105 mol) Phosphorsäure 85%, 5 ml (0.036 mol) Triethylamin und 10 ml Methanol versetzt und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt (20°C)

Externe Standards

P-HCl, (bei Bedarf: Pilocarpinsäure, Isopilocarpinsäure)

Flussrate

1.5 ml/min.

Wellenlänge

216 nm


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Die flüssigchromatographische Gehaltsbestimmung (HPLC) von P-HCl in den unterschied-lichen Untersuchungsproben erfolgte in Anlehnung an die Methode von Wiesend [351]. Die Herstellung der Kalibrierungsstandardlösungen (externer Standard) erfolgte mit den jeweils verwendeten Medien in einem Konzentrationsbereich, in dem auch die unbekannten Konzen-trationen zu erwarten waren. Die Versuchsbedingungen sind tabellarisch aufgelistet.

HPLC-Gehaltsbestimmung (P-HCl)

Pumpe

L 6200 A Intelligent Pump, E. Merck-Hitachi (Tokio, J)

Detektor

Diode Array Detector L 4500, E. Merck-Hitachi (Tokio, J)

Interface

Interface D 6000, E. Merck-Hitachi (Tokio, J)

Software

D 6500 HPLC-Manager, E. Merck (Darmstadt) & Hitachi Instr. Inc. (San Jose, CA, USA)

Autosampler

AS-2000 A, E. Merck-Hitachi (Tokio, J)

Injektionsvolumen

20 µl

5.2.2.2 Diclofenac-Na

Die spektrophotometrische (UV/VIS) Gehaltsbestimmung von D-Na erfolgte in wässriger Lösung beim Absorptionsmaximum (lambdamax) von 273 nm mit Hilfe eines Einstrahlphotometers (Unicam UV/VIS spectrometer 8625, Cambridge, GB). Es wurden UV-taugliche Quarzglas-küvetten der Schichtdicke 1.0 cm verwendet. Zum Nullabgleich wurde entweder Wasser oder die beim entsprechenden Versuch eingesetzte Pufferlösung verwendet.

Die Gehaltsbestimmung von D-Na mittels HPLC erfolgte nach einer Methode von Beaulieu et al. [352]. Die Erstellung einer Kalibrierkurve erfolgte gemäß der Beschreibung in 5.2.2.1. Die apparative Ausstattung entsprach ebenfalls 5.2.2.1 (Nutzung beider HPLC-Geräte), die son-stigen Bedingungen wurden in folgender Art und Weise modifiziert:

HPLC-Gehaltsbestimmung (D-Na)

Stationäre Phase

LiChrospher®100 RP-18, 5 µm, 125 x 4 mm oder 250 x 4 mm (I.D.), (20°C), E. Merck (Darmstadt)

Mobile Phase

Methanol:Wasser:Triethylamin 70:30:0.2, auf pH 7 eingestellt mit Phosphorsäure 85%

Externe Standards

D-Na

Flussrate

1.0 ml/min.

Wellenlänge

273 nm


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5.2.2.3 Mycophenolatmofetil und Mycophenolsäure

Die HPLC-Bestimmung von MMF und MPA erfolgte unter Abwandlung der Methode von Hooijmaaijer [92], und die Kalibrierung erfolgte unter Verwendung eines externen Standards. Die weiteren apparativen Bedingungen entsprachen wiederum 5.2.2.1. Für beide Arzneistoffe konnte das gleiche Fließmittel verwendet werden, da eine vollständige Trennung der Substan-zen durch unterschiedliche Retentionszeiten gegeben war.

HPLC-Gehaltsbestimmung (MMF und MPA)

Stationäre Phase

LiChrospher®100 RP-18, 5 µm, 125 x 4 mm oder 250 x 4 mm (I.D.), (20°C), E. Merck (Darmstadt)

Mobile Phase

Phosphorsäure 0.07%:Acetonitril 2:1, auf pH 4.0 eingestellt mit konzentrierter NaOH

Externe Standards

MMF, MPA

Flussrate

1.2 ml/min.

Wellenlänge

215 nm

5.2.3 Proteinbestimmung

5.2.3.1 Präparation der Schweinecornea1)

Für sämtliche Studien mit Schweineaugen wurden Bulbi frisch geschlachteter Hausschweine unterschiedlichen Alters von den Eberswalder Fleischwerken (Eberswalde-Britz) und der Lehr- und Versuchsanstalt Teltow2) (LVAT Ruhlsdorf, Groß Kreuz, EV) verwendet.

Der Augapfel wurde auf einen für diesen Zweck konstruierten Bulbushalter (Deutschmann-Medizintechnik, Zittau) gelegt und nach makroskopischer Kontrolle der cornealen Integrität in dieser Halterung fixiert. Nach Befreiung von anhängendem Muskelgewebe wurde der Augapfel mit GBR gespült und anschließend die Cornea mit einem Skalpell rund ausge-schnitten, so dass sich um das unbeschädigte Gewebe noch ein ca. 2-3 mm breiter Skleralring befand. Unter Vermeidung eines Austritts größerer Mengen an Kammerwasserflüssigkeit oder Glaskörper wurde die ausgeschnittene Cornea mit einer kleinen Pinzette leicht angehoben und ggf. noch verbliebene Skleralfasern mit einer Präparationsschere durchtrennt. Die Hornhaut wurde anschließend vom unterseits anhaftenden Iris-Ziliarkörper-Gewebe abgezogen.


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5.2.3.2 Präparation der Schweinesklera

Im Anschluss an die Präparation der Hornhaut erfolgte die Isolierung der Sklera. Dazu wurde der corneafreie Bulbus zunächst von allen inneren Geweben befreit und anschließend halbiert. Die noch anhaftende Aderhaut auf der Innenseite der Sklera wurde mittels Pinzette entfernt und Reste von ggf. noch vorhandenem Muskelgewebe auf der Außenseite der Sklera wurden mit einer Präparationsschere abgetrennt.

5.2.3.3 Proteinbestimmung nach Lowry1)

Lösungen:

A: 2% Na2CO3 in 0.1 M NaOH

B: 0.5% CuSO4 x 5H2O in 0.8%iger Weinsäure

C: 1 ml Lösung B in 50 ml Lösung A (frisch hergestellt)

D: Folin-Ciocalteau-Reagenz (Säurekonzentration 1mol/l, Titration mit 1 M NaOH gegen Phenolphthalein)

Die zu untersuchenden Gewebe wurden vor der Bestimmung zunächst mittels Schere zerklei-nert und in Portionen zu ca. 30 mg Cornea und 65 mg Sklera geteilt (Feuchtgewicht). Zu die-sen Portionen wurden jeweils 1.5 ml Lösung C gegeben und 12 h geschüttelt (Thys 2, VEB MLW Labortechnik, Ilmenau). Anschließend erfolgte eine weitere Zerkleinerung der Gewe-bestücke mit Hilfe eines Ultraschallstabes (GM Sonopuls HD 70, Bandelin electronic, Berlin) unter Eiskühlung. Um ggf. noch vorhandene Gewebereste von der Proteinlösung abzutrennen, wurden die Proben zentrifugiert (Hermle Z 230, Hermle AG, Gosheim). Wiederum mit Lö-sung C wurde zu 2.0 ml aufgefüllt und die Lösung weitere 10 min bei Raumtemperatur aufbe-wahrt. Unter sofortigem kräftigen Schütteln wurde Lösung D hinzugegeben und nach ca. 40 min die Extinktion bei 720 nm (Unicam UV/VIS spectrometer 8625, Cambridge, GB) gegen einen Leerwert (H2O bidest.) gemessen. Die Erstellung der Kalibrierkurve erfolgte in den Konzentrationsbereichen 7.5 x 10-4 bis 1.5 x 10-2 % mit Schweineserumalbumin als Standard. Die Extinktion jeder Probe wurde dreifach vermessen.


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5.2.4 Hydratationsstudien

Nach dem Lasern der Cornea (SC 50%) (vgl. 5.2.8.2) und mechanischer Epithelabrasio (SCo.E) mittels Skalpell erfolgte die Isolierung der zu untersuchenden Augenteile wie Cornea und Sklera (vgl. 5.2.3.1/2). Dabei wurden die Hornhäute so ausgeschnitten, dass sie ohne den o.g. skleralen Ring vorlagen. Mittels Trepan konnten vergleichbar große, kreisrunde Stücke von der Sklera ausgestanzt werden (Ø ca. 1.2 cm). Anschließend wurden die Gewebestücke einzeln auf einer Analysenwaage (ISO 9001, Sartorius AG, Göttingen) gewogen (Feucht-gewicht) und 1, 2, 3, 4 oder 5 h in Wasser, GBR bzw. GBR/PG unter Schütteln (GFL 3032, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) bei 33.5° C inkubiert. Nach Abtupfen des je-weiligen Inkubationsmediums erfolgte ein erneutes Auswiegen der bearbeiteten Proben (Feuchtgewicht) und anschließend eine Trocknung bis zur Massekonstanz bei 100° C im Trockenschrank (T 6030, Heraeus Instruments, Hanau) (ca. 24 h). Die getrockneten Gewebe wurden dann in einen Exsikkator überführt, um ohne Wasseraufnahme auf Raumtemperatur abzukühlen. Die Proben wurden erneut gewogen (Trockengewicht) und im Anschluss der Wassergehalt mit folgender Gleichung berechnet [353]:

mg/mg Gewebe = (Feuchtgewicht - Trockengewicht)/ Trockengewicht

Es wurden jeweils 4 Proben pro Zeiteinheit, Medium und Gewebeart untersucht. Die Berech-nung der Wasseraufnahme erfolgte durch Differenzbildung zwischen dem Wassergehalt des Gewebes nach der Inkubation und nach der Isolierung.

5.2.5 Penetrationsstudien

Die Isolierung von SC und SS erfolgte gemäss 5.2.3.1/2. Nach der Isolierung wurden die Gewebe wie für die Permeationsstudien präpariert und in die Ussing-Kammer (vgl. 5.2.6) ein-gespannt. Als Donatorlösungen dienten eine 2%ige P-HCl-Lösung (GBR) bzw. eine 2%ige D-Na-Lösung (GBR/PG). Die Akzeptorkammern waren jeweils mit dem wirkstofffreien Me-dium befüllt. Wie bei den Permeationsstudien (vgl. 5.2.6) wurde alle 30 min eine Probe von 1.0 ml aus den 20.0 ml Akzeptormedium entnommen und dieses durch frisches, vorge-wärmtes Akzeptormedium ersetzt. Nach 1, 2, 3, 4 bzw. 5 h Versuchsdauer wurden die SC bzw. SS (n=6) den Ussing-Kammern entnommen.


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Die Gewebe wurden zunächst vom Donator- bzw. Akzeptormedium durch Abspülen mit GBR (P-HCl) bzw. GBR/PG (D-Na) befreit und der Teil der Gewebe, der dem Durchmesser der ef-fektiven Permeationsfläche entsprach, ausgeschnitten. Nach Bestimmung des Feuchtge- wichtes dieser Gewebe wurden sie unter Eiskühlung mit dem Ultraschallstab (GM Sonopuls HD 70, Bandelin electronic, Berlin) zerkleinert. Um die Effektivität der Arzneistoffextraktion zu erhöhen, wurde im Falle von P-HCl die Zerkleinerung des Gewebes in einem Gemisch von 3 Teilen DMSO (Synopharm, Barsbüttel) und 7 Teilen GBR vorgenommen. Für die Extrak-tion von D-Na wurde ein Gemisch von 7 Teilen DMSO und 3 Teilen GBR verwendet. Das Volumen der Extraktionsflüssigkeit betrug jeweils 1.5 ml. Anschließend wurden die Homo-genate zentrifugiert und in der überstehenden Lösung mittels HPLC die Gehalte an P-HCl und D-Na ermittelt (vgl. 5.2.2).

5.2.6 Permeation durch isolierte Cornea/Sklera und Nephrophan®

5.2.6.1 Permeationsapparatur1)

Ein von unserer Arbeitsgruppe entwickeltes Permeationsmodell [73] aus Acrylglas® (Grün-berg Kunststoffe, Rödermark) wurde vorrangig, neben den Untersuchungen zur Wirkstoffauf-nahme in okulare Gewebe, zur Ermittlung des Permeationsverhaltens von P-HCl, D-Na und MMF bzw. MPA durch SC, SS und NP genutzt. Weiterhin wurden damit die Permeation von P-HCl und D-Na durch Hornhäute unterschiedlicher Epitheldicken untersucht und die Ein-flüsse der Hilfsstoffe BAC und EDTA auf die cornealen Diffusionseigenschaften von P-HCl bestimmt. Zur Bestimmung des Arzneistoffgehalts nach erfolgter Permeation in den Geweben (Penetrationsstudien, vgl. 5.2.5), diente ebenfalls dieses Ussing-Kammer-System.

Das Modell wurde in Anlehnung an eine im Arbeitskreis bereits etablierte Gleichgewichts-dialysezelle [354] in der Art und Weise modifiziert, dass die Auflagefläche für die Permea-tionsbarrieren auf der Donatorseite als zirkuläre Vertiefung und auf der Akzeptorseite als ringförmige Erhebung konzipiert wurden (Abb. 49). Neben einer sicheren Fixierung der Membran zwischen den beiden Halbzellen gewährleistet diese Konstruktion, dass die anato-misch bedingten Krümmungen der Cornea und der Sklera (Kurvatur) aufrecht erhalten bleiben. In die Donatorhalbzelle sind zur Befüllung des Kompartiments zwei Serumkanülen Nr. IV (mlw Injecta, Steinach) im Winkel von 30° eingelassen, während das Akzeptorkom-


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partiment durch zwei im Winkel von 180° angeordnete messingverstärkte Bohrungen konti-nuierlich mit Akzeptorflüssigkeit durchspült werden kann.

Abb. 49: Permeationszelle

5.2.6.2 Versuchsdesign

Die Versuchsbedingungen sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

Standardbedingungen bei den Permeationsuntersuchungen

Permeationsfläche

0.5 cm2

Donatorvolumen

1.00 ml

Donatorflüssigkeitsvolumen

1.00 ml

Akzeptorvolumen

1.00 ml

Akzeptorflüssigkeitsvolumen

20.0 ml

Probenvolumen

1.00 ml

Pufferlösung für P-HCl

GBR

Pufferlösung für D-Na

GBR/PG

Pufferlösung für MMF

GBR/HP-beta-CD

Pufferlösung für MPA

GBR/HP-beta-CD

Membran

SC, SS, NP

Temperatur

33 ± 0.5 °C

Pumpe Ismatec (Glattbrugg-Zürich, CH)

 

SC und SS wurden, wie bereits beschrieben (vgl. 5.2.3.1/2) innerhalb von zwei Stunden nach Schlachtung der Tiere präpariert und vorsichtig mit Hilfe eines Trepans auf den erforderlichen Durchmesser von 1.2 cm ausgestanzt. Bei diesem Arbeitsschritt war größte Sorgfalt erforder-lich, um die Gewebe nicht zu verletzen.

Eine Nephrophan®-Dialysemembran (regenerierte Cellulose, Porengröße ca. 2.4 nm, Dicke 14-15 µm, mit Sorbitol und Glycerol als Weichmacher imprägniert, Filmfabrik Wolfen) dien-


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te als synthetische Membran für Permeationsstudien. Die Membran wurde vor Versuchsbe-ginn 60 min in Wasser eingelegt und dann 10 min gespült, um die Weichmacher zu entfernen und um für jeden Versuch gleiche Bedingungen zu sichern. Anschließend wurden die vorbe-reiteten Membranen mit Hilfe eines Trepans ausgestanzt (1.2 cm _).

Abb. 50: Permeationsapparatur für Schweinecornea, -sklera und Nephrophan®

Die isolierten Gewebe und NP wurden vor dem jeweiligen Versuch kurz in GBR getaucht und anschließend mit einer feinen Pinzette vorsichtig auf der Donatorhalbzelle positioniert bzw. zentriert. Dabei wurde darauf geachtet, dass die epitheliale Seite der Cornea bzw. die Außen-seite der Sklera der Donatorseite zugewandt war. Mit jeweils drei Muttern (467 Ni, Schrauben Scholz, Berlin) wurden die beiden Zellenhälften verschraubt und die Gewebe damit so be-festigt, dass eine Faltenbildung vermieden werden konnte. Jeweils sechs Zellen wurden über Distanzstücke auf einem Gestänge etabliert und in ein Wasserbad eingesetzt, das auf 33 ± 0.5° C thermostatiert (T Lauda, Lauda Dr. R. Wobser GmbH & Co. KG., Lauda-Königshofen) war.

Die entsprechende Arzneistofflösung (vgl. 4.2.4/5/6) wurde in eine Injektionsspritze (5 cm3) (Record mlw Injecta, Steinach) aufgezogen und anschließend in die Donatorhalbzelle (1.0 ml) gefüllt. Die auf 33° C vortemperierten Pufferlösungen wurden über Silikonschläuche mit den Akzeptorhalbzellen verbunden und mit Hilfe einer Ismatec-Pumpe (siehe Tabelle) kontinu-ierlich umgepumpt, so dass eine ausreichende Agitation garantiert war. Bei einer Experiment-dauer von 5 h wurde alle 30 min 1.0 ml des Akzeptormediums entnommen und durch vorge-wärmtes, frisches Akzeptormedium ersetzt. Die Gehaltsbestimmung der Arzneistoffe in den Proben erfolgte mittels HPLC (5.2.2). Nach der Permeation wurden die Gewebe mit Trypan-blau-Lösung bzw. Fluoreszein-Lösung auf Vitalität geprüft (vgl. 5.2.6.3).


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5.2.6.3 Integritäts- und Vitalitätsprüfung von Schweinecornea

Zur Prüfung der Integrität und Vitalität der isolierten Gewebe vor und nach den Permeations-versuchen wurden Färbemethoden eingesetzt. Ein verwendeter Farbstoff war Fluoreszein, der epitheliale Defekte der Cornea anfärbt [355]. Die Inkubation frisch isolierter Hornhäute in Fluoreszeinlösung 0.5% (5 min) ergab punktuell gelbe Färbungen, die aber makroskopisch kaum sichtbar waren. Diese gelben Verfärbungen zeigten nach den fünfstündigen Permea-tionsexperimenten ein größeres Ausmaß und wurden durch Betrachtung unter UV-Licht in-tensiviert.

Als Färbemittel zur Vitalitätsprüfung wurde Trypanblau-Lösung (0.4%) verwendet, die ledig-lich tote Zellen anfärbt [355]. Die Ergebnisse mit Trypanblau-Lösung waren vergleichbar mit denen unter Verwendung von Fluoreszein. Direkt nach der Isolierung waren punktuell abge-storbene Zellen durch Blaufärbung zu erkennen, die nach der Permeation häufiger und groß-flächiger auftraten. Als Negativkontrolle gelangten mit 1%iger Triton ®-X-100-Lösung be-handelte Gewebe zum Einsatz (5 min).

5.2.7 Permeation durch isolierte Kaninchenkonjunktiva

5.2.7.1 Gewebeisolierung und Permeationsapparatur

Männliche pigmentierte Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2.5-3.0 kg wurden von Irish Farms (Los Angeles, USA) bezogen. Die Untersuchungen, an denen Kaninchen beteiligt waren, wurden gemäß den Guiding Principles in the Care and Use of Animals (DHEW Publi-cation, NIH 80-23), der ARVO Resolution on the Use of Animals in Research und der Dekla-ration of Helsinki durchgeführt.

Um konjunktivales Gewebe zu isolieren, wurden die Kaninchen mit einer Injektion von Pen-tobarbital-Na (85mg/kg Körpergewicht) in eine am Rand des Ohres befindliche Vene getötet. Wie in Abb. 51/1. gezeigt, wurde der Augapfel vorsichtig aus der Augenhöhle entfernt - dabei sollte das Skalpell von der Konjunktiva abgewandt sein - und anschließend in vorgewärmtem BR (pH 7.4, 37° C) aufbewahrt.


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Die Konjunktiva wurde sorgfältig zugeschnitten, um nicht dazugehörige Teile abzutrennen (Abb. 51/2.). Der Augapfel mit der noch anhaftenden, zugeschnittenen Konjunktiva (Abb. 51/3.) wurde dann in die Mitte eines speziell gefertigten Gewebeadapters platziert, dessen kreisrunde Öffnung eine Fläche von 1.0 cm2 aufwies (Abb. 51/4.). Die Öffnung des Adapters ist mit einem Weichsilikonring umgeben, der mit einer kleinen Menge Hochvakuum-Schmier-stoff (Dow Corning) versehen war. Um diesen Silikonring waren 4 mm lange Nadeln kreis-förmig in einem Abstand von 1 cm angeordnet. Nach vorsichtiger Befestigung des Gewebes an den Nadeln des Adapters, ohne die Konjunktiva dabei zu dehnen, wurde der Augapfel von der Konjunktiva entfernt. Das befestigte Gewebe, welches einer vorherigen makroskopischen Integritätsprüfung unterlag, wurde durch das Aufsetzen des Adaptergegenstücks gesichert. Das Gegenstück war ebenfalls mit einem gefetteten Silikonring versehen und mit pass-gerechten Löchern ausgestattet, in die die Nadeln des Adapterteils mit der befestigten Kon-junktiva gesteckt wurden. Diese Adapterkombination wurde dann in der Ussing-Kammer für bioelektrische Messungen platziert.

Abb. 51: Präparation von Kaninchenkonjunktiva [256], Pfeile kennzeichnen Schneiderichtung

Eine von der Arbeitsgruppe Lee modifizierte und in diesen Studien verwendete Ussing-Kam-mer [256], funktionierte nach dem gleichen Prinzip wie die für Schweineaugengewebe (vgl. 5.2.6.1). Der Gewebeadapter wurde zwischen zwei Acrylglas®-Blöcke geklemmt, deren Öf-fnungen zueinander zeigten. Dabei war die muköse Seite der Konjunktiva der Donatorhälfte zugewandt. Die Acrylglas®-Blöcke wiederum waren paarweise (jeweils zwei Paare) in einem kastenförmigen Halter untergebracht, der nach oben hin offen war und an dessen Enden


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Schrauben angebracht waren, um die Blöcke mit dem Adapter in der Mitte abzudichten. Der kastenförmige Halter war von einem Metallmantel umgeben, der kontinuierlich von auf 37° C vorgewärmtem Wasser durchflutet wurde und damit die Versuchsanordnung temperierte. Insgesamt konnten vier Kammern gleichzeitig betrieben werden.

5.2.7.2 Bioelektrische Messungen

Um die Lebensfähigkeit und Integrität der konjunktivalen Gewebe einzuschätzen, wurden die spontan entwickelte transepitheliale elektrische Potentialdifferenz (PD) und der Widerstand (TEER) mit einer automatischen Spannungsklemme (558C-5, University of Iowa, Bioen-gineering Department, Iowa city, USA) überwacht. Die Daten wurden alle 30 min während des Experimentes aufgezeichnet sowie vor und nach jedem Versuch.

Die PD wurde als Index für den aktiven Netto-Ionentransport betrachtet und TEER als Index für die Integrität der Tight junctions des isolierten Gewebes. Die PD wurde mit einem Paar Kalomelelektroden gemessen. Zwei Polyethylen-Brücken (PE 90) (gefüllt mit 4% Agar in 3 mol/l KCl), deren Enden nahe dem Zentrum der Gewebeoberflächen lokalisiert waren, wur-den genutzt, um die Flüssigkeiten, in die die Elektroden getaucht waren mit dem Donator- bzw. Akzeptormedium elektrisch zu verbinden. Der elektrische Output der Kalomelelektroden wurde durch die Spannungsklemme verstärkt. Der direkte Strom wurde mittels Ag/AgCl-Elektroden-Paar durch die Konjunktiva gesendet, das wiederum über Polyethylen-90-Brücken mit dem Donator- bzw. Akzeptormedium verbunden war. Diese Brücken waren entfernt von den Gewebeoberflächen positioniert. Der Kurzschluss-Strom (ISC), der in Richtung Puffer-Ge-webe-Puffer floss, wurde durch einen Strip Chart Recorder (Kipp and Zonen, Delft, The Netherlands) überwacht und aufgezeichnet. In 60 s-Intervallen wurde ein 2 mV Puls (DeltaV) für 3 s durch das Gewebe geschickt, um den TEER zu bestimmen. Der Widerstand wurde als oberflächennormalisiertes Verhältnis vom auferlegten Spannungspuls zur gemessenen Ablen-kung des resultierenden Stromes (DeltaI) berechnet:

TEER = (DeltaV/DeltaI)A,

wobei A die nominale Oberfläche (1 cm2) der Ussing-Kammer-Öffnung ist. Vor jedem Expe-riment wurde der Widerstand der Lösungen (<100 Omegacm2) automatisch durch die Spannungs-klemme kompensiert.


136

5.2.7.3 Permeationsstudien

Nach Abdichtung der Zellen und Temperieren der Anordnung wurden 6 ml BR in jeden der Blöcke gefüllt (Donator- bzw. Akzeptorkammer) und ca. 30 min äquilibriert, bis ein kon-stanter ISC zu verzeichnen war. Nach der Äquilibrierung wurde der Puffer aus der Donator-kammer mittels Vakuumpumpe entfernt und mit frisch hergestellter Arzneistofflösung (vgl. 4.2.4.4) wieder aufgefüllt. Nach 30, 60, 120 und 180 min wurden jeweils 0.5 ml aus dem Ak-zeptormedium für HPLC-Messungen (vgl. 5.2.2) entnommen. Die entnommene Probe wurde sofort durch temperierten Puffer ersetzt. Die Untersuchungen wurden bei 36 ± 1.0° C und unter 95% Luft/5% CO2-Begasung durchgeführt.

Standardbedingungen bei den Permeationsuntersuchungen

Permeationsfläche

1.0 cm2

Donatorvolumen

6.00 ml

Donatorflüssigkeitsvolumen

6.00 ml

Akzeptorvolumen

6.00 ml

Akzeptorflüssigkeitsvolumen

6.00 ml

Pufferlösung

BR

Probenvolumen

0.5 ml

Membran

KK

Temperatur

36 ± 1.0°C

95% Luft/5% CO2 - Begasung

 

5.2.8 Permeation nach Excimer-Laser-Behandlung

5.2.8.1 Excimer-Laser

In Excimer-Lasern (von excited dimer) wird ein Gasgemisch aus einem Halogen (Chlor oder Fluor) und einem Edelgas (Argon oder Xenon) so intensiv durch eine elektrische Entladung angeregt, dass kurzzeitig ein stabiler Zustand entsteht. Das Produkt dieses Zustands zerfällt jedoch schnell (innerhalb von ns) unter Emission von Lichtquanten, die, wie auch in anderen Lasern, verstärkt werden. Die Besonderheit dieser Puls-Laser besteht in der sehr kurzen Wel-lenlänge der emittierten Strahlung im UV-Wellenlängenbereich (< 350 nm). Sie ist aufgrund ihrer guten Fokussierbarkeit für Präzisionsarbeiten, z.B. in der Materialbearbeitung, prädesti-niert.


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Bei der Anwendung in der Hornhautchirurgie hat sich der ArF-Excimer-Laser durchgesetzt, da seine Pulse mit einer Wellenlänge von 193 nm im Hornhautgewebe besonders gut absorbiert werden. Diese kurze Wellenlänge und die geringe Pulsdauer (ca. 20 ns) ermög-lichen die hohe Präzision, die für den genauen Abtrag von Gewebe erforderlich ist [356]. Mit jedem Laserpuls wird eine Gewebeschicht von ungefähr 0.25 µm Dicke abgetragen [356]. Der maximale Abtrag bei der Korrektur von Fehlsichtigkeiten beträgt etwas mehr als 10 µm pro dpt. Zur Anwendung kommen sogenannte Ganzfeld- oder Wide-field-Laser, die einen so großen Strahlendurchmesser aufweisen, dass sie den gesamten Operationsbereich gleichzeitig behandeln. Davon unterscheiden sich Flying-spot-Laser, von denen ein Vertreter in dieser Studie zur Anwendung gelangte, deren Strahlendurchmesser unter 2 mm liegt. Dieser Spot wird in einem vorherbestimmten Ablauf über die Hornhaut geführt, wobei das vorgegebene Abtragmuster sukzessive durchlaufen wird.

5.2.8.2 Lasern der Hornhaut

Der Augapfel wurde in einem speziellen Halter platziert und ca. 12.5, 25.0, 37.5 bzw. 50.0 µm des cornealen Epithels bzw. einschließlich Bowman-Membran mittels ArF-Excimer-Laser (OpTex Laser, Lambda Physik, Göttingen; lambda = 193 nm) entfernt. Der Laser war mit einem Experimental-Scanning-Spiegel (Laser Scanning Kaiser AG, Stallikon, Schweiz) ausgestattet.

Die unterschiedlichen Ablationstiefen wurden durch eine variierende Anzahl von Laserpulsen bzw. Durchläufen (jeweils einmaliges Abfahren der gesamten Korrekturfläche) erhalten. Die Oberfläche der Hornhaut ist bei Anwendung eines Flying-spot-Lasers in sogenannte Pixel eingeteilt (Anzahl der Pixel korreliert mit der Größe der Ablationsfläche), auf die ein Laser-strahl (_ < 2 mm) trifft. Je nach Gesamtenergie der Strahlung bzw. Energie pro Pixel, ent-fernt ein Laserstrahl größere oder kleinere Gewebemengen. Da es bei dieser Studie nicht möglich war, während des Laserns die Abtragtiefe bzw. die Restdicke der Hornhäute zu be-stimmen, wurden Vorversuche durchgeführt. Dabei wurden von 20 Hornhäuten alle Epithel-schichten unter Messung der Energie pro Pixel (Gesamtenergie/Pixelanzahl) und der Proto-kollierung der Anzahl der Durchläufe entfernt. Eine Änderung der Lichtstreuung des auftref-fenden Laserstrahls und die damit verbundene Farbänderung der gelaserten Oberfläche von Dunkelblau nach Violett kennzeichnete den Übergang vom Epithel in das Stroma. An Hand dieser Vorversuche bis zu einer 100%igen Entfernung des Epithels war es möglich, über die Gesamtenergie, die Energie pro Pixel und die Anzahl der Durchläufe, die Parameter für eine


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25%ige, 50%ige und 75%ige Epithelabrasio zu berechnen. Da die Dicke des Epithels ca. 50 µm beträgt, kann davon ausgegangen werden, dass bei 25%iger Ablation des Epithels ca. 12.5 µm entfernt werden usw.

Die Laserenergie variierte zwischen 280 und 840 mJ/cm2, die Pulswiederholfrequenz betrug 40 Hz, und es wurde eine Auflösung (Überlappung der Pixel) von 100 gewählt. Die Abla-tionszone umfasste die gesamte Cornea, die unmittelbar nach dem Lasern isoliert (vgl. 5.2.3.1) und in die Ussing-Kammer für Permeationsstudien gespannt wurde (vgl. 5.2.6).

5.2.9 Raster-Elektronenmikroskopie (REM)

5.2.9.1 Aufbau und Funktion des Gerätes

Das REM eignet sich besonders zur Darstellung von räumlichen Strukturen, Bruchkanten und Oberflächen. Die wesentlichen Bauelemente eines Raster-Elektronenmikroskops sind:

Die von der Elektronenkanone emittierten Elektronen werden über Wehnelt-Zylinder und 2-3 elektromagnetische Linsen auf die Probenoberfläche fokussiert. Ein Ablenkgenerator wird so gesteuert, dass der Elektronenstrahl die Probenoberfläche zeilenförmig abrastert, synchron zum Elektronenstrahl in einer Anzeige-Bildröhre.

Die von der Probe emittierten Sekundärelektronen und/oder Rückstreuelektronen werden von geeigneten Detektoren erfasst. Die von den Detektoren ausgehenden Signale dienen einzeln, oder elektronisch gemischt, nach Passieren eines Videoverstärkers zur Helligkeitsmodulation der Bildröhre.

Die Einstellung der Vergrößerung hängt von der Größe der abgerasterten Probenoberfläche ab. Bei konstanter Bildgröße auf dem Bildschirm ergibt sich die Vergrößerung aus dem Verhältnis Bildschirmgröße : Größe der abgerasterten Probenfläche. Die Vergrößerungsbereiche kommerzieller Raster-Elektronenmikroskope liegen zwischen 10- bis 100 000fach.


139

Das erreichbare Auflösungsvermögen wird bei dickeren Proben nicht allein durch den erziel-bar kleinsten Durchmesser der Elektronensonde, sondern durch die Größe des Volumen-elements bestimmt, aus welchem am Auftreffort des Elektronenstrahls die Elektronen aus der Probe austreten (Diffusionswolke).

Der Abbildungskontrast der REM-Aufnahme wird von vier Größen bestimmt:

Entscheidend für die Zahl der ausgelösten Sekundärelektronen ist der Reliefkontrast; Kanten und Spitzen der Probe erscheinen im REM-Bild heller (Kanten-Helleffekt). Der ausgeprägt plastische Charakter der REM-Aufnahmen wird wesentlich durch den Orientierungskontrast bestimmt.

5.2.9.2 Probenpräparation1)

Die Elektronenmikroskopie ermöglicht zwar wesentlich höhere Auflösungen als die Lichtmi-kroskopie, aber das Arbeiten im Vakuum und die Tatsache, dass viele biologische Proben un-behandelt bestenfalls sehr kontrastschwache Bilder liefern würden, erfordert einen deutlich größeren Aufwand bei der Probenpräparation.


140

Damit die Materialien mit dem REM untersucht werden können, müssen sie folgende Eigen-schaften besitzen, die biologisches Material ohne Vorbehandlung nicht hat:

Es ist äußerst wichtig, dass die Probe während der Präparation möglichst wenig beschädigt wird, weil u.U. Präparationsartefakte auftreten können, die vom Betrachter als natürliche Strukturen missdeutet werden können.

Zur vergleichenden Untersuchung von gelaserter und ungelaserter Cornea wurden die Ge-webe zunächst wie unter 5.2.8.2 beschrieben einer Excimer-Laser-Behandlung unterzogen und anschließend laut 5.2.3.1 isoliert. Andere Hornhäute wurden ohne Laserbehandlung vom Augapfel isoliert und sofort präpariert bzw. 5 h in GBR, versetzt mit 0.01% BAC, inkubiert. Die so bearbeiteten cornealen Gewebe wurden, wie nachfolgend beschrieben, für die REM vorbereitet.

Im ersten Schritt der Aufbereitung wurden die Hornhäute in 2.5%igem (phosphatgepuffertem) Glutaraldehyd (Serva, Heidelberg) über Nacht fixiert. Glutaraldehyd ist für die Vernetzung der Proteine im Gewebe verantwortlich und stabilisiert so die Hornhäute. Anschließend wur-den die Gewebe mit 2%igem Osmiumtetroxid (Paesel und Lorei GmbH & Co., Hanau) gewaschen und nachfixiert. Dieses Reagenz greift an Doppelbindungen an und vernetzt z.B. die Phospholipide von Membranen, wobei es selbst reduziert wird und dadurch das Gewebe schwarz bis schwarzbraun färbt. So wirkt es gleichzeitig als Stabilisierungs- und Kontrastie-rungsmittel. Nach dem Auswaschen mit Wasser erfolgte eine Entwässerung mit 30, 50, 70, 80, 90 und 96%igem Ethanol (BfB, Offenbach am Main), wobei für jeden Schritt 10 min auf-gewendet wurden. Bei der Entwässerung wurde darauf geachtet, dass die Proben nicht mit Luft in Berührung kamen. Der Alkohol wurde mit Hexamethyldisalazin (Sigma, Steinheim) entfernt und somit gleichzeitig eine oberflächenspannungsfreie Trocknung vorbereitet.


141

Das Trocknen, genauer gesagt, der Phasenübergang des Wassers von Flüssig nach Gasförmig, ist der kritischste Schritt der Präparation. Durch die hohe Oberflächenspannung entstehen hierbei leicht Schäden an den Proben, weshalb diese vorher mit Alkoholen aufsteigender Kon-zentration entwässert werden. Diese Proben wurden dann luftgetrocknet auf einen Präparate-halter aufgebracht und mit Gold besputtert (Hochvakuum-Kleinbeschichtungsanlage MED 020, BAL-TEC, Schalksmühle). Da biologische Materialien eine sehr geringe Leitfähigkeit und eine extrem niedrige Sekundärelektronen-Ausbeute haben, ist es notwendig, eine dünne Metallschicht auf die Probe aufzubringen, um möglichst genaue Informationen über das Material zu erhalten. Zur gleichmäßigen Beschichtung des Präparates mit Gold wird ein spezielles Verfahren, das Besputtern, angewendet. Dabei werden eine Goldelektrode mit Ionen beschossen und feinste Partikel auf das Präparat übertragen. Die so vorbereitete Probe wurde schließlich in das REM (Zeiss, DSM 982, Gemini) eingebracht und untersucht.

5.2.10 Permeation durch Zellkulturen

5.2.10.1 Kultivierung von Kaninchenkonjunktiva-Epithelzellkultur

Konjunktivale Epithelzellen (Primärkultur) vom Kaninchen wurden nach einem modifizierten Protokoll von Saha et al. [348] isoliert. Pigmentierte Kaninchen wurden mit einer letalen Dosis Pentobarbital-Na (120 mg/kg) durch intravenöse Applikation in eine Vene am Ohrrand getötet (vgl. 5.2.7.1). Die exzidierte Konjunktiva wurde sofort in eine sterile Petrischale (Fal-kon, Lincoln Park, USA) überführt, die mit eisgekühlter Ca2+/Mg2+-freier Hanks‘ physio-logischer Salzlösung (HBSS) gefüllt war. Die Konjunktiva wurde wiederholt in HBSS ge-waschen und die nicht zum Gewebe gehörenden Muskeln bzw. umliegenden Gewebe asep-tisch von der äußeren Oberfläche der Konjunktiva entfernt.

Das Bindehautgewebe wurde dann in 0.2%ige Protease XIV in Minimum essential medium with Earl‘s salts and L-glutamine (S-MEM) bei 37° C in Luft/CO2 (95%:5%) für 90 min in-kubiert. Am Ende der Protease-Behandlung konnte die Epithelschicht vorsichtig mit einem sterilen Skalpell Größe 10 abgeschabt werden. Die isolierten Zellen wurden dann mit 0.5 mg/ml DNA-ase-I-Lösung, die 10% fötales Rinderserum (FBS) enthielt, vermischt und bei 37° C mit Luft/CO2 (95%:5%) voräquilibriert. Mittels steriler Pipette (Falkon, Lincoln Park, USA) fand eine Mischung der Zellsuspension statt, die anschließend bei Raumtemperatur für 10 min zentrifugiert wurde. Die Entfernung des Überstands erfolgte mit einer Vakuumpumpe,


142

und die Zellpellets wurden in S-MEM mit 10% FBS resuspendiert. Anschließend wurden die Pellets durch ein 70 µm Zellfilter (Falkon, Lincoln Park, USA) filtriert und erneut zentri-fugiert.

Die erhaltenen Zellpellets wurden in PC-1-Medium suspendiert. PC-1 ist ein serumfreies, wenig Protein enthaltendes Medium, das definierte Mengen Insulin, Transferrin, Wachstums- und Haftfaktoren und essentielle Fettsäuren enthält. Die Grundlage dieses Mediums ist eine 1:1-Mischung aus Dulbecco‘s modifiziertem Eagle‘s Medium (DMEM) und Ham‘s Nährstoff F12 Medium (F12). DMEM/F12 ist mit L-Glutamin (2 mM), Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 µg/ml), Gentamycin (50 µg/ml) und Fungizone® (1 mg/ml) versetzt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit Hilfe von 0.2%iger Trypanblau-Lösung bestimmt.

Die isolierten Konjunktivazellen (15-25 x 106 Zellen/Kaninchen) wurden auf 6.5 mm Trans-well-Filter (Corning Costar, Cambridge, USA) (Abb. 52) mit einer Dichte von 1.5 x 106 Zellen/cm2 ausgesät. Die permeablen Filter wurden vorher 4 h mit einer Mischung aus 5.3 µg/cm2 Kollagen (Rattenschwanz Typ I), 1.8 µg/cm2 Fibronectin (human) und 1.8 µg/cm2 Rinderserumalbumin (BSA) in PC-1-Medium beschichtet. 0.2 ml Zellsuspension wurden zur apikalen Seite des Filters gegeben und 0.9 ml zur basolateralen Seite (Tag 0). Diese Volumina eliminieren den hydrostatischen Druck durch den Transwell-Filter. Die Konjunktivazellen konnten durch die Beschichtung des Filters an diesem anhaften (37° C in 95%Luft : 5%CO2). Nach 48 h wurden die Medien sowohl von der basolateralen als auch von der apikalen Seite entfernt (in dieser Reihenfolge) und die Zellmonolayer vorsichtig mit PC-1-Medium (37° C, pH 7.4) gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde vorsichtig abgesaugt und die Zellschicht unter Liquid-covered-conditions kultiviert. 0.2 ml PC-1-Medium wurden zur oberen Filter-seite pipettiert und 0.9 ml zur unteren. Das Kulturmedium wurde täglich gewechselt.

Die bioelektrischen Parameter von KKEZ wurden täglich gemessen (vgl. 5.2.10.3), um die Reife und die Integrität der Kultur zu überprüfen.

5.2.10.2 Kultivierung von Kaninchencornea-Epithelzellkultur

Die Kultivierung von KCEZ erfolgte prinzipiell wie unter 5.2.10.1 nach einem modifizierten Protokoll von Chang et al. [345]. Dazu wurden die Kaninchen, wie oben beschrieben, getötet, der Augapfel entnommen und dieser in eiskalten HBSS gegeben. Der Augapfel wurde dann in einem speziellen Halter fixiert und lediglich die Epithelschicht der Hornhaut mit 0.2% Pro-tease für 60 min inkubiert. Die weitere Bearbeitung erfolgte wie für KKEZ, jedoch wurden die Epithelzellen hier durch ein 40 µm Zellfilter (Falkon, Lincoln Park, USA) gefiltert. Die anschließende Resuspendierung der Zellpellets nach dem Zentrifugieren fand entweder in PC-1-Medium oder DMEM/F12 statt, welche mit 1 µg/ml Fungizone®, 50 µg/ml Gentamycin, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, Insulin-transferrin-selenium (ITS+) Premix, 30 µg/ml Rinder-Hypophysenextrakt (BPE), 1 ng/ml Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und 0.36 µg/ml Hydrocortison versetzt waren.


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Die isolierten Epithelzellen wurden in einer Dichte von 0.9 x 106 Zellen/cm2 in Transwells (vgl. 5.2.10.1) ausgesät. Die weitere Bearbeitung erfolgte wie unter 5.2.10.1 beschrieben.

Abb. 52: 6.5 mm Clear Transwell mit permeabler Filtereinlage [344]

5.2.10.3 Bioelektrische Messungen

TEER und PD der beiden Zellkulturen (KCEZ und KKEZ) wurden täglich während des Kulti-vierens und unmittelbar vor und nach einer Permeationsstudie mit einem epithelialen Volt-ohmmeter (EVOM, World Precision Instruments, Sarasota, USA) gemessen. Zur Korrektur wurden der Hintergrund-TEER und -PD, gemessen in einem Transwell ohne Zellkultur und befüllt mit Kulturmedium bzw. BR, vom eigentlichen Messwert abgezogen.

5.2.10.4 Permeationsstudien

Die Permeationsstudien mit P-HCl durch KKEZ und KCEZ wurden in den Transwells ausge-führt, in denen die Züchtung der Zellkulturen erfolgte (Abb. 52). Es kamen ausschließlich Kulturen mit optimalen bioelektrischen Parametern zum Einsatz, so dass von einer geschlossenen und intakten Monolayer ausgegangen werden konnte (zwischen Tag 6 und 8 der Kulti-vierung). Nachdem das Kulturmedium mittels einer Vakuumpumpe abgesaugt worden war, fand eine Inkubation (1 h) der Zellen in temperiertem BR-Puffer statt. Anschließend wurden der TEER und die PD der Zellen vermessen, der Puffer von der oberen Seite des Transwells entfernt und durch die Arzneistofflösung ersetzt. Nach 30, 60, 120, 180 und 240 min wurden je 200 µl aus dem Akzeptormedium entnommen und mit dem gleichen Volumen von tempe-riertem BR wieder ergänzt. Nach Beendigung des Permeationsexperimentes wurden erneut


144

die bioelektrischen Daten aufgenommen. Die gesammelten Proben wurden per HPLC auf den P-HCl-Gehalt untersucht (vgl. 5.2.2.1).

Standardbedingungen bei den Permeationsuntersuchungen

Permeationsfläche

0.33 cm2

Donatorvolumen

0.2 ml

Akzeptorvolumen

0.8 ml

Probenvolumen

0.2 ml

Pufferlösung

BR

Membran

KKEZ, KCEZ

Temperatur

37 ± 1.0 °C

95% Luft/5% CO2 - Begasung

 

Für die pH-abhängigen Untersuchungen (vgl. 4.3.2/3) wurde BR pH 6.4 durch Zugabe von 0.1N HCl und BR pH 8.4 durch Zugabe von 0.1N NaOH hergestellt. Eine BR-Tonizität von 80 mOsmol/kg war durch die Reduktion des NaCl-Anteils im Puffer zu erreichen und die hypertone Präparation (600 mOsmol/kg) wurde durch Zugabe von Saccharose zum BR her-gestellt.

5.2.11 Statistik

Die tabellierten Daten und die verwendeten Symbole in den Abbildungen geben die Mittel-werte wieder, die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar, wobei ein bestimm-ter Stichprobenumfang (n) zugrunde gelegt wird. Die Signifikanzprüfung von Messwerten erfolgte nach Prüfung auf Normalverteilung nach David und auf Varianzhomogenität (F-Test) mittels zweiseitigem t-Test mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% (p<0.05). Bei nicht-normalverteilten Werten erfolgte die Signifikanzprüfung mit Hilfe des Mann-Whitney-Tests (u-Test).

Die Ermittlung des statistischen Unterschieds zwischen multipel unterschiedlichen Gruppen fand unter Nutzung von One Way Analysis of Variance (ANOVA) unter Anwendung des Student-Newman-Keuls Multiple Comparison Tests zum Vergleich der Mittelwerte statt, wobei p<0.05 als statistisch signifikant angenommen wurde. Die Annahme der Normal-verteilung und Varianzhomogenität wurde ebenfalls getestet und die Signifikanz durch nicht-parametrische Analyse unter Verwendung von Kruskal-Wallis ANOVA On Ranks Test be-stätigt. Für diese Kalkulationen wurde StatView (Abacus Concepts, Berkeley, USA) verwen-det.


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