Scholz, Martina: In vitro-Permeationsstudien von hydrophilen und lipophilen Arzneistoffen an okularen Geweben und Zellkulturen

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Kapitel 6. Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich vorrangig mit der Permeation von Pilocarpin-HCl (P-HCl), Diclofenac-Natrium (D-Na), Mycophenolatmofetil (MMF) und Mycophenolsäure (MPA) durch verschiedene tierische okulare Gewebe, wie unbehandelte und gelaserte Schweinecornea (SC), Schweinesklera (SS) bzw. Kaninchenkonjunktiva (KK), sowie durch corneale (KCEZ) und konjunktivale (KKEZ) Kaninchenepithelzellkultur ohne und unter Ein-fluss von Formulierungsparametern. Weiterhin wurde die synthetische Membran Nephro-phan® (NP) als Permeationsbarriere eingesetzt. Die Ergebnisse der in vitro-Permeations-studien sollen als Orientierungshilfe dienen, um Rückschlüsse auf die in vivo-Verfügbarkeit der untersuchten Arzneistoffe zu ermöglichen. Im Falle des Modellarzneistoffs P-HCl wird mit diesen Studien außerdem eine Einschätzung der Korrelierbarkeit zwischen isolierten Geweben und Zellkulturen versucht.

Als Voruntersuchungen zu den Permeationsstudien wurden von SC und SS der Proteingehalt, die Hydratation im jeweiligen Versuchsmedium und die Wirkstoffaufnahme in das Gewebe bestimmt. Unter Verwendung der Raster-Elektronenmikroskopie (REM) wurden Veränderun-gen der Epitheloberfläche, hervorgerufen durch das Lasern des Epithels sowie durch Einwir-kung von Benzalkoniumchlorid (BAC), untersucht.

Permeationstudien mit P-HCl durch isolierte Gewebe und Zellkulturen

Der Schwerpunkt der vorliegenden Dissertation lag auf der Untersuchung des hydrophilen Antiglaukomatosums P-HCl, von dessen 2%igen Zubereitungen die Permeabilitätskoeffi-zienten (Peff) durch SC, SS, KK als auch durch KCEZ und KKEZ unter dem Einfluss von BAC und/oder Natriumedetat (EDTA), verschiedenen pH-Werten und Tonizitäten ermittelt wurden.

Abb. 53 stellt die Permeabilitäten von SC, SS und KK für P-HCl gegenüber und weist den höchsten Wert für die SS (Peff = 5.92 ± 1.21 x 10-6 cm/s), das Gewebe mit der vergleichsweise ausgeprägtesten Hydrophilie, aus. Tendenziell erwies sich die Konjunktiva als am geringsten permeabel für P-HCl (Peff = 1.72 ± 0.69 x 10-6 cm/s), wobei das Ausmaß der parazellulären Diffusion des Arzneistoffs jedoch nicht signifikant verschieden von der SC (Peff = 2.54 ± 0.75


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x 10-6 cm/s) war. Erfahrungsgemäss ist die Konjunktiva für hydrophile Substanzen leichter passierbar als die Cornea, wie auch der Vergleich der Zellkulturexperimente von Cornea (KCEZ) und Konjunktiva (KKEZ) beweist (Abb. 54). Bei der Gegenüberstellung in Abb. 53 müssen jedoch die unterschiedlichen Tierspezies (Schwein bzw. Kaninchen) und differieren-den Ussing-Kammer-Modelle berücksichtigt werden (A und B).

Abb. 53: Peff von P-HCl durch Schweinecornea, -sklera und Kaninchenkonjunktiva, n = 5-12, (*) p<0.05 verglichen mit der jeweiligen 2%igen P-HCl-Lösung; A: Permeationsmodell und Provenienz der Gewebe identisch; B: anderes Modell und andereTierspezies

Der permeabilitätsfördernde Einfluss von 0.01% BAC auf die P-HCl-Permeation war für alle drei isolierten Gewebe signifikant, aber unterschiedlich stark ausgeprägt: SS < SC < KK und entspricht einem 1.2-, 3.1- bzw. 3.3fachen Peff, verglichen mit der jeweiligen konservierungs-mittelfreien Präparation (Abb 53). 0.05% EDTA führte dagegen nicht zur signifikanten Per-meabilitätssteigerung.

Abb. 54: Korrelation der Peff von P-HCl durch isolierte Gewebe und Zellkulturen, n=3-12, (*) p<0.05 verglichen mit isolierten Geweben


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Trotz unterschiedlicher Tierspezies ergab sich eine gute quantitative Korrelierbarkeit der Peff zwischen isolierter Cornea (SC) und der Epithelzellkultur (KCEZ) (Abb. 54 links). Lediglich 0.05% EDTA waren von differenziertem Einfluss auf die P-HCl-Diffusion durch die beiden Barrieren.

Dagegen resultierten beim Vergleich der konjunktivalen Barrieren gleicher Tierspezies (Ka-ninchen) wesentlich höhere Zellkultur-Permeabilitäten für P-HCl gegenüber der exzidierten Konjunktiva (Abb. 54 rechts). Die Permeation von P-HCl war ca. 20-50fach höher durch KKEZ verglichen mit KK. 0.01% BAC steigerte die Permeation durch KK um das 3.3fache im Vergleich zur P-HCl-Lösung ohne Konservierungsmittelzusatz, während eine nur 1.5fache Steigerung des Peff, hervorgerufen durch 0.01% BAC, bei KKEZ resultierte. Im Gegensatz dazu verursachten 0.05% EDTA die doppelte Arzneistoffkonzentration im Akzeptormedium der Zellkultur, wiederum verglichen mit der hilfsstofffreien Zubereitung, während eine nur 1.5fache Arzneistoffmenge durch KK das Akzeptormedium erreichte.

Abb. 55 fasst die Einflüsse der getesteten Formulierungsparameter auf KCEZ bzw. KKEZ zu-sammen, wobei die prozentuale Zu- bzw. Abnahme des Peff gegenüber der Referenz (2% P-HCl in BR, pH 7.4, 300 mOsmol/kg) dokumentiert ist.

Abb. 55: Veränderung [%] der Peff von P-HCl durch corneale und konjunktivale Epithelzellkultur unter Einfluss unterschiedlicher Formulierungsparameter

In qualitativer Hinsicht sind die Effekte der genannten Formulierungsparameter auf beide Zellkulturen als ähnlich einzuschätzen, was wahrscheinlich mit der vergleichbaren Anatomie der cornealen und konjunktivalen Epithelzellen zu begründen ist. Der Enhancer-Effekt von BAC lässt sich generell bestätigen.


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KCEZ weist eine besondere Empfindlichkeit gegenüber 0.01% BAC auf, wohingegen diese Zellkultur den anderen Formulierungsparametern gegenüber als relativ unempfindlich er-scheint. Dagegen reagierte die KKEZ sensibel auf BAC und EDTA in abgestufter Konzen-tration bzw. in Kombination.

Die Sensibilität beider Zellkulturen gegenüber pH-Veränderungen war gering. Erwartungs-gemäß führte ein pH-Wert von 6.4, bedingt durch den erhöhten Ionisierungsgrad von P-HCl, zu einer schwachen, aber nicht signifikanten Senkung der Arzneistoffkonzentration auf der Akzeptorseite beider Zellkulturen. Auch im Hinblick auf die Tonizität der Arzneistofflösung zeigte sich nur mäßige Empfindlichkeit. Lediglich eine hypotonische Zubereitung verursachte eine signifikante Steigerung der P-HCl-Permeation durch KKEZ um ca. 90%.

Schlussfolgernd hat diese Studie gezeigt, dass die parazelluläre Diffusion von P-HCl durch isolierte Gewebe und Zellkulturen unterschiedlich durch Formulierungsparameter beeinflusst werden kann. Die Korrelation zwischen den isolierten Geweben und Zellkulturen hinsichtlich der Qualität und Quantität der Effekte der Formulierungsparameter war gut, auch wenn Ein-schränkungen beim Vergleich konjunktivaler isolierter Gewebe und Zellkulturen gemacht werden müssen.

Permeationstudien mit P-HCl und D-Na durch gelaserte Schweinecornea

An Hand dieser Studie sollte die Wundheilung des Corneaepithels nach erfolgter Photorefrak-tiver Keratektomie (PRK) simuliert werden, bei der eine zeitabhängige Reepithelisierung der Cornea stattfindet. In der Excimer-Laser-Studie wurde die Permeation von P-HCl (hydro-philer Arzneistoff) und D-Na (lipophiler Arzneistoff) durch Hornhäute unterschiedlicher Epi-theldicke verglichen (Abb. 56).

Die parazelluläre Diffusion von P-HCl nahm mit zunehmender Ablationstiefe signifikant zu, da die Barrierefunktion der Cornea für hydrophile Stoffe durch die Abtragung der Zellschichten abnimmt. Verglichen mit unbehandelter Cornea (SC) erfolgte bereits nach Ablation von 25% des Epithels (SC 25%) eine Verdoppelung des Peff, während in den folgenden Ab-lationsstufen nur noch eine Steigerung um das jeweils 1.5fache resultierte. Ursache hierfür ist die ausgeprägte Barrierefunktion der beiden oberen Zellschichten des Epithels, die das Aus-maß der parazellulären Permeation determinieren. Interessanterweise verursachte die Entfer-nung der Bowman-Membran (SCo.E, o.B) keine weitere Erhöhung der Permeabilität der Cornea, im Vergleich zu einer Hornhaut, der nur das Epithel entfernt wurde (SCo.E).


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Abb. 56: Permeation von D-Na (aus GBR/PG) und P-HCl (aus GBR) durch gelaserte Schweinecornea

Parallel zu den vorangegangenen Versuchen wurde der Einfluss von 0.01% BAC auch auf die Permeation durch gelaserte Hornhäute untersucht. In Analogie zu den Befunden mit intaktem Gewebe erfolgte eine Permeationsförderung, wobei die Peff wiederum proportional zur Abla-tionstiefe anstiegen wie bei der hilfsstofffreien Formulierung. 0.05% EDTA hatten einen dif-ferenzierten, aber insgesamt moderaten permeationsfördernden Einfluss.

Im Gegensatz zu P-HCl resultierten für D-Na nur geringfügige Unterschiede zwischen den Ablationsstufen. Dieses Resultat bestätigt die Hypothese, dass das Epithel für lipophile Stoffe lediglich eine limitierte Barrierefunktion ausübt, während das Stroma die Hauptbarriere darstellt. Erst bei vollständiger Entfernung des Epithels konnte eine signifikante Erhöhung der Arzneistoffpassage durch die Cornea verzeichnet werden.

Der Peff durch intakte Cornea betrug für D-Na lediglich 1.77 x 10-6 cm/s gegenüber 2.54 x 10-6 cm/s für P-HCl, obwohl im Allgemeinen lipophile Stoffe, wie D-Na, die Cornea leichter passieren als das hydrophile P-HCl. Wie die Ergebnisse der vergleichenden Permeationsstudien mit P-HCl in GBR/PG bzw. GBR als Versuchsmedium schlussfolgern lassen, wird dieses Phänomen durch das verwendete osmotisch aktive Versuchsmedium GBR/PG hervor-gerufen. Die P-HCl-Permeation aus GBR ist ca. um den Faktor 11 größer als aus GBR/PG (Peff = 0.22 x 10-6 cm/s). Beim Vergleich der Permeation von P-HCl und D-Na aus dem gleichen Permeationsmedium (GBR/PG) bestätigte sich, dass lipophile Substanzen die Cornea


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leichter passieren als hydrophile Stoffe. Der Peff von D-Na betrug das 8fache, verglichen mit dem Peff von P-HCl.

Eine messbare Diffusion von D-Na erfolgte erst nach einer Lagtime von 119 min. Diese Lag-time nimmt mit zunehmender Ablationsrate ab. Es ist anzunehmen, dass eine Akkumulation des lipophilen Arzneistoffs im Epithel stattfindet, einhergehend mit einer Verzögerung der transzellulären Permeation in direkter Proportionalität zur Epitheldicke.

Im Ergebnis ist festzustellen, dass die Arzneistoffpermeation durch Hornhäute mit unter-schiedlich dickem Epithel in Abhängigkeit von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Arzneistoffe variiert. Demnach kann während des Wundheilungsprozesses nach PRK eine Konzentrationserhöhung hydrophiler Arzneistoffe im Kammerwasser, verbunden mit uner-wünschten Nebenwirkungen, nicht ausgeschlossen werden. Im Gegensatz dazu wird die Per-meation des lipophilen Arzneistoffs D-Na kaum verändert.

MMF-Formulierung und Permeation

MMF wurde bisher lediglich systemisch bei Hornhauttransplantationen und okularen Auto-immunerkrankungen angewendet, wobei es aber direkt nach der Applikation Diarrhöe, Übelkeit und Erbrechen und auf lange Sicht Leukopenie und Sepsis hervorrufen kann. Des-halb war es eine weitere Aufgabe dieser Arbeit, eine topisch applizierbare Zubereitung zur Testung dieses Arzneistoffs am Auge zu entwickeln.

Als Resultat der Löslichkeitsstudie erwies sich GBR mit 10% HP-beta-CD als geeignetes Lö-sungsmittel für MMF. Die gewünschte Konzentration von 1% MMF war jedoch erst durch Erhitzen dieser Formulierung im Autoklaven (121° C, 200 kPa, 15 min) zu erzielen, wobei allerdings eine ca. 50%ige hydrolytische Spaltung des Prodrugs zum aktiven MPA erfolgte.

An Hand der ermittelten Daten der in vitro-Permeationsstudie kann davon ausgegangen werden, dass das Prodrug MMF keine Vorteile gegenüber MPA hinsichtlich der Verfüg-barkeit bei der topischen okularen Anwendung bietet. Aus einer 0.57%igen MMF-Lösung, die aus einer 1%igen MMF-Zubereitung durch Autoklavieren und damit verbundener Hydrolyse des Esters hervorging, gelangten kaum messbare Konzentrationen des Esters in die Akzeptor-kammer. Im Gegensatz dazu war MPA im Akzeptormedium zu detektieren (Peff = 5.48 x 10-6 cm/s).


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Die größere Bioverfügbarkeit von MMF gegenüber MPA bei oraler Applikation konnte für die Cornea nicht bestätigt werden, da die Mrel von MMF wahrscheinlich ein Limit für die Diffusion durch die Cornea darstellt.

Bei in vivo-Verteilungsstudien an Kaninchenaugen, durchgeführt in unserer Arbeitsgruppe [289], wurde eine größere MPA-Konzentration in der Cornea bei topischer Applikation von 1%iger MMF-Lösung gefunden als bei der Anwendung von MPA-Lösung gleicher Konzen-tration (Sörensen-Phosphat-Pufferlösung pH 7.4, 10% HP-beta-CD, Autoklavieren).

Resümee

Erstmalig wurden vergleichende in vitro-Permeationsstudien unter Nutzung mehrerer okularer Gewebe (Cornea, Sklera und Konjunktiva) sowie von Zellkulturen durchgeführt. Aus den Er-gebnissen kann geschlussfolgert werden, dass die Permeation eines Arzneistoffs nicht nur von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Pharmakons (VK, Mrel, pKa) abhängt, sondern in hohem Maße auch von den Formulierungsparametern (BAC, EDTA, pH, Tonizität) be-einflusst wird. Die Untersuchungen mit gelasertem Gewebe erbrachten darüber hinaus orien-tierende Aussagen über den Stofftransport nach invasiver Behandlung (z.B. PRK). Jedoch ist die Korrelierbarkeit mit in vivo-Resultaten im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht worden, so dass die vorliegenden Ergebnisse als Grundlage für Permeationsstudien am in vivo-Modell zu bewerten sind.


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Tue Sep 16 16:33:54 2003