Scholz, Martina: In vitro-Permeationsstudien von hydrophilen und lipophilen Arzneistoffen an okularen Geweben und Zellkulturen

In vitro-Permeationsstudien von hydrophilen und lipophilen Arzneistoffen an okularen Geweben und Zellkulturen
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Pharmazie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Martina Scholz,
geboren am 28.09.1971
in Boizenburg/Elbe

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. M. Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Sigrid Keipert
2. Prof. Dr. Uwe Pleyer
3. Prof. Dr. Andreas Langner

Tag der mündlichen Prüfung:


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [120] [121] [122] [123] [124] [125] [126] [127] [128] [129] [130] [131] [132] [133] [134] [135] [136] [137] [138] [139] [140] [141] [142] [143] [144] [145] [146] [147] [148] [149] [150] [151] [155] [156] [157] [158] [159] [160] [161] [162] [163] [164] [165] [166] [167] [168] [169] [170] [171] [172] [173] [174] [175] [176] [177] [178] [179]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteIn vitro-Permeationsstudien von hydrophilen und lipophilen Arzneistoffen an okularen Geweben und Zellkulturen
Widmung
Danksagung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 EINLEITUNG
2 PROBLEMSTELLUNG
3 THEORETISCHE GRUNDLAGEN
3.1Anatomie, Physiologie und Funktionalität des Auges
3.1.1Cornea
3.1.2Sklera
3.1.3Konjunktiva
3.2Arznei- und Hilfsstoffe
3.2.1Arzneistoffe
3.2.1.1Pilocarpin
3.2.1.1.1Eigenschaften
3.2.1.1.2Pharmakologie
3.2.1.2Diclofenac-Natrium
3.2.1.2.1Eigenschaften
3.2.1.2.2Pharmakologie
3.2.1.3Mycophenolatmofetil
3.2.1.3.1Eigenschaften
3.2.1.3.2Pharmakologie
3.2.2Hilfsstoffe
3.2.2.1Benzalkoniumchlorid (BAC)
3.2.2.1.1Eigenschaften
3.2.2.1.2Anwendung und Wirkungsweise
3.2.2.2Natriumedetat (EDTA)
3.2.2.2.1Eigenschaften
3.2.2.2.2Anwendung und Wirkungsweise
3.2.2.2.3Anwendungsbeispiele für BAC und EDTA in Augentropfen
3.2.2.3Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-beta-CD)
3.2.2.3.1Cyclodextrine allgemein
3.2.2.3.2HP-beta-CD in Ophthalmika
4 Ergebnisse und Diskussion
4.1Voruntersuchungen
4.1.1Löslichkeitsversuche
4.1.1.1Diclofenac-Na
4.1.1.2Mycophenolatmofetil
4.1.2Charakterisierung der Donatorlösungen
4.1.2.1Pilocarpinhydrochlorid-Lösungen
4.1.2.2Diclofenac-Natrium-Lösung
4.1.2.3Mycophenolatmofetil- und Mycophenolsäure-Lösung
4.1.2.4Verteilungskoeffizienten der Arzneistoffe
4.1.3Proteinbestimmung von okularen Geweben
4.1.3.1Allgemeines
4.1.3.2Schweinecornea und Schweinesklera
4.1.4Hydratationsstudien an okularen Geweben
4.1.4.1Allgemeines
4.1.4.2Schweinecornea
4.1.4.3Schweinesklera
4.1.5Wirkstoffpenetration
4.1.5.1Allgemeines
4.1.5.2Pilocarpin-HCl
4.1.5.3Diclofenac-Na
4.2In vitro-Wirkstoffpermeation
4.2.1Literaturübersicht zur okularen Permeabilität
4.2.1.1Corneale Permeabilität
4.2.1.2Sklerale Permeabilität
4.2.1.3Konjunktivale Permeabilität
4.2.2Permeationsmechanismen
4.2.2.1Parazelluläre Permeation
4.2.2.2Transzelluläre Permeation
4.2.3Effektiver Permeabilitätskoeffizient (Peff)
4.2.4Pilocarpin-HCl
4.2.4.1Corneale Pilocarpin-Permeation
4.2.4.2Sklerale Pilocarpin-Permeation
4.2.4.3Vergleich von P-HCl- und P-Base-Permeation
4.2.4.4Konjunktivale Pilocarpin-Permeation
4.2.4.4.1Bioelektrische Parameter
4.2.4.4.2Permeationsstudie
4.2.5Diclofenac-Na
4.2.5.1Corneale und sklerale Permeation
4.2.5.2Vergleich von D-Na- und P-HCl-Permeation
4.2.5.3Permeation durch eine synthetische Membran
4.2.6Mycophenolatmofetil
4.2.7Permeation durch gelaserte Schweinecornea
4.2.7.1Laserchirurgie
4.2.7.2Pilocarpin-HCl-Permeation
4.2.7.3Diclofenac-Na-Permeation
4.2.7.4Raster-Elektronenmikroskopie (REM)
4.3Zellkulturen
4.3.1Allgemeines
4.3.2Kaninchencornea-Epithelzellkultur (KCEZ)
4.3.2.1Bioelektrische Parameter
4.3.2.2Permeationsstudie
4.3.3Kaninchenkonjunktiva-Epithelzellkultur (KKEZ)
4.3.3.1Bioelektrische Parameter
4.3.3.2Permeationsstudie
5 Experimenteller Teil
5.1Substanzen
5.1.1Arzneistoffe
5.1.2Hilfsstoffe
5.1.3Weitere Chemikalien
5.1.4HPLC-Fließmittel
5.1.5Pufferlösungen
5.2Methoden
5.2.1Physikalisch-chemische Charakterisierung
5.2.1.1Löslichkeitsstudien
5.2.1.1.1Diclofenac-Na
5.2.1.1.2Mycophenolatmofetil
5.2.1.2Bestimmung der Oberflächenspannung und CMC1)
5.2.1.3Viskosität
5.2.1.4Dichte
5.2.1.5Brechungsindex
5.2.1.6Osmolalität
5.2.1.7pH-Wert
5.2.1.8Verteilungskoeffizient
5.2.2Gehaltsbestimmungen
5.2.2.1Pilocarpin-HCl
5.2.2.2Diclofenac-Na
5.2.2.3Mycophenolatmofetil und Mycophenolsäure
5.2.3Proteinbestimmung
5.2.3.1Präparation der Schweinecornea1)
5.2.3.2Präparation der Schweinesklera
5.2.3.3Proteinbestimmung nach Lowry1)
5.2.4Hydratationsstudien
5.2.5Penetrationsstudien
5.2.6Permeation durch isolierte Cornea/Sklera und Nephrophan®
5.2.6.1Permeationsapparatur1)
5.2.6.2Versuchsdesign
5.2.6.3Integritäts- und Vitalitätsprüfung von Schweinecornea
5.2.7Permeation durch isolierte Kaninchenkonjunktiva
5.2.7.1Gewebeisolierung und Permeationsapparatur
5.2.7.2Bioelektrische Messungen
5.2.7.3Permeationsstudien
5.2.8Permeation nach Excimer-Laser-Behandlung
5.2.8.1Excimer-Laser
5.2.8.2Lasern der Hornhaut
5.2.9Raster-Elektronenmikroskopie (REM)
5.2.9.1Aufbau und Funktion des Gerätes
5.2.9.2Probenpräparation1)
5.2.10Permeation durch Zellkulturen
5.2.10.1Kultivierung von Kaninchenkonjunktiva-Epithelzellkultur
5.2.10.2Kultivierung von Kaninchencornea-Epithelzellkultur
5.2.10.3Bioelektrische Messungen
5.2.10.4Permeationsstudien
5.2.11Statistik
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A Publikationen, die aus vorliegender Arbeit hervorgegangen sind:
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Pilocarpinsäure [%] in Cornea, Kammerwasser und Iris/Ziliarkörper nach topischer Applikation einer 0.01 M Pilocarpinlösung [67]
Tabelle 2: Anwendung von BAC und EDTA in Augentropfen [126], exklusive Filmbildner-präparate
Tabelle 3: Eigenschaften und Toxizität modifizierter beta-CDe [138]
Tabelle 4: In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur ophthalmologischen Anwendung von
Wirkstoff/HP-beta-CD Komplexen
Tabelle 5: Beispiele von CMC-Werten (experimentell ermittelt)
Tabelle 6: Geradenanstieg tan alpha, Korrelationskoeffizienten R2 und apparente Komplex-
stabilitätskonstanten KStab der Systeme MMF/HP-beta-CD und MPA/HP-beta-CD
Tabelle 7: Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen P-HCl-Lösungen
Tabelle 8: Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen D-Na-Lösung
Tabelle 9: Physikalisch-chemische Kenngrößen wässriger MMF/HP-beta-CD- und MPA/HP-beta-CD-Lösungen
Tabelle 10: Verteilungskoeffizienten VK (Octanol/GBR) für die angewendeten Arzneistoffe
Tabelle 11: Wassergehalt (WG) und Wasseraufnahme (WA) in [mg/mg Gewebe] von Schweinecornea (1) unbehandelt, (2) 50% Epithel und (3) ohne Epithel nach Inkubation in Wasser, GBR oder GBR/PG
Tabelle 12: Wassergehalt (WG) und Wasseraufnahme (WA) in [mg/mg Gewebe] von Schweinesklera nach Inkubation in Wasser, GBR oder GBR/PG
Tabelle 13: Permeationsdaten der 2%igen P-HCl -Lösungen für Schweinecornea
Tabelle 14: Permeationsdaten der 2%igen P-HCl-Lösungen für Schweinesklera
Tabelle 15: Permeationsdaten von P-HCl und P-Base durch Schweinecornea und -sklera
Tabelle 16: Bioelektrische Parameter isolierter Kaninchenkonjunktiva
Tabelle 17: Permeationsdaten der P-HCl-Lösungen durch Kaninchenkonjunktiva
Tabelle 18: Permeationsdaten der D-Na-Lösung durch Schweinecornea und -sklera
Tabelle 19: Permeationsdaten von D-Na und P-HCl aus GBR/PG durch Schweinecornea
Tabelle 20: Permeationsdaten der D-Na- und P-HCl-Lösungen durch Nephrophan®
Tabelle 21: Permeationsdaten von MPA aus einer MMF-Lösung 1% (= 0.43% MPA) und aus einer MPA-Lösung 0.74%
Tabelle 22: Permeationsdaten von 2%igen P-HCl-Lösungen durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke
Tabelle 23: Permeationsdaten der D-Na-Lösung durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke
Tabelle 24: Vorteile von Zellkulturen [344]
Tabelle 25: Nachteile von Zellkulturen [344]
Tabelle 26: Bioelektrische Parameter der cornealen Zellkultur
Tabelle 27: Permeationsparameter von P-HCl aus BR durch corneale Epithelzellkultur
Tabelle 28: Bioelektrische Parameter der konjunktivalen Zellkultur
Tabelle 29: Permeationsparameter von P-HCl aus BR durch konjunktivale Epithelzellkultur

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Aufbau des Augapfels und seiner Anhangsgebilde [29]
Abb. 2: Aufbau der Cornea [37]; Epi = Epithel, Endo = Endothel
Abb. 3: Seitenansicht eines Menschenauges [41]
Abb. 4: Sklerafaserbündel [50]
Abb. 5: Bindehautbereiche im menschlichen Auge [55]
Abb. 6: Zersetzung von Pilocarpin [61]
Abb. 7: A: weiter Kammerwinkel; B: enger Kammerwinkel; 1=Ziliarkörper, 2=Iris,
3=Trabekelmaschenwerk, 4=Schlemm‘scher Kanal, 5=Vene, 6=Hornhaut [69]
Abb. 8: Hemmung der Prostaglandinsynthese durch Pharmaka [83]
Abb. 9: Abbauprodukte von MMF [91]; 1=MPA, 2=MMF, 3=N-Oxid des MMF, 4=2-
Morpholino-ethanol, 5=MPA-Lactonanalogon, 6=MPA-Hydroxylactonanalogon, 7-
9=unbenannt
Abb. 10: Ablauf der Immunkaskade mit Angriffsorten von Ciclosporin und MMF [26],
Hemmung durch MMF
Abb. 11: Struktur eines EDTA-Metall(II)ion-Komplexes [60]
Abb. 12: Corneale Permeationswege für Wirkstoffe in Anwesenheit von CDen [141]; (Df )
freier Wirkstoff, (CDf) freies CD, (D.CD) Wirkstoff-CD-Komplex, (C)
Komponenten des Tränenfilms, (K) Komplexstabilitätskonstante
Abb. 13: Löslichkeitsverbesserung von D-Na in GBR (pH 7.4) mittels Solubilisatoren
Abb. 14: Löslichkeitsverbesserung von MMF in GBR (pH 7.4) mittels Solubilisatoren
Abb.15: Sättigungskonzentrationen von MMF, gemessen als unverändertes MMF und dem
Hydrolyseprodukt MPA nach Zusatz von HP-beta-CD
Abb. 16: Löslichkeit von MMF (links) und MPA (rechts) in GBR (pH 7.4) in Abhängigkeit von
der HP-beta-CD-Konzentration (nach Autoklavieren, 15 min, 200kPa, 121° C)
Abb. 17: Schema der Bewegung von Arzneistoffen und Augenflüssigkeiten und deren
Zusammensetzung im vorderen Bereich des Auges [34]
Abb. 18: Proteingehalt von Schweinecornea und -sklera [µg/mg Gewebe], n=12
Abb. 19: Schema der Wasseraufnahme und -abgabe in der Cornea (Endothel = Barriere und Pumpe) [38]
Abb. 20: Versagen der Endothelfunktion führt zur ungehinderten Flüssigkeitsaufnahme in das Stroma und Epithel [38]
Abb. 21: Hydratation von Schweinecornea (unbehandelt, 50% Epithel, ohne Epithel) nach Inkubation in Wasser, GBR bzw. GBR/PG, n=4, (*) p<0.05 verglichen mit SC
Abb. 22: Hydratation von Schweinesklera nach Inkubation in Wasser, GBR bzw. GBR/PG, n=4, (*) p<0.05 verglichen mit GBR
Abb. 23: Aufnahme von P-HCl in isolierte Schweinecornea und -sklera, n = 6, (*) p<0.05verglichen mit Sklera
Abb. 24: Aufnahme von D-Na in isolierte Schweinecornea und -sklera, n = 6, (*) p<0.05 verglichen mit Sklera
Abb. 25: Schematische Darstellung der okularen Absorption nach topischer okularer Arzneistoffadministration [195]
Abb. 26: Der parazelluläre Permeationsweg [242]
Abb. 27: Tight junction Struktur Modelle [200]; A: Fusionsmodell (Plasmamembranen angrenzender Zellen verschmelzen); B: integrierende Membranproteine sind Hauptstrukturelemente der Tight junctions
Abb. 28: Potentieller Mechanismus für eine passive transzelluläre Diffusion [251]
Abb. 29: Permeationsprofil von P-HCl durch Schweinecornea unter Einfluss von BAC und EDTA, n = 9-10
Abb. 30: Permeationsprofil von P-HCl durch Schweinesklera unter Einfluss von BAC und EDTA, n=12
Abb. 31: Vergleich der Permeation von P-Base und P-HCl durch Schweinecornea und -sklera,
n = 5 -12, (*) p<0.05 im Vergleich zu P-HCl
Abb. 32: Permeationsprofil von P-HCl 2% durch Kaninchenkonjunktiva, n=5-9
Abb. 33: Permeation von D-Na durch isolierte Schweinecornea und -sklera, n=11-12
Abb. 34: Permeation von P-HCl und D-Na aus GBR/PG durch Schweinecornea, n=10-12
Abb. 35: Peff von P-HCl und D-Na durch Nephrophan®, n=5
Abb. 36: Permeation von MPA aus einer MMF-Lösung 1% (= 0.43% MPA) und aus einer MPA-Lösung 0.74%, n = 9-10
Abb. 37: Permeation von P-HCl durch Schweinecornea mit unterschiedlichen Epitheldicken unter Einfluss von BAC und EDTA, n=8-13, (*) p<0.05 verglichen mit P-HCl 2% der jeweiligen Ablationsstufe (%-Angabe der Epithellaserung; o.E = ohne Epithel; o.B = ohne Bowman-Membran)
Abb. 38: Permeation von D-Na durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke, n=8-12, (*) p<0.05 verglichen mit unbehandelter SC
Abb. 39: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: nach Inkubation in GBR/0.01% BAC, Aufsicht; x 500
Abb. 40: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: nach Inkubation in GBR/0.01% BAC, Aufsicht; x 5000
Abb. 41: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: mit 75% Epithel, Querschnitt; x 50
Abb. 42: links: Schweinecornea mit 50%Epithel, rechts: mit 25% Epithel, Querschnitt; x 50
Abb. 43: Schweinecornea ohne Epithel, Querschnitt; x 50
Abb. 44: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: mit 50% Epithel, Querschnitt, x 1000
Abb. 45: links: Schweinecornea mit 75% Epithel, rechts: mit 50% Epithel, Aufsicht; x 5000
Abb. 46: links: Schweinecornea mit 25% Epithel, rechts: ohne Epithel, Aufsicht; x 5000
Abb. 47: Peff (Kolumne) durch corneale Epithelzellkultur und TEER (final) (Punkt), n=5-8, (*) p<0.05 verglichen mit Referenz (P-HCl 2%, pH 7.4, 300 mOsmol/kg)
Abb. 48: Peff (Kolumne) durch konjunktivale Epithelzellkultur und TEER (final) (Punkt), n=3-6, (*) p<0.05 verglichen mit Referenz (P-HCl 2%, pH 7.4, 300 mOsmol/kg)
Abb. 49: Permeationszelle
Abb. 50: Permeationsapparatur für Schweinecornea, -sklera und Nephrophan®
Abb. 51: Präparation von Kaninchenkonjunktiva [256], Pfeile kennzeichnen Schneiderichtung
Abb. 52: 6.5 mm Clear Transwell mit permeabler Filtereinlage [344]
Abb. 53: Peff von P-HCl durch Schweinecornea, -sklera und Kaninchenkonjunktiva, n = 5-12, (*) p<0.05 verglichen mit der jeweiligen 2%igen P-HCl-Lösung; A: Permeationsmodell und Provenienz der Gewebe identisch; B: anderes Modell und andereTierspezies
Abb. 54: Korrelation der Peff von P-HCl durch isolierte Gewebe und Zellkulturen, n=3-12, (*) p<0.05 verglichen mit isolierten Geweben
Abb. 55: Veränderung [%] der Peff von P-HCl durch corneale und konjunktivale Epithelzellkultur unter Einfluss unterschiedlicher Formulierungsparameter
Abb. 56: Permeation von D-Na (aus GBR/PG) und P-HCl (aus GBR) durch gelaserte Schweinecornea

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Tue Sep 16 16:33:54 2003