Interaktion von T-Zellen mit sinusoidalen Endothelzellen der Leber

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologin Arnhild Schrage
geb. am 26.01.1976 in Lippstadt

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Alf Hamann
2. Prof. Dr. Hans-Dieter Volk
3. PD Dr. Hans-Willi Mittrücker

eingereicht: 18.01.2006

Datum der Promotion: 07.07.2006

Zusammenfassung

Auch unter physiologischen Bedingungen finden sich T-Zellen und andere Leukozyten nicht nur in den Sinusoiden, sondern auch im Parenchym der Leber. Da die Leber u. a. verschiedene Aufgaben für das Immunsystem übernimmt (z. B. Deletion aktivierter T-Zellen, Induktion peripherer Toleranz), könnte die Akkumulation der T-Zellen in der Leber - neben der immunologischen Überwachung der Leber - Voraussetzung für ihre Modulation sein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Leber-sinusoidalen Endothelzellen (LSEC), der Barriere zwischen Blut und Leber-Parenchym, auf CD4⁺ T-Zellen untersucht. Zum einen zeigte sich, dass die LSEC sowohl die spontane Transmigration der T-Zellen, als auch ihre Chemotaxis zu CXCL9 und CXCL12 effizienter unterstützen als andere Endothelien. Eine endotheliale Aktivierung durch die Chemokine wurde als Mechanismus ausgeschlossen. Dagegen schien eine effiziente Präsentation der Chemokine auf der luminalen LSEC-Oberfläche nach Aufnahme von abluminal für die gesteigerte Transmigration der T-Zellen verantwortlich zu sein. Die LSEC könnten somit in vivo an der Rekrutierung von T-Zellen in die Leber beteiligt sein, indem sie eine rasche Wanderung der T-Zellen aus dem Blut ins Parenchym und möglicherweise auch zurück in die Zirkulation zulassen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die LSEC fähig sind, naive CD4⁺ T-Zellen in vitro Antigen-spezifisch zu aktivieren. Im Vergleich zu professionellen APZ war hierfür eine höhere Antigen-Dosis notwendig, die Expansion schwächer und es waren kaum Effektorzytokin-Produzenten detektierbar. Diese konnten jedoch durch Restimulierung mit professionellen APZ induziert werden (reversibler Phänotyp), was auf einen unreifen Differenzierungsstatus der T-Zellen schließen ließ. Es bleibt zu prüfen, in welchem Maße die Aktivierung naiver CD4⁺ T-Zellen durch LSEC in vivo stattfindet und diese durch LSEC aktivierten CD4⁺ T-Zellen funktionelle Bedeutung, z. B. regulatorische Kapazität, für das Immunsystem besitzen.

Eigene Schlagworte: Leber Sinusoidale Endothelzellen, CD4⁺ T-Zellen, Transmigration, Chemokin-Präsentation, Antigen-Präsentation, Zytokin-Produktion

Abstract

The liver plays a major role for the metabolism, but it is also of general importance for the immune system, e.g. for the deletion of activated T cells or the induction of peripheral tolerance. Under physiological conditions T cells and other leukocytes can be found in the liver, in the sinusoids as well as in the parenchyma. This hepatic accumulation of T cells might be due to immunosurveillance, but it would also be a prerequisite for modulation of T cells by hepatic cells. The present study investigated two different aspects of the interaction of liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), the barrier between the sinusoidal lumen and the hepatic parenchyma, and CD4⁺ T cells. In the first part of the study it could be demonstrated that LSEC support the spontaneous transmigration of CD4⁺ T cells as well as their chemotaxis more efficiently than other endothelial cells. Whereas a direct endothelial activation by chemokines could be excluded theefficient chemokine presentation at the luminal LSEC surface (after abluminal uptake) might be responsible for the enhanced T cell transmigration. LSEC might be involved in the recruitment of T cells by ingtransendothelial migration. The second part of the study focused on the characteristics of LSEC in the context of antigen presentation. LSEC were able to prime and expand naïve CD4⁺ T cells in vitro but less effective than professional APC as proven by weaker expansion of cells, a requirement for higher antigen concentration and the lack of cytokine producing T cells. The “immature effector” phenotype of the CD4⁺ T cells primed on LSEC was reversible since it could be overcome by restimulation on professional APC. In conclusion these data suggest that antigen presentation by LSEC results in activation but incomplete differentiation of CD4⁺ T cells.

Keywords: liver sinusiodal endothelial cells, CD4⁺ T cells, Transmigration, chemokine presentation, antigen presentation, cytokine production

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Transendotheliale Migration der Leukozyten
    • 1.1.1  Das Multi-Step-Modell
    • 1.1.2 An der Transmigration beteiligte Moleküle
      • 1.1.2.1  Selektine
      • 1.1.2.2 Integrine
      • 1.1.2.3 Chemokine
  • 1.2  Interaktion von CD4⁺ T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen
  • 1.3  Die Leber
    • 1.3.1  Die sinusoidalen Endothelzellen der Leber
    • 1.3.2 Rekrutierung von Lymphozyten in die Leber
    • 1.3.3 Induktion peripherer Toleranz in der Leber
• 2 Zielsetzung der Arbeit und Fragestellung
• 3 Material und Methoden
  • 3.1  Material
    • 3.1.1  Geräte und Materialien
    • 3.1.2 Reagenzien
    • 3.1.3 Antikörper
    • 3.1.4 Versuchstiere
    • 3.1.5 Medien und Puffer
  • 3.2 Methoden
    • 3.2.1  Immunhistologie
    • 3.2.2 Isolation verschiedener Zellpopulationen
      • 3.2.2.1  Gewinnung von Lymphozyten aus Lymphknoten und Milz
      • 3.2.2.2 Isolation von hepatischen Lymphozyten und LSEC
    • 3.2.3 Kultivierung der Endothelzellen
    • 3.2.4 FACS-Färbung und -Analyse
      • 3.2.4.1  Oberflächenfärbung
      • 3.2.4.2 Färbung von Zellen aus murinem Blut
      • 3.2.4.3 Intrazelluläre Färbung von Zytokinen nach PMA/IM-Stimulation
      • 3.2.4.4 Messung und Analyse
    • 3.2.5 CFSE-Markierung
    • 3.2.6  In vitro Generierung von Th1-Zellen
    • 3.2.7 Generierung von Knochenmarkschimären
    • 3.2.8 Antigen-spezifische Kokultur von CD4⁺ T-Zellen mit LSEC oder Milz-APZ
    • 3.2.9 Transendothelialer Migrationsassay
      • 3.2.9.1  Kultivierung der Endothelzellen auf den Transwell^®-Einsätzen
      • 3.2.9.2 Isolation und Transmigration der T-Zellen
      • 3.2.9.3 Quantifizierung der transmigrierten T-Zell-Populationen
    • 3.2.10 Fluoreszenzmikroskopie
    • 3.2.11 Zeitrafferaufnahmen dertransendothelialen Migration
      • 3.2.11.1  Kultivierung der Endothelzellen auf µ-Slides VI
      • 3.2.11.2 Isolation und Behandlung der CD4⁺ T-Zellen
      • 3.2.11.3 Aufnahme und Analyse
    • 3.2.12 Graphische Darstellung und Statistik
• 4 Ergebnisse
  • 4.1  Ex vivo Isolation der LSEC mit Hilfe des Antikörpers ME-9F1
  • 4.2 Einfluss der LSEC auf die Transmigration von CD4⁺ T-Zellen
    • 4.2.1  Gesteigerte Transmigration von CD4⁺ T-Zellen in Anwesenheit der LSEC
    • 4.2.2 Effekt der LSEC auf die Transmigration verschiedener CD4⁺-Populationen
    • 4.2.3 Kein erhöhter chemotaktischer Effekt von CCL20, CCL21 und CXCL16 in Anwesenheit der LSEC
    • 4.2.4 Mechanismus der gesteigerten Transmigration in Anwesenheit der LSEC
      • 4.2.4.1  Endotheliale Aktivierung durch CXCL9 und CXCL12
      • 4.2.4.2 Konstitutive ICAM-1-Expression auf LSEC
      • 4.2.4.3 Chemokin-Präsentation auf der Oberfläche der LSEC
  • 4.3 Antigen-abhängige Aktivierung naiver CD4⁺ T-Zellen durch LSEC
    • 4.3.1  Aktivierung naiver CD4⁺ T-Zellen durch LSEC bei hohen Antigen-Dosen
    • 4.3.2 Myeloide APZ in der LSEC-Fraktion
      • 4.3.2.1  Anteil myeloider APZ in der LSEC-Fraktion
      • 4.3.2.2 Knochenmarkschimären als LSEC-Quelle ohne myeloide MHC-II-Expression
    • 4.3.3 Proliferation naiver CD4⁺ T-Zellen nach Antigen-Präsentation durch LSEC
    • 4.3.4 Keine Differenzierung in Effektorzellen nach Antigen-Präsentation durch LSEC
    • 4.3.5 Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen unbeeinflusst vom Stimulationsgrad der LSEC
    • 4.3.6 Induktion eines undifferenzierten, reversiblen Phänotyps nach Antigen-Präsentation durch LSEC
• 5 Diskussion
  • 5.1  Ex vivo Isolation der LSEC mit Hilfe des Antikörpers ME-9F1
  • 5.2 Einfluss der LSEC auf die Transmigration von CD4⁺ T-Zellen
    • 5.2.1  Erhöhte Transmigration durch LSEC im Vergleich zu anderen Endothelien
    • 5.2.2 Mechanismus für die erhöhte Transmigration von CD4⁺ T-Zellen in Anwesenheit der LSEC
  • 5.3 Antigen-abhängige Aktivierung naiver CD4⁺ T-Zellen durch LSEC
    • 5.3.1  Ausschluss kontaminierender professionelle APZ
    • 5.3.2 Antigen-Dosis abhängige Expansion naiver CD4⁺ T-Zellen durch LSEC
    • 5.3.3 Nach Aktivierung durch LSEC keine Differenzierung in IFN-γ-, IL-4- oder IL-10-Produzenten
  • 5.4  Schlussfolgerung und Ausblick
• Referenzen
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Publikationsliste
• Lebenslauf
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: für Zellisolation bzw. im Durchflusszytometer verwendete Antikörper
• Tabelle 2: verwendete Fluorochrome mit ihren Extinktions- und Emissionsmaxima

Bilder

• Abb. 1: Mehr-Schritt-Modell der Leukozyt/Endothel-Erkennung und Extravasation aus dem Blut. Die sequentiell erfolgenden Schritte Rollen entlang des Endothels, Aktivierung, feste Adhäsion und transendotheliale Migration und die dabei notwendigen Rezeptor-Ligand-Interaktionen ermöglichen das spezifische Homing bzw. Rekrutieren bestimmter Leukozyten-Populationen. Abbildung nach Schaerli & Moser, 2005 [2].
• Abb. 2: Interaktionen zwischen T-Zelle und APZ. Neben dem TZR/Antigen/MHC-II-Komplex erfordert die T-Zell-Aktivierung weitere Interaktionen zwischen akzessorischen Molekülen der APZ und ihre zugehörigen Rezeptoren auf der T-Zell-Seite.
• Abb. 3: Die Feinbau der Leber. Die Leber hat mehrere Leberlappen (A), die sich aus 1-2 mm großen Leberläppchen (Lobuli) zusammensetzten. An den Eckpunkten benachbarter Lobuli liegen die Periportalfelder, in denen jeweils ein Ast der Leberarterie, der Pfortader und ein Gallengang verläuft (B). Zwischen den Hepatozyten liegen die Kapillaren der Leber, die Sinusoide. Diese transportieren das Blut aus der Pfortader und der Arterie in Richtung Zentrum der Lobuli, wo es von einer Zentralvene aufgenommen wird. Die Venen vereinigen sich und das But verlässt die Leber letztendlich über die Lebervene. Die Sinusoide der Leber werden von spezialisiertem Endothel ausgekleidet und sind durch den Disse´schen Raum vom Parenchym getrennt (C). Im Lumen der Sinusoide sind die Leber-residenten Makrophagen, die Kupffer Zellen, angesiedelt, im Disse´schen Raum die Ito Zellen. Bildnachweis: A: http://www.wip.villa-bosch.de/PatInf/dr_topf/Galle anatomie.htm, B: http://www.niaaa.nih.gov/gallery/liver/lobulep295.htm, C: nach Lalor & Adams, 2002 [59].
• Abb. 4: Quantifizierung der transmigrierten T-Zellen. Die transmigrierten Zellen wurden geerntet, mit Fluoresbrite™ Beads versetzt und im Durchflusszytometer über FSC/SSC (A) und die eingesetzten Fluoreszenz-konjugierten Antikörper (B) detektiert. Aus der absoluten Zahl der Zellen (R1*R2) und der der Fluoresbrite™ Beads (C: R3) in den Proben sowie im Input ließ sich dann die Transmigrationsrate berechnen (D). Hierbei ist es nicht notwendig, die absolute Zahl der Beads zu kennen, da dieser Wert in der Gleichung 2 in Zähler und Nenner erscheint, wenn Gleichung 1 und 2 kombiniert werden.
• Abb. 5: Detekion des Endothels mit Hilfe des ME-9F1 auf Kryoschnitten von Leber, Niere und Milz. Auf Kryoschnitten von muriner Leber, Niere und Milz wurde das Endothel nach Inkubation mit dem Antikörper ME-9F1 und anti-Ratte-Peroxidase über Zugabe des Peroxidase-Substrats detektiert. Färbungen ohne den Primär-antikörper dienten als Negativkontrollen. Zusätzlich wurden mit Hämatoxylin alle Zellkerne gefärbt. Anschließend wurden am Mikroskop Dias mit 20xVergrößerung aufgenommen.
• Abb. 6: Detektion der LSEC im Durchflusszytometer. Nach Collagenase-Verdau der Leber und einem Ein-Schritt-Gradienten konnten die LSEC in der nicht-parenchymatischen Fraktion der Leber mit dem Antikörper ME-9F1 detektiert werden; der Standardmarker für Endothel Meca32 zeigte eine deutliche Kofärbung (A). Der Antikörper ME-9F1 war auch in der magnetischen Sortierung verwendbar (B): Nach Inkubation der nicht-parenchymtischen Fraktion der Leber mit dem Antikörper ME-9F1-FITC und mit anti-FITC-MicroBeads wurden die Endothelzellen in der Positivfraktion auf > 90 % angereichert. Die Reinheit der LSEC-Isolation wurde über die spezifische Aufnahme von Fluoreszenz-gekoppeltem-AcLDL nach über-Nacht-Kultur im Durchflußzytometer kontrolliert (C). Die Prozentangaben sind repräsentative Werte.
• Abb. 7: Transmigration von CD4⁺ T-Zellen in Anwesenheit verschiedener Endothelien im Vergleich zum Endothel-freien System. Die ex vivo isolierten LSEC sowie die Kontroll-Endothelien bEND5 und mlEND wurden auf FN-beschichteten Transwell^®-Einsätzen kultiviert; als Kontrolle dienten nur FN-beschichtete Einsätze. Die spontane Transmigration (A) und die Chemotaxis zu CXCL12 (B) von ex vivo isolierten CD4⁺ T-Zellen der Milz wurde in An- und in Abwesenheit der verschiedenen Endothelzellen quantifiziert. Dazu wurden die transmigrierten T-Zellen nach 90 min Migrationszeit geerntet, mit Fluoresbrite™ Beads versetzt und nach Oberflächenfärbung im Durchflusszytometer analysiert. Über die Zahl der Zellen und der Fluoresbrite™ Beads in den Proben und im Input ließ sich dann die Migrationsrate berechnen. Die Diagramme zeigen Mittelwert (MW) und Standardabweichung ( SD) von mindest. 4 unabhängigen Experimenten mit n.s. = nicht signifikant und ** = p < 0,01. Nach dem Experiment wurden die Endothelzellen auf den Transwell^®-Einsätzen mit Giemsa gefärbt und ihr Aussehen am Mikroskop kontrolliert (C).
• Abb. 8: Adhäsion und Migration von CD4⁺ T-Zellen auf LSEC bzw. bEND5. LSEC und bEND5 wurden auf FN-beschichteten µ-slides VI über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag wurden CD4⁺ T-Zellen aus der Milz isoliert, auf die Endothel-Monolayer, die zuvor mit oder ohne CXCL12 inkubiert worden waren, gegeben und im Phasenkontrast beobachtet. Zur Berechnung der Adhäsion der T-Zellen an die Endothelien wurden die T-Zellen auf den LSEC bzw. bEND5 vor und nach Waschen gezählt. Dann wurden die T-Zellen 10 min lang auf den Endothelien gefilmt und ihre Bewegungen anschließend im Zeitraffer analysiert: T-Zellen, die nach der Adhäsion ans Endothel abflachten und auf der Oberseite des Endothels um mehr als einen ½ Zelldurchmesser wanderten, galten als „mobil“. Wanderten die Zellen unter das Endothel bzw. zurück an die Oberseite, wurden sie als „transmigrierend“ definiert. Neben repräsentativen Aufnahmen zur Bestimmung der Adhäsion (A) ist beispielhaft die Transmigration einer CD4⁺ T-Zelle durch einen LSEC-Monolayer dargestellt (weißer Pfeil) (B). Die Diagramme zur Adhäsion, Mobilität und Transmigration (C) zeigen MW und SD von drei unabhängigen Experimenten.
• Abb. 9: Transmigration von naiven und Effektor/Memory CD4⁺ T-Zellen zu CXCL12 und CXCL9 in An- und Abwesenheit der LSEC. LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell^®-Einsätzen kultiviert, als Kontrolle dienten nur FN-beschichtete Einsätze. Am nächsten Tag wurde die Transmigration von naiven und Effektor/Memory CD4⁺ T-Zellen zu CXCL12 und CXCL9 untersucht. Dazu wurden naive und Effektor/Memory CD4⁺ T-Zellen mit dem Marker CD45RB unterschieden (A) und die Transmigrationsraten wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert. Die Diagramme zeigen MW und SD von 8-18 unabhängigen Experimenten mit * = p < 0,05 und ** = p < 0,01.
• Abb. 10: Transmigration verschiedener Zytokin-Produzenten zu CXCL12 und CXCL9 in An- und Abwesenheit der LSEC. LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell^®-Einsätzen kultiviert, als Kontrolle dienten nur FN-beschichtete Einsätze. Nach Isolation von CD62L^low angereicherten CD4⁺ T-Zellen aus der Milz wurden die Transmigrationsraten von IFN-γ-, IL-4- und IL-10- produzierenden CD4⁺ T-Zellen zu CXCL12 und CXCL9 in An- und Abwesenheit der LSEC untersucht. Dazu wurden die migrierten T-Zellen nach PMA/IM-Stimulation neben CD4 intrazellulär für IFN-γ, IL-4 und IL-10 gefärbt und im Durchflusszytometer analysiert (A). Zusätzlich wurden – wie in Abb. 7 beschrieben – Ansätze zur Quantifizierung mitgeführt. Über den Anteil der CD4⁺ T-Zellen ließ sich dann die Transmigration der Zytokin-Produzenten (B-D) sowie der „Nicht-Produzenten“ (E) berechnen. Die Diagramme zeigen MW und SD von 3-5 unabhängigen Experimenten.
• Abb. 11: Transmigration der CD4⁺ T-Zellen zu CCL20 in An- und Abwesenheit von LSEC. LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell^®-Einsätzen kultiviert, als Kontrolle dienten nur FN-beschichtete Einsätze. Am nächsten Tag wurde die Transmigration von naiven und Effektor/Memory CD4⁺ T-Zellen aus Milz (A) und Leber (B) zu CCL21 untersucht und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert. Die Einteilung in naive und Effektor/Memory Zellen erfolgte wie in Abb. 9 beschrieben mit dem Marker CD45RB. Das Diagramm zeigt MW und SD eines repräsentativen von zwei unabhängigen Experimenten.
• Abb. 12: Unveränderte Transmigration von CD45RB^low CD4⁺ T-Zellen zu CXCL9 durch CXCR3^-/--LSEC im Vergleich zur Migration durch wt-LSEC. LSEC wurden aus wt- bzw. CXCR3^-/--Mäusen isoliert und auf FN-beschichteten Transwell^®-Einsätzen kultiviert. Am nächsten Tag wurde die Transmigration von CD45RB^low CD4⁺ T-Zellen aus wt-Milzen zu CXCL9 untersucht und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert (A). Zusätzlich wurde die transendotheliale Migration von CD45RB^low CD4⁺ T-Zellen aus CXCR3^-/--Milzen zu CXCL9 analysiert (B). Die Diagramme zeigen MW und SD von 3-9 unabhängigen Experimenten.
• Abb. 13: U nveränderte Transmigration der CD4⁺ T-Zellen zu CXCL12 nach Vorbehandlung der LSEC mit PTX. LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell^®-Einsätzen kultiviert und am nächsten Tag 2 h mit oder ohne PTX bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Transmigration von CD4⁺ T-Zellen in An- und Abwesenheit der LSEC untersucht und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert (A). Die Aktivität des PTX wurde im Endothel-freien Transmigrationsassay durch Vorbehandlung der transmigrierenden CD4⁺ T-Zellen mit steigenden PTX-Konzentrationen überprüft (B). Die Diagramme zeigen MW und SD eines repräsentativen von zwei unabhängigen Experimenten.
• Abb. 14: Kein drastischer Einfluß der ICAM-1-Expression auf LSEC auf die Transmigration von CD4⁺ T-Zellen. LSEC wurden aus wt- oder aus ICAM-1^-/--Mäusen isoliert und auf FN-beschichteten Transwell^®-Einsätzen kultiviert. Am nächsten Tag wurde die Transmigration von CD4⁺ T-Zellen aus der Milz durch LSEC aus wt- und aus ICAM-1^-/--Mäusen untersucht und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert. Das Diagramm zeigt MW und SD von mindest. 4 unabhängigen Experimenten mit n.s. = nicht signifikant.
• Abb. 15: Unveränderte Transmigration der CD4⁺ T-Zellen nach Vorbehandlung der LSEC mit Heparinase I. Die LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell^®-Einsätzen kultiviert und am nächsten Tag mit oder ohne Heparinase I (Hep-I) für 2 h bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Transmigration von CD4⁺ T-Zellen im Endothel-freien System und durch Hep-I-behandelte bzw. durch unbehandelte LSEC untersucht und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert. Das Diagramm zeigt MW und SD von drei unabhängigen Experimenten.
• Abb. 16: Gesteigerte Transmigration der CD4⁺ T-Zellen nach Vorinkubation der LSEC mit CXCL12. Die LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell^®-Einsätzen kultiviert und am nächsten Tag entweder von oben oder von unten für 2 h mit 50 nM CXCL12 inkubiert. Die spontane Transmigration von CD4⁺ T-Zellen wurde in Anwesenheit dieser vorbehandelten LSEC mit der durch unbehandelte LSEC ohne Chemokin bzw. mit der Chemotaxis zu CXCL12 verglichen und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert. Das Diagramm zeigt MW und SD von 4-5 Experimenten mit n.s. = nicht signifikant und ** = p < 0,01.
• Abb. 17: Mittlere Zellteilungsrate der CD4⁺ T-Zellen an Tag 3 und 6 der Kokultur mit LSEC oder Milz-APZ und verschiedenen Antigen-Dosen. CFSE-markierte OVA-spezifische naive CD4⁺ T-Zellen aus DO11.10-Mäusen wurden mit verschiedenen OVA-Peptid-Konzentrationen in Anwesenheit von LSEC oder CD90^- Milz-APZ aus wt-Mäusen kultiviert. Die Proliferation der T-Zellen wurde über das CFSE-Profil am Durchflusszytometer detektiert (A) und die mittleren Zellteilungsraten nach Kokultur mit LSEC oder Milz-APZ an Tag 3 (B) und Tag 6 (C) miteinander verglichen. Die Diagramme zeigen die Werte von 5-6 unabhängigen Experimenten mit ** = p < 0,01.
• Abb. 18: Depletion endogener professioneller APZ und Rekonstitution mit MHC-II^-/--Knochenmark. 6 Wochen nach Bestrahlung und Rekonstitution mit MHC-II^-/--Knochenmark wurde den C57Bl/6-Rezipienten Blut entnommen und die Menge an MHC-II⁺ und CD4⁺ Zellen analysiert (A). 2-3 Wochen später wurden bei Milz- und Leberzellen Endothelzellen über den Antikörper ME-9F1 sowie MHC-II⁺ Zellen detektiert (B). Zellen von C57Bl/6- bzw. MHC-II^-/--Mäusen dienten als Positiv- bzw. Negativkontrollen. Zur Überprüfung der funktionellen MHC-II-Expression wurden CD90^- Milzzellen der KMCh zur Antigen-spezifischen in vitro Stimulation CFSE-markierter OVA-spezifischer naiver CD4⁺ T-Zellen eingesetzt. An Tag 3 nach Kokultur mit wt-, KMCh- oder MHC-II^-/--Milzzellen wurde die Proliferation über den GeoMean der CFSE-Fluoreszenz-intensität detektiert (C). Mit dem GeoMean der Negativkontrolle (Kokultur ohne Antigen-Zugabe) = 100 % wurde anschließend der relative GeoMean nach Kokultur mit den verschiedenen Milzzellen berechnet und die Proliferation auf KMCh-Milzzellen mit der auf wt- und MHCII^-/--Zellen verglichen (D). Es gilt n.s. = nicht signifikant und ** = p < 0,01.
• Abb. 19: Proliferation und IL-2-Produktion naiver CD4⁺ T-Zellen nach Antigen-spezifischer Kokultur mit LSEC aus KMCh. CFSE-markierte OVA-TZR transgene naive CD4⁺ T-Zellen wurden aus OT-II-Mäusen isoliert und mit 5 µg/ml OVA-Peptid und LSEC bzw. CD90^- Milz-APZ aus C57Bl/6-Mäusen oder KMCh kultiviert. Nach 6 Tagen wurde das Maß der Proliferation über das CFSE-Profil (A) und über die Zellzahl (B) sowie die IL-2-Produktion (C) nach PMA/IM-Restimulation und intrazellulärer Färbung am Durchfluss-zytometer bestimmt. Die Dot Plots zeigen repräsentative CFSE-Profile. Das Diagramm zur Zellzahl zeigt MW und SD von 6 Experimenten, das Diagramm zur IL-2-Produktion MW und SD von 5-7 Experimenten mit n.s. = nicht signifikant, * = p < 0,05 und ** = p < 0,01.
• Abb. 20: Fehlenden Expression von IFNγ, IL-4 und IL-10 nach Antigen-spezifischer Kokultur mit LSEC. CFSE-markierte OVA-spezifische naive CD4⁺ T-Zellen wurden aus OT-II-Mäusen isoliert und für 6 Tage mit 5 µg/ml OVA-Peptid und LSEC bzw. CD90^- Milz-APZ aus C57Bl/6-Mäusen oder KMCh kultiviert. Nach PMA/IM-Restimulierung wurde intrazelluläres IFN-γ, IL-4 und IL-10 am Durchflusszytometer detektiert.  Die Diagramme zeigen MW und SD von 5-7 unabhängigen Experimenten mit n.s. = nicht signifikant und ** = p < 0,01.
• Abb. 21: Trotz Stimulation der LSEC unveränderter Phänotyp der naiven CD4⁺ T-Zellen nach Antigen-spezifischer Kokultur. LSEC wurden aus C57Bl/6-Mäusen oder KMCh isoliert und mit 10 ng/ml IFN-γ und 20 ng/ml TNF-α für 24 h inkubiert. Die Expression von MHC-II und ICAM-1 auf unbehandelten und stimulierten LSEC wurde im Durchflusszytometer analysiert (A). Nach Kokultur von CFSE-markierten OVA-spezifischen naiven CD4⁺ T-Zellen aus OT-II-Mäusen mit diesen LSEC und 5 µg/ml OVA-Peptid wurde an Tag 6 der Kokultur die Zellzahl der CD4⁺ T-Zellen (B) und deren Expression von IL-2 (C) und IFN-γ (D) nach PMA/IM-Restimulation ermittelt. Die Daten eines repräsentativen von 4 unabhängigen Experimenten sind dargestellt.
• Abb. 22: Reversibler Phänotyp bei naiven CD4⁺ T-Zellen nach Aktivierung durch LSEC. CFSE-markierte OVA-TZR transgene naive CD4⁺ T-Zellen aus DO11.10-Mäusen wurden mit 5 µg/ml OVA-Peptid und LSEC oder CD90^- Milz-APZ aus wt-Mäusen kultiviert. Nach 6 Tagen wurden die T-Zellen abgeerntet und mit 5 µg/ml OVA-Peptid und frisch isolierten LSEC bzw. Milz-APZ erneut kultiviert: CD4⁺ T-Zellen, die zuvor von LSEC aktiviert worden waren, wurden für weitere 6 Tage mit Milz-APZ kultiviert und vice versa. An Tag 0, 6 und 12 wurde nach PMA/IM-Restimulation nach intrazellulärer Färbung der Anteil an IFN-γ-Produzenten bestimmt. Das Diagramm zeigt MW und SD von 12 unabhängigen Experimenten an Tag 6 und von 5 unabhängigen Experimenten an Tag 12 mit * = p < 0,05 und ** = p < 0,01.
• Abb. 23: Modell zur effizienten Chemokin-Präsentation durch die LSEC nach Middleton et al., 2002. Chemokine, die sich abluminal der LSEC befinden (A), werden von den LSEC aufgenommen und in Caveolae transzytiert; ein Prozess, der die Bindung an Glykosaminoglykane (GAGs) beinhaltet. Auf der luminalen Seite werden die Chemokine dann auf den Spitzen endothelialer Mikrovilli effizient präsentiert (B). Nach Interaktion mit Chemokinrezeptoren auf der T-Zelloberfläche kommt es zur Integrin-Aktivierung und fester Adhäsion, was in effizienter Transmigration der T-Zellen durch die LSEC resultiert.
• Abb. 24: Unvollständige Differenzierung naiver CD4⁺ T-Zellen nach Aktivierung durch LSEC. Starke stimulatorische Signale induzieren Milz-APZ die Proliferation naiver CD4⁺ T-Zellen (T_n) sowie ihre Differenzierung zu IFN-γ produzierende Effektorzellen (A). Dagegen proliferieren durch LSEC aktivierte naive CD4⁺ T-Zellen aufgrund der schwachen Stimulation geringer und weisen einen unreifen Differenzierungsstatus auf (B).