3 Material und Methoden

↓17

3.1  Material

3.1.1  Geräte und Materialien

µ-Slide VI flow through

Ibidi GmbH, Integrated BioDiagnostics, München

autoMACS

Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach

Brutschrank

Binder, Tuttlingen

Deckgläser, 24 x 50 mm

Menzel-Gläser, Braunschweig

Durchflusszytometer FACSCalibur®, LSR-I®

Becton Dickinson, Heidelberg

Einmal-Spritzen und -Kanülen

B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Gammabestrahlungsanlage Biobeam 2000

STS Steuerungstechnik und Strahlenschutz GmbH, Braunschweig

Heizplatte (inkl. Magnetrührer) Ikamag RCT

Janke & Kuntzel, Staufen

HSE Temperaturregler mit Anzeige

HugoSachs Elektronik, March-Hugstetten

Kryostat Microm HM500OM

Carl Zeiss AG, Oberkochen

Laminar-Flow-Werkbank Herasafe HS18

Kendro Laboratory Products, Hanau

MACS-Säulen, -Magneten, -Ständer

Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach

Mikroskop für Zellkultur

Helmut Hund GmbH, Wetzlar

Mikroskop Leica DM IRE2

Leica Microsystems, Wetzlar, Germany

Neubauer Zählkammer

Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen

Objektträger, 76 x 26 mm

R. Langenbrinck, Teningen

Photomikroskop Axiophot

Carl Zeiss, Oberkochen

Prä-Separationsfilter

Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach

Rotlichtlampe Osram Theratherm, 250 W

Osram, München

Rundsieb Rotilabo®

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Schüttler (TH 25)

Edmund Bühler, Tübingen

TissueTek® Cryomold®, intermediate

Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, NL

Transwell®-Einsätze für 24-Loch-Platten (5 µm Porendurchmesser)

Corning Costar über WCP, Berlin

Zellkulturgefäße, -platten

Nunc oder Corning Costar über WCP, Berlin

Zellsieb (70 µm Nylon)

BD Falcon™ über WCP, Berlin

Zentrifuge Heraeus Megafuge 1.0R

Kendro Laboratory Products, Hanau

3.1.2 Reagenzien

↓18

β-Mercaptoethanol (50 mM)

Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Accutase™

Innovative Cell Technologies, Inc., San Diego, CA, USA

Aceton

J. T. Baker, Mallinckrodt, Deventer, NL

AcLDL-BODIPY® FL

Molecular Probes, Leiden, NL

Antiinfektivum Baytril®, 2,5 %

Bayer Vital GmbH, Leverkusen

Bovines Serumalbumin (BSA), Fraktion V

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Brefeldin A

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

5-,6-Carboxyfluorescein-diacetat- succinimidylester (CFSE)

Molecular Probes, Leiden, NL

Chemokine (murines CCL20, CCL21, CXCL9, CXCL12, CXCL16)

R&D Systems, Wiesbaden

Collagenase Typ IV

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

DNase I

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Diamidinophenylindol (DAPI)

Molecular Probes, Leiden, NL

Diethylether

Merck KgaA, Darmstadt

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Merck KgaA, Darmstadt

Dulbecco´s Modified Eagle Medium (D-MEM) + 4500 g/l Glucose + L-Glutamin + Pyruvat

Invitrogen GmbH, Karlruhe

Entellan® (Schnelleindeckmittel für die Mikroskopie)

Merck KgaA, Darmstadt

Ethanol

J. T. Baker, Mallinckrodt, Deventer, NL

Fetales Kälberserum (FCS), hitze-inaktiviert für 30 min bei 56°C

Biochrom AG, Berlin

Fibronektin (murin, human, bovin)

Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Fluoresbrite™ plain YG 20.0 micron microspheres

Poysciences, Inc., Warrington, PA, USA

Formaldehylösung (min. 37 %)

Merck KgaA, Darmstadt

Fluoromount-G™

Biozol Diagnostica GmbH, Eching

Giemsa Stain Stock Solution (0,4 %)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Hämatoxylin

Merck KgaA, Darmstadt

Heparinase I aus Flavobacterium heparinum

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Heparin

Biochrom AG, Berlin

HEPES (1 M)

Biochrom AG, Berlin

Histopaque®-1083

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Hoechst 33342

Molecular Probes, Leiden, NL

Hühnereiweißalbumin (OVA), Grad V

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

IFN-γ (murin, rekombinant)

R&D Systems, Wiesbaden

IL-12 (murin, rekombinant)

R&D Systems, Wiesbaden

Ionomycin Cacium Salt

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Kaisers Glyceringelatine f. d. Mikroskopie

Merck KgaA, Darmstadt

L-Glutamin (200 mM)

Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Metrizamid, Grad 1

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

MicroBeads (anti-FITC und anti-PE, anti-Maus-CD62L, -CD4, -CD90)

Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach

Natrium-Pyruvat (100 mM)

Biochrom AG, Berlin

Nicht-essentielle Aminosäuren (MEM NEAA)

Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Novalyse

Dianova GmbH, Hamburg

NycoPrep™ Universal

Axis-Shield, Oslo, Norwegen

OVA-Peptid
(Sequenz: 323ISQAVHAAHAEINEAGR393)

Institut für Biochemie, HU Berlin

Paraformaldehyd (PFA)

Merck KgaA, Darmstadt

Penicillin/Streptomycin
(10.000 U/10000 μg/ml)

Biochrom AG, Berlin

Pertussis Toxin aus Bordetella pertussis

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)

PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich

Propidiumiodid (PI)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Ratten IgG (ChromePure, whole molecule)

Dianova GmbH, Hamburg

Rosewell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640 + GlutaMAX-I™

Invitrogen GmbH, Karlsruhe

RPMI 1640 ohne Phenolrot

Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Saponin

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Sigma FAST DAB Peroxidase Substrate Tablet Sets

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Tissue-Tek® O.C.T. Compound

Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, NL

TNF-α (murin, rekombinant)

ImmunoTools GmbH, Friesoythe

Trypan-Blau (0,4 %)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

TSA™ Fluorescence Systems Kit

NEN™ Life Science Products, Boston, USA

3.1.3 Antikörper

Für die Immunhistologie wurden Peroxidase gekoppeltes Maus-anti-Ratten Immunglobulin (IgG) von Dianova GmbH, Hamburg und anti-Fluorescein-POD (Fab-Fragment) von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim verwendet. Beim Panning wurde u. a. Kaninchen-anti-Ratten IgG (polyklonal, kreuzreaktiv zu Maus IgG) von DakoCytomation, Hamburg eingesetzt. Weitere Antikörper, die beim Panning, bei magnetischer Sortierung und im Durchflusszytometer eingesetzt wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die verwendeten Fluorchrome finden sich in Tabelle 2.

Tabelle 1: für Zellisolation bzw. im Durchflusszytometer verwendete Antikörper

↓19

Um digoxygenierte oder biotinylierte Antikörper zu detektieren, wurden anti-Digoxygenin-Antikörper (DRFZ, Berlin) oder Fluoreszenz-konjugiertes Streptavidin (BD, Heidelberg) eingesetzt. Die Isotypkontrollen stammen ebenfalls von BD, Heidelberg.

Tabelle 2: verwendete Fluorochrome mit ihren Extinktions- und Emissionsmaxima

Fluoreszenzkonjugat

Extinktionsmaximum
(λ in nm)

Emissionmaximum
(λ in nm)

APC (Allophycocyanin)

650

660

BODIPY® FL

503

512

Cy5 (Indodicarbocyanin)

650

670

Cychrome

480; 565; 649

670

DAPI

340

488

FITC (Fluoreszein-Isothiozyanat)

495

519

Hoechst 33342

355

465

PE (R-Phycoerythrin)

480; 565

613

PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein)

490

675

PI

550

650

3.1.4 Versuchstiere

Es wurden Mäuse zur Organentnahme und Isolierung von Lymphozyten bzw. Endothelzellen verwendet, die per Genickbruch getötet wurden. Die Tiere wurden unter SPF-Bedingungen (spezifisch Pathogen-frei) gehalten.

↓20

Die Wildtyp- (wt) Stämme BALB/c (H-2d) und C57Bl/6 (H-2b) wurden vom Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin oder von Charles River, Sulzfeld gekauft. Die OVA-TZR transgenen Stämme DO11.10 (H-2d) [102] und OT-II (H-2b) [103], deren transgene TZR spezifisch für das gleiche Ovalbuminpeptid (OVA-Peptid329-337) sind [104], wurden ebenfalls vom BfR, Berlin gekauft. Ferner wurden die Mausstämme CXCR3-/- (H-2b) [105] und ICAM-1-/- (H-2b) [106] vom BfR, Berlin bezogen. Die MHC-II-/--Mäuse des Stamms ABBN5-M (H-2b) [107] wurden von Taconic, Germantown, NY, USA gekauft.

3.1.5 Medien und Puffer

Einfriermedium

50 % (v/v) FCS, 40 % (v/v) Medium, 10 % (v/v) DMSO

Erythrozyten-Lyse-Puffer

10 mM KHCO3, 155 mM NH4Cl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5

Fixierungslösung (PFA/PBS)

1xPBS, 2 g/l PFA, pH 7

Giemsa-Färbelösung

2,6 % (v/v) Giemsa Stain Stock Solution in Aqua dest.

Komplett-DMEM (cDMEM)

D-MEM, 10 % (v/v) FCS, 2 % (v/v) Natrium-Pyruvat, 2 % (v/v) L-Glutamin, 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin, 1 % (v/v) MEM NEAA, 0,1 % (v/v) β-Mercaptoethanol

Komplett-RPMI (cRPMI)

RPMI 1640 mit GlutaMAX-I™, 25 mM Hepes, 10 % (v/v) FCS, 1 % (v/v) Natrium-Pyruvat, 1 % (v/v) Penicillin/ Streptomycin, 0,1 % (v/v) β-Mercapoethanol

Metrizamid (30%ig)

30 % (w/v) Metrizamid in PBS

Migrationsmedium

RPMI 1640 ohne Phenolrot, 5 g/l BSA

Nycodenz-Lösung (17%ig)

26 % (v/v) RPMI 1640, 17 % (v/v) NycoPrep™ Universal, 10 % (v/v) FCS in Aqua dest.

Nycodenz-Lösung (30%ig)

50 % (v/v) NycoPrep™ Universal in Aqua dest.

PBS/BSA

PBS, 2 g/l BSA

Saponin-Puffer

PBS, 2 g/l BSA, 5 g/l Saponin

Th1-Medium

cRPMI, 5 µg/ml OVA-Peptid, 20 ng/ml IFN-γ, 10 ng/ml IL12, 5 µg/ml anti-IL-4

TNB-Puffer

0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,5 % (v/v) Blocking Reagenz (aus TSA™ Fluorescence Systems Kit)

Verdaumedium

RPMI 1640 mit GlutaMAX-I™, 25 mM Hepes, 5 % (v/v) FCS, 0,05 % (w/v) Collagenase Typ IV, 0,002 % (w/v) DNase I

3.2 Methoden

3.2.1  Immunhistologie

Leber, Niere und Milz wurden BALB/c-Mäusen entnommen und in der Gießform Tissue-Tek® Cryomold® mit dem Gewebeeinfriermedium Tissue-Tek® O.C.T. Compound in flüssigem Stickstoff eingefroren. Am Kryostat wurden 6 µm Kryoschnitte angefertigt und über 5 min auf einer Heizplatte bei 50°C getrocknet. Nach 10 min Inkubation in eiskaltem Aceton und anschließender Trocknung bei Raumtemperatur (RT) konnten die Schnitte bis zur immunhistologischen Färbung bei -20°C gelagert werden. Die Schnitte wurden nach dem Auftauen erneut für 10 min in eiskaltem Aceton inkubiert und getrocknet, anschließend für 30 min bei RT mit TNB-Puffer und dann 60 min mit ME-9F1 in TNB inkubiert. Nach hintereinanderfolgender Inkubation mit Maus-anti-Ratte IgG konjugierter Peroxidase über 30 min, Signal-Amplifikation mit Hilfe des TSA™ Fluorescence Systems Kit und Anti-Fluorescein-POD über 30 min wurde die Peroxidaseaktivität mit Hilfe des Sigma FAST DAB Peroxidase Substrate Tablet Sets detektiert. Nach jedem Schritt wurden die Schnitte dreimal für 5 min mit PBS gewaschen. Nach Inkubation mit Hämatoxylin für 5 min und anschließendem Waschen mit Leitungswasser wurden die Schnitte in 37°C warmer Kaisergelantine eingebettet. Die Schnitte wurden am Photomikroskop Axiophot analysiert; dabei wurden Dia-Aufnahmen (auf Kodak EPT 160T Film) gemacht.

3.2.2 Isolation verschiedener Zellpopulationen

3.2.2.1  Gewinnung von Lymphozyten aus Lymphknoten und Milz

↓21

Zur Gewinnung lymphoider Zellen wurden Lymphknoten und/oder Milz entnommen. Die unter der Haut befindlichen Lymphknoten – Unterkiefer- (Lnn mandibularis) und Halslymphknoten (Lnn cervicales superficiales), die Lymphknoten des Achsellymphzentrums (Lnn axillares et cubiti) und die Kniefaltenlymphknoten (Lnn subiliaci) – fasst man als periphere Lymphknoten (pLN) zusammen. Die Darm-assoziierten Lymphknoten (Lnn jejuni, Lnn iliaci, Lnn colici) – bezeichnet man als mesenteriale Lymphknoten (mLN).

Zur Herstellung einer Einzelzellsuspension wurden die Organe nach Zerkleinern mit einer Schere mit Hilfe eines Spritzenkolbens durch ein Metallsieb gerieben. Die Suspension wurde einmal mit Medium gewaschen (Auffüllen und Zentrifugation bei 300xg für 10 min) und anschließend zum einen zur Dichtegradientenzentrifugation auf Histopaque®-1083 geschichtet und für 20 min bei RT ohne Bremse mit 755xg zentrifugiert. Lebende, mononukleäre Zellen sammeln sich dabei in der Interphase, die abpipettiert und zweimal gewaschen wurden. Zum andern wurde die Einzelzellsuspension einfach für 3 min auf Eis mit dem Erythrozyten-Lyse-Puffer inkubiert und danach zweimal gewaschen.

Panning

↓22

Beim Panning wurden CD4+ T-Zellen durch Depletion unerwünschter Zell-Populationen isoliert bzw. angereichert.

Petrischalen wurden über Nacht bei 4°C mit 50 µg/ml Kaninchen-anti-Ratte Immunglobulin inkubiert. Am nächsten Tag wurde dreimal mit PBS, einmal mit cRPMI gewaschen und dann die Zellsuspension für 15 min bei RT auf diesen Platten inkubiert, so dass B-Zellen über Zelloberflächen-exprimierte IgGs auf der Platte adhärierten. Ungebundene Zellen wurden abgeerntet und mit einer Antikörper-Mischung aus anti-CD8 und anti-CD11b (Panning-Mix) für 15 min bei 4°C inkubiert. Nach Waschen in PBS/BSA und Abzentrifugieren (300xg für 10 min) wurden die Zellen erneut auf solche Platten gegeben und für 15 min bei RT inkubiert. Nun adhärierten alle Antikörper-gebundenen Zellen an die Platte und die verbleibenden nicht-adhärenten Zellen konnten abgesammelt werden.

CD4+ T-Zellen aus Milzen wurden damit auf 68-85 % angereichert. Für die Anreicherung von Memory/Effektor CD4+ T-Zellen aus Milzen wurde 1,5 µg/ml anti-CD62L zum Panning-Mix dazugegeben. Der Anteil der Memory/Effektor-Zellen stieg dadurch von 30 % auf 60 %.

↓23

Für die Isolation naiver CD4+ T-Zellen aus Lymphknoten wurde dem Panning-Mix anti-CD25 und anti-CD16/CD32 zugegeben. Nach dem Panning lag der Anteil der CD4+ T-Zellen bei 97-99 %. Anschließend wurden die naiven Zellen mittels magnetischer Zellsortierung (MACS) weiter aufgereinigt (> 98 % CD62L+ CD4+).

MACS

Die zu sortierenden Zellen wurden nach Angaben des Herstellers mit Antikörpern, an die magnetische Mikro-Kügelchen (Beads) gekoppelt sind, inkubiert, mit PBS/BSA gewaschen und in einem Magnetfeld auf eine ferromagnetische Säule gegeben. Dies geschah entweder manuell über eine L/S-Säule an einem MACS-Magneten oder mittels autoMACS. In beiden Fällen wurden durch Spülen der Säule mit PBS/BSA ungebundene Zellen ausgewaschen und die Beads-tragenden Zellen konnten nach Entfernung der Säule aus dem Magnetfeld eluiert werden.

↓24

Mit dieser Methode wurden zum einen naive CD4+ T-Zellen aus Milz und Lymphknoten über Selektion auf CD4 und CD62L sortiert. Teilweise wurden zuvor die APZ über anti-MHC-II, anti-B220, anti-CD11b und anti-CD11c depletiert. Dies führte zu einer Reinheit der naiven CD4+ T-Zellen von ~ 99 % mit < 1 % MHC-II+ Zellen. Des Weiteren wurden Milz-APZ durch CD90-Depletion sortiert (> 95 % MHC-II+).

3.2.2.2 Isolation von hepatischen Lymphozyten und LSEC

Die Leber 8-10 Wochen alter Mäuse wurde freigelegt und mittels einer 27xG-Kanüle auf einer 20-ml-Spritze über die Vena portae mit 4-5 ml Verdaumedium gespült. Nach Abtrennen der Gallenblase wurde die Leber herausgenommen, mit Schere und Pinzette zerkleinert und in Verdaumedium für 30 min bei 37°C mit 200 rpm im Schüttler verdaut. Um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, wurde die Suspension zuerst über ein Metallsieb, dann über ein Zellsieb gegeben und übriggebliebene Organstücke wurden mittels eines Spritzenkolbens zerkleinert. Nach Waschen und Resuspendieren in RPMI 1640 wurden die nicht-parenchymatischen Zellen (NPZ) der Leber von den Hepatozyten über einen Einschritt-Gradienten getrennt. Dafür wurden die Leberzellen in einer 24%igen Metrizamid- oder einer 26%igen Nycodenz-Lösung (Dichte = 1,136 g/l) unter cRPMI unterschichtet und mit 1180xg ohne Bremse bei RT zentrifugiert. Die Interphase, hauptsächlich bestehend aus NPZ, wurde abgenommen, in PBS/BSA gewaschen und nach Inkubation für 3 min auf Eis in Erythrozyten-Lyse-Puffer erneut gewaschen.

Hepatische Lymphozyten in der NPZ-Fraktion wurden im Durchflusszytometer über Vorwärts- (FSC) und Seitwärtsstreulicht (SSC) erkannt und über Oberflächenmarker analysiert.

↓25

Die LSEC wurden mittels MACS aus der NPZ-Fraktion gewonnen. Nach Blockade unspezifischer Bindungen mit 1 µg anti-FcγRII/III pro 1x106 Zellen wurden die Zellen mit dem Endothel-spezifischen Antikörper ME-9F1-FITC und mit anti-FITC-MicroBeads inkubiert. Nach Entfernen möglicher Aggregate durch einen Pre-Separation-Filter wurden die Endothelzellen im autoMACS in der Positivfraktion angereichert. Die Zellen wurden mit 2x106/ml cRPMI ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5 % CO2 im Brutschrank kultiviert. Am nächsten Tag wurden die nicht-adhärenten Zellen durch gründliches Waschen mit PBS entfernt, wohingegen die adhärenten Endothelzellen auf der Platte verblieben.

Parallel erfolgte die Reinheitskontrolle mittels BODIPY® FL konjugiertem acetyliertem „low density lipoprotein“ (AcLDL), welches spezifisch von Endothelzellen aufgenommen wird [108]: Nach der magnetischer Anreicherung der Endothelzellen wurde ein Aliquot der Zellen über Nacht mit 1 µg/ml AcLDL inkubiert und am nächsten Tag wurden die nicht-adhärenten Zellen durch Waschen mit PBS entfernt. Dann wurden die Endothelzellen nach 10-minütiger Inkubation bei 37°C mit Accutase™ von der Zellkulturplatte abgeerntet und im Durchflusszytometer analysiert. LSEC mit einer Reinheit über 95 % wurden für Experimente verwendet.

3.2.3 Kultivierung der Endothelzellen

Die LSEC wurden in cRPMI kultiviert und einen Tag – nur für die Filmaufnahmen zwei Tage – nach der ex vivo Isolation im Experiment verwendet.

↓26

Die Zelllinie mlEND wurde aus primären Endothelzellkulturen von murinen mesenterialen Lymphknoten generiert [109]. Die adhärent wachsenden Zellen wurden in T25-Flaschen bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert und zweimal pro Woche mit frischem cRPMI versetzt. Zur Weiterkultivierung wurden die Zellen 2-3 Tage nach Erreichen der Konfluenz 1:3 bis 1:5 gesplittet. Hierfür wurden sie einmal mit PBS gewaschen, für ca. 5 min mit Accutase™ im Brutschrank inkubiert, abgeerntet, gewaschen und in frischem Medium ausgesät. Für die Experimente wurden die Zellen ebenfalls mit Accutase™ abgeerntet.

Die Endothelioma-Zelllinie bEND5 entstammt aus Gehirn von BALB/c-Mäusen [110,111]. Die adhärent wachsenden Zellen wurden wie die mlEND kultiviert, dabei wurde cDMEM verwendet. Da die Linie empfindlich gegenüber zu häufigem Passagieren ist, wurden die Zellen frühestens 14 Tage nach Erreichen der Konfluenz für die Experimente oder zur Weiterkultivierung abgeerntet.

3.2.4 FACS-Färbung und -Analyse

3.2.4.1  Oberflächenfärbung

Mit der Oberflächenfärbung werden Moleküle auf der Zelle angefärbt, die unterschiedliche Entwicklungsstadien/-linien von Leukozyten repräsentieren oder distinkte Funktionen haben. Sie wurden ursprünglich als Differenzierungsantigene bezeichnet. Gruppen von Antikörpern, welche das gleiche Differenzierungsantigen erkennen, definieren ein „cluster of differentiation“ (CD).

↓27

Für die Färbungen wurden jeweils ca. 1x106 Zellen in FACS-Röhrchen oder Eppendorf-Reaktionsgefäße gegeben, und mit 300xg zentrifugiert. Um unspezifische Bindungen zu minimieren, enthält die Färbelösung (PBS/BSA) neben den Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern 10 µg/ml anti-FCRII/III und 10 µg/ml Ratten-IgG. Die Zellen werden 15 min auf Eis inkubiert, mit PBS/BSA gewaschen und in frischem PBS/BSA resuspendiert. Wurde ein Sekundärreagenz bzw. -antikörper verwendet, wurde die zweite Färbung nach gleichem Protokoll durchgeführt. Bis zur Messung wurden die Zellen bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt.

Die ideale Konzentration der Antikörper und Sekundärreagenzien wurde vorher durch Titration bestimmt. Sie liegt meist bei 1-5 µg/ml. Die verwendeten Antikörper bzw. Fluorochrome sind in Tabelle 1 bzw. 2 aufgeführt.

3.2.4.2 Färbung von Zellen aus murinem Blut

4-5 Tropfen Blut wurde über die Schwanzvene entnommen und mit 10 µl Heparin versetzt. 50 µl Blut wurden mit 50 µl PBS/BSA vermischt, nach Antikörperzugabe 15 min bei 4°C inkubiert und danach mit PBS/BSA gewaschen. Die Zellen wurden dann in 100 µl Novalyse resuspendiert, für 10 min bei RT inkubiert, mit 1 ml Aqua dest. aufgefüllt, erneut für 10 min bei RT inkubiert und wieder zentrifugiert. Zur Messung wurden die Zellen abschließend in 0,5 % PFA/PBS resuspendiert.

3.2.4.3 Intrazelluläre Färbung von Zytokinen nach PMA/IM-Stimulation

↓28

Mit der intrazellulären Färbung wurden von der Zelle produzierte Zytokine detektiert. Da ex vivo isolierte T-Zellen spontan nahezu keine Zytokine exprimieren, wurden die Zellen vor dem Färben stimuliert: Mit einer Zellkonzentration von max. 5x106/ml cRPMI wurden die Zellen für 4 h mit 10 ng/ml PMA und 500 ng/ml Ionomycin (IM) bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. 2 h vor Ende der Inkubation wurden 10 µg/ml Brefeldin A hinzugegeben. Nach der Inkubation wurden die Zellen in PBS/BSA gewaschen, Oberflächen-gefärbt und mit 2 % PFA/PBS für 15 min bei RT fixiert. Nach erneutem Waschen mit PBS/BSA wurden die Zellen durch Resuspendierung in Saponin-Puffer permeabilisiert. Anschließend wurde die intrazelluläre Färbung in Saponin-Puffer, der neben den Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern 10 µg/ml Ratten-IgG enthielt, über 30 min bei RT im Dunkeln durchgeführt. Nach Waschen mit Saponin-Puffer und dann mit PBS/BSA wurden die Zellen in 0,5 % PFA/PBS resuspendiert und bis zur Messung bei 4°C im Dunklen aufbewahrt. Zur Überprüfung der spezifischen Färbung wurden Antikörper der entsprechenden Spezies und des gleichen Isotyps verwendet (Isotyp-Kontrolle).

3.2.4.4 Messung und Analyse

Die Messung wurde am Durchflusszytometer FACSCalibur® oder LSR-I® durchgeführt und zur Auswertung wurde das Programm CellQuestPro® verwendet. Bei Messung unfixierter Zellen wurden tote Zellen durch Anfärbung mit PI bzw. mit DAPI ausgeschlossen, lebende Lymphozyten sowie Endothelzellen wurden durch FSC und SSC im Zweiparameter-Punktdiagramm (Dot Plot) erkannt. Mit Hilfe der Negativ- bzw. Isotypkontrollen konnten die Fluoreszenz-markierten Zellen bestimmt werden. Die Frequenzen und Fluoreszenzintensitäten ließen sich dann im Dot Plot oder im Histogramm darstellen.

3.2.5 CFSE-Markierung

Durch Markierung von Zellen mit CFSE ließ sich deren Proliferation im Durchflusszytometer verfolgen, da dieser Farbstoff bei Zellteilung zu gleichen Teilen an die Tochterzellen weitergegeben wird [112]. Dafür wurden die Zellen erst zweimal mit PBS gewaschen und dann mit einer Konzentration von 1x107 Zellen/ml mit 5 µM CFSE bei RT inkubiert. Nach 2 min 40 s wurde die Reaktion mit kaltem cRPMI gestoppt, die Zellen wurden zweimal gewaschen und die Zellzahl bestimmt. Zur Analyse der Proliferation wurde der GeoMean der CFSE-Fluoreszenzintensität angegeben oder die mittlere Anzahl der Teilungen (d) berechnet: d = ∑ (ni/nt x gi) mit gi = Generationszahl beginnend mit 0 für die ungeteilten Zellen, ni = Zellzahl innerhalb jeder Generation und nt = Gesamtzellzahl.

3.2.6  In vitro Generierung von Th1-Zellen

↓29

Naive CD4+ T-Zellen werden aus Lymphknoten und Milz OVA-TZR-transgener Mäuse über CD4- und CD62L-MACS isoliert und mit CD90-depletierten APZ im Verhältnis 1:3 in Th1-Medium für 6 Tage kultiviert. Vor Verwendung werden die Zellen über einen 17%igen Nycodenz-Gradienten gegeben. Die Qualität der in vitro generierten Th1-Zellen wird über den Anteil IFN-γ-produzierender Zellen nach PMA/IM-Restimulation kontrolliert; dieser sollte mehr als 60 % betragen.

3.2.7 Generierung von Knochenmarkschimären

Zur Generierung von Knochenmarkschimären (KMCh) wurden die Rezipienten-Mäuse mit 10,4 Gy in der Gammabestrahlungsanlage Biobeam 2000 lethal bestrahlt. Am nächsten Tag wurden 3-5x106 CD90-depletierte Knochenmark-Zellen über die Schwanzvene intravenös (i. v.) injiziert. Das Knochenmark wurde dazu aus Femur und Tibia der beiden hinteren Extremitäten der Spender-Mäuse isoliert: Die Knochen wurden entnommen und von anhaftendem Gewebe weitgehend befreit. Dann wurde das Knochenmark mit einer Spritze und 27xG-Kanüle herausgespült und durch Resuspendieren vereinzelt. Nach Lyse der Erythrozyten wurden CD90+ Zellen über MACS depletiert und die Zellzahl bestimmt.

Die Rezipienten wurden eine Woche vor Bestrahlung und bis 4 Wochen nach dem Knochenmarkstransfer mit 0,4 % (v/v) Antiinfektivum Baytril® im Trinkwasser behandelt. Nach 6 Wochen wurde das Ausmaß der Bestrahlung und der Rekonstitution durch Anfärben von MHC-II+, CD4+, CD8+ und B220+ Zellen im Blut überprüft. Bei erfolgreicher Rekonstitution wurden Leber- und Milzzellen 8-10 Wochen nach Knochenmarkstransfer isoliert; entweder aus naiven KMCh oder aus vorbehandelten KMCh, denen nach i. v. Injektion von OVA-TZR-transgenen CD4+ T-Zellen OVA-Protein oral oder i.v. verabreicht worden war.

3.2.8 Antigen-spezifische Kokultur von CD4+ T-Zellen mit LSEC oder Milz-APZ

↓30

Naive CD4+ T-Zellen wurden aus OVA-TZR-transgenen Mäusen isoliert; entweder aus Lymphknoten durch Panning und anschließender CD62L-Selektion mit MACS, oder aus Milz und Lymphknoten durch MACS (CD4- und CD62L-Selektion, z. T. mit vorgeschalteter APZ-Depletion). Dann wurden die Zellen mit CFSE markiert.

5x105 naive CD4+ T-Zellen wurden mit LSEC und OVA-Peptid kultiviert. Die LSEC waren einen Tag zuvor ex vivo isoliert, in einer 24-Loch-Platte mit einer Konzentration von 2x106/ml cRPMI über Nacht kultiviert und gründlich gewaschen worden. CD90-depletierte Milz-APZ – je 1x106 pro Ansatz – dienten dabei als Kontroll-APZ. Es wurden das Maß der Proliferation und die Höhe der Zytokin-Produktion über die Zeit und bei verschiedenen Antigenkonzentrationen untersucht.

In einigen Experimenten wurden die mit LSEC oder Milz-APZ kultivierten CD4+ T-Zellen nach 6 Tagen erneut Antigen-spezifisch kultiviert. Dazu wurden die CD4+ T-Zellen geerntet und nach einem 17%igen Nycodenz-Gradienten und MHC-II-Depletion durch MACS mit frischen LSEC bzw. Milz-APZ und OVA-Peptid für weitere 6 Tage in Kultur genommen.

↓31

In anderen Experimenten wurden die LSEC direkt nach der Isolation mit 20 ng/ml IFN-γ und 10 ng/ml TNF-α in cRPMI über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden dann nach 24 h gründlich gewaschen und für die Antigen-spezifische Kokultur mit naiven CD4+ T-Zellen eingesetzt oder abgeerntet und im Durchflusszytometer analysiert.

3.2.9 Transendothelialer Migrationsassay

Zur Untersuchung des Transmigrationsverhaltens verschiedener T-Zellpopulationen in vitro wurde das Transwell®-System von Corning Costar verwendet (24-Loch-Platten mit Transwell®-Einsätzen, deren Boden aus einer Polycarbonat-Membran mit 5 µm großen Poren besteht).

3.2.9.1  Kultivierung der Endothelzellen auf den Transwell®-Einsätzen

Die LSEC wurden wie oben beschrieben eine Tag vor dem Experiment ex vivo isoliert. Nach MACS wurden 5x105 Zellen in 200 µl cRPMI auf den Transwell®-Einsätzen ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Die Membranen der Einsätze waren vorher 1 h mit 10 µg/ml Fibonektin (FN) inkubiert worden und nach Absaugen des FN für 2 h bei 27°C getrocknet. Für einige Experimente wurden die LSEC entweder mit 10 ng/ml Pertussis Toxin (PTX) oder Heparinase I (0,001 U/ml, 0,1 U/ml oder 5 U/ml) in cRPMI für 2 h bei 37°C vorinkubiert und dann nach gründlichem Waschen im Transmigrationsassay eingesetzt.

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Die verwendeten Endothelzelllinien wurden zwei Tage vor dem Transmigrationsexperiment auf den FN beschichteten Transwell®-Einsätzen ausgesät. Wegen der unterschiedlichen Größen der Endothelzellen wurden verschiedene Zellzahlen ausgesät, um am Tag des Transmigrationsexperiments vergleichbare Konfluenzen der Monolayer zu erhalten: 4x104 mlEND in 200 µl cRPMI und 5x104 bEND5 in 200 µl cDMEM. Als Kontrollen wurden nur mit FN beschichtete Transwell®-Einsätze verwendet.

Zur Überprüfung der Endothel-Monolayer wurden die Transwell®-Einsätze nach Ende des Experiments zweimal mit PBS gewaschen, für 2 h über Formaldehydlösung (min. 37 %) fixiert und für 10 min mit 2,6 % Giemsa in Aqua dest. gefärbt. Die Membranen wurden von den Transwell®-Einsätzen gelöst und auf Objektträgern in Entellan® eingebettet. Dann konnte die Belegung der Membranporen durch die Endothelzellen am Photomikroskop Axiophot quantifiziert werden: Die Endothelien bedeckten etwa 80 % der Poren.

3.2.9.2 Isolation und Transmigration der T-Zellen

Milzzellen wurden nach Dichtegradientenzentrifugation mit Histopaque®-1083 durch Panning auf CD4+ T-Zellen angereichert. Für die Analyse von Zytokin-produzierenden CD4+ T-Zellen wurde zusätzlich der Anteil an CD62Llow Zellen erhöht, um eine höhere Frequenz an Zytokin-produzierenden Effektor-/Memory T-Zellen zu erhalten. Dann wurden die Zellen auf 5x106/ml in Migrationsmedium eingestellt.

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Kurz vor dem Transmigrationsassay wurden die Transwell®-Einsätze, auf denen die Endothelzellen kultiviert worden waren, dreimal gründlich mit PBS gewaschen. Dann wurden 5x105 T-Zellen in die obere Kammer pipettiert und anschließend 600 µl Migrationsmedium mit oder ohne Chemokin in die untere Kammer. Folgende Chemokine wurden verwendet: CXCL12 (10 bzw. 50 nM), CXCL9 (100 nM), CXCL16 (10 und 100 nM), CCL20 (10, 50 und 100 nM) und CCL21 (10 und 100 nM). Die optimale Konzentration der Chemokine war entweder in Vorexperimenten bestimmt oder hier titriert worden. Für die Bestimmung der Zahl eingesetzter Zellen (Input) wurden 5x105 T-Zellen in ein Loch einer 24-Loch-Platte ohne Transwell®-Einsätze überführt und auf 600 µl aufgefüllt. Nach 90 minütiger Inkubation bei 37°C und 5 % CO2 wurden die transmigrierten Zellen aus der unteren Kammer analysiert.

3.2.9.3 Quantifizierung der transmigrierten T-Zell-Populationen

Zur Quantifizierung wurden aus der unteren Kammer 5/6 der Zellsuspension (500 µl) nach sorgfältiger Resuspendierung entnommen und in ein FACS-Röhrchen überführt, in welches zuvor 10 µl Fluoresbrite™ Microspheres, im folgenden als „Beads“ bezeichnet, verdünnt mit PBS vorgelegt worden waren. Analog wurden mit den Zellen des Inputs verfahren. Nach Blockade von unspezifischen Bindungen wurden Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gegen CD4 und CD62L bzw. CD45RB zugegeben. Die Messung am Durchflusszytometer erfolgte ohne vorhergehendes Waschen. Die Zielzellen wurden über Größe, Granularität und die eingesetzten Antikörper identifiziert (Abb. 4A, B), die Beads konnten aufgrund ihrer Größe und der starken Fluoreszenzintensität im Fluoreszenz-Detektionskanal 1 (FL-1) getrennt von den Zellen detektiert werden (Abb. 4C). Nach Zählung von mindestens 3000 Zielzellen oder 4000 Beads pro Probe wurden die relativen Zahlen der Zielzellen und zugehörigen Beads bestimmt und damit die Transmigrationsraten berechnet; dargestellt als Prozent vom Input (Abb. 4D).

Abb. 4: Quantifizierung der transmigrierten T-Zellen. Die transmigrierten Zellen wurden geerntet, mit Fluoresbrite™ Beads versetzt und im Durchflusszytometer über FSC/SSC (A) und die eingesetzten Fluoreszenz-konjugierten Antikörper (B) detektiert. Aus der absoluten Zahl der Zellen (R1*R2) und der der Fluoresbrite™ Beads (C: R3) in den Proben sowie im Input ließ sich dann die Transmigrationsrate berechnen (D). Hierbei ist es nicht notwendig, die absolute Zahl der Beads zu kennen, da dieser Wert in der Gleichung 2 in Zähler und Nenner erscheint, wenn Gleichung 1 und 2 kombiniert werden.

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Für die Bestimmung der Migration von Zytokinproduzenten wurden Zellen aus 7-27 unteren Kammern zusammengeführt und mit PMA/IM stimuliert. Nach CD4-Oberflächenfärbung und intrazellulärer Färbung von IFN-γ, IL-4, und IL-10 konnten die Frequenzen der Zytokin-positiven Zellen unter den CD4+ T-Zellen ermittelt werden. Auch hier wurde ein Aliqout an Input-Zellen analog behandelt. Mit den erhaltenen Frequenzen ließen sich die Zellzahlen pro Probe berechnen, die dann ebenfalls in Prozent vom Input ausgedrückt werden konnten.

3.2.10 Fluoreszenzmikroskopie

Ex vivo isolierte LSEC (2x105 in 50 µl cMedium) wurden auf FN beschichteten Objektträgern über Nacht mit BODIPY® FL-konjugiertem AcLDL (1:1000) inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellkerne nach gründlichem Waschen mit PBS mit 10 µg/ml Hoechst 33342 über 15 min bei RT gefärbt. Die Zellen wurden dann in Fluoromount-G™ eingebettet und am Photomikroskop Axiophot analysiert. Dabei wurden digitale Aufnahmen mit Hilfe des Programms MetaVue gemacht.

3.2.11 Zeitrafferaufnahmen dertransendothelialen Migration

Die Transmigration von CD4+ T-Zellen durch das Leberendothel sollte in vitro beobachtet werden. Dazu wurden T-Zellen auf einen LSEC-Monolayer gegeben und ihr Migrationsverhalten am Phasenkontrastmikroskop aufgenommen und im Zeitraffer analysiert.

3.2.11.1  Kultivierung der Endothelzellen auf µ-Slides VI

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Aus BALB/c-Mäusen isolierte LSEC wurden 2 Tage vor dem Experiment mit 2x106/ml cRPMI in 6-Loch-Platten ausgesät. Am nächsten Tag wurden sie gründlich gewaschen, mit Accutase™ geerntet und je 1x106 in 30 µl cRPMI für weitere 24 h auf µ-Slides VI kultiviert, die zuvor 40 min bei RT mit 120 µg/ml FN inkubiert worden waren. Die Vergleichsendothelien bEND5 wurden zwei Tage vor dem Experiment mit 1x105 in 30 µl cDMEM auf FN beschichteten µ-Slides VI ausgesät. Am Tag des Versuchs wurden die Endothelien dreimal mit warmem Medium gewaschen. Für die Chemokin-Präinkubation wurden die Endothelien über 2 h mit 50 nM CXCL12 in Medium im Brutschrank inkubiert und vor Zugabe der CD4+ T-Zellen erneut dreimal gründlich gewaschen.

3.2.11.2 Isolation und Behandlung der CD4+ T-Zellen

CD4+ T-Zellen wurden aus BALB/c-Milzen mittels MACS sortiert (>  99,4 % CD4+), 2 h in cRPMI im Brutschrank inkubiert und zur Dichtegradientenzentrifugation über 17%ige Nycodenz-Lösung geschichtet und für 10 min bei RT mit 755xg zentrifugiert. Dann wurden 1x106 Zellen in 30 µl cRPMI auf die mit Endothelzellen bewachsenen µ-Slides VI gegeben. Nach 20 min wurden die Zellen einmal mit 100 µl cRPMI gewaschen, um nicht-adhärente CD4+ T-Zellen zu entfernen, und dann in 100 µl cRPMI gehalten. Während des gesamten Versuchs wurden die Zellen mittels einer Rotlichtlampe und einem Temperatursensor auf 37 °C gehalten.

3.2.11.3 Aufnahme und Analyse

Für die Analyse wurden Fotos am Leica DM IRE2 Mikroskop mit dem Programm Leica Confocal Software (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) im Phasenkontrast mit 80-facher Vergrößerung erstellt. Zur Berechnung der Adhäsion von CD4+ T-Zellen an die Endothelien wurden vor und nach dem Waschen 5 Bereiche auf den Objekträgern fotografiert. Für die Untersuchung wandernder bzw. transmigrierender Zellen wurden je Objekträger 3 Bereiche ausgewählt, die über einen Zeitraum von 10 min alle 5 Sekunden fotografiert wurden. Diese Serien wurden dann als Filme (avi-Format) mit Zeitraffer (10 Bilder/s, 1 s Filmzeit = 50 s Echtzeit) exportiert und ausgewertet. Dabei wurden die CD4+ T-Zellen in 3 Typen unterteilt: 1.) unbeweglich: Zellen liegen nicht adhärierend auf dem Endothel. Sie erscheinen im Phasenkontrast sehr hell. 2.) mobil: Zellen flachen nach Adhäsion an das Endothel ab und wandern auf der Oberseite des Endothels um mehr als ½ Zelldurchmesser. Sie erscheinen im Phasenkontrast mittel- bis dunkelgrau. 3.) transmigrierend: Zellen wandern unter das Endothel und z. T. zurück an die Oberseite. Sie erscheinen im Phasenkontrast dunkelgrau bis schwarz.

3.2.12 Graphische Darstellung und Statistik

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Alle Graphen wurden mit den Programmen Excel (Microsoft) oder GraphPadPrism erstellt. Zur Berechnung von Signifikanzen wurde der Mann-Whitney-Test verwendet. Bei p < 0,05 wurden die Unterschiede als signifikant angesehen (* = p < 0,05; ** = p < 0,01).


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05.12.2006