4 Ergebnisse

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4.1  Ex vivo Isolation der LSEC mit Hilfe des Antikörpers ME-9F1

Zur ex vivo Gewinnung muriner LSEC wurde der Endothel-spezifische Antikörper ME-9F1 verwendet. Die Eignung des Antikörpers zur Detektion der LSEC wurde zuerst in der Histologie überprüft: Auf Kryoschnitten von Leber, aber auch von Niere und Milz ließ sich das Endothel spezifisch mit dem Antikörper ME-9F1 anfärben (Abb. 5). Auf den Leberschnitten konnten mit diesem Antikörper neben den Endothelien größerer Blutgefäße auch die sinusoidalen Endothelzellen, die anhand ihrer Morphologie erkannt wurden, detektiert werden. Auch am Durchflusszytometer konnten die LSEC mit dem Antikörper ME-9F1 detektiert werden (Abb. 6A). Zur Kontrolle wurde das Endothel dabei mit dem Pan-Endothelmarker Meca32 gegengefärbt.

Abb. 5: Detekion des Endothels mit Hilfe des ME-9F1 auf Kryoschnitten von Leber, Niere und Milz. Auf Kryoschnitten von muriner Leber, Niere und Milz wurde das Endothel nach Inkubation mit dem Antikörper ME-9F1 und anti-Ratte-Peroxidase über Zugabe des Peroxidase-Substrats detektiert. Färbungen ohne den Primär-antikörper dienten als Negativkontrollen. Zusätzlich wurden mit Hämatoxylin alle Zellkerne gefärbt. Anschließend wurden am Mikroskop Dias mit 20xVergrößerung aufgenommen.

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Neben der Detektion der LSEC war der Antikörper ME-9F1 auch für die ex vivo Isolation der LSEC (siehe Material und Methoden, 3.2.2.2) geeignet. In der nicht-parenchymatischen Fraktion der Leber waren 15-30 % der Zellen ME-9F1+, nach magnetischer Sortierung mit ME-9F1 konnte der Anteil an Endothelzellen auf über 90 % gesteigert werden (Abb. 6B). Durch die anschließende über-Nacht-Kultur und das Entfernen aller nicht-adhärenten Zellen lag der Anteil der Endothelzellen bei > 95 % (Abb. 6C). Die Reinheit der Endothelzellen nach der über-Nacht-Kultur wurde mittels AcLDL kontrolliert, welches spezifisch von Endothelzellen über den Mannose-Rezeptor aufgenommen [108] und durch Fluoreszenz-Kopplung im Durchflusszytometer detektiert werden kann.

Abb. 6: Detektion der LSEC im Durchflusszytometer. Nach Collagenase-Verdau der Leber und einem Ein-Schritt-Gradienten konnten die LSEC in der nicht-parenchymatischen Fraktion der Leber mit dem Antikörper ME-9F1 detektiert werden; der Standardmarker für Endothel Meca32 zeigte eine deutliche Kofärbung (A). Der Antikörper ME-9F1 war auch in der magnetischen Sortierung verwendbar (B): Nach Inkubation der nicht-parenchymtischen Fraktion der Leber mit dem Antikörper ME-9F1-FITC und mit anti-FITC-MicroBeads wurden die Endothelzellen in der Positivfraktion auf > 90 % angereichert. Die Reinheit der LSEC-Isolation wurde über die spezifische Aufnahme von Fluoreszenz-gekoppeltem-AcLDL nach über-Nacht-Kultur im Durchflußzytometer kontrolliert (C). Die Prozentangaben sind repräsentative Werte.

4.2 Einfluss der LSEC auf die Transmigration von CD4+ T-Zellen

Der Einfluss der LSEC auf die Transmigration von CD4+ T-Zellen wurde in An- und Abwesenheit der LSEC im Transwell®-System und am Phasenkontrastmikroskop untersucht. Die CD4+ T-Zellen wurden ex vivo aus Milzen isoliert. Nach Abreicherung von CD8+, CD11b+ und B-Zellen lag der Anteil der CD4+ T-Zellen bei 68-85 %. Mit Hilfe des Markers CD45RB, der auf naiven CD4+ T-Zellen sehr hoch exprimiert ist (CD45RBhigh) und während der Differenzierung in Effektor/Memory-Zellen herunter reguliert wird (CD45RBlow), zeigte sich, dass etwa 2/3 der ex vivo isolierten CD4+ Milzzellen naive, 1/3 Effektor/Memory-Zellen waren.

4.2.1  Gesteigerte Transmigration von CD4+ T-Zellen in Anwesenheit der LSEC

↓38

Zuerst wurde die transendotheliale Migration der gesamten CD4+ T-Zellen durch LSEC mit der Migration durch andere Endothelien verglichen. Die Migration durch Endothel-freie Transwell®-Membranen diente dabei als Standard.

Die spontane Transmigration der CD4+ T-Zellen durch eine Endothel-freie Membran lag bei 8,1 ± 4,4 %, welche durch die Anwesenheit der LSEC nicht verändert wurde (8,6 ± 5,1 %). Die Anwesenheit der Kontroll-Endothelien bEND5 und mlEND hingegen führte zu einer signifikanten Verminderung der Transmigration auf 2,1 ± 2,7 % und 2,8 ± 1,6 % (Abb. 7A).

Durch den chemotaktischen Gradienten mit CXCL12 erhöhte sich die Transmigration der CD4+ T-Zellen durch Membranen ohne Endothel auf 26,7 ± 10,3 %. Durch den LSEC-Monolayer wurde diese Transmigration signifikant auf 49,6 ± 16,8 % gesteigert. Im Gegensatz dazu zeigte sich auf den Kontroll-Endothelien bEND5 und mlEND eine signifikant niedrigere Transmigration von 10,8 ± 2,7 % und 5,2 ± 2,8 % (Abb. 7B). Somit war die Chemotaxis der T-Zellen zu CXCL12 in Anwesenheit der LSEC nicht nur im Vergleich zur Migration durch die Kontrollendothelien erhöht, sondern auch im Vergleich zum Endothel-freien System.

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Abb. 7: Transmigration von CD4+ T-Zellen in Anwesenheit verschiedener Endothelien im Vergleich zum Endothel-freien System. Die ex vivo isolierten LSEC sowie die Kontroll-Endothelien bEND5 und mlEND wurden auf FN-beschichteten Transwell®-Einsätzen kultiviert; als Kontrolle dienten nur FN-beschichtete Einsätze. Die spontane Transmigration (A) und die Chemotaxis zu CXCL12 (B) von ex vivo isolierten CD4+ T-Zellen der Milz wurde in An- und in Abwesenheit der verschiedenen Endothelzellen quantifiziert. Dazu wurden die transmigrierten T-Zellen nach 90 min Migrationszeit geerntet, mit Fluoresbrite™ Beads versetzt und nach Oberflächenfärbung im Durchflusszytometer analysiert. Über die Zahl der Zellen und der Fluoresbrite™ Beads in den Proben und im Input ließ sich dann die Migrationsrate berechnen. Die Diagramme zeigen Mittelwert (MW) und Standardabweichung ( SD) von mindest. 4 unabhängigen Experimenten mit n.s. = nicht signifikant und ** = p < 0,01. Nach dem Experiment wurden die Endothelzellen auf den Transwell®-Einsätzen mit Giemsa gefärbt und ihr Aussehen am Mikroskop kontrolliert (C).

Das Migrationsverhalten der CD4+ T-Zellen auf LSEC wurde nicht nur im Transwell®-System, sondern auch am Phasenkontrastmikroskop untersucht. Als Vergleichsendothel wurden hier die bEND5-Zellen verwendet. Dabei wurde neben der Anzahl transmigrierender T-Zellen auch die Zahl adhärierender bzw. mobiler Zellen bestimmt: Auf Bildaufnahmen vor und nach Waschen der Zellen konnte die Anzahl adhärierender CD4+ T-Zellen auf den Endothel-Monolayern berechnet werden, die Menge mobiler bzw. transmigrierender Zellen wurde in Zeitraffer-Aufnahmen quantifiziert (Abb. 8). Auf den LSEC adhärierten nach 20 min etwa 30 % der T-Zellen, auf den bEND5 waren es ca. 8 %. Während der 10 min Beobachtungszeit am Mikroskop wanderten ca. 6 % der T-Zellen entlang des LSEC-Monolayers und 1 % transmigrierte durch die LSEC, wohingegen auf den bEND5 nur bei knapp 2 % der T-Zellen Mobilität und bei 0,1 % Transmigration beobachtet wurde. Ein Effekt durch Vorinkubation der Endothelien mit CXC12 ließ sich nicht beobachten.

Da die Adhäsion an das Endothel Voraussetzung für die Transmigration der Zellen ist, könnte die erhöhte Adhäsion der CD4+ T-Zellen an die LSEC ein Grund für ihre gesteigerte Transmigration durch die LSEC sein.

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Abb. 8: Adhäsion und Migration von CD4+ T-Zellen auf LSEC bzw. bEND5. LSEC und bEND5 wurden auf FN-beschichteten µ-slides VI über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag wurden CD4+ T-Zellen aus der Milz isoliert, auf die Endothel-Monolayer, die zuvor mit oder ohne CXCL12 inkubiert worden waren, gegeben und im Phasenkontrast beobachtet. Zur Berechnung der Adhäsion der T-Zellen an die Endothelien wurden die T-Zellen auf den LSEC bzw. bEND5 vor und nach Waschen gezählt. Dann wurden die T-Zellen 10 min lang auf den Endothelien gefilmt und ihre Bewegungen anschließend im Zeitraffer analysiert: T-Zellen, die nach der Adhäsion ans Endothel abflachten und auf der Oberseite des Endothels um mehr als einen ½ Zelldurchmesser wanderten, galten als „mobil“. Wanderten die Zellen unter das Endothel bzw. zurück an die Oberseite, wurden sie als „transmigrierend“ definiert. Neben repräsentativen Aufnahmen zur Bestimmung der Adhäsion (A) ist beispielhaft die Transmigration einer CD4+ T-Zelle durch einen LSEC-Monolayer dargestellt (weißer Pfeil) (B). Die Diagramme zur Adhäsion, Mobilität und Transmigration (C) zeigen MW und SD von drei unabhängigen Experimenten.

Damit konnte am Phasenkontrastmikroskop bestätigt werden, dass die CD4+ T-Zellen in Anwesenheit der LSEC erhöhte Transmigration zeigen. Die niedrigeren Prozentzahlen der Transmigrationsraten könnten hierbei auf die kürzere Versuchszeit zurückzuführen sein: Am Mikroskop wurden die Zellen für 10 min beobachtet, im Transwell®-System akkumulierten die transmigrierten Zellen in der unteren Kammer und die Transmigrationsraten wurden nach 90 min Migrationszeit berechnet.

4.2.2 Effekt der LSEC auf die Transmigration verschiedener CD4+-Populationen

In vivo ist für die Leber eine präferentielle Akkumulation von Memory CD4+ T-Zellen, nicht jedoch von naiven CD4+ T-Zellen beschrieben [61]. Auch konnte mittels Intravitalmikroskopie gezeigt werden, dass Th1-polarisierte Zellen besser als Th2-polarisierte Zellen am sinusoidalen Endothel adhärieren [113]. Bisher konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass LSEC die Transmigrationsraten von CD4+ T-Zellen erhöhen. Nun sollte untersucht werden, ob die LSEC als Filter für bestimmte CD4+ T-Zell-Subsets fungieren, somit selektiv das Migrationsverhalten bestimmter Subsets beeinflussen.

↓41

Zuerst wurde die Transmigration von naiven und Effektor/Memory CD4+ T-Zellen untersucht, die über den Markers CD45RB (CD45RBhi vs. CD45RBlow) detektiert wurden (Abb. 9A). Zu CXCL12 migrierten erwartungsgemäß beide Populationen, da auf beiden der Rezeptor CXCR4 zu finden ist: 32,5 ± 11,0 % der naiven und 24,7 ± 10,4 % der Effektor/Memory Zellen migrierten durch Endothel-freie Membranen. In Anwesenheit der LSEC konnte eine signifikante Steigerung der Chemotaxis von naiven bzw. Effektor/Memory CD4+ T-Zellen auf 59,5 ± 21,7 % bzw. 56,6 ± 15,0 % detektiert werden (Abb. 9B, C). Somit wurde die Transmigration beider CD4+ Populationen durch die LSEC gesteigert.

Neben CXCL12 wurde auch CXCL9, dessen Rezeptor CXCR3 nicht auf naiven, aber z. B. auf Th1-polarisierten T-Zellen exprimiert ist, im Chemotaxisassay verwendet. Erwartungsgemäß ließ sich im Endothel-freien System kein chemotaktischer Effekt auf die naiven CD4+ T-Zellen beobachten. Auch durch LSEC war keine erhöhte Migration detektierbar. Die Effektor/Memory CD4+ T-Zellen zeigten dagegen einen signifikant erhöhte Transmigration zu CXCL9 (16,3 ± 5,6 %). Diese Chemotaxis konnte in Anwesenheit der LSEC signifikant auf 26,3 ± 8,8 % gesteigert werden (Abb. 9c).

Abb. 9: Transmigration von naiven und Effektor/Memory CD4+ T-Zellen zu CXCL12 und CXCL9 in An- und Abwesenheit der LSEC. LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell®-Einsätzen kultiviert, als Kontrolle dienten nur FN-beschichtete Einsätze. Am nächsten Tag wurde die Transmigration von naiven und Effektor/Memory CD4+ T-Zellen zu CXCL12 und CXCL9 untersucht. Dazu wurden naive und Effektor/Memory CD4+ T-Zellen mit dem Marker CD45RB unterschieden (A) und die Transmigrationsraten wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert. Die Diagramme zeigen MW und SD von 8-18 unabhängigen Experimenten mit * = p < 0,05 und ** = p < 0,01.

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Des Weiteren wurde die Transmigration einiger Zytokin-Produzenten (IFN-γ, IL-4 und IL-10-Produzenten) bestimmt. Es wurden ebenfalls ex vivo isolierte Milzzellen verwendet. Um eine ausreichende Anzahl an Zytokin-Produzenten zu erhalten, war durch Abreichern der CD62Lhigh-Fraktion der Anteil an Effektor/Memory CD4+ T-Zellen von 30 % auf 60 % erhöht worden. Die Migration wurde dann ohne weitere Vorbehandlung der Zellen durchgeführt. Anschließend wurde die Fähigkeit zur Zytokinsekretion durch PMA/IM-Stimulation und intrazelluläre Färbung der Zytokine detektiert (Abb. 10A). Alle drei Zytokin-Produzenten zeigten in Anwesenheit der LSEC gesteigerte Transmigrationsraten zu den Chemokinen CXCL12 und CXCL9 (Abb. 10B-D). Die „Nicht-Produzenten“ (IFN-γ- IL-4- IL-10- CD4+ T-Zellen) zeigten in Anwesenheit der LSEC ebenfalls eine erhöhte Chemotaxis zu CXCL12, aber nicht zu CXCL9 (Abb. 10E). Sie wanderten also erwartungsgemäß wie naive T-Zellen.

Abb. 10: Transmigration verschiedener Zytokin-Produzenten zu CXCL12 und CXCL9 in An- und Abwesenheit der LSEC. LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell®-Einsätzen kultiviert, als Kontrolle dienten nur FN-beschichtete Einsätze. Nach Isolation von CD62Llow angereicherten CD4+ T-Zellen aus der Milz wurden die Transmigrationsraten von IFN-γ-, IL-4- und IL-10- produzierenden CD4+ T-Zellen zu CXCL12 und CXCL9 in An- und Abwesenheit der LSEC untersucht. Dazu wurden die migrierten T-Zellen nach PMA/IM-Stimulation neben CD4 intrazellulär für IFN-γ, IL-4 und IL-10 gefärbt und im Durchflusszytometer analysiert (A). Zusätzlich wurden – wie in Abb. 7 beschrieben – Ansätze zur Quantifizierung mitgeführt. Über den Anteil der CD4+ T-Zellen ließ sich dann die Transmigration der Zytokin-Produzenten (B-D) sowie der „Nicht-Produzenten“ (E) berechnen. Die Diagramme zeigen MW und SD von 3-5 unabhängigen Experimenten.

Damit konnte für alle untersuchten CD4+ T-Zellpopulationen eine erhöhte Chemotaxis in Anwesenheit der LSEC festgestellt werden. Voraussetzung für die gesteigerte Transmigration war dabei die Reaktivität der T-Zellen auf das verwendete Chemokin. Durch die LSEC wurde die Transmigration reaktiver T-Zellen gefördert, nicht die Transmigration bestimmter Subpopulationen.

4.2.3 Kein erhöhter chemotaktischer Effekt von CCL20, CCL21 und CXCL16 in Anwesenheit der LSEC

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In der Leber werden neben CXCL9 und CXCL12 weitere Chemokine, wie CCL20, CCL21 und CXCL16 konstitutiv exprimiert [59]. Daher wurde nun der Einfluss der LSEC auf die Chemotaxis von CD4+ T-Zellen zu diesen drei Chemokinen untersucht.

Zu CCL21 migrierten über 70 % der naiven und mehr als 60 % der Effektor/Memory CD4+ T-Zellen. Dies war unabhängig vom Vorhandensein oder Fehlen der LSEC (Abb. 11A). Die Chemotaxis von CD4+ T-Zellen zu CCL20 und CXCL16 waren eher gering, aber wie zu CCL21 durch die Anwesenheit der LSEC im Vergleich zu Endothel-freien Membranen nicht verändert (Daten nicht gezeigt).

Abb. 11: Transmigration der CD4+ T-Zellen zu CCL20 in An- und Abwesenheit von LSEC. LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell®-Einsätzen kultiviert, als Kontrolle dienten nur FN-beschichtete Einsätze. Am nächsten Tag wurde die Transmigration von naiven und Effektor/Memory CD4+ T-Zellen aus Milz (A) und Leber (B) zu CCL21 untersucht und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert. Die Einteilung in naive und Effektor/Memory Zellen erfolgte wie in Abb. 9 beschrieben mit dem Marker CD45RB. Das Diagramm zeigt MW und SD eines repräsentativen von zwei unabhängigen Experimenten.

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Durch die Anwesenheit der LSEC ließ sich somit die Chemotaxis von CD4+ T-Zellen zu CXCL9 und CXCL12 signifikant steigern, nicht jedoch zu den Chemokinen CCL20, CCL21 und CXCL16.

Neben der Transmigration von CD4+ Milzzellen wurde auch das Migrationsverhalten von intrahepatischen CD4+ T-Zellen untersucht: Diese zeigten ebenfalls durch die Anwesenheit der LSEC keine erhöhte Chemotaxis zu CCL20, CCL21 und CXCL16. Allerdings war der chemotaktische Effekt von CCL21 auf Leber-residente Effektor/Memory CD4+ T-Zellen geringer als auf die der Milz (Abb. 11B).

4.2.4 Mechanismus der gesteigerten Transmigration in Anwesenheit der LSEC

Bisher konnte gezeigt werden, dass die Transmigration von CD4+ T-Zellen durch die Anwesenheit der LSEC beeinflusst wird: Zum einen wirken die LSEC bei der spontanen Transmigration im Gegensatz zu anderen Endothelien nicht als Barrieren, zum anderen wird der chemotaktische Effekt bestimmter Chemokinen durch die Anwesenheit der LSEC gesteigert. Nun sollte geklärt werden, welcher Mechanismus für die beobachteten Effekte verantwortlich ist. Dazu wurden eine direkte Aktivierung des Endothels durch die Chemokine, der Einfluss endothelialer Adhäsionsmoleküle und die Fähigkeit der LSEC zur Chemokin-Präsentation untersucht.

4.2.4.1  Endotheliale Aktivierung durch CXCL9 und CXCL12

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Da Endothelzellen ebenso wie Leukozyten Chemokinrezeptoren exprimieren können [114], wurde zunächst untersucht, ob eine direkte Aktivierung der LSEC nach Chemokin/Rezeptor-Interaktion erfolgt. Dazu standen CXCR3-/--Mäusen zur Verfügung, aus denen die LSEC isoliert wurden. So konnte dann die Transmigration von CD45RBlow Effektor/Memory CD4+ T-Zellen zu CXCL9 in Anwesenheit der Knockout- und wt-LSEC miteinander verglichen werden (Abb. 12A). Die Migration der T-Zellen durch CXCR3-/--LSEC war mit 31,3 ± 3,6 % im Vergleich zur Migration durch wt-LSEC unverändert (26,3 ± 8,8 %). Die LSEC schienen somit nicht direkt durch das Chemokin beeinflusst zu werden. Dagegen konnte erwartungsgemäß bei den T-Zellen aus CXCR3-/--Mäusen keine Chemotaxis zu CXCL9 beobachtet werden (Abb. 12B).

Abb. 12: Unveränderte Transmigration von CD45RBlow CD4+ T-Zellen zu CXCL9 durch CXCR3-/--LSEC im Vergleich zur Migration durch wt-LSEC. LSEC wurden aus wt- bzw. CXCR3-/--Mäusen isoliert und auf FN-beschichteten Transwell®-Einsätzen kultiviert. Am nächsten Tag wurde die Transmigration von CD45RBlow CD4+ T-Zellen aus wt-Milzen zu CXCL9 untersucht und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert (A). Zusätzlich wurde die transendotheliale Migration von CD45RBlow CD4+ T-Zellen aus CXCR3-/--Milzen zu CXCL9 analysiert (B). Die Diagramme zeigen MW und SD von 3-9 unabhängigen Experimenten.

Da keine CXCR4-/--Maus zur Verfügung stand, wurde die mögliche endotheliale Aktivierung durch CXCL12 mittels Blockade der Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion untersucht (Abb. 13A). Dazu wurden die LSEC mit Pertussis Toxin (PTX) vorbehandelt, welches die Signaltransduktion der an die Chemokinrezeptoren gekoppelten Gi-Proteine blockiert: PTX katalysiert die ADP-Ribosylierung eines spezifischen Cysteinrests in der α-Untereinheit von Gi. Diese kovalente Modifikation blockiert die Spaltung in α- und βγ-Untereinheit und hält Gi in der inaktiven GDP-Form fest [115].

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Abb. 13: U nveränderte Transmigration der CD4+ T-Zellen zu CXCL12 nach Vorbehandlung der LSEC mit PTX. LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell®-Einsätzen kultiviert und am nächsten Tag 2 h mit oder ohne PTX bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Transmigration von CD4+ T-Zellen in An- und Abwesenheit der LSEC untersucht und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert (A). Die Aktivität des PTX wurde im Endothel-freien Transmigrationsassay durch Vorbehandlung der transmigrierenden CD4+ T-Zellen mit steigenden PTX-Konzentrationen überprüft (B). Die Diagramme zeigen MW und SD eines repräsentativen von zwei unabhängigen Experimenten.

Die Präinkubation der Endothelzellen mit PTX zeigte wiederum keinen Effekt auf die Transmigration der CD4+ T-Zellen, wohingegen die Vorbehandlung der T-Zellen mit PTX erwartungsgemäß zu einer Dosis-abhängigen Blockade der Transmigration führte (Abb. 13B).

4.2.4.2 Konstitutive ICAM-1-Expression auf LSEC

Neben den Chemokinen nehmen die endothelialen Adhäsionsmoleküle Einfluß auf die Transmigration von Leukozyten. Das Adhäsionsmolekül ICAM-1 scheint dabei nicht nur für die Adhäsion, sondern auch für den Durchtritt der Lymphozyten durch das Endothel eine Rolle zu spielen [116] und wird auf LSEC konstitutiv auf hohem Level exprimiert. Daher wurde der Einfluss von ICAM-1 auf die Transmigration von CD4+ T-Zellen mit Hilfe von LSEC aus ICAM-1-/--Mäusen untersucht (Abb. 14).

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Die Transmigration zu CXCL12 durch ICAM-1-/--LSEC war mit 34,1 ± 10,2 % im Vergleich zur Transmigration durch wt-LSEC (49,6 ± 16,8 %) geringfügig, jedoch nicht signifikant reduziert (p = 0,11). Vergleichbares galt auch für die spontane Transmigration der T-Zellen.

Abb. 14: Kein drastischer Einfluß der ICAM-1-Expression auf LSEC auf die Transmigration von CD4+ T-Zellen. LSEC wurden aus wt- oder aus ICAM-1-/--Mäusen isoliert und auf FN-beschichteten Transwell®-Einsätzen kultiviert. Am nächsten Tag wurde die Transmigration von CD4+ T-Zellen aus der Milz durch LSEC aus wt- und aus ICAM-1-/--Mäusen untersucht und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert. Das Diagramm zeigt MW und SD von mindest. 4 unabhängigen Experimenten mit n.s. = nicht signifikant.

4.2.4.3 Chemokin-Präsentation auf der Oberfläche der LSEC

Endothelzellen können Chemokine aus der Umgebung aufnehmen und über Glykosaminoglykane (GAGs) präsentieren [23]. Diese auf Endothelzellen präsentierten Chemokine können im Vergleich zu löslichen Chemokinen zu einer effektiveren Aktivierung, verstärkten Adhäsion und erhöhten Transmigration der Lymphozyten führen [19].

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Zur Untersuchung der Chemokin-Präsentation durch GAGs wurde die Transmigration von CD4+ T-Zellen in Anwesenheit von LSEC gemessen, die mit dem GAG-schneidenden Enzym Heparinase I vorbehandelt worden waren (Abb. 15). Die Transmigration der T-Zellen durch Heparinase I behandelte LSEC entsprach der durch unbehandelte LSEC. Die Vorbehandlung zeigte damit keinen Effekt auf die Transmigration der CD4+ T-Zellen.

Abb. 15: Unveränderte Transmigration der CD4+ T-Zellen nach Vorbehandlung der LSEC mit Heparinase I. Die LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell®-Einsätzen kultiviert und am nächsten Tag mit oder ohne Heparinase I (Hep-I) für 2 h bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Transmigration von CD4+ T-Zellen im Endothel-freien System und durch Hep-I-behandelte bzw. durch unbehandelte LSEC untersucht und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert. Das Diagramm zeigt MW und SD von drei unabhängigen Experimenten.

Die Chemokin-Präsentation auf der Oberfläche der LSEC wurde dann durch Vorinkubation der Endothelzellen mit dem Chemokin weiter untersucht. Dazu wurden die LSEC von oben (= luminal) oder von unten (= abluminal) mit CXCL12 vorinkubiert. Während der Transmigrationsphase der T-Zellen wurde dann kein Chemokin verwendet. Abb. 16 zeigt, dass die Vorinkubation der LSEC mit dem Chemokin von oben im Vergleich zur spontanen Transmigration nicht zu einer signifikant erhöhten Transmigration der T-Zellen führte (9,0 ± 3,1 % bzw. 12,0 ± 11,5 %). Dies konnte auch in den Zeitrafferaufnahmen am Mikroskop beobachtet werden (Abb. 8C). Dagegen führte die Vorinkubation des Endothels mit dem Chemokin von unten zu einer signifikanten Steigerung der Transmigrationsrate auf 50,2 ± 16,5 %. Die LSEC waren somit in der Lage, das Chemokin auf ihrer Oberfläche zu binden und zu präsentieren, allerdings war ein Effekt auf die Transmigration der T-Zellen abhängig vom Ursprungsort des Chemokins.

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Abb. 16: Gesteigerte Transmigration der CD4+ T-Zellen nach Vorinkubation der LSEC mit CXCL12. Die LSEC wurden auf FN-beschichteten Transwell®-Einsätzen kultiviert und am nächsten Tag entweder von oben oder von unten für 2 h mit 50 nM CXCL12 inkubiert. Die spontane Transmigration von CD4+ T-Zellen wurde in Anwesenheit dieser vorbehandelten LSEC mit der durch unbehandelte LSEC ohne Chemokin bzw. mit der Chemotaxis zu CXCL12 verglichen und wie in Abb. 7 beschrieben quantifiziert. Das Diagramm zeigt MW und SD von 4-5 Experimenten mit n.s. = nicht signifikant und ** = p < 0,01.

4.3 Antigen-abhängige Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen durch LSEC

Im Unterschied zu anderen mikrovaskulären Endothelien besitzen die LSEC Charakteristika Antigen-präsentierender Zellen: Neben der Fähigkeit zur Antigen-Aufnahme exprimieren sie konstitutiv MHC-II- und kostimulatorische Moleküle [94,95,96]. Allerdings ist umstritten, ob es eine Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen durch LSEC-abhängige Antigen-Präsentation gibt. Einerseits ist die Induktion von Zytokinproduktion nachgewiesen [99], andererseits wird eine unzureichende T-Zell-Proliferation beschrieben [101].

Neben dem Einfluss der LSEC auf das Migrationsverhalten von CD4+ T-Zellen wurde daher im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit die Rolle der LSEC bei MHC-II restringierter Antigen-Präsentation näher untersucht.

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Ex vivo isolierte naive CD4+ T-Zellen wurden Antigen-spezifisch mit LSEC kokultiviert und anschließend analysiert. Hierfür wurden die CD4+ T-Zellen besonders sorgfältig aufgereinigt (z. T. mit vorgeschalteter Entfernung der APZ durch Depletion der MHC-II+, B220+, CD11b+ und CD11c+ Zellen) und ihre Reinheit im Proliferationsexperiment überprüft (CD4+ T-Zellen mit Antigen ohne APZ).

4.3.1  Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen durch LSEC bei hohen Antigen-Dosen

Zuerst wurden LSEC aus wt-Mäusen isoliert und mit naiven OVA-TZR transgenen CD4+ T-Zellen Antigen-spezifisch kultiviert. Als Kontroll-APZ wurden professionelle Milz-APZ aus wt-Mäusen verwendet. Die Proliferation der naiven CD4+ T-Zellen nach Kokultur mit den LSEC oder Milz-APZ wurde an Tag 3 und Tag 6 bei verschiedenen Antigen-Konzentrationen analysiert (Abb. 17).

An Tag drei war nach Kokultur mit den LSEC bei niedrigen Antigen-Dosen (0,01 µg/ml und 0,1 µg/ml OVA-Peptid) kaum Proliferation der CD4+ T-Zellen detektiertbar, erst bei hohen Antigen-Dosen (1 µg/ml und 5 µg/ml) zeigte sich Proliferation. Im Gegensatz dazu proliferierten die T-Zellen, die mit Milz-APZ kultiviert worden waren, schon bei niedrigen OVA-Konzentrationen; die mittlere Zellteilungsrate war signifikant erhöht. An Tag 6 war die Proliferation der T-Zellen nach Kokultur mit LSEC bei niedrigen Antigen-Dosen weiterhin signifikant niedriger als nach Kokultur mit Milz-APZ; bei hoher Antigen-Gabe war kein deutlicher Unterschied in der mittleren Zellteilungsrate mehr zu sehen.

↓51

Die LSEC waren somit nur bei hohen Antigen-Konzentrationen in der Lage, die Proliferation naiver CD4+ T-Zellen zu induzieren.

Abb. 17: Mittlere Zellteilungsrate der CD4+ T-Zellen an Tag 3 und 6 der Kokultur mit LSEC oder Milz-APZ und verschiedenen Antigen-Dosen. CFSE-markierte OVA-spezifische naive CD4+ T-Zellen aus DO11.10-Mäusen wurden mit verschiedenen OVA-Peptid-Konzentrationen in Anwesenheit von LSEC oder CD90- Milz-APZ aus wt-Mäusen kultiviert. Die Proliferation der T-Zellen wurde über das CFSE-Profil am Durchflusszytometer detektiert (A) und die mittleren Zellteilungsraten nach Kokultur mit LSEC oder Milz-APZ an Tag 3 (B) und Tag 6 (C) miteinander verglichen. Die Diagramme zeigen die Werte von 5-6 unabhängigen Experimenten mit ** = p < 0,01.

4.3.2 Myeloide APZ in der LSEC-Fraktion

4.3.2.1  Anteil myeloider APZ in der LSEC-Fraktion

Für die in vitro Untersuchungen zur Antigen-spezifischen Interaktion zwischen LSEC und T-Zellen ist die Reinheit der ex vivo isolierten Zellpopulationen von großer Bedeutung, da schon geringe Mengen professioneller APZ ausreichen, um die Proliferation von naiven T-Zellen zu induzieren. Daher wurde in der LSEC-Fraktion nicht nur der prozentuale Anteil der Endothelzellen überprüft, sondern auch der Anteil an nicht-endothelialen MHC-II+ Zellen.

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Die Reinheit der LSEC-Fraktion nach ex vivo Isolation und über-Nacht-Kultur wurde mit Fluoreszenz-konjugiertem AcLDL im Durchflusszytometer überprüft und lag jeweils bei über 95 %. Eine Analyse der nicht-endothelialen Zellen (AcLDL-) aus der LSEC-Isolation ergab, dass 0,48 ± 0,44 % (bezogen auf die Gesamtzellen) MHC-II+ waren. Zusätzlich wurden der Anteil verschiedener Marker für professionelle APZ bestimmt: 0,72 ± 0,15 % der Gesamtzellen waren CD11b+, 0,13 ± 0,12 % CD11c+ und 0,24 ± 0,24 % CD45R/B220+. Aufgrund der hohen Effizienz, naive CD4+ T-Zellen Antigen-spezifisch zu aktivieren, konnte eine Induktion der Proliferation von T-Zellen durch diese geringen Mengen kontaminierender professioneller APZ nicht ausgeschlossen werden.

4.3.2.2 Knochenmarkschimären als LSEC-Quelle ohne myeloide MHC-II-Expression

Um die Antigen-Präsentation über myeloide APZ auszuschließen, wurden Knochenmarkschimären (KMCh) aus C57Bl/6- und MHC-II-/--Mäusen generiert. Nach Bestrahlung wurden C57Bl/6-Mäuse mit MHC-II-/--Knochenmark rekonstituiert. Das führte zu fehlender MHC-II-Expression auf myeloiden Zellen, z. B. auf den professionellen APZ. In diesen chimären Mäusen war die MHC-II-Expression somit auf nicht-myeloide Zellen, z. B. Endothelzellen, beschränkt.

Um das Ausmaß der Depletion endogener Zellen sowie der Rekonstitution mit MHC-II-/--Zellen zu überprüfen, wurde den KMCh 6 Wochen nach Bestrahlung und Injektion des MHC-II-/--Knochenmarks Blut entnommen und dieses für MHC-II und CD4 gefärbt (Abb. 18A). Außerdem wurde der Anteil an MHC-II+-Zellen in Milz und Leber überprüft (Abb. 18B). Zellen aus C57Bl/6- oder MHC-II-/--Mäusen dienten dabei als Kontrollen.

↓53

Im Vergleich zu den wt-Mäusen wurde bei den KMCh der Anteil MHC-II+ Zellen im Blut von fast 60 % auf 0,11 ± 0,11 % gesenkt, in der Milz von 65 % auf 0,18 ± 0,25 %. In der Leber konnte der Anteil nicht-endothelialer MHC-II+-Zellen durch die Bestrahlung von ca. 35 % auf knapp 1 % reduziert werden. Dies bedeutete eine 99%ige Depletion der endogenen myeloiden in Blut und Milz und eine 95%ige Depletion in der Leber.

Abb. 18: Depletion endogener professioneller APZ und Rekonstitution mit MHC-II-/--Knochenmark. 6 Wochen nach Bestrahlung und Rekonstitution mit MHC-II-/--Knochenmark wurde den C57Bl/6-Rezipienten Blut entnommen und die Menge an MHC-II+ und CD4+ Zellen analysiert (A). 2-3 Wochen später wurden bei Milz- und Leberzellen Endothelzellen über den Antikörper ME-9F1 sowie MHC-II+ Zellen detektiert (B). Zellen von C57Bl/6- bzw. MHC-II-/--Mäusen dienten als Positiv- bzw. Negativkontrollen. Zur Überprüfung der funktionellen MHC-II-Expression wurden CD90- Milzzellen der KMCh zur Antigen-spezifischen in vitro Stimulation CFSE-markierter OVA-spezifischer naiver CD4+ T-Zellen eingesetzt. An Tag 3 nach Kokultur mit wt-, KMCh- oder MHC-II-/--Milzzellen wurde die Proliferation über den GeoMean der CFSE-Fluoreszenz-intensität detektiert (C). Mit dem GeoMean der Negativkontrolle (Kokultur ohne Antigen-Zugabe) = 100 % wurde anschließend der relative GeoMean nach Kokultur mit den verschiedenen Milzzellen berechnet und die Proliferation auf KMCh-Milzzellen mit der auf wt- und MHCII-/--Zellen verglichen (D). Es gilt n.s. = nicht signifikant und ** = p < 0,01.

Die Analyse am Durchflußzytemer zeigte ferner, dass die LSEC der KMCh (ME-9F1+) erwartungsgemäß nicht durch MHC-II- LSEC ersetzt wurden, sondern schwach MHC-II+ blieben (Abb. 18B).

↓54

In der Milz reagiert der Endothel-spezifische Antikörper ME-9F1 mit einer kleinen Zellpopulation (ca. 1 %), bei der es sich wahrscheinlich um NK-Zellen handelt (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise war der Anteil dieser ME-9F1+-Zellen in der Milz der MHC-II-/--Mäuse auf 4 % erhöht. Da die MHC-II-/--Maus kaum CD4+ T-Zellen enthält, könnte der erhöhte prozentuale Anteil der NK-Zellen auf den geringen prozentualen Anteil an CD4+ T-Zellen in der Milz (2 % statt 15-20 %) zurückzuführen sein.

Die Depletion endogener MHC-II+ professioneller APZ wurde außerdem in vitro funktionell überprüft: die Fähigkeit der Antigen-Präsentation wurde durch Antigen-spezifische Kultur CFSE-markierter naiver CD4+ T-Zellen mit CD90-depletierten Milzzellen der einzelnen KMCh getestet. An Tag 3 wurden die T-Zellen analysiert und der GeoMean der CFSE-Fluoreszenzintensität bestimmt (Abb. 18C, D). Nach Kokultur mit Milzzellen aus MHC-II-/--Mäusen wurde erwartungsgemäß keine Proliferation festgestellt. Der relative GeoMean lag bei 96,71 ± 6,38 % (mit GeoMean der Negativkontrolle, also Kokultur ohne Antigen = 100 %). Nach Kokultur mit wt-Milzzellen war der GeoMean der CFSE+ T-Zellen auf 29,71 ± 5,64 % reduziert, da die Zellen proliferiert waren. Nach Kokultur mit KMCh-Milzzellen war in 5 von 6 unabhängigen Experimenten (mit n = 21) keine bzw. nur minimale Proliferation meßbar. Trotz deutlicher T-Zell-Proliferation in einem Experiment (mit n = 5) war mit einem GeoMean von 84,00 ± 23,23 % kein signifikanter Unterschied zur Kokultur mit MHC-II/-Milzzellen vorhanden. Der GeoMean nach Kokultur mit wt-Milzzellen war dagegen signifikant vermindert. Somit zeigte auch der funktionelle Test die effiziente Depletion der endogenen professionellen APZ.

Der Anteil endogener MHC-II+-Zellen in der LSEC-Fraktion, der schon in den Fraktionen aus wt-Mäusen nur 1 % betrug, wurde durch Verwendung der Knochenmarkschimären um 95 % reduziert. Damit war die Menge myeloider APZ in der LSEC-Fraktion so gering, dass ein Einfluss auf die Proliferation von naiven T-Zellen ausgeschlossen werden konnte.

4.3.3 Proliferation naiver CD4+ T-Zellen nach Antigen-Präsentation durch LSEC

↓55

Für die Antigen-spezifische Kokultur mit naiven OVA-TZR transgenen CD4+ T-Zellen und 5 µg/ml OVA-Peptid wurden die LSEC aus wt-Mäusen und aus den KMCh isoliert. An Tag 6 wurden das Maß der Proliferation über CFSE-Profil und Zellzahl (Abb. 19), sowie die Zytokin-Produktion analysiert (Abb. 20).

Wie nach Kokultur mit den wt-LSEC proliferierten die naiven CD4+ T-Zellen auch in Anwesenheit der LSEC aus den KMCh. Das CFSE-Profil der CD4+ T-Zellen zeigte, dass nach Kokultur mit den KMCh-LSEC mehr T-Zellen in der ungeteilten Fraktion verblieben als nach Kokultur mit wt-LSEC (Abb. 19A). Auch die Zellzahl war mit 0,6·105 ± 0,3·105 niedriger als nach Kokultur mit wt-LSEC (1,6·105 ± 0,4·105) (Abb. 19B). Die Proliferation war nach Kokultur mit den Kontroll-APZ der wt-Milz am stärksten, es verblieben keine Zellen in der G0-Fraktion und die Zellzahl war mit 3,2·105 ± 0,8·105 signifikant höher als nach Kokultur mit den beiden LSEC-Fraktionen.

Abb. 19: Proliferation und IL-2-Produktion naiver CD4+ T-Zellen nach Antigen-spezifischer Kokultur mit LSEC aus KMCh. CFSE-markierte OVA-TZR transgene naive CD4+ T-Zellen wurden aus OT-II-Mäusen isoliert und mit 5 µg/ml OVA-Peptid und LSEC bzw. CD90- Milz-APZ aus C57Bl/6-Mäusen oder KMCh kultiviert. Nach 6 Tagen wurde das Maß der Proliferation über das CFSE-Profil (A) und über die Zellzahl (B) sowie die IL-2-Produktion (C) nach PMA/IM-Restimulation und intrazellulärer Färbung am Durchfluss-zytometer bestimmt. Die Dot Plots zeigen repräsentative CFSE-Profile. Das Diagramm zur Zellzahl zeigt MW und SD von 6 Experimenten, das Diagramm zur IL-2-Produktion MW und SD von 5-7 Experimenten mit n.s. = nicht signifikant, * = p < 0,05 und ** = p < 0,01.

↓56

Nach Kokultur mit den KMCh-Milzzellen ließ sich – wie schon in Abb. 18 für Tag 3 gezeigt – nur minimale Proliferation messen; die Zellzahl lag bei 0,2·105 ± 0,1·105. In der Negativkontrolle (CD4+ T-Zellen mit Antigen ohne APZ) war keine Proliferation detektierbar; die T-Zell-Fraktion enthielt somit keine kontaminierenden professionellen APZ. Da die meisten Zellen starben, war die Zellzahl an Tag 6 war sehr gering (< 0,02·105). Auch die Kokultur der T-Zellen mit den verschiedenen APZ ohne Antigen zeigte erwartungsgemäß keine Proliferation (Daten nicht gezeigt).

Somit ließ sich auch mit LSEC aus KMCh, bei denen ein Effekt durch professionellen APZ ausgeschlossen war, die Proliferation naiver CD4+ T-Zellen induzieren. Im Vergleich zur Kokultur mit wt-LSEC ließ sich hierbei ein quantitativer Unterschied feststellen, der auf die professionellen APZ in der wt-LSEC-Fraktion zurückzuführen sein könnte.

Da IL-2, das von aktivierten T-Zellen gebildet wird und z. B. als autokriner Wachstumsfaktor die Expansion der T-Zellen beeinflusst, wurde der Einfluss der LSEC auf die IL-2-Produktion untersucht. Nach PMA/IM-Restimulierung der CD4+ T-Zellen wurde IL-2 intrazellulär angefärbt und im Durchflusszytometer detektiert (Abb. 19C).

↓57

Nach Kokultur der naiven CD4+ T-Zellen mit wt-LSEC waren 40,15 ± 9,14 % IL-2-Produzenten detektierbar, nach Kokultur mit LSEC aus KMCh nur 11,73 ± 5,24 %. Diese signifikant geringere IL-2-Produktion könnte für die niedrigere Zellzahl nach Kokultur mit KMCh-LSEC verantwortlich sein.

Nach Kokultur mit professionellen Milz-APZ aus wt-Mäusen lag der Anteil der IL-2-Produzenten bei 40,66 ± 17,80 %. Dies ist vergleichbar mit der IL-2-Produktion nach Kokultur mit wt-LSEC. Bei letzterer wurde dennoch eine signifikant geringere Zellzahl detektiert. Möglicherweise war bei Kokultur mit Milz-APZ an Tag 6 die maximale IL-2-Produktion schon überschritten, so dass ein Unterschied in der IL-2-Produktion nur zu Beginn der Kokultur detektiert werden könnte.

4.3.4 Keine Differenzierung in Effektorzellen nach Antigen-Präsentation durch LSEC

Neben der Proliferation wurde auch der Einfluss der LSEC auf die Differenzierung der CD4+ T-Zellen untersucht. Dazu wurden die Zellen ohne Zugabe weiterer Zytokine kokultiviert („neutrale Kultur“). An Tag 6 der Kokultur wurde dann die Frequenz der IFN-γ-, IL-4- und IL-10-Produzenten mittels intrazellulärer Zytokinfärbung nach PMA/IM-Restimulation bestimmt (Abb. 20).

↓58

Nach Kokultur mit wt- oder KMCh-LSEC produzierten nur ca. 2 % der T-Zellen IFN-γ, während 17,13 ± 7,50 % der CD4+ T-Zellen, die mit APZ aus wt-Milzen kokultiviert worden waren, IFN-γ produzierten. Nach Kokultur mit Milzzellen aus KMCh wurden ebenfalls ca. 2 % IFN-γ+ Zellen detektiert. IL-4- und IL-10-Produzenten wurden nicht generiert. Eine Differenzierung zu IFN-γ-produzierenden Zellen ließ sich somit nur auf den professionellen APZ aus wt-Milzen erreichen. Auf LSEC – sowohl aus wt-Mäusen als auch aus KMCh – war die Generierung dieser Effektorzellen nicht zu beobachten.

Abb. 20: Fehlenden Expression von IFNγ, IL-4 und IL-10 nach Antigen-spezifischer Kokultur mit LSEC. CFSE-markierte OVA-spezifische naive CD4+ T-Zellen wurden aus OT-II-Mäusen isoliert und für 6 Tage mit 5 µg/ml OVA-Peptid und LSEC bzw. CD90- Milz-APZ aus C57Bl/6-Mäusen oder KMCh kultiviert. Nach PMA/IM-Restimulierung wurde intrazelluläres IFN-γ, IL-4 und IL-10 am Durchflusszytometer detektiert.
Die Diagramme zeigen MW und SD von 5-7 unabhängigen Experimenten mit n.s. = nicht signifikant und ** = p < 0,01.

4.3.5 Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen unbeeinflusst vom Stimulationsgrad der LSEC

Nach Stimulation mit pro-inflammatorischen Zytokinen oder mikrobiellen Substanzen ist auf Endothelzellen die Expression von MHC-II sowie die verstärkte Expression von kostimulatorischen und Adhäsionsmolekülen zu beobachten [50,117,118,119,120]. Um die Auswirkung der Stimulation von LSEC auf die Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu untersuchen, wurden die LSEC für 24 h mit IFN-γ und TNF-α inkubiert und dann in der Antigen-spezifischen Kokultur mit naiven CD4+ T-Zellen aus OVA-TZR transgenen Mäusen eingesetzt. Die Analyse der LSEC im Durchflusszytometer zeigte erwartungsgemäß eine Heraufregulierung der MHC-II-Expression (Abb. 21A). Bei den wt-LSEC stieg der Anteil der Endothelzellen mit deutlicher MHC-II-Expression von 4,25 ± 2,10 % auf 16,55 ± 4,71 %. Dies war bei den LSEC aus KMCh mit einem Anstieg von 3,18 ± 1,25 % auf 20,20 ± 6,98 % ähnlich. Auch die ICAM-1-Expression, die schon ohne Stimulation auf der gesamten LSEC-Population sehr hoch war, konnte durch die pro-inflammatorischen Zytokine gesteigert werden: Im Durchflusszytometer war nach Stimulation der wt- und KMCh-LSEC eine Verdopplung der mittleren Fluoreszenzintensität zu beobachten.

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Um den Einfluss der aktivierten LSEC auf die Stimulation der naiven CD4+ T-Zellen zu untersuchen, wurden auch hier Zellzahl, sowie die Produktion der Zytokine IL-2 und IFN-γ bestimmt (Abb. 21B-D). Nach Kokultur mit LSEC aus KMCh führte die Aktivierung des Endothels weder zur veränderten Expansion noch war die Zytokinproduktion beeinflusst. Trotz der erhöhten MHC-II- und ICAM-1-Expression waren die LSEC nicht in der Lage, eine stärkere Aktivierung der T-Zellen herbeizuführen.

Interessanterweise konnte nach Kokultur mit wt-LSEC durch die Aktivierung des Endothels ein Effekt detektiert werden: Die Kokultur mit aktivierten wt-LSEC führte zu einer verminderten Zellzahl und IL-2-Produktion. Dies könnte auf einen Effekt von IFN-γ und/oder TNF-α auf die Wechselwirkung zwischen den wenigen professionellen APZ und den LSEC bzw. T-Zellen zurückzuführen sein, der möglicherweise durch Deletion dieser Zellen die erhöhte Proliferation und IL-2-Produktion im Vergleich zur Kokultur mit KMCh-LSEC verhindert hat. Ein Effekt auf die IFN-γ-Produktion der CD4+ T-Zellen war aber auch hier nicht detektierbar.

Abb. 21: Trotz Stimulation der LSEC unveränderter Phänotyp der naiven CD4+ T-Zellen nach Antigen-spezifischer Kokultur. LSEC wurden aus C57Bl/6-Mäusen oder KMCh isoliert und mit 10 ng/ml IFN-γ und 20 ng/ml TNF-α für 24 h inkubiert. Die Expression von MHC-II und ICAM-1 auf unbehandelten und stimulierten LSEC wurde im Durchflusszytometer analysiert (A). Nach Kokultur von CFSE-markierten OVA-spezifischen naiven CD4+ T-Zellen aus OT-II-Mäusen mit diesen LSEC und 5 µg/ml OVA-Peptid wurde an Tag 6 der Kokultur die Zellzahl der CD4+ T-Zellen (B) und deren Expression von IL-2 (C) und IFN-γ (D) nach PMA/IM-Restimulation ermittelt. Die Daten eines repräsentativen von 4 unabhängigen Experimenten sind dargestellt.

4.3.6 Induktion eines undifferenzierten, reversiblen Phänotyps nach Antigen-Präsentation durch LSEC

↓60

Neben Deletion von Effektorzellen oder Suppression durch regulatorische Zellen ist die Entwicklung anerger T-Zellen, also T-Zellen mit fehlender Effektorfunktion, ein Mechanismus der peripheren Toleranz. Bisher konnte in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden, dass die Aktivierung der naiven CD4+ T-Zellen durch LSEC zwar zur Proliferation der T-Zellen, nicht aber zu Generierung von Effektorzellen führt. Nun sollte geklärt werden, ob diese fehlende Effektorfunktion auf einen irreversibel anergen Zustand der T-Zellen zurückzuführen ist.

Dazu wurden naive CD4+ T-Zellen in der ersten Woche Antigen-spezifisch mit LSEC kultiviert und in der zweiten Woche entweder mit professionellen Milz-APZ oder erneut mit LSEC (LSEC/Milz bzw. LSEC/LSEC). Zum Vergleich wurden naive CD4+ T-Zellen zuerst Antigen-spezifisch mit Milz-APZ kultiviert und in der zweiten Woche entweder mit LSEC oder erneut mit Milz-APZ (Milz/LSEC bzw. Milz/Milz). Nach PMA/IM-Restimulation wurde dann die IFN-γ-Produktion der T-Zellen intrazellulär überprüft (Abb. 22).

An Tag 6 konnten – wie erwartet – nach Kokultur mit den Milz-APZ 14,76 ± 10,99 % IFN-γ+ CD4+ T-Zellen detektiert werden; nach Aktivierung durch die LSEC nur ca. 2 %. Nach einer zweiten Antigen-spezifischen Stimulation der von den LSEC aktivierten Zellen durch professionelle APZ wurden an Tag 12 eine Steigerung der IFN-γ-Produktion auf 11,60 ± 10,46 % detektiert. Dagegen war nach einer zweiten Stimulation durch LSEC der Anteil IFN-γ-produzierender Zellen mit knapp 1 % weiterhin minimal. Die zuerst mit professionellen Milz-APZ kultivierten IFN-γ-produzierenden T-Zellen zeigten auch nach zweiter Stimulation mit Milz-APZ eine gleich bleibende IFN-γ-Expression von 16,19 ± 12,60 %. Eine zweite Kultivierungsrunde auf LSEC führte bei diesen Zellen zu einer reduzierten, aber nicht signifikant niedrigeren IFN-γ-Produktion von 10,58 ± 3,72 %.

↓61

Die Aktivierung der naiven CD4+ T-Zellen durch LSEC führte somit zwar zur Expansion von T-Zellen ohne Effektorzytokin-Expression, die Differenzierung in Effektorzellen konnte aber durch eine zweite Stimulierung mit professionellen APZ induziert werden. Die CD4+ T-Zellen waren somit während der initialen Aktivierung durch LSEC nicht irreversibel anergisiert worden.

Abb. 22: Reversibler Phänotyp bei naiven CD4+ T-Zellen nach Aktivierung durch LSEC. CFSE-markierte OVA-TZR transgene naive CD4+ T-Zellen aus DO11.10-Mäusen wurden mit 5 µg/ml OVA-Peptid und LSEC oder CD90- Milz-APZ aus wt-Mäusen kultiviert. Nach 6 Tagen wurden die T-Zellen abgeerntet und mit 5 µg/ml OVA-Peptid und frisch isolierten LSEC bzw. Milz-APZ erneut kultiviert: CD4+ T-Zellen, die zuvor von LSEC aktiviert worden waren, wurden für weitere 6 Tage mit Milz-APZ kultiviert und vice versa. An Tag 0, 6 und 12 wurde nach PMA/IM-Restimulation nach intrazellulärer Färbung der Anteil an IFN-γ-Produzenten bestimmt. Das Diagramm zeigt MW und SD von 12 unabhängigen Experimenten an Tag 6 und von 5 unabhängigen Experimenten an Tag 12 mit * = p < 0,05 und ** = p < 0,01.


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05.12.2006