5 Diskussion

↓61

Eine wichtige Aufgabe des sinusoidalen Endothels der Leber ist der rasche Austausch von Makromolekülen zwischen sinusoidalem Lumen und Leber-Parenchym. Neben den Nährstoffen, die die Leber v. a. mit dem Blut aus dem Darm erreichen, gelangen auch T-Zellen und andere Leukozyten in die Sinusoide. Aufgrund des langsamen Blutflusses in der Leber bewegen sich diese nicht sehr schnell durch die Leber und können aufgrund des geringen Durchmessers der Sinusoide direkt mit den sinusoidalen Endothelzellen in Kontakt treten [121].

↓62

In der vorliegenden Arbeit wurden zwei verschiedene Aspekte der Interaktion der sinusoidalen Endothelzellen mit CD4+ T-Zellen in vitro untersucht: Zum einen die transendotheliale Migration von CD4+ T-Zellen, zum anderen die Fähigkeit der sinusoidalen Endothelzellen, CD4+ T-Zellen Antigen-abhängig zu stimulieren.

5.1  Ex vivo Isolation der LSEC mit Hilfe des Antikörpers ME-9F1

Um die Modulation von CD4+ T-Zellen durch LSEC in vitro untersuchen zu können, ist es notwendig, eine Methode zur Isolation der Endothelzellen einzusetzen, die neben einer guten Reinheit auch eine ausreichende Ausbeute garantiert.

In der vorliegenden Arbeit wurden die LSEC ex vivo durch magnetische Sortierung mit dem Antikörper ME-9F1 isoliert. Das Hybridom wurde 1992 im Rahmen einer Doktorarbeit durch Fusion einer Myelomalinie mit Milzzellen aus Ratten, die mit der Endothelzelllinie TME-3H3 immunisiert worden waren, generiert. Der Antikörper färbt das Kapillarendothel in Peyer´s Patches, peripheren Lymphknoten, Niere, Leber, Milz, Skelettmuskel, Haut und Gehirn. Ansonsten werden die glatte Muskulatur des Dünndarms und das Trabekelwerk der Milz angefärbt [122].

↓63

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Antikörper nicht nur in der Immunhistologie und Durchflusszytometrie einsetzbar ist, bei der sich eine Kofärbung mit dem Panendothelzellmarker Meca32 zeigt, sondern auch in der magnetischen Separation der LSEC von den übrigen nicht-parenchymatischen Leberzellen (Abb. 6). Mit einer Ausbeute von ca. 2-4x106 Zellen pro Leber war keine Expansion der ex vivo isolierten Zellen notwendig und nach über-Nacht-Kultur wurde eine Reinheit der LSEC von über 95 % erreicht. Mittlerweile ist der Antikörper ME-9F1 – direkt an magnetische Beads gekoppelt – zur LSEC-Isolation bei Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach kommerziell erhältlich.

Eine vergleichbare Isolationsmethode ist für mikrovaskuläre Endothelzellen aus den murinen peripheren Organen Lunge und Herz beschrieben [123], bei der zur magnetischen Sortierung anti-CD31 (PECAM-1), anti-CD105 (Endoglin) und Isolectin B-4 verwendet werden. Diese Methode ist zwar ebenfalls schnell und ohne besondere Geräteausstattung durchführbar, bringt jedoch nur geringe Ausbeuten. Die Endothelzellen müssen in vitro über meherer Passagen expandiert werden, bevor sie für Experimente verwendet werden können.

Speziell für die sinusoidalen Endothelzellen der Leber gibt es eine Isolationsmethode, bei der neben den LSEC auch die Leber-residenten Makrophagen, die Kupffer Zellen, mittels zentrifugaler Elutriation von den übrigen hepatischen Zellen getrennt werden [124]. Aufgrund der guten Ausbeute können die so isolierten LSEC ohne Expansion über mehrere Passagen eingesetzt werden [96]. Die Methode erfordert jedoch eine spezielle Ausstattung wie Elutriationszentrifuge und -rotor.

↓64

Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzte Methode zur LSEC-Isolation vereinigt somit die Vorteile der beiden beschriebenen alternativen Prozeduren: eine weniger aufwändige magnetischen Anreicherung mit einem Endothel-spezifischen Antikörper und eine gute Ausbeute.

5.2 Einfluss der LSEC auf die Transmigration von CD4+ T-Zellen

In der Leber finden sich Leber-residente Lymphozyten nicht nur während Infektion oder Inflammation, sondern auch unter physiologischen Bedingungen sowohl innerhalb der Sinusoide als auch im Parenchym. In der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, inwieweit die LSEC an der Rekrutierung von zirkulierenden CD4+ T-Zellen beteiligt sein könnten, indem sie das Migrationsverhalten der T-Zellen beeinflussen.

5.2.1  Erhöhte Transmigration durch LSEC im Vergleich zu anderen Endothelien

Es konnte gezeigt werden, dass LSEC im Vergleich zu anderen Endothelien die Fähigkeit haben, sowohl die spontane transendotheliale Migration von T-Zellen zu erhöhen als auch deren Migration zu bestimmten Chemokinen – zu CXCL9 und CXCL12 – zu steigern.

↓65

Transmigration von Lymphozyten durch endotheliale Barrieren ist sowohl für lymphoide als auch für nicht-lymphoide mikrovaskuläre Endothelien gezeigt worden. So wandern rezirkulierende Lymphozyten durch die Endothelzellen der HEV in die sekundären Organe ein [125]. In vitro Studien zur Diapedese von Leukozyten verwenden mikrovaskuläre primäre Endothelzellen oder Endothelioma aus verschiedenen Geweben, wie Nabelschnur, Lymphknoten, Haut, Thymus oder Gehirn [111,116,126,127,128,129,130]. Durch die aus primärem Hirnendothel generierte Linie bEND5 konnte die spontane Migration von Memory T-Zellen, aber auch von naiven T-Zellen gezeigt werden; im Vergleich zur Migration durch Endothel-freie Transwell®-Einsätze war die Migration allerdings vermindert [111]. Diese Endothelzelllinie bEND5 kann als Modell für mikrovaskuläres Endothel peripherer Organe eingesetzt werden, da die Zellen nicht mehr die komplexen Tight Junctions der Blut-Gehirn-Schranke besitzen [111,116]. Dazu scheinen sie im Vergleich zur in vivo Situation höhere Permeabilität und einen geringeren transendothelialen elektrischen Widerstand aufzuweisen [131,132].

In der vorliegenden Arbeit ließ sich die reduzierte transendotheliale Migration nicht nur durch die Zelllinie bEND5, sondern auch durch die Zelllinie mlEND beobachten (Abb. 7). Die Linie mlEND wurde aus mesenterialen Lymphknoten generiert und repräsentiert somit lymphoides mikrovaskuläres Endothel [109]. Wie die bEND5-Zellen trägt diese Linie das Polyomavirus middle-T onkogene, das spezifisch Endothelzellen immortalisiert, dabei aber Charakteristika nicht-transformierter Zellen, wie Expression des von-Willebrand-Faktors oder in vitro Kontaktinhibition, bewahrt [133,134]. Daher wurden beide Endothelioma trotz Immortalisierung als Vergleichsendothelien zu den LSEC herangezogen.

Beide Endothelien fungierten im Vergleich zum Endothel-freien System für die Transmigration der CD4+ T-Zellen eher als Barrieren. In Anwesenheit der bEND5 bzw. mlEND mussten die T-Zellen nicht nur durch die Transwell®-Membran, sondern auch durch einen endothelialen Monolayer wandern, der die Poren der Membran bedeckte. Im Gegensatz dazu war durch die LSEC trotz des endothelialen Monolayers auf der Transwell®-Membran im Vergleich zum Endothel-freien System eine ähnliche Migrationsrate zu beobachten. Dies weist auf einen aktiven Beitrag der LSEC an der transendothelialen Migration hin.

↓66

Die im Gegensatz zu den Kontrollendothelien gesteigerte Migration durch die LSEC könnte zusätzlich durch bestimmte Eigenschaften der LSEC unterstützt worden sein: Sie sind nicht nur aufgrund der Fenestrae und der fehlenden Basallamina als spezialisiertes Endothel zu bezeichnen, sondern auch aufgrund fehlender Tight Junctions [135] und bilden im Gegensatz zu anderen mikrovaskulären Endothelzellen eine diskontinuierliche Barriere zwischen sinusoidalem Lumen und Leber-Parenchym [59,136]. Die erhöhte spontane Migration durch LSEC – im Vergleich zur Migration durch bEND5 und mlEND – könnte somit auch auf die geringer organisierten Zell-Zell-Kontakte zurückzuführen sein, die die interendotheliale Transmigration durch die LSEC erleichtern.

Unter physiologischen Bedingungen werden verschiedene Chemokine in der Leber exprimiert, die an der homeostatischen Rekrutierung von T-Zellen in die Leber beteiligt sein könnten [64]: Im humanen System wurde gezeigt, dass z. B. CXCL9 und CXCL10 von sinusoidalen Endothelzellen, CXCL12 und CXCL16 von Cholangiozyten exprimiert werden. Des Weiteren werden DCs und Makrophagen in den Periportalfeldern mit der Expression von CCL20 assoziiert; erstere auch mit der Expression von CCL21 [73].

In der vorliegenden Arbeit wurde die Chemotaxis von CD4+ T-Zellen zu verschiedenen Chemokinen in Anwesenheit der LSEC untersucht: Die Experimente zeigten im Vergleich zum Endothel-freien System einen signifikanten additiven Effekt der LSEC auf die gerichtete Migration zu bestimmten Chemokinen (Abb. 9). Die Anwesenheit der Kontrollendothelien hingegen führte zu einer signifikant geringeren Migration. Die LSEC wirkten dabei nicht als Filter für bestimmte T-Zell-Subsets, z. B. bestimmte Zytokin-Produzenten, sondern steigerten den chemotaktischen Effekt von CXCL9 und CXCL12 bei allen responsiven Populationen. Die Zusammensetzung der Leber-residenten Lymphozyten, die im Vergleich zu Zellen aus Blut oder lymphoiden Organen einen erhöhten Anteil an Effektor/Memory-Zellen aufweisen [55], scheint somit nicht durch einen Einfluss der LSEC auf die Transmigration bestimmter Subpopulationen, sondern vor allem durch die vorhandenen Chemokine reguliert zu werden.

5.2.2 Mechanismus für die erhöhte Transmigration von CD4+ T-Zellen in Anwesenheit der LSEC

↓67

Die Transmigration von Leukozyten wird zum einen durch die Kombination vorhandener Chemokine und der zugehörigen Chemokinrezeptoren auf den Leukozyten reguliert, zum anderen durch die Zusammensetzung der Adhäsionsmoleküle auf den Leukozyten und den Endothelzellen. Hierbei ist neben der Aktivierung der Leukozyten, Signaltransduktion zur Änderung der Integrin-Affinität, auch die der Endothelzellen erforderlich, z. B. zur Umorganisation des Zytoskeletts [137,138,139,140].

In der vorliegenden Arbeit wurde zuerst die direkte Aktivierung der LSEC durch Chemokine untersucht, um die erhöhte Transmigration in Anwesenheit der LSEC zu erklären. Des Weiteren wurde der Einfluß endothelialer Adhäsionsmoleküle und die Fähigkeit der LSEC zur effizienten Chemokin-Präsentation überprüft.

Da die Expression von CXC-Chemokinrezeptoren für Endothelzellen bekannt ist [114], sollte geklärt werden, ob die LSEC direkt von den in den Experimenten verwendeten Chemokinen CXCL9 und CXCL12 aktiviert wurden und dadurch die erhöhte Transmigration zu erklären ist. Mit LSEC aus CXCR3-/--Mäusen ließ sich jedoch keine verminderte Transmigration der T-Zellen beobachten; somit ließ sich ein Aktivierung der LSEC über CXCL9/CXCR3-Interaktion ausschließen (Abb. 12). Da CXCR4-/--Mäuse perinatal sterben [69], konnte die mögliche Aktivierung der LSEC durch CXCL12 nicht mit LSEC aus CXCR4-/--Mäusen überprüft werden. Daher wurden LSEC mit Pertussis Toxin (PTX) inkubiert, welches die Gi-Protein gekoppelte Signaltransduktion, die nach Chemokin/Rezeptor-Interaktion stattfindet, blockiert [11]. Auch hier ließ sich kein Unterschied in der Transmigration der CD4+ T-Zellen durch PTX-behandelte oder unbehandelte LSEC feststellen (Abb. 13). Dagegen ließ sich durch Vorbehandlung der T-Zellen mit PTX erwartungsgemäß deren Transmigration dosisabhängig blockieren. Wie schon für HEV aus Lymphknoten gezeigt, konnte bestätigt werden, dass zwar die Vorbehandlung der T-Zellen, nicht aber die der Endothelzellen zur Blockade der Transmigration führen kann [141]. Durch die generelle Blockade der Chemokinrezeptorfunktion mittels PTX ließ sich ausschließen, dass eine direkte Aktivierung der LSEC über Chemokinrezeptoren für die gesteigerte Transmigration der T-Zellen verantwortlich war.

↓68

Die Transmigration ist nicht nur abhängig von der Art der Chemokine, sondern auch von der Kombination der Adhäsionsmoleküle auf den Endothelzellen [3]. Im humanen System wird dem Adhäsionsmolekül VAP-1 eine besondere Rolle bei der Leukozyten-Rekrutierung in die Leber zugeschrieben. Es ist – ebenso wie ICAM-1 – auf LSEC konstitutiv exprimiert und scheint an der Adhäsion und Transmigration durch LSEC beteiligt zu sein [142]. Da VAP-1 in der murinen Leber zwar stark auf dem Endothel der Zentralvene, auf den LSEC aber sehr schwach bis gar nicht exprimiert ist [143], scheint der Einfluss von VAP-1 auf die Transmigration von Lymphozyten im murinen System jedoch nicht sehr wahrscheinlich. Für ICAM-1 dagegen konnte im murinen System ein Einfluss auf die Retention von CD8+ T-Zellen in der Leber gezeigt werden [144]. Darüber hinaus spielt ICAM-1 bei der in vivo Akkumulation von NKT-Zellen in der Leber eine Rolle [145,146,147]. In vitro ist ICAM-1, aber auch ICAM-2 für die Transmigration von T-Zellen durch Hirnendothel essentiell [129]. Es ist nicht nur an der festen Adhäsion von Leukozyten an das Endothel, sondern auch an der transendothelialen Migration beteiligt [116]. In der vorliegenden Arbeit konnte allerdings gezeigt werden, dass eine fehlende ICAM-1-Expression auf den LSEC weder bei der spontanen Migration durch diese LSEC noch bei der Chemotaxis zu CXCL12 zu einer signifikanten Verminderung führte (Abb. 14). Die hohe ICAM-1-Expression der LSEC scheint somit nicht für den additiven Effekt bei der transendothelialen Migration von CD4+ T-Zellen verantwortlich zu sein.

Für Endothelzellen ist durch Immobilisierung von Chemokinen auf der Oberfläche eine lokale Erhöhung der Chemokinkonzentration und damit der transendothelialen Migration beschrieben [19]. Chemokine können aufgrund ihrer basischen Eigenschaft über negativ geladene Glykosaminoglykane (GAGs) auf der Oberfläche von Endothelzellen präsentiert werden. Da sich die Bindungsstellen für die GAGs und die zugehörigen Chemokinrezeptoren unterscheiden, können immobilisierte Chemokine weiterhin von anderen Zellen über den spezifischen Rezeptor erkannt werden [14,15]. Die Immobilisierung von Chemokinen lässt sich durch eine Behandlung mit GAG-schneidenden Enzymen verhindern. So verliert subendotheliale Extrazelluläre Matrix (EZM) nach Behandlung mit Heparinase die Fähigkeit der Chemokin-Bindung und die Adhäsion von CD4+ T-Zellen an die EZM wird reduziert [148]. Des Weiteren wurde auf HeLa-Zellen eine Verringerung an gebundenen CXCL12 nach Behandlung mit Heparinase oder Heparitinase I, nicht jedoch mit Chondroitinase beschrieben [149]. In der vorliegenden Arbeit wurden die LSEC vor dem Chemotaxisassay mit Heparinase-I behandelt, dessen Aktivtität – wie vom Hersteller empfohlen – über Heparin-Spaltung am Photometer nachgewiesen wurde (Daten nicht gezeigt). Dies führte jedoch nicht zu einer verminderten Anzahl migrierender T-Zellen (Abb. 15). Die Bindung der Chemokine auf den LSEC scheint somit nicht von Heparinase-I sensitiven GAGs abhängig zu sein. Eine Immobilisierung der Chemokine über andere GAGs, wie Dermatansulfat oder Chondroitinsulfat, könnte mittels Behandlung der LSEC mit Chondroitinase oder Trypsin überprüft werden.

Ein weiterer Bindungspartner für Chemokine ist DARC (Duffy antigen/receptor for chemokines) [23]. Dieses Glykoprotein wurde zuerst auf roten Blutkörperchen beschrieben und dient als Rezeptor für den Malariaparasiten Plasmodium vivax. Für DARC ist bisher kein Mechanismus zur Signaltransduktion bekannt. Es besitzt zwar eine Sieben-Transmembrandomäne ähnlich den Chemokinrezeptoren, ist aber nicht G-Protein gekoppelt [150]. Trotzdem könnte DARC durch Immobilisierung und damit Präsentation von Chemokinen eine Rolle für die Chemotaxis von Leukozyten spielen. Da eine Expression von DARC zwar u. a. auf den sinusoidalen Endothelzellen der Milz und des Knochenmarks, nicht aber auf den LSEC beschrieben ist [151], scheint eine Rolle bei der Chemokin-Präsentation auf LSEC nicht sehr wahrscheinlich und wurde daher in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht.

↓69

Um die mögliche Chemokin-Bindung über GAGs auf den LSEC genauer zu untersuchen, wurden die Endothelzellen mit dem Chemokin CXCL12 vorinkubiert. Ein direkter Effekt des Chemokins auf die LSEC über Chemokin/Rezeptor-Interaktion konnte dabei ausgeschlossen werden, da – wie oben diskutiert – eine Behandlung der LSEC mit PTX ohne Effekt blieb. Die Chemokin-Vorinkubation bewirkte allerdings nur dann eine Steigerung der Transmigration, wenn das Chemokin von unten (abluminal) gegeben wurde. Die Inkubation von oben (luminal) führte weder bei den Zeitrafferaufnahmen am Phasenkontrastmikroskop noch im Transwell®-System zu erhöhten Migrationsraten der CD4+ T-Zellen (Abb. 8, 16). Somit scheint die Immobilisierung des Chemokins auf der LSEC-Oberfläche allein nicht ausreichend, eine gesteigerte Transmigration von T-Zellen zu induzieren. Es scheint zusätzlich notwendig, dass sich das Chemokin während der Präinkubation an der Endothel-Unterseite befindet. Ohne diese zweite Bedingung hätte auch die Präinkubation von oben eine erhöhte Transmigration der T-Zellen hervorrufen müssen.

Für einige Chemokine (CXCL8, CCL2, CCL19 oder CCL21) konnte mittlerweile gezeigt werden, dass Endothelzellen diese Chemokine über Transzytose von der abluminalen zur luminalen Seite transportieren und dort präsentieren können [20,24,25,26]. Dabei erscheint die Interaktion mit GAGs notwendig, wie Experimente mit mutiertem CXCL8 zeigen, das bei fehlender Bindungsfähigkeit zu Heparansulfat nicht mehr transportiert werden kann [20]. Hierbei kommt es nicht zu einer gleichmäßigen Verteilung entlang der Endotheloberfläche, sondern CXCL8 wird auf den Spitzen der Mikrovilli zusammen mit bestimmten Adhäsionsmolekülen wie ICAM-1 präsentiert. Diese Kolokalisation der an der transendothelialen Migration beteiligten Moleküle resultiert dann in erhöhter Transmigration. Die Transzytose dient somit der lokalen Präsentation der im Gewebe produzierten Chemokine, um Lymphozyten ins Gewebe zu rekrutieren [20]. Der Effekt der gesteigerten Chemotaxis nach abluminaler Präinkubation der LSEC mit CXCL12 passt in dieses Modell (Abb. 23). Die LSEC scheinen somit die Fähigkeit der effizienten Aufnahme und Transzytose bestimmter Chemokine zu besitzen; eine Fähigkeit, die die gesteigerte Chemotaxis der CD4+ T-Zellen erklärt.

Abb. 23: Modell zur effizienten Chemokin-Präsentation durch die LSEC nach Middleton et al., 2002. Chemokine, die sich abluminal der LSEC befinden (A), werden von den LSEC aufgenommen und in Caveolae transzytiert; ein Prozess, der die Bindung an Glykosaminoglykane (GAGs) beinhaltet. Auf der luminalen Seite werden die Chemokine dann auf den Spitzen endothelialer Mikrovilli effizient präsentiert (B). Nach Interaktion mit Chemokinrezeptoren auf der T-Zelloberfläche kommt es zur Integrin-Aktivierung und fester Adhäsion, was in effizienter Transmigration der T-Zellen durch die LSEC resultiert.

5.3 Antigen-abhängige Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen durch LSEC

↓70

Aufgrund der Fähigkeit zur Antigen-Aufnahme und -Präsentation sowie der Expression kostimulatorischer Moleküle gehören die LSEC neben hepatischen DCs und Kupffer Zellen zu den Leber-spezifischen Antigen-präsentierenden Zellen [94,99,152,153]. Neben dem Einfluss der LSEC auf das Migrationsverhalten von CD4+ T-Zellen sollte daher in der vorliegenden Arbeit geklärt werden, welcher Effekt auf naive CD4+ T-Zellen nach Antigen-Präsentation durch LSEC zu beobachten ist und inwieweit dies bei der Induktion von peripherer Toleranz eine Rolle spielen könnte.

Bisher konnte mit zwei unterschiedlichen experimentellen Systemen gezeigt werden, dass in vivo die Cross-Präsentation von exogenem Antigen durch LSECbei CD8+ T-Zellen zu Immuntoleranz führt [90,98]. Auch scheinen LSEC in vitro an der alloreaktiven Toleranzinduktion von CD4+ T-Zellen beteiligt zu sein [97,153] und können – neben Kupffer Zellen und Hepatozyten – die Suppressoraktivität regulatorischer CD4+ T-Zellen in vitro stimulieren [100]. Um zunächst zu klären, ob LSEC als nicht-professionelle APZ generell in der Lage sind, naive CD4+ T-Zellen zu aktivieren, wurden in vitro Antigen-spezifische Kokulturen durchgeführt und der Phänotyp der CD4+ T-Zellen nach Kokultur mit den LSEC genauer untersucht.

5.3.1  Ausschluss kontaminierender professionelle APZ

Bei der Untersuchung der Aktivierung naiver T-Zellen durch nicht-professionelle APZ spielt die Reinheit der ex vivo isolierten Zell-Populationen eine große Rolle. Es muss eine Kontamination mit professionellen APZ ausgeschlossen werden, da diese – v. a. die dendritischen Zellen – sehr effiziente Antigen-Präsention und Kostimulation aufweisen und so schon in sehr geringer Anzahl eine Aktivierung auslösen und damit die Ergebnisse beeinflussen können.

↓71

Nach der ex vivo Isolation der LSEC waren bei einer Reinheit von > 95 % geringe Mengen professioneller APZ in der Endothelzell-Fraktion vorhanden. Um eine LSEC-Fraktion ohne MHC-II+ professionelle APZ zu erhalten, wurden die Endothelzellen aus Knochenmarks-chimären (KMCh) isoliert, bei denen die MHC-II-Expression auf professionellen myeloiden APZ fehlt, aber auf nicht-professionellen APZ, wie den Endothelzellen, noch vorhanden ist. Da professionelle APZ aus dem Knochenmark stammen und aufgrund ihrer geringen Halbwertszeit schnell durch neue Zellen aus dem Knochenmark ersetzt werden, LSEC dagegen nicht-myeloiden Ursprungs sind [101,154], wurde dies durch Rekonstitution von wt-Mäusen mit MHC-II-/--Knochenmark erreicht. Um einen kompletten Austausch des hämatopoietischen Systems der wt-Mäuse mit MHC-II-/--Knochenmark zu gewährleisten, ist eine lethale Bestrahlungsdosis notwendig, die abhängig vom Mausstamm zwischen 8 und 12 Gy liegt [155,156,157,158]. Sowohl die phänotypische Analyse der KMCh als auch der funktionelle Test zeigten eine effiziente Depletion der myeloiden Zellen bei der eingesetzten Bestrahlungsdosis von 10,4 Gy (Abb. 18).

Die Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen nach Kokultur mit KMCh-LSEC war im Vergleich zur Kokultur mit LSEC aus wt-Mäusen geringer. Die geringere Zellzahl an Tag 6 könnte auf die niedrigere IL-2-Produktion zurückzuführen sein (Abb. 19), da IL-2 ein wichtiger Wachstumsfaktor während der Expansion ist. Der Grad der Expansion kann proportional zur verfügbaren Menge an IL-2 sein, ein Mangel an IL-2 dagegen zu Apoptose führen [159]. Die verminderte Aktivierung der T-Zellen nach Kokultur mit LSEC aus KMCh war – neben der Analyse der LSEC am Durchflusszytometer – ein weiterer Hinweis auf die Kontamination der LSEC-Präparation mit myeloiden APZ. Diese wenigen professionellen APZ könnten aufgrund der effizienten Aktivierung einiger naiver T-Zellen für die erhöhte IL-2-Produktion und Proliferation nach der Kokultur mit wt-LSEC verantwortlich sein.

Um das Vorhandensein professioneller APZ in der CD4+ T-Zell-Fraktion auszuschließen, wurde vor der Isolation der naiven CD4+ T-Zellen eine Depletion der MHC-II+ Zellen vorgenommen und das Fehlen von MHC-II+ Zellen nicht nur im Durchflusszytometer, sondern ebenfalls im Proliferationsexperiment überprüft (Abb. 19, nur T-Zellen plus Antigen). Die fehlende Proliferation der T-Zellen schließt zusätzlich die Expression von MHC-II-Molekülen auf CD4+ T-Zellen aus. Eine de novo MHC-II-Synthese konnte bisher für CD4+ T-Zellen aus Ratte und Mensch, nicht jedoch für murine Zellen gezeigt werden [160,161,162,163].

↓72

Damit konnte in den LSEC- und den CD4+ T-Zell-Fraktionen eine Kontamination mit myeloiden MHC-II+ APZ ausgeschlossen und die Fähigkeit der Antigen-Präsentation und Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen den LSEC zugeschrieben werden.

5.3.2 Antigen-Dosis abhängige Expansion naiver CD4+ T-Zellen durch LSEC

Die Fähigkeit, naive CD4+ T-Zellen optimal zu aktivieren und damit ihre Expansion und Differenzierung in Effektorzellen zu induzieren, wird generell nur einem Subset der professionellen APZ, den DCs, zugeschrieben [41,164,165], da diese die erforderlichen Signale über TZR-MHC-II/Peptid-Interaktion und kostimulatorische Moleküle auslösen können.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben professionellen APZ auch LSEC in der Lage sind, die Proliferation von naiven CD4+ T-Zellen zu induzieren. Damit konnten die Ergebnisse von Knolle et al. bestätigt werden, die für CD4+ T-Zellen eine Aktivierung durch LSEC, nicht jedoch durch andere Endothelzellen wie Aorta-Endothel beschreiben [99]. Im Gegensatz dazu konnten Katz et al. nach Antigen-spezifischer Kokultur von CD4+ T-Zellen mit LSEC keine Stimulation beobachten [101]. Dies könnte zum einen auf die unterschiedliche Isolation und Kultivierung der LSEC zurückzuführen sein: In der vorliegenden Arbeit wurden die LSEC mit einem Endothel-spezifischen Antikörper über MACS angereichert und über Nacht in Flachboden-Platten kultiviert, so dass sie adhärieren konnten. Dagegen isolieren Katz et al. die LSEC über magnetische Depletion der CD45+ Zellen und setzen die frisch isolierten LSEC direkt im Proliferationsexperiment in Rundboden-Platten ein. Dabei verwenden sie 1 µg/ml OVA-Peptid und analysieren das Maß die T-Zell-Proliferation an Tag 3. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass an Tag 3 die Proliferation von CD4+ T-Zellen nach Kokultur mit LSEC nur bei 5fach höherer Antigen-Menge gut detektierbar war (Abb. 17). Erst an Tag 6 war auch bei 1 µg/ml OVA-Peptid deutliche Proliferation sichtbar. Daher wurden in den Kokultur-Experimenten der vorliegenden Arbeit 5 µg/ml OVA-Peptid eingesetzt und die Analyse nicht an Tag 3, sondern an Tag 6 durchgeführt.

↓73

Die Experimente zur Antigendosis-abhängigen Aktivierung wurden mit LSEC aus wt-Mäusen durchgeführt (Abb. 17). Die Aktivierung der T-Zellen konnte aber auch nach Kokultur mit LSEC aus MHC-II-KMCh gezeigt werden (Abb. 19).

Im Gegensatz zu den LSEC ist für die Stimulation naiver T-Zellen durch professionelle Milz-APZ eine 500fach niedrigere Antigen-Menge ausreichend (Abb. 17). Dies lässt auf eine ineffiziente T-Zell-Aktivierung durch die LSEC im Vergleich zu professionellen APZ schließen. Für das TZR-Signal spielen neben der Affinität vom TZR zum Antigen/MHC-II-Komplex auch Konzentration des exogenen Antigens und Dichte der spezifischen MHC-Moleküle eine Rolle [166]. Da die LSEC nur schwache Level an MHC-II exprimieren (Abb. 18, [153]), scheint die hohe Antigenmenge notwendig, da nur dann ausreichend viele OVA-Peptid/MHC-II-Komplexe auf der Endothel-Oberfläche vorhanden sind, um ein TZR-Signal auszulösen. Zusätzlich könnte die effiziente Antigen-Aufnahme durch die LSEC, die durch die hohe Expression von Mannose- und Scavenger-Rezeptor erreicht wird [94,167], die Zahl der OVA-Peptid/MHC-II-Komplexe erhöhen und damit die schwache MHC-II-Expression kompensieren. Da in der vorliegenden Arbeit kein Protein, sondern Peptid als Antigen verwendet wurde, welches direkt an die Oberflächen-MHC-II-Moleküle bindet, bleibt dies noch zu prüfen.

5.3.3 Nach Aktivierung durch LSEC keine Differenzierung in IFN-γ-, IL-4- oder IL-10-Produzenten

Trotz der Induktion von Proliferation waren nach Antigen-spezifischer Kokultur von naiven CD4+ T-Zellen mit LSEC kaum IFN-γ- und keine IL-4- oder IL-10-Produzenten detektierbar (Abb. 20). Die niedrige Sekretion von IFN-γ wird durch die Arbeit von Knolle et al., 1999 bestätigt, obwohl dort auch die Produktion von IL-4 und IL-10 beschrieben wird [99]. Diese schwache Induktion von Zytokin-Expression war also mittels ELISA im Kulturüberstand, nicht jedoch – wie in der vorliegenden Arbeit durchgeführt – intrazellulär auf Einzelzellebene detektierbar. Die Aktivierung auf LSEC könnte somit zwar die Generierung von Th0-Zellen, also von IFN-γ+ IL-4+ IL-10+ T-Zellen, nicht jedoch von Th1-Effektorzellen induzieren. Stimulationsexperimente mit HUVEC zeigen ebenfalls, dass Endothelzellen zwar kostimulatorische Kapazität besitzen, jedoch keine Th1-polarisierten Zellen induzieren [168].

↓74

Im Gegensatz zu den Endothelzellen wurde auf professionellen Milz-APZ und aus APZ aus Knochenmark oder Blut, die in den anderen Studien verwendet wurden, eine Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen in Th1-polarisierte Zellen beobachtet. Dies resultiert wahrscheinlich aus einem starken TZR-Stimulus – aufgrund der hohen MHC-II-Expression und ausreichender Antigen-Konzentration – sowie einer optimalen Kostimulation. Auf Milz-APZ wurden auch bei niedrigen Antigen-Konzentrationen, also einem schwachen TZR-Signal, mehr IFN-γ-Produzenten als auf LSEC generiert (Daten nicht gezeigt). Wie für humane Endothelzellen gezeigt, könnte neben der schwachen Stimulation auch das Fehlen polarisierender Zytokine, z. B. IL-12, für die unvollständige Differenzierung der CD4+ T-Zellen auf den LSEC verantwortlich sein [168].

LSEC und andere Endothelzellen scheinen somit zwar die Proliferation, bei naiven T-Zellen eine notwendige Voraussetzung für die Synthese von Effektorzytokinen [169], nicht jedoch die Reifung zu Effektorzellen induzieren zu können (Abb. 24).

Abb. 24: Unvollständige Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen nach Aktivierung durch LSEC. Starke stimulatorische Signale induzieren Milz-APZ die Proliferation naiver CD4+ T-Zellen (Tn) sowie ihre Differenzierung zu IFN-γ produzierende Effektorzellen (A). Dagegen proliferieren durch LSEC aktivierte naive CD4+ T-Zellen aufgrund der schwachen Stimulation geringer und weisen einen unreifen Differenzierungsstatus auf (B).

↓75

Um die Induktion einer T-Zell-Aktivierung durch Endothelzellen zu untersuchen, werden die Endothelzellen in der Regel stimuliert [50,117,118,119,120]. Dies geschieht durch pro-inflammatorische Zytokine oder mikrobielle Substanzen, die auf den Endothelzellen eine de novo oder gesteigerte Expression von MHC- und kostimulatorischen Molekülen induzieren. Erwartungsgemäß ließ sich auf LSEC nach Stimulation mit TNF-α und IFN-γ eine erhöhte MHC-II- und ICAM-1-Expression detektieren. Dennoch hatte die Stimulation der LSEC auf die Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen keinen Einfluss: Weder war die Proliferation der T-Zellen erhöht noch wurde die Expression von IFN-γ induziert (Abb. 21). Für die Stimulation der LSEC mit LPS ist ebenfalls kein Effekt auf die Proliferation von CD4+ T-Zellen beschrieben [100]. Die LSEC scheinen somit eine funktionelle Resistenz gegenüber bestimmten proinflammtorischen Signalen zu besitzen.

In der Literatur ist eine Antigen-spezifische Modulation durch LSEC bereits für CD8+ T-Zellen sowie für Antigen-erfahrende CD4+ T-Zellen gezeigt worden: Für CD8+ T-Zellen ist in vitro ebenfalls eine fehlende Differenzierung in Effektorzellen beschrieben (keine Zytotoxizität, keine IFN-γ-Produktion), in vivo konnte die Induktion peripherer Toleranz beobachtet werden [90]. Für in vitro polarisierte Th1-Effektorzellen konnte nach Antigen-Präsentation durch LSEC eine verminderte Expansion sowie eine geringere Menge an IFN-γ-produzierenden Zellen detektiert werden [170]. Letzteres ließ sich in der vorliegenden Arbeit für die zuerst auf professionellen Milz-APZ differenzierten T-Zellen nur tendeziell zeigen; es war kein signifikanter Unterschied zwischen Restimulation durch LSEC und durch Milz-APZ messbar. Möglicherweise war hier die initiale Menge IFN-γ-produzierender Zellen von Bedeutung: Bei in vitro generierten Th1-Kulturen werden Th1-polarisierende Zytokine und Antikörper zugesetzt, so dass an Tag 6 der Kultur mindest. 60 % der Zellen IFN-γ produzieren. Die auf Milz-APZ aktivierten CD4+ T-Zellen wurden ohne zusätzliche Zytoki ne kultiviert und der Anteil IFN-γ-produzierender Zellen lag bei nur 15 %.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die CD4+ T-Zellen nach Aktivierung durch LSEC nicht dauerhaft anerg sind. Die Zellen sind in der Lage, nach einer zweiten Antigen-spezifischer Stimulierung durch professionelle APZ IFN-γ zu produzieren (Abb. 22); sie scheinen dann von „unreifen“ zu „reifen“ Effektorzellen zu differenzieren. Die funktionelle Bedeutung der LSEC-aktivierten CD4+ T-Zellen wurde hier jedoch nicht weiter untersucht. Es bleibt noch zu klären, inwieweit die MHC-II restringierte Antigen-Präsentation durch LSEC in vivo Einfluss auf das Immunsystem nimmt.

5.4  Schlussfolgerung und Ausblick

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Die Untersuchungen zur Transmigration von CD4+ T-Zellen durch die LSEC in vitro haben gezeigt, dass die Endothelzellen der hepatischen Sinusoide im Vergleich zu anderen Endothelien in der Lage sind, eine rasche Wanderung der T-Zellen zu veranlassen. Hierbei scheint die Transzytose und effiziente Präsentation von Chemokinen Grund für die erhöhte Chemotaxis zu sein. Ein direkter Nachweis von LSEC-gebundenem bzw. in Caveolae transzytiertem Chemokin fehlt allerdings bisher und sollte in nachfolgenden Experimenten ergänzt werden. Auch konnte bisher eine erhöhte Migration durch die LSEC in vivo noch nicht direkt gezeigt werden.

In den Versuchen am Phasenkontrastmikroskop konnte beobachtet werden, dass die T-Zellen nicht nur von der luminalen auf die abluminale Seite transmigrierten, sondern z. T. auch zurück auf die Oberseite der LSEC wanderten. In vivo würde dies nicht nur einen schnellen Wechsel der T-Zellen vom Lumen der Sinusoide ins Parenchym bedeuten, sondern auch zurück in die Zirkulation. Damit würden die T-Zellen nicht nur in die Leber rekrutiert werden, sondern auch transient in das Organ einwandern können.

Dieser Mechanismus könnte für eine immunologische Überwachung der Leber relevant sein, aber auch für die immunmodulatorische Funktion der Leber: Durch die Immigration ins Parenchym und evtl. auch die Emigration zurück zum sinusoidalen Lumen würde sich die Aufenthaltsdauer der T-Zellen in der Leber verlängern. Neben dem Kontakt zur den LSEC wäre so die Interaktion der T-Zellen mit anderen hepatischen Populationen, wie Hepatozyten oder Ito Zellen, möglich.

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Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die immunmodulatorischen Fähigkeiten der LSEC genauer untersucht. Ob Endothelzellen eine T-Zell-Antwort durch Antigen-Präsentation initiieren können, ist umstritten. Dabei sind die dafür notwendigen Voraussetzungen, wie Expression der MHC-Moleküle und die Fähigkeit der Antigen-Aufnahme und -Präsentation, für LSEC und auch für andere Endothelien beschrieben [50,121]. Verschiedene Studien konnten jedoch keine Stimulation von T-Zellen nach endothelialer Antigen-Präsentation feststellen [101,171,172], wohingegen andere Arbeiten eine Aktivierung, Proliferation und/oder Zytokin-Expression zeigen [32,99,168,173,174]. Allerdings scheinen Endothelzellen aufgrund fehlender optimaler Aktivierung der T-Zellen keine Immunantwort sondern Toleranz zu induzieren [90,98,175].

In der vorliegenden Arbeit konnte in vitro gezeigt werden, dass die LSEC generell in der Lage sind, bei naiven CD4+ T-Zellen Antigen-spezifische Proliferation, jedoch keine Zytokinproduktion zu induzieren. Dabei konnte ein Effekt kontaminierender professioneller APZ durch die Verwendung von LSEC aus MHC-II-/--Knochenmarkschimären (Transfer von MHC-II-/--Knochenmark in wt-Rezipienten) ausgeschlossen werden. Es bleibt zu prüfen, in welchem Maße die Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen durch LSEC in vivo stattfindet und ob diese durch LSEC aktivierten CD4+ T-Zellen funktionelle Bedeutung für das Immunsystem besitzen. Das Auslösen einer Immunantwort durch Generierung von Effektorzellen scheint aufgrund der fehlenden Zytokinproduktion in vitro nicht sehr wahrscheinlich, möglicherweise besitzen die Zellen dagegen regulatorische Kapazität. Neben der Expression regulatorischer Marker wie FoxP3, CD25 oder CD103 könnte dies in weiteren Experimenten, z. B. im Suppressionsassay, überprüft werden.

Um die Modulation naiver CD4+ T-Zellen durch LSEC in vivo zu überprüfen, ist die Etablierung eines Tiermodells notwendig, das die MHC-II restringierte Antigen-Präsentation auf LSEC beschränkt. Die MHC-II-/--Knochenmarkschimären scheinen hierfür geeignet, da die MHC-II-Expression ausschließlich auf parenchymatischen Zellen, also auch auf den LSEC, und nicht auf professionellen myeloiden APZ erfolgt. Durch orale Antigen-Gabe kann dabei die Antigen-Präsentation vor allem auf die Leber begrenzt werden, da Nahrungsantigene mit dem Blut vom Darm über die Vena portae zuerst in die Leber gelangen. Ließe sich nach adoptivem Transfer Antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen in MHC-II-/--Knochenmarkschimären die Induktion von Toleranz zeigen, sei es durch Deletion, Anergisierung oder Differenzierung der CD4+ T-Zellen zu Suppressorzellen, könnten die LSEC nicht nur für CD8+ T-Zellen, sondern generell als Toleranz-induzierende APZ bezeichnet werden, die z. B. für den Erhalt der oralen Toleranz von Bedeutung sein könnten.


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05.12.2006