Identifizierung neuer E2F-Zielgene in der Wachstumskontrolle und Tumorprogression

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalis (Dr. rer. nat)
im Promotionsfach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Dipl. Biol. Caroline   Schreiber  
geb. Boden  

geboren am 26. August 1977 in Mutlangen

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön

Gutachter:
1. Prof. A. Leutz
2. Prof. W. Birchmeier
3. Prof. P. Knaus

Tag der mündlichen Prüfung: 24. Oktober 2008

Abstract (Deutsch)

Der pRB/E2F-Signalweg ist ein wichtiger Schlüsselpunkt für die Wachstumskontrolle in Säugerzellen und in vielen Tumoren sind Komponenten dieses Signalweges dereguliert. Durch die Nullmutation von E2F3 in Mausembryonalen Fibroblasten (MEFs) und Mäusen konnte gezeigt werden, dass E2F3 essentiell für das zelluläre Wachstum ist und in der Maus organspezifisch sowohl als Tumorsuppressor als auch Onkogen agieren kann. Jedoch sind dafür die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht genau geklärt. Möglicherweise tragen verschiedene Signalwege, die durch den Verlust von E2F3 dereguliert werden, zu den Defekten bei.

In dieser Arbeit wurde TGFbeta1, ein wichtiger Wachstumsregulator, in den E2f3-/- MEFs untersucht und es konnte zum ersten Mal eine direkte Verbindung zwischen der E2F3-Expression und der TGFbeta1-Signalwirkung gezeigt werden. Durch den Verlust von E2F3 werden Tgfb1 und die TGFbeta1-regulierten Gene PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin in MEFs dereprimiert. Darüber hinaus werden MEFs und humane Lungenkarzinomzellen durch den Verlust von E2F3 gegenüber TGFbeta1 sensibilisiert und reagieren verstärkt auf TGFbeta1-induzierte Genexpression und Prozesse wie Wachstumsarrest und EMT. Somit wird E2F3 nicht nur durch TGFbeta1 reguliert, sondern kann auch auf TGFbeta1 und die TGFbeta1-Signalwirkung Einfluss nehmen, was für die Tumorprogression weit reichende Auswirkung haben kann.

Um die tumorsuppressiven Eigenschaften von E2F3 besser zu verstehen, wurden im zweiten Teil dieser Arbeit murine medulläre Schilddrüsentumore mit unterschiedlichem metastatischen Potential miteinander verglichen und es konnten neue E2F-Zielgene identifiziert werden. Die Untersuchung von humanen Struma nodosa-Biopsien und metastatischen medullären Schilddrüsentumoren ergab, dass die in den Mäusen gefundenen Gene künftig auch als humane Metastasemarker Verwendung finden können.

Eigene Schlagworte: E2F3, TGFbeta1, Proliferation, E2F-Zielgene

Abstract (Englisch)

The pRB/E2F-pathway plays a key role in growth control and it is deregulated in many tumors. Previously, by analysing E2f3 deficient mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and mice it has been shown that E2F3, a key downstream target of pRB, is essential for cellular proliferation and can act either as an oncogene or tumorsuppressor in mice depending on the organ. However, the underlying mechanism is still unclear. We suggest that specific pathways which are deregulated due to the deletion of E2F3 contribute to these defects.

TGFbeta1, which is one of the most potent growth regulators for mammalian cells was analysed in E2f3-/- MEFs. In this study, we could establish a direct link between E2F3 expression and TGFbeta1 signalling. Loss of E2F3 in MEFs leads to de-repression of Tgfb1 and TGFbeta1-regulated genes like PAI-1, p21, vimentin and fibronectin. Moreover, loss of E2F3 in MEFs or in human lung carcinoma cells results in an increased sensitivity to TGFbeta1-induced gene expression and processes like growth arrest and epithelial mesenchymal transition. These data suggest that not only TGFbeta1 can act on E2F3 but also E2F3 can affect TGFbeta1 and the outcome of TGFbeta1-induced signalling.

In order to understand the tumor suppressive properties of E2F3, we compared gene expression profiles of murine medullary thyroid carcinomas (MTCs) of different metastatic potential and could identify novel E2F-target genes. Analysis of human struma nodosa biopsies and human metastatic medullary thyroid tumors showed that the genes identified in the mouse model can also be used as metastasis markers in human tumors.

Die vorliegende Arbeit wurde unter Anleitung von Frau Dr. Ulrike Ziebold am Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in Berlin-Buch angefertigt.

Keywords: E2F3, TGFbeta1, Proliferation, E2F-target genes

Inhaltsverzeichnis

• Zusammenfassung
• 1 Einleitung
  • 1.1 Zellzyklus, Proliferation und Seneszenz
  • 1.2 Der pRB/E2F-Signalweg
    • 1.2.1 Der Retinoblastoma-Tumorsuppressor
    • 1.2.2 Die E2F-Familie
    • 1.2.3 E2F-abhängige Gene
    • 1.2.4 Die aktivierenden E2Fs
    • 1.2.5 Der E2f3-Lokus
  • 1.3 Der p53-Signalweg
  • 1.4 Der TGFβ1-Signalweg
    • 1.4.1 TGFβ1-induzierte zelluläre Prozesse
      • 1.4.1.1 TGFβ1-induzierter Wachstumsarrest
      • 1.4.1.2 TGFβ1-induzierte Seneszenz 
      • 1.4.1.3 TGFβ1-induzierte Apoptose
      • 1.4.1.4 TGFβ1-induzierte epitheliale-mesenchymale Transition
    • 1.4.2 Der TGFβ1-Signalweg in der Mausentwicklung
    • 1.4.3 Der TGFβ1-Signalweg in der Tumorentwicklung
  • 1.5 Ziele dieser Arbeit
• 2 Ergebnisse
  • 2.1  Tgfb1 ist in asynchronen und synchronisierten E2f3-/- MEFs hoch reguliert
  • 2.2 Der TGFβ1-Signalweg ist in E2f3-/- MEFs dereguliert
  • 2.3 Die Derepression von Tgfb1 und TGFβ1-regulierter Gene in den E2f3-/- MEFs wird durch wiederholtes Passagieren verstärkt
  • 2.4 E2F-Transkriptionsfaktoren binden an die Promotoren von Tgfb1 und TGFβ1- regulierten Genen
  • 2.5 TGFβ1 ist in E2f3-/- embryonalen Lungen dereguliert 
  • 2.6  E2f3-/- MEFs sind sensibilisiert für TGFβ1-induzierte Prozesse
  • 2.7 E2F3-Verlust führt zur Sensibilisierung gegenüber TGFβ1-induzierter Genregulation
  • 2.8 Die autokrine Expression von TGFβ1 ist p53-unabhängig
  • 2.9 Der Verlust von E2F3 führt zu einer Prädisposition gegenüber TGFβ1-induzierter Vimentin und p21-Expression in A549-Zellen
  • 2.10 Die Identifizierung E2F3-abhängiger Metastasemarker
    • 2.10.1 Genexpressionsanalyse der metastatischen und nicht-metastatischen MTCs
    • 2.10.2 Genexpressionsanalyse von Wildtyp und Rb-/-;E2f3-/- MEFs
    • 2.10.3  RacGAP1, Ect2, Prc1 und Cep55 sind mögliche humane Metastasemarker
    • 2.10.4  RacGAP1, Ect2, Prc1 und Cep55 sind potentielle E2F-Gene
• 3 Diskussion
  • 3.1 Der Verlust von E2F3 führt zur Deregulation des TGFβ1-Signalwegs
  • 3.2  E2f3-/- MEFs sind prädisponiert für Seneszenz
  • 3.3 E2F3 und E2F1 binden an die Promotoren von Tgfb1, PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin in vivo
  • 3.4 TGFβ1 ist in E2f3-defizienten Lungen überexprimiert
  • 3.5 Der Verlust von E2F3 führt zu einer Sensibilisierung gegenüber TGFβ1
  • 3.6 Die Verwendung des Rb/E2f3-Mausmodels
  • 3.7 Ect2, RacGAP1, Cep55 oder Prc1 sind neue Marker für die murine und möglicherweise auch für die humane Metastasierung
• 4 Material und Methoden
  • 4.1 Material
    • 4.1.1 Chemikalien und ihre Bezugsquellen
    • 4.1.2 Oligonukleotide
    • 4.1.3 Antikörper
    • 4.1.4 Plasmide
  • 4.2 Molekularbiologische Methoden
    • 4.2.1  Site-directed-Mutagenese
    • 4.2.2 Luciferase-Assay
    • 4.2.3 Chromatin-Immunpräzipitation
    • 4.2.4 RNA-Isolierung
    • 4.2.5 cDNA-Synthese und quantitative PCR
    • 4.2.6 Präparation der Proben für die Microarray-Analyse
  • 4.3 Biochemische Methoden
    • 4.3.1 Proteinextraktion aus Säugerzellen
    • 4.3.2 Bestimmung der Proteinmenge
    • 4.3.3 SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse
    • 4.3.4 Bestimmung der TGFβ1-Konzentration im Zellüberstand
  • 4.4 Zellbiologische Methoden
    • 4.4.1 Kultivierung von Zellen
    • 4.4.2 Isolierung von Mausembryonalen Fibroblasten (MEFs)
    • 4.4.3 Genotypisierung von Mausgewebe
    • 4.4.4 CaPO₄-Transfektion
    • 4.4.5 Transfektion mit Lipofectamin
    • 4.4.6 Produktion ekotropher Viren durch Phoenix-Zellen
    • 4.4.7 Infektion von A549 mittels ekotropher Viren
    • 4.4.8 TGFβ1-induzierte Reduktion der Zellzahl
    • 4.4.9 BrdU-Proliferationsassay
    • 4.4.10 AnnexinV-Färbung
    • 4.4.11 Seneszenz-assoziierte β-Gal Färbung (SA-β-Gal)
• Anhang
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Erklärung
• Publikationsliste

Tabellen

• Tabelle 1 : Liste der differentiell exprimierten Gene, die sowohl beim Vergleich der metastatischen/nicht-metastatischen Tumore als auch beim Vergleich der Rb -/-; E2f3 -/- /Wildtyp-MEFs über dem Schwellenwert liegen.
• Tabelle 2 : Verwandte Oligonukleotide mit Sequenzen und jeweiliger Anwendung
• Tabelle 3 : Aufführung der verwandten Antikörper
• Tabelle 4: Liste der mindestens zweifach differentiell exprimierten Gene in den metastatischen gegenüber nicht-metastatischen MTCs („MTC-Liste“)
• Tabelle 5 : Liste der mindestens zweifach differentiell exprimierten Gene in den Rb -/-; E2f3 -/- gegenüber Wildtyp-MEFs („WT/DKO-Liste“)

Bilder

• Abb. 1: Der pRB/E2F-Signalweg (modifiziert nach Trimarchi und Lees, 2002). Der korrekte Eintritt in die S-Phase wird durch die aufeinander folgende Aktivierung der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK4/6 und CDK2) kontrolliert. Diese werden durch die CKIs der INK4- und CIP/KIP-Familien reguliert. In der frühen G1-Phase ist pRB an E2F gebunden und rekrutiert repressorisch wirkende Chromatinmodifikatoren. Durch die CDK-bedingte Phosphorylierung von pRB, wird pRB von E2F losgelöst und aktivierende Chromatinmodifikatoren werden zu den E2F-Promotoren rekrutiert.
• Abb. 2: Die Familie der E2F-Transkriptionsfaktoren (modifiziert nach Bracken et al., 2004). E2F1-6 besitzen eine DNA-Bindedomäne (DB) und eine DP-Dimerisierungsdomäne, bestehend aus einem Leuzinzipper (LZ) und der Marked Box (MB). Sequenzen für die Transaktivierung (TA) und zur Bindung der Pocket-Proteine (PB) sind nur in E2F1-5 enthalten. Dagegen enthalten E2F7/8 zwei DNA-Bindedomänen. (NLS: nukleäres Lokalisationssignal, NES: nukleäres Exportsignal).
• Abb. 3: Schematische Darstellung der E2Fs, ihre physiologische Funktion und spezifische Bindepartner (modifiziert nach Attwool et al., 2004). Die E2F-Familie kann definiert durch ihre Regulation durch die Pocket-Proteine und physiologische Funktion in verschiedene Klassen eingeteilt werden.
• Abb. 4: Der p53-Signalweg (modifiziert nach Harris und Levine, 2005). Onkogenaktvierung und durch ionisierende Strahlung (IR) oder ultraviolettes Licht (UV) verursachte DNA-Schäden aktivieren den p53-Signalweg. Über verschiedene Mittler wird p53 modifiziert und stabilisiert. Effektorproteine sind nur beispielhaft aufgeführt und es existieren wesentlich mehr.
• Abb. 5: Der TGFβ1-Signalweg (modifiziert nach Siegel und Massague, 2003). TGF β 1 bindet an T β RII und bewirkt die Rekrutierung und Phosphorylierung von T β RI. Der aktivierte T β RI phosphoryliert die Rezeptor-assoziierten R-SMADs (SMAD2/3), die dadurch von ihrem cytoplasmatischen Anker (SARA) befreit werden und zusammen mit SMAD4 in den Kern translozieren. SMAD-Proteine interagieren mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren (TF) und Kofaktoren (Co), um die Gentranskription zu regulieren. SMAD7 reguliert zusammen mit Smurf1/2 die Degradation der Rezeptoren.
• Abb. 6: TGFβ1-induzierte Prozesse. TGF β 1 kann je nach Zelltyp unterschiedliche Antworten auslösen.
• Abb. 7: Tgfb1 ist in asynchronen und synchronisierten E2f3-/- MEFs dereprimiert. (A) qPCR-Analyse der Tgfb1 -Expression von asynchron wachsenden Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs (P4). mRNA wurde aus MEFs isoliert, in cDNA umgeschrieben und im iCycler analysiert. (B) qPCR-Analyse der Genexpression von Tgfb1 , Mcm6 und p107 . Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs wurden durch Serumentzug für 72 Stunden synchronisiert und anschließend mit 10% FCS stimuliert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben geerntet, mRNA isoliert und cDNA synthetisiert. Mcm6 und p107 dienen als Kontrolle für den S-Phase-Wiedereintritt.
• Abb. 8: Der Verlust von E2F3 führt zur Deregulation von TGFβ1 und TGFβ1-regulierten Genen. (A) TGF β 1 wird von E2f3 -/- MEFs vermehrt sekretiert. Die Mengen an TGF β 1-Protein wurden mittels eines kommerziellen TGF β 1-ELISAs (R&D) untersucht, wofür für 48 Stunden konditionierte Zellkultur-mediumüberstände von Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs (Passage P6) verwandt wurden. Die Daten zeigen ein repräsentatives Ergebnis. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. (B) In E2f3 -/- MEFs ist SMAD2 erhöht phosphoryliert. Western-Blot-Analyse von gehungerten und für 16 Stunden Serum stimulierten Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs unter Verwendung eines spezifischen anti-phospho-SMAD2-Antikörpers. Die Gesamtmenge an SMAD2/3 dient als Ladekontrolle. (C) TGF β 1-regulierte Gene sind in E2f3 -/- MEFs dereguliert. qPCR-Analyse der Expression von PAI-1 , p21 , Vimentin und Fibronectin in asynchron wachsenden Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs (Passage P4). (D) Western-Blot-Analyse von Gesamtzellproteinextrakten asynchron wachsender Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs. Es wurden spezifische Antiköper gegen Vimentin, Fibronectin und p21 verwandt. Vinculin diente als Ladekontrolle.
• Abb. 9: E2F3-abhängige Deregulation von Tgfb1 und TGFβ1-regulierter Gene ist erst durch wiederholtes Passagieren E2f3-defizienter MEFs detektierbar. (A) TGF β 1-ELISA mit konditionierten Überständen von Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs der angegeben Passagen. Die Daten zeigen ein repräsentatives Ergebnis. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. (B) qPCR-Analyse der Genexpression von Tgfb1 , PAI-1 , Vimentin , Fibronectin , p21 und p19 . Proben von asynchron wachsenden Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs wurden bei den angegebenen Passagen geerntet, mRNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und anschließend im iCycler analysiert. Die Daten repräsentieren die Zusammenfassung drei unabhängiger Experimente. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar.
• Abb. 10: E2F1 und E2F3 binden an die Promotoren von Tgfb1 und TGFβ1-induzierten Genen in vivo. (A) Schematische Darstellung der murinen Promotoren von Tgfb1 , PAI-1 , p21 , Vimentin und Fibronectin mit potentiellen E2F- und SMAD-Bindestellen (SBE). (B) Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) von asynchron wachsenden Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs (Passage P5). Die ChIPs wurden unter Verwendung von E2F1, E2F3 und E2F4 spezifischer Antikörper durchgeführt. Anti-IgG diente als Negativkontrolle für die Immunpräzipitationen. Die präzipitierte DNA wurde mit spezifischen Primern für die angegebenen Gene amplifiziert. Der Cdc2- Promotor diente als Positiv- und der b-actin -Promotor als Negativkontrolle.
• Abb. 11: TGFβ1 ist in E2f3-defizienten embryonalen Lungen dereguliert. (A) qPCR-Analyse von Wildtyp- und E2f3 -/- Lungen von Embryonen des Alters E17.5. mRNA wurde aus ganzen Lungen isoliert und in cDNA umgeschrieben. Mindestens drei Lungen von verschiedenen Embryonen pro Genotyp wurden analysiert. (B) Western-Blot-Analyse von Gesamtproteinextrakten aus embryonalen Lungen E17.5. Zwei verschiedene anti- TGF β 1-Antikörper wurden verwandt, um sowohl die TGF β 1-Vorläuferform (44kDa) als auch aktiviertes TGF β 1 (25kDa) zu detektieren. (C) Western-Blot-Analyse von Gesamtproteinextrakten aus Lungen von neugeborenen Mäusen (P0).
• Abb. 12: E2f3-defiziente MEFs sind sensibilisiert gegenüber TGFβ1-induzierten Prozessen. Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs der Passage P2 wurden mit gleicher Dichte in An- oder Abwesenheit von 100pM TGF β 1 ausplattiert, nach 48 Stunden geerntet und analysiert. (A) Die TGF β 1-Behandlung führt zur Herunterregulation von E2F3A und E2F3B. Western-Blot-Analyse von Kontroll- und TGF β 1-behandelten Wildtyp- beziehungsweise E2f3 -/- MEFs. Vinculin diente als Ladekontrolle. (B) TGF β 1 induziert die Reduktion der Zellzahl. Bestimmung der Zellzahl von Kontroll- beziehungsweise TGF β 1-behandelten Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs. (C) E2f3 -/- MEFs reagieren sensitiver auf einen TGF β 1-induzierten Wachstumsarrest. Bestimmung der BrdU-positiven Zellen nach TGF β 1- oder Kontrollbehandlung mithilfe eines α -BrdU-Antiköpers im Durchflußzytometer. (D) Unbehandelte E2f3 -/- MEFs neigen zur Seneszenz. Bestimmung der Seneszenzrate mittels SA- β -Gal-Färbung. Quantitative Darstellung des Verhältnisses SA- β -Gal-positiver Zellen zu DAPI-gefärbten Kernen. (E) Repräsentatives Bild der SA- β -Gal-gefärbten TGF β 1- oder kontrollbehandelten Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs. (F) E2f3 -/- MEFs zeigen früher eine reduzierte Proliferationskapazität. Die Zellzahl wurde nach jeder Passagierung der Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs bestimmt und anschließend die gleiche Anzahl an Zellen wieder ausplattiert. Die Daten stellen zusammengefasst die Wachstumskurven von je drei unabhängigen Zelllinien pro Genotyp dar.
• Abb. 13: Asynchron wachsende E2f3-/- MEFs zeigen bereits eine erhöhte Apoptoserate. (A) Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs der Passage P2 wurden mit gleicher Dichte in An- oder Abwesenheit von 100pM TGF β 1 ausplattiert und nach 48 Stunden auf TGF β 1-induzierte Apoptose unter Verwendung eines AnnexinV-Antikörpers untersucht. (B) Wildtyp-MEFs wurden mit 30 J/m ² UV behandelt und nach 48 Stunden auf Apoptose unter Verwendung eines AnnexinV-Antikörpers untersucht. UV-behandelte Zellen dienten als positive Kontrolle für die Detektion apoptotischer Zellen.
• Abb. 14: Der Verlust von E2F3 führt zur Sensibilisierung der MEFs gegenüber der TGFβ1-induzierten Genexpression. (A) Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs der Passage P2 wurden für 24 Sunden mit 0,1% BSA gehungert und anschließend mit 0,1% BSA oder 100pM TGF β 1 behandelt. 48 Stunden später wurden die Zellen geerntet, RNA isoliert und die Genexpression von Tgfb1 , PAI-1 , p21 , Id1 und E2f1 mittels qPCR analysiert. Die Daten repräsentieren die Zusammenfassung drei unabhängiger Experimente. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar. (B) Die Zellen wurden wie oben behandelt. Anschließend wurden Proteinextrakte hergestellt und mittels Western-Blot-Analyse auf Proteinexpression von E2F1 und p21 untersucht. Vinculin diente als Ladekontrolle.
• Abb. 15: E2F1 wird durch TGFβ1 an die Promotoren von Tgfb1, PAI-1 und p21 rekrutiert. Wildtyp-MEFs Passage P5 wurden für 24 Stunden in 0,1% BSA gehungert und anschließend für weitere 48 Stunden mit oder ohne 100pM TGF β 1 inkubiert. ChIP-Analysen wurden unter Verwendung von E2F1, E2F3 und E2F4 spezifischer Antikörper durchgeführt. Anti-IgG diente als negative Kontrolle für die Immunpräzipitationen. Die Anreicherung von E2F1, E2F3 und E2F4 an den Promotoren wurde mit semiquantitativer PCR (A) und quantitativer qPCR (B) analysiert.
• Abb. 16: p53 ist essentiell für die TGFβ1-induzierte Seneszenz und für die Expression von p21 und PAI-1. (A) p53 -/- MEFs sind insensitiv gegenüber TGF β 1-induzierter Seneszenz. Wildtyp- und p53 -/- MEFs wurden in An- oder Abwesenheit von 100pM TGF β 1 ausplattiert und nach 48 Stunden auf SA- β -Gal-Färbung untersucht. ND: nicht detektiert. (B) p53 ist essentiell für die Expression von p21 und PAI-1. Wildtyp- und p53 -/- MEFs der Passage P2 wurden für 24 Sunden mit 0,1% BSA gehungert und anschließend mit 0,1% BSA oder 100pM TGF β 1 behandelt. 48 Stunden später wurden die Zellen geerntet, RNA isoliert und die Genexpression von Tgfb1 , PAI-1 , p21 , Id1 und E2f1 mittels qPCR analysiert. 
• Abb. 17: Der Verlust von E2F3 führt zu einer Derepression von TGFβ1-induziertem Vimentin. (A) Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs wurden Kontroll- oder mit 100pM TGF β 1 behandelt. Mithilfe der Western-Blot-Analyse wurde die Vimentinexpression untersucht. (B) TGF β 1 induziert EMT in A549-Zellen. A549-Zellen wurden für 24 Stunden mit 0,1% BSA gehungert und anschließend mit oder ohne 5ng/ml TGF β 1 für weitere 48 Stunden behandelt. Die hergestellten Proteinextrakte wurden mittels der Western-Blot-Analyse mit den angegebenen Antikörpern untersucht. Vinculin diente als Ladekontrolle. (C) TGF β 1 induziert EMT in A549-Zellen ohne das Wachstum der Zellen zu beeinflussen. Oben: Phasenkontrastbild von 0,1% BSA und 5ng/ml TGF β 1 behandelten A549-Zellen. Unten: Zellzyklusprofil der BSA und TGF β 1-behandelten A549-Zellen, analysiert im Durchflußzytometer. (D) Herunterregulation von E2F3 mithilfe von shRNA-Konstrukten in A549-Zellen führt zur Derepression von Vimentin nach TGF β 1-Behandlung. Links: Western-Blot-Analyse der shE2F3 - und Kontrollkonstrukt ( shLuc ) infizierten A549-Zellen, die für 48 Stunden mit verschiedenen TGF β 1-Konzentrationen behandelt wurden. Rechts: Western-Blot-Analyse zur Überprüfung der E2F3-Herunterregulation durch die shE2F3-Konstrukte. (E) Durch Mutation der proximalen E2F-Bindestelle kann der humane Vimentinpromotor nicht mehr durch TGF β 1 aktiviert werden. (CAGA) ₁₂   enthält 12 SMAD- Erkennungssequenzen und dient als Positivkontrolle für die TGF β 1-Behandlung. Vim ist ein heterologer Luziferasereporter des humanen Vimentinpromotors (-964~+73) und enthält fünf potentielle E2F-Erkennungssequenzen und zwei potentielle SMAD-Erkennungssequenzen. Vim-E2Fmut ist ein heterologer Luziferasereporter des humanen Vimentinpromotors (-964~+73) mit einer Mutation in der proximalen E2F-Bindestelle (durchgestrichen). Die Reporterkonstrukte wurden in die A549-Zellen transient transfiziert, die Zellen anschließend in 0,1% BSA gehungert und mit oder ohne TGF β 1 (5ng/ml) behandelt. Die Zellen wurden nach 48 Stunden geerntet, lysiert und die Firefly -Luziferaseaktivität gemessen. Die Werte wurden auf die konstant exprimierte Renilla -Luziferaseaktivität normalisiert.
• Abb. 18: Funktionelle Einteilung der differentiell exprimierten Gene. (A) MTC-Microarray (B) WT/DKO-Microarray
• Abb. 19: RacGAP1, Ect2, Prc1 und Cep55 sind differentiell in murinen und humanen metastatischen zu nicht-metastatischen MTCs exprimiert. (A) qPCR-Analyse von fünf metastatischen und fünf nicht-metastatischen Maustumoren. RNA wurde aus den Tumoren isoliert, in cDNA umgeschrieben und auf die Expression von RacGAP1 , Ect2 , Prc1 und Cep55 untersucht. (B) qPCR-Analyse von 12 menschlichen metastatischen MTC-Biopsien und 11 menschlichen Normalgewebe/ Struma nodosa-Biopsien. Die erhaltene RNA wurde in cDNA umgeschrieben und auf die Expression von RacGAP1 , Ect2 , Prc1 und Cep55 untersucht.
• Abb. 20: RacGAP1, Ect2, Prc1 und Cep55 sind unterschiedlich in Rb-/- und Rb-/-; E2f3-/- MEFs exprimiert. qPCR-Analyse von RNA/cDNA isoliert aus asynchron wachsenden Wildtyp, E2f3 -/-, Rb -/- und Rb -/-; E2f3 -/- MEFs. Mcm6 und p107 sind bekannte E2F-Gene und weisen ein sehr ähnliches Expressionsprofil auf.
• Abb. 21: RacGAP1, Ect2, Prc1 und Cep55 sind zellzyklusabhängig in Wildtyp-MEFs exprimiert. qPCR-Analyse von RNA/cDNA isoliert aus synchronisierten Wildtyp-MEFs. Expression von Mcm6 und p107 dient zur Kontrolle des S-Phase-Wiedereintritts und als Vergleich mit bereits bekannten E2F-Genen
• Abb. 22: Hypothetisches Modell der E2F3-TGFβ1-Regulation. (A) TGF β 1 kann durch den Verlust von E2F3 übermäßig stark seine Zielgene aktivieren und induziert vermehrt Wachstumsarrest und Seneszenz. (B) In normalen Zellen reprimiert E2F3 TGF β 1-abhängige Zielgene und erlaubt möglicherweise dadurch Proliferation.