Einleitung

Vor allem während der Embryonalentwicklung, aber auch im erwachsenen Leben finden ständig Zellteilungen statt. Der Vorgang der Zellvermehrung wird streng kontrolliert, damit die DNA korrekt an die zwei Tochterzellen weitergeben wird. Fehler bei der Verdopplung des Genoms oder bei der Zellteilung können schrittweise zur Entstehung von „abartigen“ Zellen führen, deren Wachstumskontrollmechanismen gestört sind [1 ]. Das unkontrollierte Zellwachstum ist ein entscheidender Faktor für die Vermehrung der Tumorzellen [2 ]. Deswegen ist das Verständnis der Wachstumskontrolle unerlässlich für die Entwicklung neuer Tumortherapien.

Zellzyklus, Proliferation und Seneszenz

Wenn Zellen sich vermehren, durchlaufen sie immer die gleichen Schritte. Das beinhaltet die Replikation der DNA sowie die Teilung des Kerns und des Cytoplasmas, um zwei Tochterzellen zu generieren. Diese Abfolge wird als Zellzyklus bezeichnet und jede Zelle muss ihn durchlaufen. Während frühembryonale Zellen, wie am Beispiel von Drosophila gezeigt, einen sehr schnellen Zyklus von DNA-Synthese (S-Phase) und Zellteilung (Mitose; M-Phase) aufweisen, schieben Zellen in komplexeren Umgebungen zwei weitere so genannte Gap-Phasen (engl. Lücke) in den Zyklus ein: die G1-Phase zwischen M- und S-Phase und die G2-Phase zwischen S- und M-Phase. Diese G-Phasen ermöglichen die Reparatur von DNA-Schäden und Replikationsfehlern, aber auch um auf Signale der Umgebung zu antworten [3 ,4 ,5 ].

Die Entscheidung, in den Zellzyklus einzutreten, wird während der G1-Phase getroffen und ist von extrazellulären Stimuli wie Wachstumsfaktoren und der Verankerung in der extrazellulären Matrix abhängig [6 ,7 ]. Sind die Bedingungen für den Eintritt nicht erfüllt, arretiert die Zelle vorübergehend in der G0-Phase [8 ]. Dieses Stadium wird auch Quieszenz genannt. Die Quieszenz ist ein reversibles Stadium, wohingegen die Seneszenz einen scheinbar irreversiblen Arrest darstellt. Seneszente Zellen bleiben zwar metabolisch aktiv, können aber unter normalen Umständen nicht mehr zur Proliferation angeregt werden. Den Begriff der Seneszenz prägte Hayflick in den 1960er Jahren und beschrieb damit die begrenzten Replikationsspanne primärer Zellen. Durch erworbene Mutationen können Zellen jedoch die Seneszenz durchbrechen und immortal werden, was bedeutet, dass sie unendlich proliferieren können [9 ,10 ,11 ].

Dagegen können quieszente Zellen unter geeigneten Bedingungen zum Eintritt in die S-Phase stimuliert werden, was die Progression durch den Zellzyklus zur Folge hat [12 ]. Um einen korrekten Zellzyklus zu garantieren, wird an verschiedenen Stellen im Zyklus der Ablauf kontrolliert und notfalls unterbrochen. Das Durchbrechen dieser Kontrollen ist ein wichtiger Prozess während der Tumorentwicklung und involviert die zwei wichtigen Signalwege: den pRB/E2F- und den p53-Signalweg, die hier im nachfolgenden besprochen werden [2 ,13 ].

Der pRB/E2F-Signalweg

In Säugerzellen ist der pRB/E2F-Signalweg der Drehpunkt der G1-Kontrolle. Dieser wird positiv durch Mitogene und negativ durch Stress, TGFβ1 oder Entzug der Wachstumsfaktoren reguliert. Zum Eintritt in den Zellzyklus werden aufeinander folgend D- und E-Typ Cycline synthetisiert, die mit den Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4/6 respektive CDK2 Komplexe bilden [14 ]. Die CDKs werden durch so genannte CDK-Inhibitoren (CKI) katalytisch gehemmt, um einen verfrühten Eintritt in die S-Phase zu verhindern. Bei den CKIs unterscheidet man zwei Familien. Die INK4-Proteine p15, p16, p18 und p19 hemmen spezifisch die Aktivität von Cyclin D-Kinasen, wohingegen die Mitglieder der CIP/KIP-Familie p21, p27 und p57 auf alle anderen Cyclin/CDK Komplexe einwirken können [15 ].

Während der frühen G1-Phase binden pRB und seine beiden weiteren Pocket-Protein-Familienmitglieder p107 und p130 an die E2F-Transkriptionsfaktoren [16 ,17 ,18 ,19 ]. Durch die Bindung der Pocket-Proteindomäne (engl. Tasche) an die Transaktivierungsdomäne der E2Fs, wird diese maskiert und verhindert die Rekrutierung des basalen Transkriptionsfaktors TFIID und anderer transkriptioneller Kofaktoren [20 ,21 ]. Zusätzlich werden durch die Pocket-Proteine eine ganze Reihe von Chromatinmodifikatoren und „Remodeling“-Faktoren zu den Promotoren der E2F-abhängigen Gene rekrutiert (Abb. 1). Durch die Rekrutierung von Sin3-Histondeacetylase (HDAC)-Komplexen, der SUV39H1-Histonmethyltransferase und SWI/ SNF-ATP-abhängigen „Remodeling“-Faktoren wird das Chromatin deacetyliert, methyliert, kompakter und dadurch für Transkriptionsfaktoren schlechter zugänglich [22 ,23 ,24 ,25 ].

Mit dem Eintritt in den Zellzyklus verändert sich die Zusammensetzung an den E2F-abhängigen Promotoren. Zum einen werden die so genannten repressorischen durch aktivierende E2Fs ersetzt. Durch die Akkumulation der Cyclin D/ CDK4/6 und Cyclin E/ CDK2-Komplexe während der G1-Phase wird pRB, p107 und p130 hyperphosphoryliert und dadurch werden die E2Fs „befreit“ [26 ,27 ,28 ,29 ]. Zum anderen werden anstelle von HDACs Histonacetyltransferasen (HATs) wie p300/CBP, GCN5 oder Tip60 ebenso wie Histonmethyltransferasen (HMTs) der MLL/Set1-Familie rekrutiert, die durch Acetylierung der Histone H3 und H4 und Methylierung des Lysins 4 im Histon3 (H3K4) das Chromatin offen und zugänglich für den Transkriptionsapparat machen [30 ,31 ]. Sowohl bei der Rekrutierung der repressorischen als auch der aktivierenden Chromatinmodifikatoren spielt HCF-1 (Herpes simplex Virus host cell factor) eine wesentliche Rolle [32 ]. Demnach sind ganze Proteinkomplexe bei der E2F-abhängigen Genaktivierung und Repression beteiligt, deren Zusammensetzung und unterschiedliche Rekrutierungsbedingungen zu verschiedenen E2F-Genen noch nicht komplett verstanden ist [33 ].

Abb. 1: Der pRB/E2F-Signalweg (modifiziert nach Trimarchi und Lees, 2002). Der korrekte Eintritt in die S-Phase wird durch die aufeinander folgende Aktivierung der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK4/6 und CDK2) kontrolliert. Diese werden durch die CKIs der INK4- und CIP/KIP-Familien reguliert. In der frühen G1-Phase ist pRB an E2F gebunden und rekrutiert repressorisch wirkende Chromatinmodifikatoren. Durch die CDK-bedingte Phosphorylierung von pRB, wird pRB von E2F losgelöst und aktivierende Chromatinmodifikatoren werden zu den E2F-Promotoren rekrutiert.

Der Retinoblastoma-Tumorsuppressor

Das Retinoblastoma-Genprodukt pRB wurde 1983 als einer der ersten Tumorsuppressoren identifiziert [34 ,35 ,36 ]. Eine Keimbahnmutation des Retinoblastoma-Gens und der spätere Verlust des zweiten Allels verursachen den im hohen Maße vererbbaren frühkindlichen Augenhintergrundstumor [37 ]. Etwa 90% der betroffenen Kinder entwickeln einen Tumor, später gefolgt von weiteren bösartigen Tumoren [38 ,39 ]. Auch in vielen sporadisch auftretenden Retinoblastomen, Osteosarcomen, kleinzelligen Lungenkarzinomen oder Brusttumoren ist pRB durch direkte Mutation beziehungsweise Deletion inaktiviert, wohingegen Mutationen in p107 und p130 in Tumoren sehr selten sind [13 ,40 ,41 ,42 ,43 ]. Außerdem kann der pRB/E2F-Signalweg durch Mutationen oder veränderte Expression der vorgeschalteten Regulatoren wie Cyclin D, p27 oder p16 in Brusttumoren, Gehirntumoren, Lymphomen, Melanomen und Leberkrebs inaktiviert werden [44 ,45 ,46 ,47 ].

Die wichtige Funktion von pRB bei der Tumorsuppression wird durch Studien bestätigt, in denen das Retinoblastoma-Gen (Rb) in Mäusen inaktiviert wurde. Bereits durch die Inaktivierung eines Rb-Allels entwickeln sich Gehirnanhangsdrüsen- und Schilddrüsentumore jedoch keine Retinoblastome [48, ]. Erst durch die kombinierte Ausschaltung von pRB und p107 oder pRB und p130 bilden sich retinale Hyperplasien und Retinoblastome [49, ,50 ,51 ,52 ]. Dies zeigt eine kompensierende Funktion der Pocket-Proteine bei der Tumorentwicklung der murinen Retina.

Konventionelle Rb-homozygote Tiere sterben schon während der frühen Embryonalentwicklung zwischen Tag E13.5 und E15.5 an einer defekten Plazenta, die zu einer gestörten Nährstoffversorgung führt [53 ]. Defekte bei der hepatischen Erythropoiese und der neuronalen Entwicklung lassen sich auf ektopische Mitose und Apoptose in den Organen zurückführen [48 ,54 ,55 ]. Rb-/- Mausembryonale Fibroblasten (MEFs) haben eine erhöhte Proliferationsrate und eine leicht verkürzte G1-Phase, ihr Wachstum bleibt jedoch von Serum abhängig und sie können durch Serumentzug arretiert werden [56 ,57 ,58 ]. Erst der kombinierte Verlust aller drei Pocket-Proteine bewirkt die Immortalisierung der MEFs und die Deregulation vieler zellzyklusrelevanter Gene [59 ,60 ]. Somit können die einzelnen Pocket-Proteine den Verlust des anderen bei der Zellzykluskontrolle zum Teil kompensieren, nicht jedoch bei der Embryonalentwicklung und der Tumorgenese. Dies zeigt, dass die Ausschaltung von pRB und des dazu gehörigen Signalwegs eine wichtige Voraussetzung für die Entstehung von Krebs ist.

Die E2F-Familie

Das erste Mitglied der E2F-Familie wurde ursprünglich als wichtiger zellulärer Faktor für die Transkription des adenoviralen E2-Promoters identifiziert und erhielt dadurch auch seinen Namen (E2 binding factor) [61 ,62 ]. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass E1A für die Aktivierung des E2-Promoters durch E2F notwendig ist und die Loslösung eines zellulären Proteins von E2F verursacht. Dies führte zu der Entdeckung, dass in normalen Zellen E2F mit pRB assoziiert [63 ,64 ,65 ,66]. Des Weiteren binden auch andere virale Onkoproteine wie das large T-Protein des Simianvirus und das E7-Onkogen des Pappilomavirus an pRB, um die Transkriptionsaktivität von E2F für ihre Zwecke zu benutzen [67 ,68 ,69 ].

Das 1986 entdeckte E2F war das erste einer ganzen Reihe von E2F-Familienmitgliedern und wurde demnach E2F1 benannt. Mittlerweile sind acht E2F-Genloki bekannt, die teilweise mehrere Isoformen kodieren (Abb. 2). Da sie entfernt verwandt sind, können die drei heterodimeren DP-Mitglieder ebenfalls zur E2F-Familie hinzugerechnet werden. Die DP-Proteine sind wichtige Dimerisierungspartner von E2F und für die meisten E2F-Mitglieder für die Bindung an die DNA essentiell [70, ]. Weitere homologe Faktoren konnten unter anderem in Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans und Arabidopsis identifiziert werden [71 ,72 ,73 ,74 ,75 ,76 ].

Abb. 2: Die Familie der E2F-Transkriptionsfaktoren (modifiziert nach Bracken et al., 2004). E2F1-6 besitzen eine DNA-Bindedomäne (DB) und eine DP-Dimerisierungsdomäne, bestehend aus einem Leuzinzipper (LZ) und der Marked Box (MB). Sequenzen für die Transaktivierung (TA) und zur Bindung der Pocket-Proteine (PB) sind nur in E2F1-5 enthalten. Dagegen enthalten E2F7/8 zwei DNA-Bindedomänen. (NLS: nukleäres Lokalisationssignal, NES: nukleäres Exportsignal).

Aufgrund von Sequenzhomologien und funktionellen Aspekten lassen sich die E2Fs in der klassischen, aber vereinfachten Sicht in verschiedene Klassen einteilen. Demnach kann man zwischen aktivierenden (E2F1, E2F2, E2F3A), repressorischen E2Fs (E2F3B, E2F4, E2F5) und nicht-klassischen E2Fs (E2F6, E2F7, E2F8) unterscheiden [77 ].

Die E2Fs, die zur Familie der so genannten Winged-Helix-Transkriptionsfaktoren gehören [78 ], haben mehrere gemeinsame Domänen. Die hoch konservierte DNA-Bindedomäne ist bei allen E2Fs vorhanden und definiert die Familie dieser Transkriptionsfaktoren. E2F7 und E2F8, die sich von den übrigen E2Fs durch eine zweite zusätzliche DNA-Bindedomäne unterscheiden, bilden Homo- und Heterodimere [79 ,80 ,81 ]. Dagegen dimerisieren E2F1-6 mittels der Dimerisierungsdomäne mit DP, um an die DNA zu binden [82 ,83 ]. Durch die Transaktivierungs-/pRb-Bindedomäne werden E2F1-5 von den Pocket-Proteinen gebunden, wohingegen E2F6, E2F7 und E2F8 diese Sequenz fehlt [84 ,85 ,86 ]. E2F6 reprimiert als Teil des Polycomb-Group (PcG)-Komplexes spezifische E2F-Gene [87 ,88 ]. Wie E2F7 und E2F8 repressorisch wirken können und welche Kofaktoren dafür nötig sind, ist bis jetzt noch ungeklärt.

Die Pocket-Proteine binden mit unterschiedlicher Präferenz an E2F1-5 [86 ,89 ]. So bindet pRB hauptsächlich an E2F1-3. E2F4 kann zwar von allen drei Pocket-Proteinen gebunden werden, wird aber während der frühen G1-Phase von p130 und in der S-Phase vor allem von p107 gebunden, wohingegen E2F5 nur mit p107 und p130 interagiert [90 ,91 ,92 ]. Erst durch die Bindung an die Pocket-Proteine ist es E2F4 und E2F5 möglich in den Kern zu translozieren, da sie ungebunden durch mehrere nukleäre Exportsignale vom Kern ausgeschlossen werden [93 ,94]. Demgegenüber enthält der N-Terminus von E2F1-3 ein nukleäres Lokalisationssignal, das den Transport von E2F1-3 in den Kern und deren konstitutiv nukleäre Lokalisation bewirkt [95 ,96 ]. Darüber hinaus kann über eine Bindestelle für Cyclin A/CDK2 im N-Terminus die DNA-Bindeaktivität von E2F1-3/DP reguliert werden [97 ]. Die funktionelle Einteilung der E2Fs und die dazugehörigen Bindepartner sind in Abb. 3 schematisch dargestellt.

Abb. 3: Schematische Darstellung der E2Fs, ihre physiologische Funktion und spezifische Bindepartner (modifiziert nach Attwool et al., 2004). Die E2F-Familie kann definiert durch ihre Regulation durch die Pocket-Proteine und physiologische Funktion in verschiedene Klassen eingeteilt werden.

E2F-abhängige Gene

Mit der Entdeckung der pRb-abhängigen Regulation von E2F und deren potentiellen Funktion während des Zellzyklusses und der Entstehung von Krebs, wuchs das Interesse an E2F-abhängigen Zielgenen. Das erste identifizierte E2F-abhängige Gen war sein Namensgeber selbst, das adenovirale E2, und direkt danach folgten die zellulären Gene Dhfr und c-myc [61 ,98 ,99 ,100 ]. Im Laufe der nachfolgenden Jahre konnten weitere E2F-Gene gefunden werden, die alle eine Rolle bei der DNA-Replikation und Zellzyklusprogression spielen [101 ,102 ,103 ]. Allen gemein ist die Erkennungssequenz für die E2F-Genprodukte („E2F-Bindestelle“) TTTC(C/G)CGC, die meist in der Nähe des Transkriptionsstarts gelegen ist [19 ]. In den letzten sieben Jahren wurden durch Microarray-Analysen und Chromatin-Immunopräzipitations-(ChIP)-Assays viele weitere potentielle E2F-Gene identifiziert [104 ,105 ,106 ,107 ,108 ]. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sich unter den E2F-abhängigen Genen nicht nur während der S-Phase sondern auch während der frühen G1- oder S/G2-Phase-regulierte Gene befinden. Außerdem wurden auch Gene identifiziert, die nicht im Zellzyklus sondern bei der DNA-Reparatur, Apoptose und überraschenderweise auch bei der Differenzierung oder Entwicklung involviert sind. Damit ist die Anzahl an E2F-regulierten Genen weit größer als angenommen. Interessanterweise findet man bei den E2F-abhängigen Genen Zellzyklusaktivatoren (CyclinE und E2f1) sowie Zellzyklusrepressoren (p107 oder Rb), sowohl anti-apoptotische wie Bcl2 als auch pro-apoptotische Gene wie Apaf1 oder Caspase-3 [109 ].

Die aktivierenden E2Fs

Zu den aktivierenden E2Fs werden E2F1, E2F2 und E2F3A gezählt. Einerseits sind sie potente transkriptionelle Aktivatoren und wenn sie überexprimiert werden, können sie quieszente Zellen zum Eintritt in die S-Phase zwingen sowie die Transformation primärer Zellen bewirken [110 ,111 ,112 ,113 ]. Andererseits spielen E2F1, E2F2 und E2F3 auch bei der Induktion des programmierten Zelltods (Apoptose) eine Rolle. So wurde gezeigt, dass die Nullmutation von E2F1 oder E2F3 die in Rb-/- Embryonen beobachtete Apoptose rückgängig machen kann und der Verlust von E2F2 in c-myc induzierten T-Zelllymphomen die Apoptose verhindert. Außerdem kann die Überexpression von E2F1, E2F2 oder E2F3 in Zellen und in Organen Apoptose auslösen [114 ,115 ,116 ,117 ,118 ,119 ]. Somit haben die aktivierenden E2Fs sowohl proto-onkogene als auch tumorsuppressive Eigenschaften, die sich auch in den verschiedenen Mausmodellen widerspiegeln [115 ,119 ,120 ,121 ,122 ].

Der E2f3-Lokus

Da sich meine Doktorarbeit hauptsächlich auf E2F3 konzentriert, wird in diesem Kapitel speziell auf E2F3 eingegangen.

Der E2f3-Lokus exprimiert zwei Isoformen [123 ,124 ]. Das längere Transkript ist die ursprünglich als E2f3 bezeichnete Form und wird mittlerweile E2f3a genannt. Von einem zweiten, im ersten Intron gelegenen alternativen Promotor auf dem E2f3-Lokus wird die kürzere Isoform E2f3b transkribiert. Da die restlichen Exons sowohl von E2f3a als auch von E2f3b genützt werden, unterscheiden sich die Proteine nur im N-Terminus. In E2F3B fehlen die ersten 122 Aminosäuren von E2F3A und werden durch sechs alternative Aminosäuren ersetzt. Im Gegensatz zu E2f3a, wird E2f3b konstitutiv während des Zellzyklusses exprimiert. Adams et al. konnte zeigen, dass der E2f3a-Promotor mehrere Erkennungssequenzen für das Myc-Genprodukt („Myc-Bindestellen“) enthält, die verantwortlich für die zellzyklusabhängige Regulierung sind. Dagegen enthält der E2f3b-Promotor zwar keine Myc-Bindestellen, aber dafür mehrere Ets- und Sp1-Bindestellen. Ob diese für die konstitutive Expression verantwortlich sind, ist noch nicht genauer untersucht [125 ].

Einen ersten Hinweis für eine essentielle Rolle für E2F3 bei der S-Phase-Induktion brachte die Mikroinjektion eines E2F3-spezifischen Antikörpers in REF52-Zellen, durch die gezeigt werden konnte, dass die Neutralisierung von E2F3, nicht aber von E2F1, zu einer drastischen Reduktion an BrdU-positiven Zellen führt [126 ]. Die Etablierung von E2f3-defizienten Mausembryonalen Fibroblasten (MEFs) durch homologe Rekombination zeigte, dass das Ausschalten beider E2F3-Isoformen zu einer erheblichen Reduktion der Wachstumsrate führt, wohingegen E2f1-/- MEFs nicht langsamer wachsen. Des Weiteren können E2f3-/- MEFs nach Serumentzug nur sehr schlecht wieder in die S-Phase eintreten [127 ]. Das Ausschalten von allen drei aktivierenden E2Fs (E2F1, E2F2, E2F3) hat einen kompletten Wachstumsarrest zur Folge [128 ]. Interessanterweise können E2f1-/-; E2f2-/-; E2f3+/- MEFs noch wachsen und erst nach dem Ausschalten des zweiten E2f3-Allels arretieren die Zellen vollständig. Dies spricht für eine essentielle Funktion von E2F3 für das zelluläre Wachstum.

Mehrere Gründe können für den Proliferationsdefekt von sowohl E2f3-/- als auch E2f1-/-; E2f2-/-; E2f3-/- (TKO) MEFs verantwortlich gemacht werden. Zum einen ist die Induktion der S-Phase-spezifischen Gene in synchronisierten E2f3-/- MEFs sehr schwach, was für eine aktivierende Rolle von E2F3 spricht. Jedoch konnte keine verringerte Expression dieser Gene in asynchron wachsenden Zellen festgestellt werden [129 ], so dass das schlechte Wachstum der E2f3-/- MEFs nicht allein durch eine veränderte Expression S-Phase-spezifischer Gene erklärt werden kann. Zum anderen sind nicht nur zellzyklusrelevante Gene dereguliert, sondern auch die Wachstumsinhibitoren p21^CIP und p19^ARF und p53, die sowohl in den E2f3-/- MEFs als auch den TKO-MEFs erhöht exprimiert werden [128 ,130 ]. Da die CKIs das Zellwachstum hemmen können, ist die erhöhte Expression dieser Gene eine weitere Erklärung für den Wachstumsdefekt der E2f3-mutanten Zellen. Der Verlust von p21 in den TKO-Zellen kann zwar die Probleme beim S-Phase-Wiedereintritt beheben, nicht jedoch die Rate an mitotischen Zellen erhöhen. Dagegen kann der Verlust von p53 sowohl den S-Phase-Wiedereintritt als auch die Proliferation der TKO-MEFs retten [131 ,132 ]. Jedoch wachsen sowohl p53-/-; E2f3-/- MEFs als auch p19-/-; E2f3-/- MEFs schlechter als die Einzelmutanten p53-/- beziehungsweise p19-/- MEFs [129 ]. Dies deutet an, dass weder p53, p19 noch p21allein für das schlechte Wachstum der E2f3-/- MEFs verantwortlich sind und möglicherweise noch weitere Signalwege dereguliert sind. Die Gründe für die Deregulation von p21 und p19 sind noch nicht richtig verstanden. Eine mögliche Erklärung für die Deregulation von p19 wird in der Studie von Aslanian et al. gegeben, in der vor allem E2F3B am p19-Promotor identifiziert werden kann und p19 unter normalen Umständen reprimiert. Durch Verlust von E2F3 (E2F3A und E2F3B) wird p19 dereprimiert [130 ].

Die unterschiedliche Bedeutung von E2F1, E2F2 und E2F3 für das zelluläre Wachstum kann unter anderem auch durch spezifische Proteininteraktionpartner erklärt werden. So konnten mithilfe eines so genannten Yeast-Two-Hybrid-Screens unter Verwendung der Marked Box RYBP und TFE3 als Interaktionspartner für E2F3 identifiziert werden [133, ,134 ,135 ].

Wie die E2f3-defizienten MEFs zeigen auch E2f3-/- Mäuse eine verzögerte Entwicklung. So sind die E2f3-/- Embryonen kleiner und im reinen C57/BL6- oder 129/Sv-Hintergrund embryonal letal. Im gemischten Hintergrund (C57/BL6 x 129/Sv) werden nur 25% der zu erwartenden Embryonen geboren, die übrigen sterben in utero. Die Ursache hierfür ist nicht genau geklärt, könnte aber durch einen plazentalen Defekt verursacht werden. Die überlebenden E2f3-/- Tiere haben ein reduziertes Gewicht und Größe sowie eine verkürzte Lebenserwartung. Viele der Tiere sterben an einer kongestiven Herzinsuffizienz und weisen Lungenödeme auf. Im Gegensatz zu E2f1-defizienten Mäusen, entwickeln E2f3-/- Mäuse keine Tumore [120 ,121 ,136 ]. Überraschenderweise führt der vollständige Verlust von E2F3 in Rb-heterozygoten Mäusen zwar zu einem Rückgang der Gehirnanhangsdrüsentumore, aber die Schilddrüsentumore weisen eine erhöhte Metastasierungsrate auf [122 ]. Darüber hinaus korreliert die Überexpression von E2F3 in humanen Ovar- und kleinzelligen Lungenkarzinomen mit einer schlechten Prognose für die Patienten [137 ,138 ]. Zudem konnte in Blasen- und Prostatatumoren sowie Retinoblastomen eine Überexpression durch Amplifikation des E2F3-Lokus detektiert werden [139 ,140 ,141 ,142 ,143 ,144 ]. Somit ist E2F3 ein wichtiger Faktor für das zelluläre Wachstum und seine Deregulation trägt zur Tumorentwicklung bei.

Der p53-Signalweg

Der Tumorsuppressor p53 wurde fälschlicherweise zuerst als Onkogen identifiziert. Wie sich später herausstellte, waren es jedoch mutierte Formen von p53, die in transformierten Zellen überexprimiert wurden [145 ,146 ,147 ,148 ,149 ]. Mittlerweile wird p53 als einer der wichtigsten Tumorsuppressoren angesehen und man geht davon aus, dass p53 in 50% aller Tumore mutiert ist [150 ]. Darüber hinaus sind Keimbahnmutationen im p53-Gen Hauptursache für das LiFraumeni-Syndrom, einem erblichen Krebs, verantwortlich [151 ,152 ,153 ]. Dementsprechend führt auch der Verlust von p53 in Mäusen zu einer Disposition zur Tumorentwicklung [154 ].

p53 ist das Zentrum eines sehr komplexen Netzwerks [155 ]. Die Menge an p53 ist in den meisten Zellen aufgrund schneller Degradation sehr gering [156, ], kann aber durch verschiedene Stressfaktoren wie durch UV oder ionisierende Strahlung hervorgerufene DNA-Schäden oder Onkogenaktivierung induziert und stabilisiert werden (Abb. 4) [157 ,158 ,159 ]. Die Überexpression von Onkogenen wie E2F1 oder c-myc führt zur Expression von p14/p19^ARF, das die Ubiquitinligase Mdm2 inhibiert und damit p53 stabilisiert [160, ,161 ,162 ,163 ,164 ,165 ]. Die zelluläre Antwort auf die p53-Aktivierung kann unterschiedlich ausfallen und zu Wachstumsarrest, Apoptose, Seneszenz oder Differenzierung führen. Wie die Zelle auf p53 reagiert, hängt sowohl von kooperierenden Signalwegen als auch von der Art und Grad des Schadens ab [166 ,167 ].

Abb. 4: Der p53-Signalweg (modifiziert nach Harris und Levine, 2005). Onkogenaktvierung und durch ionisierende Strahlung (IR) oder ultraviolettes Licht (UV) verursachte DNA-Schäden aktivieren den p53-Signalweg. Über verschiedene Mittler wird p53 modifiziert und stabilisiert. Effektorproteine sind nur beispielhaft aufgeführt und es existieren wesentlich mehr.

p53 gehört zusammen mit p63 und p73 zu einer kleinen Proteinfamilie. Als Transkriptionsfaktor kann p53 direkt die Genexpression von Wachstumsregulatoren (p21, Mdm2, 14-3-3-), pro-apoptotische Faktoren (Bax, Puma, Noxa) und Überlebenssignalen (Slug und TIGAR) regulieren [168 ,169 ,170 ,171 ,172 ,173 ,174,175]. Durch Interaktion mit verschiedenen Kofaktoren wie Miz, ASPP oder Slug und Unterschieden in der p53-Erkennungssequenz kann p53 die Zielgene spezifisch regulieren. Darüber hinaus kann p53 unabhängig von seiner transkriptionellen Funktion im Cytoplasma pro-apoptotische Aktivitäten auslösen, indem es als BH3-Domänenprotein die Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien bewirkt, das die Induktion von Caspasen und Zelltod zur Folge hat [167 ].

Die Expression von p53 kann sowohl zu einem G1- als auch G2-Arrest führen [176,177 ,178, ]. Der wichtigste Vermittler des p53-induzierten G1-Arrests ist der CDK-Inhibitor p21, der zusätzlich zur Hemmung der CDKs auch durch die Bindung an PCNA und die damit einhergehende Hemmung der Replikation den Zellzyklus inhibieren kann [168 ,179 ]. Dementsprechend reagieren p21-/- MEFs nicht mehr auf den p53-induzierten Zellzyklusarrest [180 ,181]. Paradoxerweise sind jedoch p21-/- MEFs verfrüht seneszent und können durch Ras nicht transformiert werden [182 ]. Demgegenüber sind p53-defiziente MEFs immortal und haben eine unbegrenzte Lebensspanne [183]. Jedoch kann in MEFs mit herunterreguliertem p53 (p53^kd) durch die Überexpression des Plaminogen-Inhibitors PAI-1 oder GSK3β Seneszenz induziert werden, was zeigt, dass der PI(3)K-Akt-GSK3β-Signalweg eine wichtige Funktion für das Wachstum der p53^kd-MEFs hat [184 ]. Bemerkenswerterweise kann p53 auch in einer TGFβ1-abhängigen Weise mit SMAD2 interagieren und spielt eine wichtige Rolle bei der Induktion von p21 und PAI-1 während der TGFβ1-induzierten cytotoxischen Antwort [185 ,186 ]. Dies zeigt, dass die verschiedenen Signalwege miteinander kommunizieren und dadurch die Antwort auf den jeweiligen Stimulus beeinflussen können.

Der TGFβ1-Signalweg

Ursprünglich als transformierender Faktor normaler Fibroblasten entdeckt, ist TGFβ (Transforming growth factor ) mittlerweile überall als potenter Regulator des Zellwachstums, der Differenzierung und der Migration akzeptiert. TGFβ gehört zusammen mit den BMPs, den Activinen, dem anti-Müllerschen Hormon (AMH) und den Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (GDFs) zur TGF-Superfamilie [187 ]. In den Säugetieren sind drei Isoformen von TGFβ bekannt, die auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind sowie zeitlich und räumlich unterschiedlich exprimiert werden. Am besten untersucht ist TGFβ1, das hier eingehend besprochen wird.

Wie die meisten Mitglieder der TGF-Superfamilie, wird TGFβ1 als latenter Faktor sekretiert [188 ,189 ,190]. In der extrazellulären Matrix (ECM) eingelagert, kann die latente Vorläuferform nach Bedarf durch Proteasen gespalten und dadurch aktiviert werden. Durch die Bindung von TGFβ1 an den TGFβ-TypII-Rezeptor (TβRII), kann TβRII an TypI-Rezeptoren (TβRI) binden und phosphorylieren, wodurch die Rezeptorkinase aktiviert wird. TβRI wiederum erkennt und phosphoryliert spezifisch die Rezeptor-regulierten SMAD-Proteine (R-SMAD) [191 ]. Je nach Zelltyp liegen unterschiedliche TβRI vor. In den meisten Zellen ist ALK5 (activin receptor-like kinase 5) vorherrschend, aber in Endothelzellen wird neben ALK5 auch ALK1 durch TGFβ1 aktiviert [192 ]. Signale über ALK5 führt zur Phosphorylierung von SMAD2 und SMAD3, wohingegen ALK1 SMAD1, SMAD5 und SMAD8 aktiviert. Im Grundzustand sind SMAD2 und SMAD3 im Cytoplasma lokalisiert, wo sie durch Bindung an verschiedene Proteine wie zum Beispiel SARA (SMAD anchor for receptor activation) zurückgehalten werden [193 ]. Die TβRI-vermittelte Phosphorylierung reduziert die Affinität der SMADs zu SARA und bewirkt die Interaktion mit dem Kofaktor SMAD4. SMAD2/3-SMAD4 Heterodimere beziehungsweise -trimere translozieren in den Kern und aktivieren dort TGFβ1-abhängige Zielgene (Abb. 5).

Abb. 5: Der TGFβ1-Signalweg (modifiziert nach Siegel und Massague, 2003). TGF β 1 bindet an T β RII und bewirkt die Rekrutierung und Phosphorylierung von T β RI. Der aktivierte T β RI phosphoryliert die Rezeptor-assoziierten R-SMADs (SMAD2/3), die dadurch von ihrem cytoplasmatischen Anker (SARA) befreit werden und zusammen mit SMAD4 in den Kern translozieren. SMAD-Proteine interagieren mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren (TF) und Kofaktoren (Co), um die Gentranskription zu regulieren. SMAD7 reguliert zusammen mit Smurf1/2 die Degradation der Rezeptoren.

Da die Bindung von SMAD2/3-SMAD4-Komplexe an die SMAD-Erkennungssequenz CAGAC relativ schwach ist [194 ], interagieren SMAD-Kernkomplexe mit verschiedenen Kofaktoren wie FOXH1, JunB, TFE3, LEF1/TCF, C/EBPβ oder p300/CBP, um besser an die DNA binden zu können [195 ,196 ,197 ,198 ,199 ,200 ]. Dagegen können Korepressoren wie TGIF, SKI und SnoN die SMAD-vermittelte Transaktivierung schwächen [201,202 ,203 ].

Der TGFβ1-Signalweg wird durch die Degradierung der Rezeptoren beendet. TGFβ1 induziert neben anderen Zielgenen auch das Inhibitor-SMAD (I-SMAD) SMAD7, das die E3-Ubiquitinligasen Smurf1 oder Smurf2 zu den Rezeptoren rekrutiert. Dadurch werden diese ubiquitiniert, mittels Caveolin-reicher Vesikel internalisiert und über das Proteasom abgebaut [204 ]. Da SMAD2/3-SMAD4-Komplexe durch De- und Rephosphorylierung kontinuierlich zwischen Kern und Cytoplasma pendeln, wird nach Abbau der Rezeptoren auch deren Translokation in den Kern angehalten. Darüber hinaus können auch SMAD2 und SMAD3 ubiquitiniert und über das Proteasom abgebaut werden [205 ].

Nicht alle TGFβ1-induzierte Prozesse sind SMAD-abhängig [206 ]. Sowohl die extrazelluläre-Signal-regulierte-Kinase 1 und 2 (ERK1/2) als auch die p38- oder JNK-Mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPKs) können durch TGFβ1 aktiviert werden. Da diese Signalwege miteinander vernetzt sind, kann Ras durch direkte und indirekte Mechanismen den TGFβ1-Signalweg sowohl positiv als auch negativ beeinflussen. Dies zeigt, dass der TGFβ1-Signalweg in ein komplexes Netzwerk eingegliedert ist und verschiedene Faktoren die zelluläre Antwort auf TGFβ1 beeinflussen können.

TGFβ1-induzierte zelluläre Prozesse

Angesichts des komplexen Netzwerks und der vielen verschiedenen Kofaktoren der SMADs ist es nicht verwunderlich, dass TGFβ1 eine ganze Reihe verschiedener und gegensätzlicher Prozesse in den Zellen induzieren kann. Die Antwort, wie eine Zelle auf ein TGFβ1-Stimulus reagiert, ist stark vom Zelltyp abhängig und kann zu Wachstumsarrest, Proliferation, Apoptose, Seneszenz oder auch epithelialer-mesenchymaler Transition führen (Abb. 6) [207 ,208].

Abb. 6: TGFβ1-induzierte Prozesse. TGF β 1 kann je nach Zelltyp unterschiedliche Antworten auslösen.

TGFβ1-induzierter Wachstumsarrest

TGFβ1 verursacht bei den meisten Zelltypen einen Wachstumsarrest, obwohl es auch bei manchen adulten Mesenchymzellen und transformierten Zellen Proliferation induzieren kann. In primären Fibroblasten verhindert die Zugabe von TGFβ1 den Eintritt in die S-Phase, und erst durch Immortalisierung wirkt TGFβ1 als Wachstumsfaktor [209, ]. Dementsprechend führt die Verhinderung der TGFβ1-Sekretion entweder durch Mutation des Gens oder durch Zugabe eines neutralisierenden TGFβ1-Antiköpers zur Verdopplung der Zellwachstumsrate [210]. Außerdem ist die Expression typischer TGFβ1-abhängiger Zielgene wie PAI-1, Fibronectin und pro- 1-Kollagen in Tgfb1-/- MEFs reduziert. Demnach kann eine veränderte Tgfb1-Expression auf autokrine Weise auf Proliferation und Genexpression einwirken.

Durch die Mutation von entweder Smad2, Smad3 oder Alk5 (TypI-TGFβ-Rezeptor) werden MEFs insensitiv gegenüber TGFβ1-induzierten G1-Arrest [211 ,212 ]. Sowohl die TGFβ1-induzierte Expression von PAI-1, p21, p15 als auch die autokrine Regulation von Tgfb1 ist von funktionellem ALK5, SMAD2 und SMAD3 abhängig. Jedoch ist die TGFβ1-induzierte Expression von Fibronectin von dem Verlust von entweder SMAD2 oder SMAD3 nicht betroffen und hängt vielmehr von c-Jun ab [213 ]. Interessanterweise sind auch Rb-/- MEFs teilweise insensitiv gegenüber TGFβ1-induziertem Wachstumsarrest [214 ]. Dies zeigt, dass ein funktioneller pRB/E2F-Signalweg wichtig für einen vollständigen TGFβ1-induzierten Wachstumsarrest ist.

Molekularbiologisch am besten untersucht ist der TGFβ1-induzierte Wachstumsarrest in Epithelzellen. Durch Transkriptionsanalysen konnte gezeigt werden, dass ein komplexes cytostatisches Programm durch TGFβ1 induziert wird, das die Repression der Zellzyklus-aktivatoren und die Induktion der Zellzyklusinhibitoren bewirkt und damit zu einem Stopp in der G1-Phase führt [215 ]. Durch Interaktion mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren können SMAD2/3 diese cytostatische Antwort ausführen. So konnte gezeigt werden, dass SMAD3 und SMAD4 mit E2F4, E2F5 und p107 einen Komplex bilden, um den c-myc-Promotor zu reprimieren [216 ]. Ferner wird Id1 durch SMAD3 und den Transkriptionsfaktor ATF3 reprimiert [217]. Die Induktion der CDK-Inhibitoren p15 und p21 durch TGFβ1 erfolgt durch Bildung eines aktivierenden SMAD-FOXO-Komplexes. Gleichzeitig wird c-myc herunter reguliert, das in proliferierenden Zellen p15 und p21 reprimiert [218 ,219,220].

TGFβ1-induzierte Seneszenz

Neben dem reversiblen G1-Arrest kann TGFβ1 bei länger andauerndem, chronischem Signal einen permanenten Wachstumsarrest, die Seneszenz, auslösen [221 ,222 ]. So konnte gezeigt werden, dass die TGFβ1-Expression in seneszenten Keratinozyten stark hoch reguliert wird und v-Ras keine Seneszenz in Tgfb1-/- Keratinozyten induzieren kann. Zudem zeigen diese Zellen eine erhöhte maligne Transformation [223 ,224]. Der Mechanismus der TGFβ1-induzierten Seneszenz ist noch nicht genau geklärt, aber die Hochregulierung der CDK-Inhibitoren p21 und p15 und der darauf folgenden Hypophosphorylierung von pRB zeigt, dass der pRB/E2F-Signalweg eine wichtige Rolle dabei spielt [11 ]. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Pml-defiziente Fibroblasten resistent gegenüber der TGFβ1-induzierten Seneszenz sind [225]. Da PML mit SMAD2/3 interagiert, sind zumindest SMAD2/3-Signale wichtig für die TGFβ1-induzierte Seneszenz. Interessanterweise kann PML die Aktivität von p53 regulieren und wird aber auch von p53 reguliert [226 ]. Des Weiteren wird PAI-1 in seneszenten Fibroblasten hoch reguliert, das sowohl durch TGFβ1 als auch p53 reguliert wird. Als Inhibitor des Plasminogen-Systems kann PAI-1 die Verfügbarkeit der Wachstumssignale regulieren [227 ]. Diese Studien deuten an, dass sowohl der pRB- als auch p53-Signalweg eine wichtige Rolle bei der TGFβ1-induzierten Seneszenz spielen.

TGFβ1-induzierte Apoptose

Neben Wachstumsarrest und Seneszenz kann TGFβ1 auch Apoptose auslösen, wobei diese Fähigkeit stark vom Zelltyp abhängt. Der Mechanismus ist noch nicht sehr gut verstanden, es konnte jedoch gezeigt werden, dass Tieg1, DAPK, SHIP, SMAD7 und p53 eine Rolle bei der TGFβ1-induzierten Apoptose spielen [228 ,229 ,230 ,231 ]. Letztlich führen all diese Signale zu einer veränderten Expression von pro- und anti-apoptotischen Komponenten wie die Bcl2-Familienmitglieder und Caspasen, die den programmierten Zelltod auslösen [232 ].

TGFβ1-induzierte epitheliale-mesenchymale Transition

Eine weitere wichtige Funktion übt TGFβ1 bei der epithelialen-mesenchymalen Transition (EMT) aus. Unter EMT versteht man den Übergang von polarisierten Epithelzellen zu Zellen mit mesenchymalen Eigenschaften, wie zum Beispiel der Fähigkeit sich zu bewegen. Dieser Prozess wurde zuerst während der Embryogenese bei der Gastrulation beobachtet. Das unangebrachte Wiedereinsetzten der EMT während der Krebsentwicklung wird mit Tumorprogression assoziiert. Bei der Entstehung von chronischen fibrotischen Krankheiten steht die EMT in Zusammenhang mit der Degradation von epithelialen Strukturen und der Erzeugung von Fibroblasten mit einer erhöhten Produktion spezifischer ECM-Proteine [233 ,234 ].

TGFβ1 kann neben anderen Faktoren die zellulären Veränderungen der EMT induzieren. Die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Snail/Slug und Twist führt zur Herunterregulation der Zelladhäsionsmoleküle E-Cadherin, ZO1 und MUC1 und damit zur Auflösung der epithelialen Zellkontakte sowie zur Reorganisation des Actin-Cytoskeletts [235,236 ,237,238,239 ]. Über Smad3 und SIP1 kann TGFβ1 den EMT-Marker Vimentin anschalten [240 ]. Die ECM-Proteine Fibronectin und Kollagen ebenso wie verschiedene Metalloproteinasen werden ebenfalls durch TGFβ1 induziert [241 ]. Dadurch kann TGFβ1 bei vielen Tumorzellen zu einer höheren Migrationsrate führen und deren Tumorigenität erhöhen.

Der TGFβ1-Signalweg in der Mausentwicklung

Schon in den frühen 1990 Jahren wurden Tgfb1-defiziente Mäuse etabliert. Im 129/SV Hintergrund sterben etwa 50% der Tgfb1-/- Embryonen intrauterin zwischen E9.5 und E11.5. Die Embryonen entwickeln sich normal, zeigen aber vaskulogene und hämatopoietische Defekte im extraembryonalen Gewebe wie im Dottersack und in der Nabelschnur [242 ]. Interessanterweise findet sich exakt dieser Phänotyp auch in Tgfbr1-/- und Tgfbr2-/- Embryonen, die ebenfalls um E9.5-E11.5 sterben [243 ,244]. Jedoch können je nach genetischem Hintergrund null bis zu 80% der Tgfb1-/- Tiere bis zur Geburt überleben, wohingegen Tgfbr1-/- und Tgfbr2-/- Tiere unabhängig vom genetischen Hintergrund während der Embryonalentwicklung sterben. Die geborenen Tgfb1-defizienten Tiere zeigen keine morphologischen Defekte, sterben jedoch drei Wochen nach der Geburt an multifokalen Entzündungen, wobei eine massive Infiltrierung der Hauptorgane durch Lymphozyten und Makrophagen auftritt [245 ]. Durch Kreuzung mit immundefizienten SCID-Mäusen überleben die Tgfb1-/- Mäuse bis zum Erwachsenenalter. Die Tiere sind aber vergleichsweise kleiner und gedeihen nicht [246 ]. Zudem wurde bei den Tgfb1-/- SCID-Mäusen eine verzögerte Wundheilung festgestellt [247 ]. Die Analysen der Tgfb1-/- Mäuse legen nahe, dass TGFβ1 während der Entwicklung bei der endothelialen Differenzierung und Hämatopoiese und später bei der Immunsupression und Wundheilung eine Rolle spielt.

Ähnlich wie die Tgfb1-/- Mäuse sterben auch Smad3-/- Mäuse an einer chronischen Infektion ein bis drei Monate nach der Geburt [248 ,249]. Darüber hinaus konnte eine weitere Studie zeigen, dass Smad3-defiziente Mäuse an metastasierenden kolorektalen Krebs erkranken [250 ]. Dagegen sind sowohl Smad2 als auch Smad4-defiziente Mäuse früh embryonal letal. Beide zeigen unter anderem Defekte in der Mesodermbildung und in der Gastrulation [251 ,252,253,254 ,255 ]. Zudem entwickeln Smad4-heterozygote Mäuse im Alter von einem Jahr bösartige intestinale Tumore [256].

Der TGFβ1-Signalweg in der Tumorentwicklung

Viele humane Tumorzelllinien sind resistent gegenüber TGFβ1-induziertem Wachstumsarrest, zeigen aber in anderer Hinsicht eine normale Induktion der TGFβ1-abhängigen Zielgene wie Smad7, PAI-1 und c-Jun [257 ]. Außerdem weisen viele humane Tumore Mutationen im TGFβ1-Signalweg auf. Zum einen findet man eine Überexpression von TGFβ1 in vielen verschiedenen Tumorarten wie Brust-, Kolon-, Magen-, Pankreas- und Lungenkrebs [258 ], die mit Tumorprogression, Angiogenese, Metastasierung und schlechter klinischer Prognose assoziiert wird. Zum anderen werden TβRII, TβRI, SMAD2 und SMAD4 durch Mutation ebenfalls in Kolon-, Pankreas- Brust-, Prostata-, Lungen- und Magentumoren inaktiviert [259,260 ,261 ,262,263 ].

Um die komplexe Rolle von TGFβ1 während der Tumorentwicklung und -progression zu untersuchen, wurden verschiedene transgene Maustumormodelle etabliert. Am besten untersucht sind Brustkrebsmodelle, die durch transgene Expression von MMTV-TGFα oder MMTV-c-Neu induziert werden. Durch Kreuzung mit einer MMTV-Cre-Maus, die konditional aktives TGFβ1 exprimiert, konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von TGFβ1 zwar zu einer verzögerten Tumorentwicklung aber zur erhöhten Metastasenbildung führt [264 ,265 ]. Ein weiteres Modell unter Verwendung von dominant-negativen TβRII beziehungsweise konstitutiv aktiven TβRI in MMTV-cNeu-Mäusen zeigte, dass das Ausschalten des TGFβ1-Signalwegs zu einer früheren Entwicklung der Brusttumore führt, die jedoch seltener metastasieren. Dagegen wird durch die konstitutive Aktivierung des TGFβ1-Signalwegs die primäre Tumorentstehung verzögert, aber die Metastasierung der entwickelten Tumore nimmt drastisch zu [266 ]. Diese elegante Studie spiegelt die gegensätzliche Funktion TGFβ1 bei der frühen Tumorentwicklung und späteren Tumorprogression wider.

Nicht nur zellautonome Signale der Tumorzellen sondern auch Tumor-Stroma-Interaktionen spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorentwicklung und -progression. Um die Frage zu klären, ob autokrine oder parakrine TGFβ1-Signale für die Tumorprogression verantwortlich sind, wurde mithilfe einer Fibroblasten-spezifischen Cre-Rekombinase das Tgfbr2-Gen ausgeschaltet. Die Störung des TGFβ1-Signalwegs in den Fibroblasten führte zur Entstehung intraepithelialer Neoplasien in der Prostata und zu Plattenepithelkarzinomen des Vormagens. Dies konnte auf eine erhöhte Produktion der Krebs-fördernden Faktoren wie HGF, MST1 und TGFα der Fibroblasten zurückgeführt werden [267 ,268 ].

Zusammengefasst kann gesagt werden, dass TGFβ1 eine zweigeteilte Funktion in der Tumorentwicklung hat: in frühen Stadien übt es eine tumorsuppressive, proliferations-hemmende Funktion aus, wohingegen TGFβ1 in späten malignen Stadien zu einer erhöhten Invasivität, Motilität und Metastasierung führt.

Ziele dieser Arbeit

E2F3 spielt innerhalb der E2F-Familie für Wachstum und Tumorprogression eine besondere Rolle, die bisher noch nicht exakt verstanden wird. Zudem ist der Grund für die Hochregulation von p53, p21 oder p19 in den E2f3-/- MEFs, die zum Wachstumsdefekt dieser Zellen beitragen, noch nicht genau geklärt. Neben p53, dessen Nullmutation jedoch in E2f3-/- MEFs und Mäusen keine vollständige Rettung des Wachstumsdefekts bewirkt, kann auch der TGFβ1-Signalweg p21 induzieren.

Deswegen war das Ziel dieser Arbeit den TGFβ1-Signalweg in den E2f3-/- MEFs zu analysieren. Dabei wurde zuerst geklärt, ob TGFβ1 durch den Verlust von E2F3 dereguliert wird und ob dies zu einer Deregulation des TGFβ1-Signalwegs führt. Ferner habe ich untersucht, ob der Verlust von E2F3 auf TGFβ1-induzierte Prozesse Einfluss nimmt. Darüber hinaus wurden metastatische und nicht-metastatische Schilddrüsentumore der verschiedenen Rb+/-, Rb+/-; E2f3+/- und Rb+/-; E2f3-/- Mäuse mithilfe der Microarrayanalyse untersucht, um neue, E2F-abhängige Gene zu identifizieren, die zur Tumorprogression beitragen und möglicherweise als neue Metastasemarker humaner Tumore dienen können.