Um zu untersuchen, ob die TGFβ1-Signalwirkung in den E2f3-/- MEFs verändert ist, wurde als erstes die Expression von Tgfb1 in primären, asynchron wachsenden Wildtyp- und E2f3-/- MEFs analysiert. Dafür wurde RNA aus den MEFs isoliert, in cDNA umgeschrieben und anschließend mithilfe der quantitativen PCR (qPCR) analysiert. Wie Abb. 7A zeigt, ist Tgfb1 in den E2f3-/- MEFs erhöht exprimiert.

Da die Deregulation von p19, p21 und der S-Phase-Gene vor allem in synchronisierten E2f3-/- MEFs besonders deutlich ist, wurde als nächstes die Tgfb1-Expression in synchronisierten Wildtyp- und E2f3-/- MEFs untersucht. Dafür wurden die Zellen 72 Stunden gehungert und anschließend mit 10% Serum stimuliert. Die Proben für die RNA-Isolation wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet.

Abb. 7: Tgfb1 ist in asynchronen und synchronisierten E2f3-/- MEFs dereprimiert. (A) qPCR-Analyse der Tgfb1 -Expression von asynchron wachsenden Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs (P4). mRNA wurde aus MEFs isoliert, in cDNA umgeschrieben und im iCycler analysiert. (B) qPCR-Analyse der Genexpression von Tgfb1 , Mcm6 und p107 . Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs wurden durch Serumentzug für 72 Stunden synchronisiert und anschließend mit 10% FCS stimuliert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben geerntet, mRNA isoliert und cDNA synthetisiert. Mcm6 und p107 dienen als Kontrolle für den S-Phase-Wiedereintritt.

Wie die qPCR-Analyse zeigt, steigt die Tgfb1-Expression in Wildtyp-MEFs während der G1-Phase leicht an und verändert sich nicht wesentlich während der Progression durch den Zellzyklus. Dagegen wird Tgfb1 sehr stark während der G1-Phase in E2f3-/- MEFs hoch reguliert und bleibt durchgehend erhöht (Abb. 7B). Die Induktion der S-Phase wurde durch die Expression der bekannten E2F-Zielgene Mcm6 und p107 nachgewiesen. Konsistent mit anderen Studien werden diese nur sehr schwach in E2f3-/- MEFs induziert [127 ]. Diese Ergebnisse zeigen, dass Tgfb1 sowohl in den asynchronen als auch in den synchronisierten E2f3-/- MEFs stark dereprimiert ist.

TGFβ1 wird als latentes Protein sekretiert, das durch in der extrazellulären Matrix vorhandene Proteasen aktiviert wird [189 ]. Um zu untersuchen, ob die erhöhte Tgfb1-Expression zu einer erhöhten TGFβ1-Sekretion führt, wurde Medium von Wildtyp- und E2f3-/- MEFs für zwei Tage konditioniert und anschließend mithilfe eines TGFβ1-ELISAs (R&D) die vorhandene Menge an latentem als auch aktiviertem TGFβ1 in den Überständen analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass in den Überständen der E2f3-/- MEFs, übereinstimmend mit der erhöhten Tgfb1-Expression dieser Zellen, mehr TGFβ1-Protein sekretiert wird (Abb. 8A).

TGFβ1 kann durch Bindung an seine Rezeptoren (TβRI und TβRII) den TGFβ1-Signalweg anschalten, der zur Phosphorylierung von SMAD2 und SMAD3 führt [191 ]. Deswegen kann man anhand der SMAD-Phosphorylierung messen, ob der TGFβ1-Signalweg aktiviert wurde. Um dies zu untersuchen, wurden Wildtyp- und E2f3-/- MEFs gehungert und anschließend mit 10% Serum stimuliert. Nach null beziehungsweise 16 Stunden wurden die Proteinextrakte mithilfe eines Antiköpers, der spezifisch phosphoryliertes SMAD2 erkennt, untersucht. Wie zu erwarten, kann durch Serumzugabe eine Zunahme der SMAD–Phosphorylierung in Wildtyp- und E3f3-/- MEFs beobachten werden (Abb. 8B). Im Vergleich zu den Kontrollzellen zeigen E2f3-/- MEFs jedoch eine erhöhte Phosphorylierung von SMAD2 sowohl im unstimulierten Zustand als auch nach 16 Stunden Serumzugabe. Dies bedeutet, dass die erhöhte Tgfb1-Expression und TGFβ1-Sekretion der E2f3-/- MEFs zu einer erhöhten Aktivität des TGFβ1-Signalwegs führt.

Abb. 8: Der Verlust von E2F3 führt zur Deregulation von TGFβ1 und TGFβ1-regulierten Genen. (A) TGF β 1 wird von E2f3 -/- MEFs vermehrt sekretiert. Die Mengen an TGF β 1-Protein wurden mittels eines kommerziellen TGF β 1-ELISAs (R&D) untersucht, wofür für 48 Stunden konditionierte Zellkultur-mediumüberstände von Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs (Passage P6) verwandt wurden. Die Daten zeigen ein repräsentatives Ergebnis. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. (B) In E2f3 -/- MEFs ist SMAD2 erhöht phosphoryliert. Western-Blot-Analyse von gehungerten und für 16 Stunden Serum stimulierten Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs unter Verwendung eines spezifischen anti-phospho-SMAD2-Antikörpers. Die Gesamtmenge an SMAD2/3 dient als Ladekontrolle. (C) TGF β 1-regulierte Gene sind in E2f3 -/- MEFs dereguliert. qPCR-Analyse der Expression von PAI-1 , p21 , Vimentin und Fibronectin in asynchron wachsenden Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs (Passage P4). (D) Western-Blot-Analyse von Gesamtzellproteinextrakten asynchron wachsender Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs. Es wurden spezifische Antiköper gegen Vimentin, Fibronectin und p21 verwandt. Vinculin diente als Ladekontrolle.

Die Aktivierung des TGFβ1-Signalwegs führt zur Induktion von Genen, die unter anderem bei der Zellzyklusregulation sowie bei der EMT involviert sind [241 ,269 ]. Deswegen wurde als nächstes untersucht, ob neben der Deregulation von TGFβ1 in den E2f3-/- MEFs auch eine Deregulation typischer TGFβ1-abhängiger Zielgene zu beobachten ist. Darum wurde die Expression von PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin auf RNA-Ebene untersucht. Die qPCR-Analyse zeigt, dass diese Gene ähnlich wie Tgfb1 dereguliert sind (Abb. 8C). Darüber hinaus kann auch eine erhöhte Expression von Vimentin, Fibronectin und p21 in den E2f3-/- MEFs auf Proteinebene detektiert werden (Abb. 8D). Für p21 ist bereits bekannt, dass es durch den Verlust von E2F3 hoch reguliert wird [128 ,130 ], jedoch ist der Mechanismus, der zu dieser Deregulation führt, nicht geklärt. Die erhöhte Expression von Vimentin und Fibronectin ist mit der von p21 vergleichbar. Damit kann gezeigt werden, dass durch den Verlust von E2F3 in primären MEFs Tgfb1 dereprimiert und dadurch der TGFβ1-Signalweg dereguliert wird.

TGFβ1 kann die Expression von PAI-1, p21, Vimentin, Fibronectin und auch von sich selbst induzieren [211 ]. Jedoch deuten Reportergenanalysen an, dass E2F1 bei der Expression von Tgfb1, PAI-1, Fibronectin und p21 involviert ist [270 ,271 ,272 ,273 ]. Deswegen wurde untersucht, ob der Verlust von E2F3 direkt oder indirekt, über die erhöhte TGFβ1-Sekretion, für die Deregulation von Tgfb1, PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin verantwortlich ist.

Um diese Frage zu beantworten, wurden Proben von Wildtyp- und E2f3-/- MEFs über mehrere Passagen (P2-P8) gesammelt, da die TGFβ1-Sekretion in den E2f3-/- MEFs über die Passagen zunimmt (Abb. 9A). Die qPCR-Analyse ergab, dass die Genexpression von Tgfb1, p21 und Vimentin in jungen Passagen (P2) von Wildtyp- und E2f3-/- MEFs sehr ähnlich ist und erst im Laufe der Passagierung (P4, P6 oder P8) der E2f3-/- MEFs hoch reguliert wird, wohingegen deren Expression in den Wildtyp-MEFs unverändert bleibt (Abb. 9B). Die Deregulation von PAI-1 und Fibronectin ist schon in früheren Passagen E2f3-defizienter MEFs sichtbar. Interessanterweise werden auch p19 und E2f1 erst mit zunehmenden Passagen in E2f3-defizienten MEFs hoch reguliert. Sowohl p19 als auch E2f1 sind bekannte E2F-Zielgene und die Deregulation von p19 in den E2f3-/- MEFs ist zuvor schon publiziert worden [130 ].

Dies bedeutet, dass während der Passagierung die transkriptionelle Kontrolle der TGFβ1-Zielgene von E2F3 abhängt, da die Expression von Tgfb1, PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin mit zunehmender Passage in den E2f3-/- nicht jedoch in den Wildtyp-MEFs erhöht wird. Der Verlust von E2F3 ist für die Deregulation verantwortlich, aber der Phänotyp wird erst mit zunehmender Passage völlig offensichtlich wird. Dies suggeriert, dass auch die erhöhte TGFβ1-Sekretion der E2f3-/- MEFs zu dieser Deregulation beiträgt.

Abb. 9: E2F3-abhängige Deregulation von Tgfb1 und TGFβ1-regulierter Gene ist erst durch wiederholtes Passagieren E2f3-defizienter MEFs detektierbar. (A) TGF β 1-ELISA mit konditionierten Überständen von Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs der angegeben Passagen. Die Daten zeigen ein repräsentatives Ergebnis. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. (B) qPCR-Analyse der Genexpression von Tgfb1 , PAI-1 , Vimentin , Fibronectin , p21 und p19 . Proben von asynchron wachsenden Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs wurden bei den angegebenen Passagen geerntet, mRNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und anschließend im iCycler analysiert. Die Daten repräsentieren die Zusammenfassung drei unabhängiger Experimente. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar.

Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, in wieweit E2F3 eine direkte Rolle bei der Regulation von Tgfb1, PAI-1, Vimentin, Fibronectin und p21 spielt. Da die E2Fs als Transkriptionsfaktoren an bestimmte DNA-Sequenzen binden [61 ], wurden die Promotoren der oben genannten Gene mithilfe mehrerer Softwareprogramme (TFSearch, Cister, MatInspector) nach möglichen E2F-Bindestellen untersucht. In Abb. 10A sind die Promotoren und die darauf gefundenen potentiellen E2F-Bindestellen schematisch dargestellt.

Abb. 10: E2F1 und E2F3 binden an die Promotoren von Tgfb1 und TGFβ1-induzierten Genen in vivo. (A) Schematische Darstellung der murinen Promotoren von Tgfb1 , PAI-1 , p21 , Vimentin und Fibronectin mit potentiellen E2F- und SMAD-Bindestellen (SBE). (B) Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) von asynchron wachsenden Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs (Passage P5). Die ChIPs wurden unter Verwendung von E2F1, E2F3 und E2F4 spezifischer Antikörper durchgeführt. Anti-IgG diente als Negativkontrolle für die Immunpräzipitationen. Die präzipitierte DNA wurde mit spezifischen Primern für die angegebenen Gene amplifiziert. Der Cdc2- Promotor diente als Positiv- und der b-actin -Promotor als Negativkontrolle.

Um festzustellen, ob die E2Fs in vivo an diese Promotoren binden können, wurden Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) unter Verwendung von spezifischen E2F1, E2F3 und E2F4-Antikörpern und unspezifischen anti-Hasen-IgG von asynchron wachsenden Wildtyp- und E2f3-/- MEFs durchgeführt. In Wildtyp-MEFs bindet E2F3 an die Promotoren von Tgfb1, Vimentin, Fibronectin, PAI-1 und p21, nicht jedoch an b-actin, das als Negativkontrolle dient (Abb. 10B). E2F1 kann ebenfalls an die Promotoren von Tgfb1, PAI-1, Vimentin, p21 und Fibronectin binden. Es scheint jedoch so, als ob E2F1 mit geringerer Affinität als E2F3 an die Promotoren von Tgfb1 und p21 bindet. Dagegen ist kein Unterschied an den Promotoren von PAI-1, Vimentin oder Fibronectin zu erkennen. E2F4 bindet nicht an die Promotoren von Vimentin, Fibronectin und p21 und nur sehr schwach an Tgfb1 und PAI-1. Dafür wird es aber an den Promotor des klassischen E2F-Gens Cdc2 im gleichen Maße wie E2F1 und E2F3 rekrutiert. So kann man schlussfolgern, dass E2F1 und E2F3 spezifisch an Tgfb1 und TGFβ1-regulierte Gene binden, E2F4 aber nur im geringen Maße. Damit unterscheiden sich diese Gene prinzipiell von klassischen E2F-Zellzyklusgenen.

In E2f3-defizienten MEFs ist keine Bindung von E2F3 feststellbar. Die Bindung von E2F1 und E2F4 ist unverändert, jedoch kann man über eine erhöhte Bindung von E2F1 an die Promotoren von Tgfb1 und p21 im Vergleich zu den Wildtyp-MEFs spekulieren. Dies ist jedoch nicht quantifizierbar, da die ChIPs unabhängig voneinander durchgeführt wurden.

Die ChIP-Analysen zeigen, dass E2F1 und E2F3 direkt an die Promotoren von Tgfb1, PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin binden können. Dies unterstützt die Annahme, dass E2F3 und möglicherweise auch E2F1 bei der Regulation oben genannter Gene involviert sind.

Der Verlust von E2F3 in Mäusen ist in den meisten genetischen Hintergründen embryonal letal. Auch im gemischten Hintergrund (C57/BL6 x 129/Sv) werden nur 25% der zu erwartenden homozygoten Embryonen geboren [136 ]. Die Ursache der embryonalen Sterblichkeit ist bis jetzt nur unzureichend geklärt, jedoch kann vermutlich ein Defekt in der Plazenta und in der Lunge zur Letalität beitragen (unveröffentlichte Daten Ulrike Ziebold).

Um zu untersuchen, ob die Deregulation der Tgfb1-Expression nur in kultivierten E2f3-/- MEFs auftritt oder ob diese auch in vivo vorkommt, wurden Wildtyp und E2f3-defiziente Embryonen im Alter von 17.5 d.c. untersucht. Durch Analyse verschiedener Gewebe (Lunge, Leber, Herz und Gehirn) konnte die größte Deregulation von Tgfb1 in den Lungen der E2f3-/- Embryonen festgestellt werden. Tgfb2 und Tgfb3 waren dagegen in den Lungen nicht differentiell reguliert (Daten nicht gezeigt). Deswegen konzentrierten sich die weiteren Untersuchungen auf das Lungengewebe. Neben Tgfb1 wird auch Vimentin, Fibronectin und p21 in den E2f3-defizienten Lungen hoch reguliert (Abb. 11A). PAI-1 wird zu diesem Zeitpunkt nicht differentiell exprimiert (Daten nicht gezeigt).

Darüber hinaus wurden aus den embryonalen Lungen Gesamtproteinextrakte hergestellt, um die Expression von TGFβ1 auf Proteinebene zu untersuchen. Wie in Abb. 11B zu sehen, wird sowohl die TGFβ1-Vorläuferform als auch reifes TGFβ1 in den mutanten Lungen stark hoch reguliert. Interessanterweise wird E2F1 in E2f3-/- Lungen ebenfalls hoch reguliert, nicht jedoch E2F4, das in Wildtyp und mutanten Lungen gleich exprimiert wird.

Abb. 11: TGFβ1 ist in E2f3-defizienten embryonalen Lungen dereguliert. (A) qPCR-Analyse von Wildtyp- und E2f3 -/- Lungen von Embryonen des Alters E17.5. mRNA wurde aus ganzen Lungen isoliert und in cDNA umgeschrieben. Mindestens drei Lungen von verschiedenen Embryonen pro Genotyp wurden analysiert. (B) Western-Blot-Analyse von Gesamtproteinextrakten aus embryonalen Lungen E17.5. Zwei verschiedene anti- TGF β 1-Antikörper wurden verwandt, um sowohl die TGF β 1-Vorläuferform (44kDa) als auch aktiviertes TGF β 1 (25kDa) zu detektieren. (C) Western-Blot-Analyse von Gesamtproteinextrakten aus Lungen von neugeborenen Mäusen (P0).

Zudem wurden Lungen von frisch geborenen Embryonen auf deren Proteinexpression untersucht (P0). Auch zu diesem Zeitpunkt kann eine erhöhte Expression von TGFβ1 in den E2f3-/- Lungen festgestellt werden. Übereinstimmend mit diesem Befund liegt SMAD2 in den E2f3-defizienten Lungen vermehrt in der phosphorylierten Form vor (Abb. 11C).

Diese Ergebnisse zeigen, dass der Verlust von E2F3 auch im Embryo zu einer deregulierten Expression von Tgfb1 und TGFβ1-regulierten Genen führt und unterstützen damit die in den MEFs gefundenen Ergebnisse.

TGFβ1-Aktivierung kann in Zellen unterschiedliche Antworten auslösen. Mit am besten untersucht ist der von TGFβ1 verursachte Wachstumsarrest. Dabei spielt unter anderem auch der pRB/E2F-Signalweg eine Rolle, da zum einen TGFβ1 die Dephosphorylierung von pRB bewirkt [215 ,274 ]. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass Rb-/- MEFs insensitiv gegenüber TGFβ1-induziertem Wachstumsarrest sind [214 ]. Interessanterweise wird nicht nur die Aktivität der E2Fs durch pRB sondern auch die Expression von E2F3 herunter reguliert (Abb. 12A), was darauf hindeutet, dass E2F3 eine negative Rolle bei diesem TGFβ1-induzierten Prozess spielt. Darüber hinaus zeigen meine bisherigen Daten eine Deregulation von TGFβ1 und TGFβ1-regulierter Gene in E2f3-/- MEFs. Alles zusammen veranlasste mich die Rolle des E2F3-Verlusts während verschiedener TGFβ1-induzierter Prozesse zu untersuchen.

Als erstes wurde die Wirkung von TGFβ1 auf das Zellwachstum von Wildtyp und E2f3-/- MEFs untersucht. Dafür wurden Wildtyp und E2f3-/- MEFs in gleicher Anzahl in Gegenwart oder Abwesenheit von TGFβ1 ausgesät und nach zwei Tagen die Zellzahl bestimmt. Wie erwartet, führte die Behandlung von Wildtyp-MEFs mit TGFβ1 zu einer Reduktion der Zellzahl (-22%) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Dagegen führte die Behandlung mit TGFβ1 bei den E2f3-mutanten MEFs zu einer Reduktion um 36%. (Abb. 12B). Dies ist ein sehr guter Hinweis darauf, dass die E2f3-/- MEFs sensitiver als Wildtyp-Zellen auf TGFβ1 reagieren. Mehrere Gründe können für die stärkere Reduktion der Zellzahl der E2f3-/- MEFs verantwortlich sein, da TGFβ1 sowohl einen Wachstumsarrest in der G1-Phase als auch Apoptose auslösen kann.

Um zu untersuchen, welche dieser Möglichkeiten für die verstärkte Antwort in den E2F3 mutanten Zellen verantwortlich ist, wurde zunächst die Frage nach der durch TGFβ1 ausgelösten S-Phase-Inhibition gestellt. Dafür wurden wie oben Wildtyp und E2f3-/- MEFs mit TGFβ1 für 48 Stunden behandelt. Um anschließend eine BrdU-Inkorporation messen zu können war ein Puls von 24 Stunden mit BrdU nötig, das als Thymidinanalogon in die DNA eingebaut wird. Die Zellen wurden fixiert und im Durchflußzytometer wurde die Zahl der BrdU-positiven Zellen mithilfe eines anti-BrdU-Antikörpers bestimmt. Das Ergebnis zeigt, dass die TGFβ1-Behandlung in den Wildtyp-MEFs zu einer 27% Reduktion der BrdU-Inkorporation führt. Die Reduktion an BrdU-positiven Zellen ist bei den E2f3-/- MEFs noch gravierender. 46% weniger Zellen befinden sich nach TGFβ1-Behandlung in der S-Phase im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Abb. 12C). Das bedeutet, dass die E2f3-/- Zellen stärker auf den TGFβ1-induzierten Wachstumsarrest reagieren und unterstützt damit die Annahme, dass E2f3-/- MEFs gegenüber der TGFβ1-Aktivität sensibilisiert sind.

Abb. 12: E2f3-defiziente MEFs sind sensibilisiert gegenüber TGFβ1-induzierten Prozessen. Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs der Passage P2 wurden mit gleicher Dichte in An- oder Abwesenheit von 100pM TGF β 1 ausplattiert, nach 48 Stunden geerntet und analysiert. (A) Die TGF β 1-Behandlung führt zur Herunterregulation von E2F3A und E2F3B. Western-Blot-Analyse von Kontroll- und TGF β 1-behandelten Wildtyp- beziehungsweise E2f3 -/- MEFs. Vinculin diente als Ladekontrolle. (B) TGF β 1 induziert die Reduktion der Zellzahl. Bestimmung der Zellzahl von Kontroll- beziehungsweise TGF β 1-behandelten Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs. (C) E2f3 -/- MEFs reagieren sensitiver auf einen TGF β 1-induzierten Wachstumsarrest. Bestimmung der BrdU-positiven Zellen nach TGF β 1- oder Kontrollbehandlung mithilfe eines α -BrdU-Antiköpers im Durchflußzytometer. (D) Unbehandelte E2f3 -/- MEFs neigen zur Seneszenz. Bestimmung der Seneszenzrate mittels SA- β -Gal-Färbung. Quantitative Darstellung des Verhältnisses SA- β -Gal-positiver Zellen zu DAPI-gefärbten Kernen. (E) Repräsentatives Bild der SA- β -Gal-gefärbten TGF β 1- oder kontrollbehandelten Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs. (F) E2f3 -/- MEFs zeigen früher eine reduzierte Proliferationskapazität. Die Zellzahl wurde nach jeder Passagierung der Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs bestimmt und anschließend die gleiche Anzahl an Zellen wieder ausplattiert. Die Daten stellen zusammengefasst die Wachstumskurven von je drei unabhängigen Zelllinien pro Genotyp dar.

TGFβ1 kann sowohl einen transienten Wachstumsarrest als auch die permanente Seneszenz induzieren [221 ,222 ]. Beide Formen des Wachstumsarrests führen zu einem Arrest in G1 und dadurch zu einer Reduktion an S-Phase-positiven Zellen und können damit nicht anhand der BrdU-Inkorporation unterschieden werden. Zudem werden in den E2f3-/- MEFs typische Seneszenzmarker wie PAI-1, Vimentin und p19 hoch reguliert (Abb. 9B) [275 ,276 ,277 ]. Deswegen war es wichtig zu untersuchen, ob TGFβ1 in den E2f3-/- Zellen vermehrt Seneszenz induziert.

Um diese Frage zu klären, wurden die Zellen auf seneszenzassoziierte β-Galaktosidase (SA-β-Gal) untersucht. SA-β-Gal ist ein bekannter Seneszenzmarker und kann histochemisch nachgewiesen werden. Es wird vermutet, dass SA-β-Gal von lysosomaler β-Galaktosidase abstammt und die erhöhte lysosomale Aktivität seneszenter Zellen reflektiert [11 ].

Das Ergebnis der SA-β-Gal-Färbung zeigt, dass TGFβ1 nach 48 Stunden in den Wildtyp-MEFs im geringen Maße Seneszenz induzieren kann (Abb. 12D und E). Interessanterweise sind bereits etwa dreimal so viele der unbehandelten E2f3-/- Zellen im Vergleich zu den Wildtyp-Zellen seneszent. Jedoch kann durch die TGFβ1-Behandlung der E2f3-defizienten Zellen nur ein leichter Anstieg der schon erhöhten Seneszenzrate detektiert werden. Dies deutet an, dass schon unbehandelte, in Serum gehaltene E2f3-/- MEFs zur Seneszenz neigen. Dies wird durch Ergebnisse der längeren Passagierung von Wildtyp und E2f3-/- MEFs unterstützt. Dabei zeigt sich, dass E2f3-/- MEFs schneller als Wildtyp-MEFs ihre Proliferationskapazität verlieren (Abb. 12F).

Um zu untersuchen, ob auch TGFβ1-induzierte Apoptose für den Effekt der reduzierten Zellzahl verantwortlich ist, wurden die Zellen wie oben beschrieben behandelt. Anschließend wurden die Zellen im Überstand gesammelt, mit den abtrypsinierten adherenten Zellen vereinigt und auf AnnexinV-Färbung untersucht. AnnexinV bindet an Phosphatidylserin, das während des programmierten Zelltods von der Innen- zur Außenseite der Zelle transloziert[278 ]. Um nekrotische von apoptotischen Zellen unterscheiden zu können, wurde mit Propidiumiodid gegengefärbt, das nur in nekrotische Zellen eindringen kann. Dabei zeigt sich, dass TGFβ1 im Vergleich zu UV in den MEFs nur im geringen Maße Apoptose induzieren kann (Abb. 13A und B). Die relative Apoptoseinduktion (unbehandelt zu behandelt) ist vergleichbar zwischen den Wildtyp- und E2f3-/- MEFs (36% vs. 41%). Jedoch kann man eine leicht erhöhte Apoptoserate bereits in den unbehandelten E2f3-defizienten Zellen detektieren, die durch TGFβ1 weiter erhöht wird.

Zusammengefasst kann man aus diesen Ergebnissen schließen, dass der Verlust von E2F3 zu einer erheblichen Sensibilisierung gegenüber dem TGFβ1-induzierten Wachstumsarrest führt. Darüber hinaus weisen bereits asynchron wachsende, unbehandelte E2f3-/- MEFs eine höhere Seneszenzrate auf, die durch die TGFβ1-Behandlung nur leicht erhöht werden kann. Durch den Verlust von E2F3 kommt es ebenfalls zu einer leicht erhöhten Apoptoserate, jedoch wird die TGFβ1-induzierte Apoptose kaum durch den Verlust von E2F3 beeinflusst.

Abb. 13: Asynchron wachsende E2f3-/- MEFs zeigen bereits eine erhöhte Apoptoserate. (A) Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs der Passage P2 wurden mit gleicher Dichte in An- oder Abwesenheit von 100pM TGF β 1 ausplattiert und nach 48 Stunden auf TGF β 1-induzierte Apoptose unter Verwendung eines AnnexinV-Antikörpers untersucht. (B) Wildtyp-MEFs wurden mit 30 J/m ² UV behandelt und nach 48 Stunden auf Apoptose unter Verwendung eines AnnexinV-Antikörpers untersucht. UV-behandelte Zellen dienten als positive Kontrolle für die Detektion apoptotischer Zellen.

Der Verlust von E2F3 führt zu einer Prädisposition gegenüber TGFβ1-induzierten zellulären Prozessen. Daher stellte sich als nächstes die Frage, ob eine Sensibilisierung gegenüber TGFβ1 in den E2f3-/- MEFs auch auf Genregulationsebene stattfindet. Um diese Frage zu klären, wurden Wildtyp- und E2f3-/- MEFs 24 Stunden in 0,1% BSA gehungert und anschließend mit 100pM TGFβ1 für 48 Stunden behandelt oder weiter in 0,1% BSA inkubiert. Anschließend wurde die Expression von Tgfb1, PAI-1, p21, Id1 und E2f1 durch eine qPCR analysiert. Diese Gene werden während des TGFβ1-induzierten Wachstumsarrests reguliert [269 ]. Wie erwartet kann TGFβ1 sich selbst, PAI-1 und im geringen Maße auch p21 in den Wildtyp-MEFs hoch regulieren. Demgegenüber wird die Expression von Id1 und E2f1 durch TGFβ1 herunter reguliert (Abb. 14A).

Übereinstimmend mit den vorherigen Ergebnissen sind in den E2f3-/- Zellen Tgfb1, PAI-1 und p21 schon in der BSA-behandelten Kontrolle im Vergleich zum Wildtyp erhöht exprimiert. Durch die TGFβ1-Behandlung wird eine starke Hochregulation dieser Gene ausgelöst. Auch die Expression von Id1 verhält sich in den E2f3-/- im Vergleich zu Wildtyp-MEFs extremer. Id1 ist schon niedriger als in den Wildtyp-MEFs exprimiert und wird durch TGFβ1 noch weiter herunter reguliert. Allerdings wird E2f1 durch TGFβ1 kaum in den E2f3-/- MEFs reguliert, zumindest nicht auf RNA-Ebene. Jedoch sieht man auf Proteinebene eine mit den Wildtyp-MEFs vergleichbare Herunterregulation von E2F1 (Abb. 14B). Dies deutet an, dass E2f1 mRNA und E2F1-Proteinexpression nicht immer gleich reguliert werden. Dagegen zeigt die Western-Blot-Analyse der p21-Proteinexpression wie die qPCR eine schwache Induktion in den TGFβ1 behandelten Wildtyp-MEFs, die in den E2f3-/- MEFs verstärkt ist.

Abb. 14: Der Verlust von E2F3 führt zur Sensibilisierung der MEFs gegenüber der TGFβ1-induzierten Genexpression. (A) Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs der Passage P2 wurden für 24 Sunden mit 0,1% BSA gehungert und anschließend mit 0,1% BSA oder 100pM TGF β 1 behandelt. 48 Stunden später wurden die Zellen geerntet, RNA isoliert und die Genexpression von Tgfb1 , PAI-1 , p21 , Id1 und E2f1 mittels qPCR analysiert. Die Daten repräsentieren die Zusammenfassung drei unabhängiger Experimente. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar. (B) Die Zellen wurden wie oben behandelt. Anschließend wurden Proteinextrakte hergestellt und mittels Western-Blot-Analyse auf Proteinexpression von E2F1 und p21 untersucht. Vinculin diente als Ladekontrolle.

Diese Ergebnisse zeigen, dass durch den Verlust von E2F3 eine Sensibilisierung gegenüber TGFβ1 nicht nur auf zellbiologischer Ebene sondern auch bei der transkriptionellen Regulation typischer TGFβ1-induzierter Gene stattfindet.

Da E2F1 und E2F3 als Transkriptionsfaktoren an die Promotoren der untersuchten Gene binden können (Abb. 10B), wurde untersucht, ob sich die Bindung von E2F1 und E2F3 an den Promotoren von Tgfb1, PAI-1 und p21 durch die TGFβ1-Behandlung verändert. Deswegen wurden ChIP-Analysen von Kontroll- beziehungsweise TGFβ1-behandelten Wildtyp-MEFs durchgeführt. Die semiquantitative PCR-Analyse zeigt, dass die Komposition von E2F1 und E2F3 an den Promotoren durch die TGFβ1-Behandlung weitgehend unverändert bleibt (Abb. 15A). E2F3 bindet vor und nach der TGFβ1-Behandlung im gleichen Maße an die Promotoren von Tgfb1, PAI-1 und p21, jedoch kann hier nicht zwischen E2F3A und E2F3B unterschieden werden, da der verwandte Antikörper beide Isoformen erkennt. Für E2F1 ist ebenfalls kaum eine Veränderung erkennbar.

Abb. 15: E2F1 wird durch TGFβ1 an die Promotoren von Tgfb1, PAI-1 und p21 rekrutiert. Wildtyp-MEFs Passage P5 wurden für 24 Stunden in 0,1% BSA gehungert und anschließend für weitere 48 Stunden mit oder ohne 100pM TGF β 1 inkubiert. ChIP-Analysen wurden unter Verwendung von E2F1, E2F3 und E2F4 spezifischer Antikörper durchgeführt. Anti-IgG diente als negative Kontrolle für die Immunpräzipitationen. Die Anreicherung von E2F1, E2F3 und E2F4 an den Promotoren wurde mit semiquantitativer PCR (A) und quantitativer qPCR (B) analysiert.

Jedoch zeigt die Analyse der ChIP-DNA mittels qPCR ein anderes Bild (Abb. 15B). Hier deutet das Ergebnis darauf hin, dass E2F1 durch TGFβ1 an die Promotoren rekrutiert wird. Doch dafür ist die Bindung von E2F3 and die Promotoren sehr schwach und wird ebenfalls mit TGFβ1-Behandlung stärker. Dieses Ergebnis für E2F3 widerspricht aber dem der semiquantitativen PCR. Darüber hinaus sind die IgG-Werte der Kontrollbehandlung bei der qPCR sehr hoch, was ebenfalls nicht bei der semiquantitativen PCR beobachtet werden kann. Deswegen kann die qPCR-Analyse der ChIP bei der Interpretation der Ergebnisse nicht bedenkenlos in Betracht gezogen werden

Wie schon beschrieben, kann TGFβ1 sowohl Wachstumsarrest, Apoptose als auch Seneszenz induzieren. In allen diesen Prozessen spielt unter anderem der Tumorsuppressor p53 eine wichtige Rolle [167 ,279 ]. Zudem wird die Expression von PAI-1 und vor allem von p21 durch p53 reguliert [184 ,280 ]. Interessanterweise können die E2Fs, vor allem E2F1, p53 durch p19 regulieren [155 ,281 ]. Deswegen ist es eine interessante Frage, ob p53 eine Rolle bei den durch TGFβ1 induzierten Prozessen spielt, die in den E2f3-/- MEFs dereguliert sind.

Um die Rolle von p53 bei der TGFβ1-induzierten Seneszenz zu untersuchen wurden Wildtyp und p53-/- MEFs im gemischtrassigen („outbread“) Hintergrund hergestellt. Übereinstimmend mit veröffentlichten Studien sind die p53-/- MEFs immortalisiert und haben eine unbegrenzte Wachstumskapazität [183 ]. Wie in den vorherigen Seneszenzversuchen wurden die mit TGFβ1 behandelten oder unbehandelten Wildtyp- und p53-/- MEFs auf SA-β-Gal-Färbung untersucht. Bei den Wildtyp-MEFs wurde wie oben eine Induktion von Seneszenz beobachtet, wohingegen bei den p53-/- MEFs keinerlei Färbung detektiert werden konnte (Abb. 16A). Auch in geringer Dichte ausplattierte und mit TGFβ1 behandelten p53-/- MEFs zeigen keine seneszenzassoziierte Färbung (Daten nicht gezeigt). Somit kann man schlussfolgern, dass p53 für die TGFβ1-induzierte Seneszenz essentiell ist. Dieses Ergebnis wird durch Befunde unterstützt, die zeigen, dass p53-/- MEFs insensitiv gegenüber TGFβ1-induziertem G1-Arrest sind [185 ].

Da bereits gezeigt werden konnte, dass p53 für die Induktion von p21 durch TGFβ1 in humanen H1299-Zellen jedoch nicht in HaCaT-Zellen benötigt wird [186 ,282 ], sollte als nächstes die Frage geklärt werden, ob p53 bei der TGFβ1-induzierten Expression von p21 in MEFs eine Rolle spielt und ob p53 für die TGFβ1-induzierten Expression von Tgfb1, PAI-1, Id1 und E2f1 benötigt wird. Dafür wurden Wildtyp- und p53-/- MEFs wie in Abb. 14A für 24 Stunden in 0.1% BSA gehungert und anschließend mit oder ohne TGFβ1 für weitere 48 Stunden behandelt. Mithilfe der qPCR-Analyse wurde die Expression von Tgfb1, PAI-1, p21, Id1 und E2f1 untersucht.

Wie in Abb. 16B gezeigt, kann TGFβ1 sich in autokriner Weise selbst induzieren und zwar in den p53-/- MEFs im gleichen Maße wie in den Wildtyp-MEFs. Die Expression von PAI-1 ist in den p53-/- MEFs stark herunterreguliert, kann aber auf niedrigem Niveau noch durch TGFβ1 induziert werden. Dagegen kann p21 in den p53-/- MEFs weder exprimiert noch durch TGFβ1 induziert werden, was mit den Ergebnissen in H1299-Zellen übereinstimmt. Die Expression von Id1 ist in den BSA-behandelten p53-/- MEFs erniedrigt, kann aber wie in den Wildtyp-MEFs durch TGFβ1 reprimiert werden. Dagegen wird E2f1 in den p53-/- MEFs nicht durch TGFβ1 reprimiert, sondern induziert.

Abb. 16: p53 ist essentiell für die TGFβ1-induzierte Seneszenz und für die Expression von p21 und PAI-1. (A) p53 -/- MEFs sind insensitiv gegenüber TGF β 1-induzierter Seneszenz. Wildtyp- und p53 -/- MEFs wurden in An- oder Abwesenheit von 100pM TGF β 1 ausplattiert und nach 48 Stunden auf SA- β -Gal-Färbung untersucht. ND: nicht detektiert. (B) p53 ist essentiell für die Expression von p21 und PAI-1. Wildtyp- und p53 -/- MEFs der Passage P2 wurden für 24 Sunden mit 0,1% BSA gehungert und anschließend mit 0,1% BSA oder 100pM TGF β 1 behandelt. 48 Stunden später wurden die Zellen geerntet, RNA isoliert und die Genexpression von Tgfb1 , PAI-1 , p21 , Id1 und E2f1 mittels qPCR analysiert. 

Diese Ergebnisse zeigen, dass erstens die autokrine Regulation von Tgfb1 unabhängig von p53 ist. Zweitens ist zwar die Grundexpression von PAI-1 und Id1 von p53 abhängig, nicht aber die Induktion beziehungsweise Repression durch TGFβ1. Drittens kann p21 in Abwesenheit von p53 nicht exprimiert werden und wird somit direkt von p53 reguliert. Dagegen wird E2f1 in Abwesenheit von p53 durch TGFβ1 induziert und nicht reprimiert. Dies könnte bedeuten, dass das Wachstum der p53-/- MEFs durch TGFβ1 angeregt wird.

Vimentin und Fibronectin sind Marker für mesenchymale Zellen und werden bei der epithelialen-mesenchymalen Transition (EMT) hoch reguliert. Darüber hinaus kann TGFβ1 in Epithelzellen EMT induzieren [234 ]. Da sowohl Vimentin und Fibronectin als auch TGFβ1 in den E2f3-/- MEFs dereguliert sind, war es interessant zu untersuchen, ob E2F3 eine Rolle bei der TGFβ1-induzierten EMT spielt.

Ein erster Hinweis dafür, erhielten wir durch die Untersuchung der Vimentinexpression in Wildtyp- und E2f3-/- MEFs nach Behandlung mit TGFβ1. Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass in den Wildtyp-MEFs Vimentin durch TGFβ1 leicht induziert wird. Dagegen wird Vimentin in den E2f3-/- MEFs sehr viel stärker durch TGFβ1 induziert (Abb. 17A). Dies deutet auf eine Funktion für E2F3 bei der TGFβ1-abhängigen Vimentinexpression. Da MEFs mesenchymalen Ursprungs sind, konnte hier der Prozess der EMT nicht untersucht werden. Deswegen verwandte ich für die Analyse, ob E2F3 eine Rolle bei der TGFβ1-induzierten EMT spielt, ein epitheliales Zellsystem, die A549-Zellen. Diese humanen Lungenkarzinomzellen sind zur TGFβ1-induzierten EMT fähig [283 ,284 ]. Durch die 48-stündige TGFβ1-Behandlung wird in den A549-Zellen der mesenchymale Marker Vimentin hoch und der epitheliale Marker E-Cadherin herunter reguliert (Abb. 17B). Dementsprechend wird das epitheliale Aussehen der Zellen in Richtung mesenchymaler Zellen verändert (Abb. 17C). Außerdem werden typische TGFβ1-Signalwegkomponenten wie SMAD2 und Id2 reguliert. Wie in den MEFs wird durch TGFβ1 auch E2F1 und E2F3 reprimiert. Jedoch wird das Wachstum der Zellen kaum durch TGFβ1 beeinflusst, wie das Zellzyklusprofil von BSA- beziehungsweise TGFβ1-behandelten Zellen zeigt (Abb. 17C Tabelle).

Um zu untersuchen, ob bei diesem Prozess E2F3 eine Rolle spielt, wurde E2F3 mithilfe von shRNA-Konstrukten herunter reguliert. Da der so genannte Knock-down unter Verwendung der einzelnen shE2F3-Konstrukte nicht sehr effizient war, wurden zwei Konstrukte gleichzeitig durch eine retrovirale Infektion stabil in die Zellen gebracht. Der Grad der Herunterregulation von E2F3 durch shRNA ist in Abb. 17D (rechts) zu sehen. Anschließend wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von TGFβ1 für 48 Stunden behandelt. Die Zellen wurden geerntet, lysiert und die Proteinexpression untersucht. Wie in Abb. 17D gezeigt, führt der Verlust von E2F3 schon bei niedrigen TGFβ1-Konzentrationen zu einer Induktion von Vimentin und p21. Dagegen wird die Expression von E-Cadherin nicht verändert.

Abb. 17: Der Verlust von E2F3 führt zu einer Derepression von TGFβ1-induziertem Vimentin. (A) Wildtyp- und E2f3 -/- MEFs wurden Kontroll- oder mit 100pM TGF β 1 behandelt. Mithilfe der Western-Blot-Analyse wurde die Vimentinexpression untersucht. (B) TGF β 1 induziert EMT in A549-Zellen. A549-Zellen wurden für 24 Stunden mit 0,1% BSA gehungert und anschließend mit oder ohne 5ng/ml TGF β 1 für weitere 48 Stunden behandelt. Die hergestellten Proteinextrakte wurden mittels der Western-Blot-Analyse mit den angegebenen Antikörpern untersucht. Vinculin diente als Ladekontrolle. (C) TGF β 1 induziert EMT in A549-Zellen ohne das Wachstum der Zellen zu beeinflussen. Oben: Phasenkontrastbild von 0,1% BSA und 5ng/ml TGF β 1 behandelten A549-Zellen. Unten: Zellzyklusprofil der BSA und TGF β 1-behandelten A549-Zellen, analysiert im Durchflußzytometer. (D) Herunterregulation von E2F3 mithilfe von shRNA-Konstrukten in A549-Zellen führt zur Derepression von Vimentin nach TGF β 1-Behandlung. Links: Western-Blot-Analyse der shE2F3 - und Kontrollkonstrukt ( shLuc ) infizierten A549-Zellen, die für 48 Stunden mit verschiedenen TGF β 1-Konzentrationen behandelt wurden. Rechts: Western-Blot-Analyse zur Überprüfung der E2F3-Herunterregulation durch die shE2F3-Konstrukte. (E) Durch Mutation der proximalen E2F-Bindestelle kann der humane Vimentinpromotor nicht mehr durch TGF β 1 aktiviert werden. (CAGA) ₁₂   enthält 12 SMAD- Erkennungssequenzen und dient als Positivkontrolle für die TGF β 1-Behandlung. Vim ist ein heterologer Luziferasereporter des humanen Vimentinpromotors (-964~+73) und enthält fünf potentielle E2F-Erkennungssequenzen und zwei potentielle SMAD-Erkennungssequenzen. Vim-E2Fmut ist ein heterologer Luziferasereporter des humanen Vimentinpromotors (-964~+73) mit einer Mutation in der proximalen E2F-Bindestelle (durchgestrichen). Die Reporterkonstrukte wurden in die A549-Zellen transient transfiziert, die Zellen anschließend in 0,1% BSA gehungert und mit oder ohne TGF β 1 (5ng/ml) behandelt. Die Zellen wurden nach 48 Stunden geerntet, lysiert und die Firefly -Luziferaseaktivität gemessen. Die Werte wurden auf die konstant exprimierte Renilla -Luziferaseaktivität normalisiert.

Um zu untersuchen, ob die E2Fs direkt bei der Aktivierung von Vimentin durch TGFβ1 beteiligt sind, wurden zwei verschiedene heterologe Reportergenkonstrukte des Vimentinpromotors in die A549-Zellen transfiziert und anschließend mit BSA oder TGFβ1 behandelt. Interessanterweise kann der heterologe Vimentinpromotor durch die Mutation der proximalen E2F-Bindestelle nicht mehr aktiviert werden (Abb. 17E). Dies deutet an, dass die E2F-Bindestelle wichtig für die Aktivierung von Vimentin ist, dass E2Fs eine direkte Rolle dabei spielen und dass, obwohl der Verlust von E2F3 zu einer Hochregulierung von Vimentin führt, die Bindung der E2Fs notwendig für die Aktivierung von Vimentin durch TGFβ1 ist.

Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, dass die Herunterregulation von E2F3 zu einer Derepression von Vimentin und p21, nicht aber zu einer Veränderung der E-Cadherin-Expression führt. Dies deutet an, dass E2F3 bei der EMT eine Rolle spielt, aber der alleinige Verlust von E2F3 nicht ausreicht, um den vollständigen Prozess der EMT zu beschleunigen. Die Derepression von Vimentin und p21 in den A549-Zellen durch den Verlust von E2F3 unterstützt jedoch die in den MEFs gefundene Ergebnisse, die eine Sensibilisierung der E2f3-/- MEFs gegenüber TGFβ1 zeigen.

TGFβ1 und Vimentin tragen beide zur Metastasierung von Tumoren bei und werden, wie in den vorhergegangenen Kapiteln gezeigt, durch E2F3 reguliert. Interessanterweise hat auch der Verlust von E2F3 in Rb-heterozygoten Mäusen Auswirkungen auf die Tumorprogression von medullären Schilddrüsenkarzinomen (MTCs). Ziebold et al. konnte zeigen, dass der Verlust von E2F3 zu einer Zunahme der Tumorgröße der MTCs führt und zudem viermal so häufig Metastasen (9% vs. 36%) gebildet werden, wohingegen der Verlust von E2F3 in der Gehirnanhangsdrüse zu einem Rückgang dieser Tumore führt [122 ]. Dagegen bewirkt der Verlust von E2F1 in Rb+/- Mäusen einen Rückgang sowohl der Gehirnanhangsdrüsen- als auch Schilddrüsentumore und dokumentiert somit ausschließlich die onkogene Rolle von E2F1 bei pRB-defizienten Tumoren [115 ]. Die erhöhte Metastaserate der Rb-/-; E2f3-/- Schilddrüsenkarzinome deutet auf eine Funktion von E2F3 als Tumorsuppressor wenn nicht gar als Metastasesuppressor hin.