Durch Analysen von primären Mausembryonalen Fibroblasten konnte ich zeigen, dass durch den Verlust von E2F3 in sowohl asynchronen als auch synchronisierten MEFs Tgfb1 hoch reguliert wird und dies zu einer erhöhten Sekretion des TGFβ1-Proteins führt (Abb. 7 und Abb. 8). Die in den Mutanten stark erhöhte Expression von TGFβ1 in der G1-Phase, die einhergeht mit einer erhöhten Phosphorylierung von SMAD2 in der S-Phase, ist interessant, da gezeigt werden konnte, dass TGFβ1 den Übergang von G1- zu S-Phase hemmen und damit die G1-Phase verlängern kann [209 ]. Da E2f3-/- MEFs nach einer Zeit des Hungerns nur sehr erschwert in die S-Phase wieder eintreten können und damit eine längere G1-Phase aufweisen [127 ], könnte dieser Defekt durch eine hohe TGFβ1-Produktion in der frühen G1-Phase der E2f3-/- MEFs verursacht werden. Sudarshan et al. konnte zeigen, dass die Nullmutation von Tgfb1 zu einem erhöhten Wachstum und schnelleren Zellzyklus führt. Zudem konnte ein neutralisierender TGFβ1-Antikörper das Wachstum immortalisierter Wildtyp-MEFs erheblich verbessern [210 ]. Allerdings konnte ich den Wachstumsdefekt der E2f3-/- MEFs mithilfe des ALK-Inhibitors SB-431542 [293 ,294 ] nicht beheben, da in meinen Analysen alle getesteten Konzentrationen des Inhibitors von den primären MEFs nicht über einen längeren Zeitraum toleriert wurden (Daten nicht gezeigt). Um dieser Frage nachzugehen, müssen in der Zukunft der experimentelle Aufbau neu überdacht und immortalisierte MEFs oder andere TGFβ-Inhibitoren verwandt werden.

Neben einer erhöhten TGFβ1-Produktion und SMAD-Phosphorylierung konnte ich auch eine erhöhte Expression typischer TGFβ1-regulierter Zielgene wie PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin in den E2f3-/- MEFs nachweisen (Abb. 8). Interessanterweise nimmt die Expression von Tgfb1 und der Zielgene durch das Passagieren der E2f3-defizienten Zellen zu, wohingegen die Expression dieser Gene in den Wildtyp-MEFs weitgehend unverändert bleibt (Abb. 9B). Das bedeutet, dass der Phänotyp des E2F3-Verlusts durch wiederholtes Passagieren verstärkt wird, aber dass das Passagieren der Wildtyp-Zellen scheinbar keine Auswirkung auf die Expression dieser Gene hat. E2F3 ist also essentiell, um Tgfb1 und PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin sowie p19 und E2f1 über mehrere Passagen zu reprimieren. Da ich zeigen konnte, dass schon junge Passagen der E2f3-/- MEFs, wenn sie mit TGFβ1 behandelt werden, zur Deregulation von Tgfb1, PAI-1, p21, Vimentin, Id1 und E2f1 neigen (Abb. 14), schließen wir aus diesen Ergebnissen, dass der Verlust von E2F3 für die Deregulation verantwortlich ist, aber erst durch zusätzliche Faktoren wie exogenes oder über die Passagen akkumuliertes TGFβ1 richtig zum Tragen kommt. Dies suggeriert, dass die erhöhte Sekretion von TGFβ1 durch die Passagierung oder die exogene Zugabe von TGFβ1 den Phänotyp der Zellen verstärkt, aber nicht der ursprüngliche Grund dafür ist.

Da primäre Fibroblasten eine begrenzte Replikationsspanne haben, führt wiederholtes Passagieren zur Seneszenz [9 ,295 ]. Deswegen ist nicht auszuschließen, dass Seneszenz oder Seneszenz-auslösende Faktoren wie Zellkulturstress durch hohe Sauerstoffwerte oder Serumfaktoren zur Deregulation der E2f3-/- MEFs beitragen [296 ]. Dass die zelluläre Seneszenz einen Einfluss auf die TGFβ1-Sekretion hat, konnte Tremain et al. in primären Keratinozyten beobachten, da durch die v-Ras induzierte Seneszenz TGFβ1 stark hoch reguliert wurde [224 ]. Andererseits kann auch chronische Exposition gegenüber TGFβ1 Seneszenz induzieren [221 ,222 ,225 ]. Da E2f3-/- MEFs mit zunehmender Passage TGFβ1 hoch regulieren, könnte dies auf Seneszenz hinweisen. Zudem können wir zeigen, dass bereits junge E2f3-defiziente MEFs im Vergleich zu Wildtyp-MEFs eine höhere Seneszenzrate aufweisen und früher ihre Proliferationskapazität verlieren (Abb. 12D-F). Damit übereinstimmend werden PAI-1, Vimentin und p19 hoch reguliert (Abb. 9B), deren erhöhte Expression mit Seneszenz in Fibroblasten korreliert [184 ,275 ,276 ,277 ]. Interessanterweise sehen wir auch eine erhöhte Expression von E2F1, das unter bestimmten Bedingungen in humanen Fibroblasten Seneszenz induzieren kann [297 ]. Weitere Ergebnisse in Mel18-/- MEFs deuten darauf hin, dass E2F3B zusammen mit dem Polycomb-Protein Ring1b bei der Repression des p19ARF-Promotors zur Verhinderung der verfrühten Seneszenz eine Rolle spielt [298 ]. Umgekehrt wurde auch für überexprimiertes E2F3A, möglicherweise in Abhängigkeit von E2F1, eine Seneszenz-induzierende Rolle in der Gehirnanhangsdrüse nahe gelegt [299 ]. Jedoch hat in früheren Studien ein so genannter vergleichender 3T3-Assay der Wildtyp und E2f3-/- MEFs keinen Hinweis auf eine verfrühte Seneszenz ergeben [127 ,129 ]. Demnach ist die Rolle von E2F3 bei der Seneszenz kontrovers und hängt möglicherweise vom Zelltyp und Zeitpunkt der Untersuchung ab, denn für den 3T3-Assay wurden MEFs ab Passage 4 verwandt. Zu diesem Zeitpunkt hat in meinen Versuchen bereits die Proliferationskapazität der E2f3-/- MEFs stark abgenommen. Darüber hinaus wurden in den früheren Studien keine weitere Seneszenzmarker untersucht. Zu dieser Diskrepanz können Unterschiede in Medium oder Serum beitragen, da gezeigt werden konnte, dass ein hoher Glucose-Anteil im Medium zu einer erhöhten TGFβ1-Produktion beitragen kann [300 ,301 ].

Ob nun die Prädisposition zur Seneszenz der E2f3-/- MEFs zur erhöhten TGFβ1-Sekretion oder die erhöhte Sensibilisierung gegenüber TGFβ1 zur Seneszenz führt, konnte letztlich noch nicht endgültig geklärt werden. Da beide Effekte sich gegenseitig bedingen, ist dies kein triviales Problem. Beide Faktoren können zum Phänotyp der E2f3-/- MEFs beitragen, jedoch ist der Verlust von E2F3 ausschlaggebend für sowohl Seneszenz als auch die Deregulation von TGFβ1 in den MEFs. Damit gibt meine Untersuchung einen ersten wichtigen Hinweis auf die enge Verknüpfung von E2F3 und TGFβ1.

Der Verlust von E2F3 führt zur Derepression von Tgfb1, PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin. Wir können zeigen, dass E2F3 und E2F1, jedoch kaum E2F4, an die Promotoren der untersuchten Gene in vivo bindet. Dies ist ein deutlicher Unterschied zu bereits bekannten zellzyklusregulierten E2F-Gene wie Cdc2 und b-myb, an deren Promotoren in asynchron wachsenden Zellen sowohl E2F1, E2F3 als auch E2F4 bindet (Abb. 10B) [30 ]. Dies deutet auf einen neuen Regulationsmechanismus hin, wie auch die Expressionsprofile der untersuchten Gene vermuten lassen. Typische E2F-abhängige Zellzyklusgene wie Mcm6 und p107 werden in der G1/S-Phase hoch reguliert und sind in E2f3-/- MEFs kaum exprimiert [126 ,127 ,128 ]. Das bedeutet, E2F3 ist für die Aktivierbarkeit dieser Gene essentiell. Dagegen sehen wir eine Hochregulation von Tgfb1 und Zielgene in E2f3-/- MEFs (Abb. 7 und Abb. 8). Dies suggeriert, dass E2F3 hier für die langfristige Repression dieser Gene zuständig ist.

E2F1 bindet ebenfalls an die Promotoren der TGFβ1-regulierten Gene. Interessanterweise sehen wir eine Hochregulation der E2F1-Expression in asynchron wachsenden E2f3-/- MEFs und in den Lungen von E2f3-defizienter Embryonen (Abb. 9 und Abb. 11). Außerdem scheint E2F1 in Wildtyp-MEFs mit geringerer Affinität als E2F3 an die Promotoren von Tgfb1 und p21 zu binden und wird durch TGFβ1 möglicherweise an die Promotoren von Tgfb1, p21 und PAI-1 rekrutiert (Abb. 10 und Abb. 15). Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, ob E2F1 hier aktivierend wirken könnte. Mehrere Studien konnten für E2F1 eine Rolle bei der Regulation von Tgfb1, PAI-1, Fibronectin und p21 nahe legen. So konnte gezeigt werden, dass E2F1 in Abhängigkeit des large T-Antigens ein heteorologes Reportergenkonstrukt des Tgfb1-Promotors aktivieren kann [270 ]. Ebenso konnte ein heterologes Reportergenkonstrukt des p21-Promotors durch die Überexpression von E2F1 aktiviert werden [272 ]. Eine weitere Studie konnte einen Zusammenhang zwischen Fibronectin und einer mutanten Form von E2F1 (E2Fd87) herstellen, wobei die Expression des mutanten E2Fs eine Reduktion von Fibronectin bewirkt [271 ]. Dagegen korreliert die Expression von E2F1 und PAI-1 in reziproker Weise und ein heterologer PAI-1-Promotorreporter kann durch E2F1 reprimiert werden [273 ,302 ]. Letzteres widerspricht einer aktivierenden Rolle von E2F1 während der TGFβ1-induzierten PAI-1-Expression. Dafür unterstützen die Studie des Tgfb1- und des p21-Promotors unsere ChIP-Ergebnisse. Allerdings können Luziferaseassays und E2F-Überexpression nicht die in vivo-Situation bezüglich Chromatinmodifikation und wichtiger Kofaktoren mit einbeziehen. Somit sind unsere Ergebnisse die ersten Daten, die die Expression von Tgfb1, PAI-1, p21 und Fibronectin in Zusammenhang mit E2F3 und die Präsenz der E2Fs an deren Promotoren in vivo untersucht. Zudem konnte ich Vimentin, das ebenfalls durch TGFβ1 reguliert wird, als neues E2F-Zielgen identifizieren. Interessanterweise deuten meine in silico-Analysen an, dass es kaum TGFβ1-Zielgene ohne E2F-Bindestelle gibt und dass möglicherweise noch viele weitere so regulierte Gene identifiziert werden können (Daten nicht gezeigt).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass E2F3 eine wichtige reprimierende Rolle bei der Regulation von Tgfb1, PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin spielt. Nicht geklärt ist, ob der E2F3-Verlust allein zur Derepression führt, ob E2F3A und E2F3B unterschiedliche Funktionen ausüben oder ob E2F1 tatsächlich eine aktivierende Rolle spielt. Die Möglichkeit, dass E2F3 und E2F1 unterschiedlich zur Deregulation beitragen, ist sehr interessant, da dies zum ersten Mal eine antagonistische Funktion von E2F1 und E2F3 bei der Genregulation vermuten lässt und die massiven Unterschiede der jeweiligen Nullmutation in der Maus erklären könnte.

Da die E2f1-/-; E2f3-/- Embryonen zu früh (E9.5) sterben [136 ], kann letztendlich nur das gezielte Ausschalten von E2F1 in Wildtyp und E2f3-/- MEFs durch shRNA die Frage klären, ob E2F1 eine antagonistische oder kompensatorische Funktion zu E2F3 ausübt. Zum jetzigen Zeitpunkt können wir zu dieser Frage noch keine Aussage machen, entsprechende Analysen werden gerade unternommen. Um die Unterschiede zwischen E2F3A und E2F3B zu untersuchen, habe ich bereits einen ersten Versuch durchgeführt. Dabei konnte ich zeigen, dass die Überexpression von entweder E2F3A oder E2F3B die TGFβ1-induzierte Expression von PAI-1 und p21 komplett reprimieren kann (Daten nicht gezeigt). Dagegen hat die Überexpression von E2F3A oder E2F3B keine Auswirkung auf die autokrine Regulation von Tgfb1. Möglicherweise müssen hierzu beide E2F3-Isoformen überexprimiert werden. Dieser Versuch muss jedoch wiederholt und verifiziert werden.

Weiterhin darf man nicht die Möglichkeit unerwähnt lassen, dass weitere Transkriptionsfaktoren wie SMADs, p53 oder TFE3, die teils mit den E2Fs und teils miteinander interagieren können [134 ,186 ,196 ,216 ,303 ], eine wichtige Rolle bei der Deregulation von Tgfb1, PAI-1, p21, Vimentin und Fibronectin spielen. Jedoch können wir zeigen, dass p53 für die autokrine Regulation von Tgfb1 irrelevant ist (Abb. 16).

Durch eine vergleichende Expressionsanalyse von verschiedenen Organen von Wildtyp und E2f3-/- Embryonen konnte ich eine Hochregulation von Tgfb1, Vimentin, Fibronectin und p21 speziell in den Lungen der E2f3-defizienten Embryonen feststellen. Dies geht einher mit einer erhöhten TGFβ1-Proteinexpression und Phosphorylierung von SMAD2 (Abb. 11). Die Lunge ist interessant, da der pRB/E2F-Signalweg eine wichtige Rolle bei der Lungenentwicklung spielt. So fehlen in Rb-/- sowie Rb-/-; E2f3-/- Embryonen die alveolaren Räume und Rb-/- Chimären entwickeln Hyperplasien neuroendokrinen Ursprungs, die als Vorläufer des kleinzelligen Lungentumors gelten [116 ,304 ,305 ]. Interessanterweise kann auch in den E2f3-/- Embryonen eine veränderte Entwicklung der Lunge beobachtet werden (unpublizierte Daten Ulrike Ziebold). Die Entwicklung der Lunge fängt in Mäusen am Tag E9.5 an und entsteht aus endodermalen Epithel des Vordarms, das sich ins umgebende Mesenchym ausweitet. Dieses Epithel entwickelt sich zu Bronchiolen durch schnelles Wachstum und Verzweigung, wobei zur Bildung der Verzweigungen Wachstum an der Knospe und Hemmung des Wachstums an der Verzweigungsspalte notwendig ist [306 ,307 ]. Während dieser Entwicklungsphase kann TGFβ1 im Stroma entlang der proximalen Atemwege und an den Verzweigungsspalten detektiert werden [308 ,309 ]. Zudem kann TGFβ1 die tracheobronchiale Entwicklung in Organkulturen inhibieren [310 ]. Dies bedeutet, dass eine Deregulation des TGFβ1-Signalwegs zu einer veränderten Lungenmorphologie führen kann. Allerdings scheint pRB für den TGFβ1-induzierten Wachstumsarrest in den Lungen nicht essentiell zu sein, da Rb-defiziente wie Wildtyp-Lungenkulturen auf TGFβ1 reagieren [311 ]. Dies steht im Widerspruch zu den Rb-/- MEFs, die resistent gegenüber TGFβ1-induziertem Wachstumsarrest sind [214 ] und könnte auf die unterschiedlich verwandten Zellsysteme (epithelial gegenüber mesenchymal) zurückzuführen sein.

Nichtsdestotrotz könnte eine erhöhte Expression von TGFβ1 in den E2f3-/- Embryonen zu der veränderten Lungenentwicklung führen. Leider sind dies bisher nur korrelative Daten. Diese müssten durch weitere Expressionsanalysen in vivo und Kreuzungen mit Tgfb1+/- Mäusen, untermauert werden, um zu prüfen, ob eine verringerte Expression von Tgfb1 die Entwicklung der E2f3-/- Embryonen positiv beeinflusst.

Wir konnten in den oben diskutierten Ergebnissen zeigen, dass durch den Verlust von E2F3 TGFβ1 und TGFβ1-induzierte Gene dereprimiert werden. Da TGFβ1 auch auf den pRB/E2F3-Signalweg wirken kann, untersuchte ich ebenfalls die Wirkung von TGFβ1 auf die E2f3-/- im Vergleich zu den Wildtyp-MEFs. Dadurch konnte gezeigt werden, dass E2f3-/- MEFs wesentlich sensibler auf TGFβ1 sowohl in Bezug auf Wachstumsarrest als auch bei der Induktion von Tgfb1, PAI-1, p21 und Id1 reagieren (Abb. 12 und Abb. 14).

Auch A549-Lungenkarzinomzellen werden durch die Herrunterregulation von E2F3 gegenüber TGFβ1 sensibilisiert. A549(shE2F3)-Zellen zeigen, wie E2f3-/- MEFs, nach TGFβ1-Behandlung eine verstärkte Vimentin- und p21-Expression (Abb. 17). Vimentin ist ein wichtiger Marker für die epitheliale mesenchymale Transition (EMT) [233 ,312 ]. Jedoch konnten Analysen der E-Cadherin-Expression den Verdacht, dass der Verlust von E2F3 den vollständigen Prozess der EMT beschleunigt, nicht erhärten. Möglicherweise war hierfür die Herunterregulation von E2F3 nicht stark genug oder weitere Faktoren kooperieren dabei. Unsere Ergebnisse deuten an, dass sowohl epitheliale als auch mesenchymale Zellen durch E2F3-Verlust eine veränderte TGFβ1-Antwort aufweisen und dass auch die Lungenepithelzellen der E2f3-/- Embryonen gegenüber der erhöhten TGFβ1-Sekretion sensibilisiert sein und zum Lungenphänotyp beitragen können.

Demzufolge kann sich eine veränderte E2F3-Expression auch auf das Verhalten von Tumorzellen auswirken. Vimentin, als Marker für die EMT, wird mit erhöhter Migration und Metastasierung in Verbindung gebracht [240 ,313 ]. Interessanterweise weisen E2f3-/- MEFs eine um 60% erhöhte Migrationsrate auf (Daten nicht gezeigt). Zudem wird in vielen späten Stadien aggressiver Tumore ein Anstieg an TGFβ1 beobachtet, was mit einer hohen Metastasenrate korreliert [258 ,263 ]. Da der Verlust von E2F3 zu einer Erhöhung von sowohl TGFβ1-Sekretion als auch Vimentin-Expression führt, könnte eine verminderte E2F3-Expression in Tumorzellen die Metastasierungsrate erhöhen. In frühen Tumorstadien hemmt TGFβ1 jedoch das Tumorwachstum und, wie unsere Daten nahe legen, könnte herunter reguliertes E2F3 diese Antwort verstärken.

E2F3 ist das am besten untersuchte E2F bezüglich seiner Expression in humanen Tumoren. Die Überexpression von E2F3 wurde in einer Reihe von Tumorarten untersucht und konnte in Blasen-, Prostata-, Ovar- und Lungenkrebs sowie in Retinoblastomen detektiert und mit erhöhter Proliferation, höherem Tumorgrad und fortgeschrittenem Tumorstadium korreliert werden [137 ,139 ,140,141 ,142 ,143 ,144 ]. Überexprimiertes E2F3 könnte letztlich aber zu einer Resistenz gegenüber TGFβ1 führen, wie es für E2F1 in Lungenepithelzellen und Magenkrebszellen angedeutet wurde [314 ,315 ]. Diese gerade publizierte Studie von Petrocca et al. involviert E2F1 in die Regulation des microRNA-Clusters miR106b-25, das die Resistenz gegenüber TGFβ1 vermittelt. Ob dieses oder ein ähnliches microRNA-Cluster auch von E2F3 reguliert wird, ist nicht bekannt und könnte Teil weiterer Untersuchungen sein.

So könnte die Überexpression von E2F3 durch TGFβ1-Resistenz ein verstärktes Tumorwachstum begünstigen, doch die TGFβ1-induzierte Tumorprogression verhindern. Eine verminderte E2F3-Expression könnte zu Tumoren mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber TGFβ1 führen, die zwar langsamer wachsen, aber vermehrt metastasieren. Dieser Ansatz wird durch die Ergebnisse unterstützt, die zeigen, dass die Inaktivierung des TGFβ1-Signalwegs zu schnell wachsenden, aber weniger aggressiven Tumoren führt, wohingegen die Aktivierung des TGFβ1-Signalwegs ein verzögertes Tumorwachstum mit nachfolgender erhöhter Tumorprogression und Metastasierung bewirkt [266 ]. Allerdings wird diese dogmatische Sicht mehr und mehr in Frage gestellt, da auch die Inaktivierung des TGFβ1-Signalwegs in murinen Brusttumormodellen unter Verwendung anderer Cre-Linien zu aggressiven Tumore führen kann [316 ,317 ,318 ]. Demnach ist die Frage der Zell- und Organspezifität ein wichtiger Punkt für die TGFβ1-Wirkung während der Tumorprogression. Zudem konnte auch für E2F3 eine organspezifische Tumorsuppressorfunktion in murinen MTC-Tumoren gezeigt werden, wohingegen E2F3 in der Gehirnanhangsdrüse als Onkogen agiert [122 ].

Um das Verhältnis von E2F3 und TGFβ1 in Tumoren genau aufzuklären, müsste konsequent nach veränderten E2F3-Expression in Bezug auf TGFβ1-Expression in Tumoren der verschiedenen Organe gesucht werden, da es meines Wissens nach bis jetzt keine Studien über eine verminderte E2F3-Expression in humanen Tumoren gibt.

Der erste Anhaltspunkt für die Theorie, dass eine verminderte E2F3-Expression zur Tumorprogression beitragen kann, gibt das Rb/E2f3-defiziente Mausmodell. Der Verlust von E2F3 führt hierbei zu einer erhöhten Metastaserate der medullären Schilddrüsentumore (MTCs) [122 ]. Um die Gründe dafür zu untersuchen, habe ich die Genexpressionsprofile metastatischer und nicht-metastatischer MTCs in einer Microarrayanalyse verglichen. Um pRB/E2F3-regulierte Zielgene darin zu identifizieren, wurde von mir auch eine Microarrayanalyse mit Wildtyp und Rb-/-; E2f3-/- MEFs durchgeführt (vollständige Listen im Anhang Tabelle 4 und 5). Sowohl beim Vergleich der Tumor-Microarrays als auch der WT/DKO-Microarrays wurden viele bereits bekannte E2F-Genen heraus filtriert, die als positive Kontrolle für die Verlässlichkeit der Microarrays dienten (vgl. [105 ,106 ,319 ]). Bedauerlicherweise konnte ich weder Tgfb1 noch TGFβ1-regulierte Gene identifizieren. Letzteres könnte mit dem untersuchten Tumormaterial zusammenhängen, da wir für den Microarray zentrale Tumorbereiche verwandten, um möglichst reines Tumormaterial zu erhalten. In humanen Tumoren wird TGFβ1 jedoch vor allem mit der EMT in der invasiven Front assoziiert [263 ,320 ,321 ].

Dass Tgfb1 auch im Vergleich der WT/DKO-Microarrays nicht identifiziert wurde, könnte darin begründet sein, dass für diese Analysen asynchron wachsende Passage 4 MEFs verwandt wurden. Wie bereits oben erklärt, kann zu diesem Zeitpunkt nur ein leichte Deregulation in der qPCR-Analyse von Tgfb1 in E2f3-/- MEFs nachgewiesen werden. Möglicherweise liegt diese Deregulation also unterhalb der strengen Filterbedingungen der Microarrayanalyse.

Interessanterweise wurde sowohl in dem Tumormicroarray als auch in dem WT/DKO-Microarray ein großer Anteil an Genen herausgefiltert, die in der Mitose und Cytokinese involviert sind. Durch eine vergleichende Expressionsanalyse von murinen und humanen Schilddrüsengeweben konnte ich zeigen, dass Ect2, Prc1 und Cep55 in sowohl murinen als auch humanen metastatischen MTCs signifikant hoch reguliert werden (Abb. 19). Dagegen wird RacGAP1 nur in murinen metastatischen MTCs signifikant hoch reguliert. Für aller vier Gene können wir eine pRB/E2F-abhängige Expression feststellen, die den typischen E2F-Genen ähnlich ist (Abb. 20 und Abb. 21).

Die Analyse dieser Gene war deswegen interessant, da alle vier in den gleichen Prozessen wie Chromosomensegregation während der Prometaphase und Bildung der Zentralspindel während der Cytokinese involviert sind und teilweise miteinander interagieren können. Somit deutet ihre veränderte Expression die Deregulation eines ganzen Signalwegs an [287 ,289 ,291 ,322 ,323 ,324 ,325 ]. Darüber hinaus ist Ect2 als Onkogen bekannt und korreliert mit schlechter Prognose bei Glioma-Patienten [326 ,327 ]. RacGAP1, Prc1 oder Cep55 sind zwar bis jetzt nicht als Onkogene etabliert, RacGAP1 wurde aber zusammen mit E2F3 in Ovarkarzinomen und Prc1 in Brustkrebs hoch reguliert gefunden [137 ,328 ], was auf eine Rolle als Onkogen hindeutet.

Welcher Mechanismus der tumorprogressiven Wirkung zu Grunde liegt, ist noch unklar. Jedoch können Ect2 als GDP-exchange-factor (GEF), RacGAP1 als GTP-activating-protein (GAP) und Prc1 als Inhibitor von RacGAP1 die so genannten small GTPasen Cdc42 und RhoA in der Mitose regulieren [286,292 ,329 ]. Man kann darüber spekulieren, ob diese Proteine, wenn sie überexprimiert sind, auch außerhalb der Mitose die small GTPasen regulieren können, die in vielen Tumoren bei der Invasion und Metastasierung involviert sind [330 ]. Zudem ist bekannt, dass Ect2 für seine transformierende Wirkung RhoA aktiviert [331 ]. Des Weiteren spielen Ect2 und RacGAP1 eine Rolle bei der Polarität epithelialer Zellen und Lokalisation der STAT-Transkriptionsfaktoren [332 ,333 ,334,335,336 ]. Beides sind Faktoren, die zur Tumorentwicklung beitragen können.

Letztlich könnte auch eine abnormale Chromosomensegregation zu einer erhöhten chromosomalen Instabilität führen, die ebenfalls zur Tumorbildung und möglicherweise Tumorprogression beitragen kann [290]. Für diese Möglichkeit spricht auch die Tatsache, dass wir in unseren Microarrays noch weitere Centromer-spezifische Proteine wie CenpA und CenpF gefunden haben, die eine zentrale Rolle bei der Chromosomensegregation spielen und zudem mit der Progression in humanen Tumoren korreliert (persönliche Mitteilung Kirsten Vormbrock) [337,338 ,339].

Die Rolle bei der Tumorentstehung ist für Mitose-regulierende Proteine etabliert. Allerdings ist es neu und höchst interessant, dass wir eine Korrelation der Expression von Ect2, RacGAP1, Prc1 und Cep55 und anderen, hier nicht besprochenen Mitose-regulierten Genen mit der Tumorprogression und Metastasierung muriner und humaner Tumore beobachten, was eine Metastasefunktion dieser Gene andeutet. Weitere Experimente, um die potentielle Metastase-fördernde Rolle der in den Microarrays gefundenen Gene und den zu Grunde liegenden Mechanismen zu analysieren, werden von Kirsten Vormbrock in ihrer Doktorarbeit durchgeführt.

Unsere Hypothese, dass weitere Signalwege zum Phänotyp der E2f3-Mutanten beitragen können, konnten wir durch die Untersuchung der E2f3-/- MEFs bestätigen, in dem wir zeigen, dass TGFβ1 und TGFβ1-regulierte Gene in den E2f3-defizienten MEFs und Lungen dereguliert sind. Damit können wir zum ersten Mal zeigen, dass E2F3 TGFβ1 regulieren kann. Da TGFβ1 auch oberhalb von E2F3 agieren kann, führt der Verlust von E2F3 zu einem positiven Rückkopplungseffekt, der die Zellen gegenüber TGFβ1 sensibilisiert. Damit steht E2F3 sowohl oberhalb als auch unterhalb von TGFβ1 und vermutlich entscheidet die Stärke des jeweiligen Signals, wie die Zellen reagieren (Abb. 22). Des Weiteren konnte ich durch einen Vergleich von metastatischen und nicht-metastatischen murinen Tumoren neue potentielle Metastasemarker identifizieren, die auch auf humane Tumore angewandt werden können.

Abb. 22: Hypothetisches Modell der E2F3-TGFβ1-Regulation. (A) TGF β 1 kann durch den Verlust von E2F3 übermäßig stark seine Zielgene aktivieren und induziert vermehrt Wachstumsarrest und Seneszenz. (B) In normalen Zellen reprimiert E2F3 TGF β 1-abhängige Zielgene und erlaubt möglicherweise dadurch Proliferation.