Schröder, Christoph: Selektive Hemmung der Noradrenalin-Wiederaufnahme als humanes Modell für Orthostatische Intoleranz

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Kapitel 3. Probanden und Methoden

3.1 Probanden

Untersucht wurden 27 gesunde Freiwillige (14 Männer, 13 Frauen, Alter 29.3±1 Jahre, BMI 23±0.5 kg/m2, Tabelle 2). Zwölf Probanden waren Raucher (5 Männer, 7 Frauen, 8±1 Zigaretten/d). Im Rahmen der Screeninguntersuchung wurde eine ausführliche Anamnese erhoben. Keine Versuchsperson hatte eine Vorgeschichte mit kardiovaskulären oder chronischen Erkrankungen. Synkopen oder orthostatische Beschwerden wurden ebenfalls von allen Probanden verneint. Während der Einschlussuntersuchung wurde ein kurzer Kipptischversuch (bis 10 min bei 75°) durchgeführt, der bei keinem der Probanden zu Beschwerden führte. Routinelaborwerte lagen bei allen Probanden im Normbereich. Alle Versuchspersonen gaben ihr schriftliches Einverständnis zu der Studie. Alle Teilversuche waren durch die Ethikkommission der Humboldt Universität, Berlin, positiv begutachtet worden.

3.2 Reboxetin

Reboxetin ist ein selektiver Inhibitor des Noradrenalin-Transporters, der für den therapeutischen Einsatz am Menschen zugelassen ist. Chemisch handelt es sich um ein Morpholin, abgeleitet von Nisoxetin, einem in vitro und in Tierversuchen genutzten Noradrenalin-Wiederaufnahme-Hemmer. Die Dissoziationskonstante Ki von Reboxetin für den Noradrenalin-Transporter ist 8 nmol/L. Die Bindungsaffinität für andere Rezeptoren, u.a. Adrenorezeptoren, dopaminergen, histaminischen, muscarinergen und nikotinergen Rezeptoren, ist verhältnismässig schwach. Die Bindung an Serotonin-Rezeptoren ist ungefähr 68fach schwächer als die Bindung an den Noradrenalin-Transporter. Die höhere Selektivität unterscheidet Reboxetin von anderen Inhibitoren des Noradrenalin-Transporters, wie z.B. Desipramin. Reboxetin ist eine razematische Mischung aus zwei Enantiomeren, von denen das (S,S)-(+)-Enantiomer deutlich potenter im Hinblick, sowohl auf die antidepressive, als auch die hämodynamischen Wirkungen ist. Nach oraler Applikation ist die Bioverfügbarkeit 94.5 % und höchste Plasmakonzentrationen werden nach 1.4 ± 1 h erreicht. Die Plasmahalbwertzeit ist 12 ± 2 h, die Plasmaeiweissbindung ist > 97 %. Nach hepatischer Metabolisierung durch CYP3A4 ist die Ausscheidung von Reboxetin hauptsächlich renal. Die Standarddosierung für die Behandlung von Depressionen ist 2 x 4 mg/d.


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Tabelle 2. Probandencharakteristika.

Nr.

Geschlecht

Alter

Größe

Gewicht

BMI

Raucher

 

 

[Jahre]

[cm]

[kg]

[kg/m2]

 

1

w

37

178

78

24.6

nein

2

w

43

159

58

22.9

nein

3

w

39

160

52

20.3

nein

4

w

23

163

55

20.7

nein

5

w

20

158

47

18.8

12 / d

6

w

31

162

52

19.8

10 / d

7

w

36

175

60

19.6

nein

8

w

22

160

53

20.7

10 / d

9

w

27

173

58

19.4

3 / d

10

w

21

180

70

21.6

10 / d

11

w

23

170

66

22.8

4-5 / d

12

w

23

175

65

21.2

3 / d

13

m

25

191

80

21.9

3 / d

14

m

35

185

85

24.8

nein

15

m

31

170

80

27.7

10 / d

16

m

31

173

80

26.7

nein

17

m

39

181

90

27.5

nein

18

m

40

168

61

21.6

nein

19

m

26

174

68

22.5

nein

20

m

19

180

75

23.1

nein

21

m

34

178

73

23.0

15 / d

22

m

26

194

96

25.5

nein

23

m

22

190

95

26.3

nein

24

m

24

196

87

22.6

nein

25

m

32

172

64

21.6

10 / d

26

m

24

177

74

23.6

3 - 4 / d

27

m

38

178

74

23.4

nein

 

Anzahl

27

 

 

27

 

 

Mittelwert

29.3

 

 

22.8

 

 

Standardfehler

1.4

 

 

0.5

 


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3.3 Experimentelles Protokoll

Die Probanden wurden gebeten, 48 h vor den Versuchstagen keine Substanzen mehr zu sich zu nehmen, die mit der Messung der Plasmakatecholamin-Konzentration interferieren könnten. Dazu zählen koffeinhaltige Nahrungsmittels, Schokolade und Alkohol. Weil Rauchen die Plasmakonzentration erhöhen kann, wurden die Versuchteilnehmer gebeten, 48 h vor Versuchsbeginn nicht mehr zu rauchen. Alle Versuche begannen morgens zwischen 9 und 10 Uhr im nüchternen Zustand. Es wurden zwei getrennte Studien durchgeführt. In der ersten Teilstudie wurde placebokontrolliert der Effekt von Reboxetin auf kardiovaskuläre Reflexe und die hämodynamische Reaktion auf eine Kipptischuntersuchung untersucht. An dieser Teilstudie nahmen 24 Probanden teil (Nr.1 - 24). In der zweiten Teilstudie wurde an einer kleineren Gruppe von Probanden (6 Männer (Probanden Nr. 13, 15, 18, 25, 26 und 27) und 4 Frauen (Probandinnen Nr. 3, 4, 8 und 9), Alter 30±2 Jahre, BMI 22±0.8 kg/m2) der Effekt systemischer Gabe verschiedener Adrenorezeptor-Agonisten unter Reboxetin und Placebo untersucht. Bei beiden Teilstudien wurden den Versuchspersonen jeweils 8 mg Reboxetin oder Placebo 12 und 1 h vor Versuchsbeginn oral verabreicht. Beide Studien wurden doppeltblind im Crossover-Design durchgeführt. Um eventuelle Langzeitwirkungen auszuschliessen, lag zwischen den zwei Versuchstagen jeweils eine mindestens sieben Tage lange Auswaschphase.

3.3.1 Autonome Funktionstests

Nach einer 30 minütigen Ruhephase im Liegen wurde die respiratorische Sinusarrhythmie während einer getakteten Atemphase erfasst (5 Sekunden Inspiration und 5 Sekunden Exspiration über 90 Sekunden). Die Sinusarrhythmie-Ratio wurde aus dem Quotienten des längsten und des kürzesten RR-Intervalls während eines Atemzyklus berechnet. Ein Valsalva-Pressversuch wurde jeweils dreimal durchgeführt. Dafür wurden die Probanden angewiesen für 15 sec in ein Manometer auszuatmen. Der Zieldruck von 40 mmHg wurde von allen Versuchspersonen erreicht. Für die Auswertung wurden die Ruhepuls- und Blutdruckwerte vor dem Manöver bestimmt und mit den minimalen Druckwerten während Phase II, sowie der maximalen Blutdruckspitze während Phase IV verglichen. Ferner wurde die Valsalva-Ratio aus der maximalen Herzfrequenz in Phase II und der minimalen Herzfrequenz in Phase IV errechnet. Blutdruckanstiege nach 3 min isometrischer Kraftanstrengung (Handgrip-Test) und auf einen Kälte- und Schmerzreiz (Cold Pressor-Test) wurden ebenfalls bestimmt. Für den Handgrip-Test wurde


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zunächst die maximale Kraft des Faustschlusses am rechten Arm mithilfe eines Manometers bestimmt. Nachdem Ruhewerte für Herzfrequenz und Blutdruck wieder erreicht waren, wurden die Probanden gebeten 30 % der maximalen Kraft über drei Minuten zu halten. Für die Auswertung wurde der Blutdruck während der letzten 30 sec mit den Ausgangswerten verglichen. Für den Cold Pressor-Test wurde die rechte Hand der Probanden für eine Minute in Eiswasser (Eis:Wasser 1:1) getaucht. In der Auswertung wurden der Blutdruck während der letzten 20 sec Kälteexposition mit den Ausgangswerten verglichen. Nach jedem einzelnen Test wurde darauf geachtet, dass die Ruhewerte für Herzfrequenz und Blutdruck wieder erreicht wurden, bevor der nächste Test begonnen wurde.

3.3.2 Kipptischuntersuchung

Nach einer mindestens 15minütigen Ruhephase im Liegen (0°) wurden die Probanden mithilfe eines motorisierten Kipptisches graduell in eine 75° Kopfhochlagerung gebracht. Dabei verblieben die Probanden jeweils für drei Minuten bei 15°, 30°, 45° und 60°. Nach Erreichen von 75° verblieben die Versuchspersonen für 30 min auf dieser Stufe, bevor der Kipptisch wieder in die Ausgangslage zurückgekippt wurde. Nach Erreichen der waagerechten Position verblieben die Probanden für weitere drei Minuten in Rückenlage. Beim Auftreten von Symptomen wurde die Untersuchung abgebrochen und der Kipptisch wieder in die waagerechte Position gebracht.

3.3.2.1 Evaluation vasovagaler Reaktionen

Kardiovaskuläre Reaktionen, die zum vorzeitigen Abbruch der Kipptischuntersuchung führten wurden von zwei unabhängigen Untersuchern (Dr. J. Jordan und Dr. J. Tank) beurteilt. Beide Untersucher erhielten anonymisierte Ausdrucke von Fingerblutdruck- und Herzfrequenz-Kurven der letzten fünf Minuten vor Abbruch der Kipptischuntersuchung. Eine vasovagale Reaktion wurde nur dann angenommen, wenn typische Beschwerden von einem progredienten Blutdruckabfall um mindestens 35 mmHg systolisch und einem progredienten Herzfrequenzabfall um mindestens 25 Schläge/min begleitet waren und beide Untersucher die Reaktion übereinstimmend als vasovagal werteten (s. Beispiel in Abbildung 7). Mit einer Ausnahme (Nr.1 unter Reboxetin) waren die Beurteilungen der beiden Untersucher konkordant.


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3.3.3 Pharmakologische Tests

Alle pharmakologischen Tests wurden am liegenden Probanden nach einer ausreichenden Ruhephase durchgeführt.

3.3.3.1 Phenylephrin-Sensitivität

Hämodynamische Reaktionen auf Phenylephrin (American Regent Laboratories Inc., USA, Chargennummer NDC 0517-0299-25) wurden wie zuvor beschrieben ausgewertet. Dafür wurden steigende Bolusdosen (6.25 bis maximal 200 µg) in eine Venenverweilkanüle injiziert. Der resultierende Blutdruckanstieg wurde kontinuierlich aufgezeichnet. Nachdem die Ausgangswerte für Blutdruck und Herzfrequenz wieder erreicht waren, wurde die nächsthöhere Dosis verabreicht. Dieses Procedere wurde fortgeführt, bis ein sofortiger systolischer Blutdruckanstieg von ca. 25 mmHg erreicht wurde. Die genaue Auswertung erfolgte anhand der aufgezeichneten Daten. Dafür wurden die Ausgangswerte für Blutdruck und Herzfrequenz vor jeder Bolusgabe über 20 sec gemittelt. Für den sofortigen Blutdruckanstieg wurde der erste systolische Blutdruckgipfel ca. 20 sec nach Bolusgabe ausgewertet. Ferner wurde ein kumulativer Blutdruckeffekt ausgewertet, indem mit Beginn des Blutdruckanstieges nach 20 sec der Mittelwert des systolischen Blutdruckes über 120 sec mit der Länge des Intervalls (120 sec) multipliziert wurde. Sowohl die sofortige Blutdruckeffekte, als auch die protrahierten Blutdruckanstiege wurden individuell als Dosis-Wirkungskurven dargestellt. Von den individuellen Dosis-Wirkungskurven wurden dann diejenigen Phenylephrindosen abgelesen, die zu einem sofortigen systolischen Blutdruckanstieg von 12.5 mmHg (PheSBD+12.5), bzw. einem kumulativen Blkutdruckeffekt von 500 mmHg über 120 sec (PheAUC+500) führten.

3.3.3.2 Nitroprussid-Sensitivität

An einer Untergruppe von sechs Probanden wurde die Blutdrucksenkung durch Nitroprussid (Schwarz Pharma, Deutschland, Chargennummer 4108703) bestimmt. Hierfür wurden steigende, gewichtskorrigierte Bolusdosen Nitroprussid (0.1 bis maximal 1.6 µg/kg KG) in eine Venenverweilkanüle injiziert. Die Dosierung wurde gesteigert, bis ein Abfall des systolischen Blutdruckes von 25 mmHg erreicht wurde. Für die Auswertung wurden die Ausgangswerte vor jeder Boluswerte und die niedrigsten systolischen Blutdruckwerte ca. 20 bis 30 sec nach Bolusgabe bestimmt. Individuelle Dosis-Wirkungskurven wurden erstellt und diejenige Dosis


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abgelesen, die zu einem systolischen Blutdruckabfall von 12.5 mmHg führte (NtpSBD-12.5).

3.3.3.3 Isoproterenol-Sensitivität

Steigende Dosen des nicht-spezifischen beta-Adreno-Agonisten Isoproterenol (Abbott, Niederlande, Chargennummer 98F16 42-144-3R) wurden über eine Venenverweilkanüle infundiert. Die Infusion wurde mit einer Rate von 0.25 µg/min begonnen und nach jeweils 5 min verdoppelt bis ein Herzfrequenzanstieg von 30 Schlägen/min im Vergleich zu den Ausgangswerten erreicht wurde. Die maximale Infusionsrate betrug 4.0 µg/min. Für die Auswertung wurden die Ausgangwerte von Blutdruck und Herzfrequenz vor Beginn der Infusion und Mittelwerte über jeweils 60 sec am Ende jeder Infusionsstufe offline bestimmt. Es wurden individuelle Dosis-Wirkungskurven erstellt und diejenige Dosis abgelesen, die zu einer Steigerung der Herzfrequenz von 25 Schlägen/min führte (IsoHF+25).

3.3.4 Blutdruck und Herzfrequenzmessung

Der Blutdruck wurde mit zwei verschiedenen Methoden während aller Untersuchungen gemessen: Rasche Blutdruckänderungen im Rahmen der autonomen Funktionstests und akuter Blutdruckänderungen am Ende der Kipptischuntersuchung wurden mittels photoplethysmografischer Fingerblutdruckmessung (Finapres, Ohmeda, USA) bestimmt. Alle anderen Blutdruckwerte wurden mittels automatisierter, oszillometrischer Messung am Oberarm alle 3 - 5 Minuten gemessen. Die Herzfrequenz wurde aus dem kontinuierlich aufgezeichneten EKG als Mittelwert über 20 - 60 sec bestimmt. Bei raschen Änderungen der Herzfrequenz im Rahmen der autonomen Funktionstests wurde die Herzfrequenz als nur über 2-3 sec gemittelt.

3.3.5 Thorakale Bioimpedanz

Während aller Untersuchungen wurde die thorakale Bioimpedanz kontinuierlich aufgezeichnet (Cardioscreen, Medis, Deutschland). Impedanzkardiografie ist ein nicht-invasives Verfahren zur Bestimmung kardiovaskulärer Parameter, dass auf Widerstandsänderungen im Bereich des Thorax basiert. Dafür wurden die Elektroden an der oberen (Fossa supraclavicularis am Übergang zum Hals) und unteren Thoraxöffnung (Medioaxillarlinie auf Höhe des Processus xiphoideus) platziert. Auf eine identische Lage der Elektroden an allen Versuchstagen wurde geachtet. Zur Berechnung des Schlagvolumens aus dem Impedanzsignal wurde die Formel nach Sramek verwendet. Das Herzzeitvolumen wurde als Produkt aus Schlagvolumen und Herzfrequenz


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berechnet, der periphere Widerstand als Quotient aus arteriellem Mitteldruck am Oberarm und Herzzeitvolumen.

3.3.6 Transkranielle Dopplersonografie

Während der Kipptischuntersuchung wurde die Blutflussgeschwindigkeit in der Arteria cerebri media mittels gepulster Dopplersonografie (EME Pioneer TC2020, Nicolet, USA) kontinuierlich aufgezeichnet. Dafür wurde eine 2 MHz-Sonde verwendet, die von einem Kopfband während der Untersuchung in Position gehalten wurde. Die Tiefe des Messfensters lag zwischen 46 und 52 mm, das Messvolumen bei 2 ml.

3.3.7 Plasmakatecholamine

Bei einer Untergruppe von 14 Probanden wurden Plasmakatecholamine in Ruhe und am Ende der Kipptischuntersuchung bestimmt. Zwei Blutproben wurden an jedem Versuchstag aus der Antekubitalvene entnommen. Um einen Einfluss der Venenpunktion auf die Plasmakatecholamine zu vermeiden, wurde hierfür zu Beginn des Versuchstages eine Venenverweilkanüle gelegt (Vasocan® 20G, Braun, Deutschland). Auf die identische Lage der Venenverweilkanüle wurde in allen Experimenten geachtet, um inter- und intraindividuelle Vergleichbarkeit der Katecholaminwerte zu gewährleisten. Die erste Probe wurde nach 30 min Ruhe, unmittelbar vor den autonomen Funktionstests, entnommen. Die zweite Probe wurde am Ende das Kipptischversuchs in 75° Kopfhochlagerung entnommen. Die ersten 5 ml jeder Probe wurden verworfen, danach wurden 10 ml Vollblut in EGTA-Röhrchen (Kabevette®, Kabe Labortechnik, Deuschland) entnommen und sofort auf Eis gelagert. Die Proben wurden 10 min bei 4° C und 3000 U/min zentrifugiert, das Plasma in CryoTubes® (NUNC, Dänemark) überführt und bei -80° C eingefroren. Die Analyse der Katecholamine erfolgte im biochemischen Labor der Vanderbilt University, USA.

3.4 Herzfrequenz- und Blutdruckvariabilität und Baroreflexsensitivität

Die Variabilität von Herzfrequenz und Blutdruck ist Ausdruck rascher Regulationsmechanismen, die durch das autonome Nervensystem vermittelt werden. Die Herzfrequenzvariabilität kann mittels Zeitreihenanalyse im Zeit- und Frequenzbereich erfasst werden. Häufig genutzte statistische Parameter der Herzfrequenzvariabilität sind pnn50 und rmssd. Der pnn50 ist der Prozentsatz der RR-Intervalle, die mehr als 50 msec vom benachbarten RR-Intervall abweichen.


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Der rmssd wird berechnet als die Wurzel der Mittelwerte der quadrierten Differenzen zwischen benachbarten RR-Intervallen. Bei der Spektralanalyse werden periodische Schwankungen der Herzfrequenz oder des Blutdruckes im Frequenzbereich analysiert. Mehrere Minuten lange Zeitreihen der Herzfrequenz und des Blutdruckes weisen dabei charakteristischerweise Maxima in drei Frequenzbereichen auf: hochfrequent (high frequency (hf) 0.15-0.4 Hz), niedrigfrequent (low frequency (lf) 0.04-0.15 Hz) und sehr niedrigfrequent (very low frequency (vlf) le0.04 Hz). Datenerfassung (EKG, kontinuierliche Blutdruckmessung), Auswahl und Länge der Zeitreihen, Statistik und Spektralanalyse erfolgte in der vorliegenden Arbeit in Übereinstimmung mit den derzeitig gültigen Empfehlungen.

Rasche Blutdruckänderungen werden durch Dehnungsrezeptoren in der Gefässwand der Karotisgabeln erfasst und bewirken eine reflektorische Gegenregulation durch das autonome Nervensystem. Die Afferenz erfolgt über den IX. Hirnnerv, wird im Hirnstamm integriert und auf vagale Efferenzen umgeschaltet. Schnelle Blutdruckänderungen werden so durch eine Änderung des RR-Intervalles im selben oder folgenden Herzschlag beantwortet. Die Empfindlichkeit dieses Baroreflexes kann als Koeffizient aus der Änderung des RR-Intervalles pro mmHg Änderung des systolischen Blutdruckes berechnet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Sequenzmethode verwendet, bei der kurze Sequenzen (=3 aufeinanderfolgende Herzschläge) mit kontinuierlich ansteigendem bzw. abfallendem Blutdruck gesucht und die Änderung der entsprechenden RR-Intervalle gemessen werden. Die Steigung der linearen Regression zwischen systolischem Blutdruck und RR-Intervallen ergibt dann die spontane Baroreflexsensitivität in msec/mmHg. Analysiert wurden Abschnitte zwischen 90 und 180 sec Länge ohne Herzrhythmusstörungen vor Beginn und am Ende des Kipptischversuchs.

3.5 Datenerfassung und Datenanalyse

Die analogen Rohsignale von Fingerblutdruckmessung, transkraniellem Dopplerultraschall und Bioimpedanz wurden digitalisiert (14 Bit A/D-Karte, DAS 410, Dataq Instruments Inc., USA) und bei einer Abtastrate von 500 Hz auf einem IBM-kompatiblen Computer erfasst. Dafür wurde handelsübliche Software (Windaq pro+, Dataq Instruments Inc., USA) verwendet. Für die Auswertung der einzelnen Parameter wurde das Programm PV-Wave (Visual Numerics Inc., USA) verwendet. Die weitere Analyse der Daten erfolgte mittels kommerzieller Software (Excel2000, Microsoft, USA und GraphPad Prism V3.00, GraphPad Software Inc., USA).


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3.6 Statistik

Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes dargestellt. Intraindividuelle und interindividuelle Unterschiede wurden mit gepaartem bzw. ungepaartem t Test verglichen. Wenn der F-Test signifikant unterschiedlichen Verteilungen in beiden Vergleichsgruppen ergab, wurde für verbundene Stichproben der nicht-parametrische Wilcoxon-Rangtest anstelle des gepaarten t Tests angewendet. Multiple Vergleiche wurden mittels zweiseitiger Varianzanalyse (two way ANOVA) auf signifikante Unterschiede untersucht. Dosis-Wirkungskurven wurden mittels nicht-linearer Regressionsanalyse erstellt. Zur Berechnung des Signifikanzniveaus bei Kaplan-Meier-Kurven wurde der logarithmische Rangtest angewendet. Alle Tests wurden zweiseitig durchgeführt. Statistische Signifikanz wurde bei einem p-Wert unter 0.05 angenommen. In Abbildungen und Tabellen steht * für p<0.05, ** für p<0.01 und *** für p<0.001.


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