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1  Einleitung

1.1 Rheumatoide Arthritis

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische, entzündliche und systemische Erkrankung, die hauptsächlich die Gelenke betrifft. Ungefähr 1% der Bevölkerung der westlichen Welt leidet an dieser Autoimmunerkrankung. Eine fortgeschrittene RA führt oft zur Arbeitsunfähigkeit und zu einer stark eingeschränkten Lebensqualität (Gabriel (2001), Wolfe und Hawley (1998)). RA tritt bei Frauen dreimal häufiger auf und führt zu einer erhöhten Mortalität, wenn die RA nicht entsprechend behandelt wird (Pincus et al. (1994)). Die RA ist charakterisiert durch die Entwicklung einer progressiven und chronischen Polyarthritis in den synovialen Gelenken. Typisch für RA ist der symmetrische Befall der kleinen Gelenke. Betroffen sind vor allem die Metacarpophalangeal- (MCP), Hand-, proximalen Interphalangeal- (PIP), Metatarsophalangeal- (PTP), Knie-, Sprung- und Ellenbogengelenke, sowie die Schulter. Bei einem Drittel der Patienten ist auch die Halswirbelsäule betroffen. Neben der Synovitis im Gelenk können häufig auch extraartikuläre Manifestationen festgestellt werden. In einigen Patienten bilden sich subkutane Granulome, die sogenannten Rheumaknoten. Einige Patienten entwickeln auch eine Vaskulitis. Außerdem können die Augen, die Lunge, das Herz und die Nieren betroffen sein (Klippel und Dieppe (1998), Maddison et al. (2004)).

Abb. 1.1: Rheumatoide Veränderungen an der Hand. Die chronische Entzündung der metacarpophalan-gealen Gelenke führt zur Deformation der Hände mit einer Deviation der Finger. Copyright©2002, The School of Medicine of the University of California, San Diego, Katalog für medizinische Bilder

Eine Sonderform der rheumatoiden Arthritis ist das Felty-Syndrom. Es tritt vorwiegend bei langjährigen, progressiven und schweren Verläufen bei weniger als 1% der RA-Patienten auf. Gekennzeichnet ist das Felty-Syndrom durch eine vergrößerte Milz und manchmal auch der [Seite 3↓]Lymphknoten, sowie eine starke Verminderung der Granulozyten. Bei schweren Verläufen eines Felty-Syndroms entwickeln sich außerdem große Geschwüre an den Unterschenkeln.

1.1.1 Die Rolle der B-Zellen in der Pathogenese der RA

Den B-Zellen wird eine große Rolle bei der Pathogenese zugeschrieben. Eine Depletion von B-Zellen ist therapeutisch wirksam (Edwards et al. (2004)). Außerdem können bei vielen Patienten Rheumafaktoren detektiert werden. Rheumafaktoren (RF) sind vor allem IgM Antikörper, die den Fc-Teil von IgG Antikörpern erkennen. Sie sind nicht spezifisch für RA, da z.B. auch Patienten mit Sjögren Syndrom oder Patienten mit Infektionen wie Tuberkulose und Hepatitis RF entwickeln. Bis jetzt ist nicht klar, welche Rolle sie bei RA spielen, obwohl ein Zusammenhang zwischen der Konzentration der RF und dem Schweregrad der Erkrankung besteht (van Boekel et al. (2002)). Es wird vermutet, dass RF an der Bildung großer Immunkomplexe beteiligt sind, die das Voranschreiten der Erkrankung begünstigen indem Komplement aktiviert wird und die Zytokinsynthese initiiert wird (Dorner et al. (2004)). Neben den RF konnten aber noch zahlreiche andere Autoantikörper detektiert werden. Dazu zählen Antikörper, die gegen RA33 gerichtet sind, einem Protein des heterogenen nukleären Ribonukleoproteinkomplexes (Hassfeld et al. (1989), Steiner et al. (1992)) und gegen Calpastatin (Despres et al. (1995)), dem natürlichen Inhibitor der Calpaine. Daneben können Antikörper detektiert werden, die sich gegen eine große Anzahl gelenkspezifischer Antigene richten, wie z.B. Kollagen oder Fibronektin, aber auch Antikörper die gegen Phospholipide oder Nichthiston chromosomale Proteine (HMG1 und HMG2) gerichtet sind (van Boekel et al. (2002)). Alle diese Antikörper werden aber auch bei anderen Erkrankungen festgestellt. Daneben gibt es auch eine Vielzahl citrullinierter Antigene, die von Autoantikörpern in RA-Patienten erkannt werden (van Boekel et al. (2002)). Obwohl im Gelenk Ablagerungen von Immunkomplexen gefunden wurden (Ishikawa et al. (1975)) ist noch nicht bewiesen, dass Antikörper gegen die eben beschriebenen Antigene pathologisch relevant sind. Daneben spielen auch Mechanismen der angeborenen Immunität eine Rolle. Seit langem ist bekannt, dass Komplement in der Synovialflüssigkeit von RA-Patienten aktiviert ist und sogar lokal produziert wird (Neumann et al. (2002)).

1.1.2 Die Rolle der MHC-Proteine und der T-Zellen in der Pathogenese der RA

Zwillingsstudien und andere genetische Studien konnten zeigen, dass Menschen, die bestimmte MHC-II Allele exprimieren, prädisponiert sind für die Entwicklung von RA. Mehr als 80% der Rheumapatienten exprimieren HLA-DR1 oder HLA-DR4 Subtypen, die über ein [Seite 4↓]bestimmtes Sequenzmotiv verfügen, das „shared epitope“ engl.: gemeinsames Epitop (Gregersen et al. (1987)). Dieses Sequenzmotiv beeinflusst wahrscheinlich auch den Schweregrad der Erkrankung, da das Risiko extraartikulärer Manifestationen und Erosionen in Patienten erhöht ist, wenn die Allele für diese MHC-Proteine homozygot vorliegen (Weyand et al. (1992)). Da die einzige bisher bekannte Funktion von MHC-Molekülen die Präsentation von Peptiden ist, die vom T-Zellrezeptor der T-Zellen erkannt werden, kann auf eine direkte Beteiligung der T-Zellen bei der Pathogenese der RA geschlossen werden. Tatsächlich konnten in in vitro Proliferationsexperimenten mit T-Zellen von RA-Patienten mögliche Autoantigene identifiziert werden. Dazu zählten insbesondere Kollagen II, Proteoglykane, Aggrekan, Hitzeschockproteine und andere, meist gelenkspezifische, Autoantigene (Firestein (2003)). Trotz allem bleibt die Rolle der T-Zellen umstritten und es wird spekuliert, ob T-Zellen vielleicht nur an der Induktion beteiligt sind, da im entzündeten Synovium nur geringe Mengen der T-zellspezifischen Zytokine IFN-γ und IL-2 gefunden wurden und die T-Zellen nur eingeschränkt proliferieren können (Firestein et al. (1990), Firestein und Zvaifler (1990)). Unterstützt wird diese These durch fehlgeschlagene therapeutische Ansätze, CD4 T-Zellen zu depletieren (van der Lubbe et al. (1995)). Dagegen spricht, dass Patienten erfolgreich mit einem CTLA-4-Ig Fusionsprotein behandelt werden, welches verhindert, dass T-Zellen ein kostimulatorisches Signal bekommen (Kremer et al. (2003), Moreland et al. (2002)). Ein Grund für die eingeschränkte Funktion der T-Zellen in der aktiven Erkrankung liegt möglicherweise in dem vorhandenen inhibitorischen Zytokinmilieu aus IL-10 und TGF-β (Fava et al. (1989), Katsikis et al. (1994), Wahl (1994)).

1.1.3 Die Rolle der Zytokine in der Pathogenese der RA

In den entzündeten Gelenken kann eine Vielzahl von Zytokinen detektiert werden. Diesen Zytokinen kommt im Verlauf der Arthritis wahrscheinlich eine große Bedeutung zu. Vor allem können Zytokine, die von Makrophagen oder makrophagenähnlichen Zellen bzw. Fibroblasten produziert werden, nachgewiesen werden. Dazu zählen IL-1, IL-6, IL-8, IL-15, IL-18, TNF-α, GM-CSF und verschiedene Chemokine. Daneben werden aber auch eher T-zellassoziierte Zytokine wie INF-γ und IL-17 produziert. Außerdem werden auch anti-inflammatorische Zytokine wie TGF-β, IL-10 (Fava et al. (1989), Katsikis et al. (1994), Wahl (1994)) und IL-1Ra sowie ein das Zytokinsignal supprimierendes Protein (SOCS3) (Shouda et al. (2001)) im RA Synovium exprimiert. Diese reichen jedoch scheinbar nicht aus, die Synovitis aufzuhalten.


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Abb. 1.2: Schematische Darstellung eines normalen Gelenks und seine Veränderung in RA. Ein normales synoviales Gelenk (links) besteht aus zwei Knochenenden, die mit Knorpel überzogen sind und von der Gelenkkapsel umgeben sind. Das Synovium ist dünn und die Deckzellschicht besteht aus einer Schicht von 1-3 Synoviozyten. Im Gegensatz dazu ist im rheumatoiden Gelenk (rechts) die Synovialmembran entzündet, und eine massive Infiltration durch T-, B- und Plasmazellen, sowie dendritische Zellen, Makrophagen und Mastzellen kann beobachtet werden. Zusätzlich findet Angiogenese statt und es kommt zur Pannusformation, der Osteoklasten enthält. ( Leicht verändert aus: Smolen JS und Steiner G. Nat Rev Drug Discov. 2003 Jun;2(6):473-88)

Es scheint, dass die pro-inflammatorischen und anti-inflammatorischen Zytokine in einer Art Gleichgewicht miteinander in Verbindung stehen. Zu einem bestimmten Zeitpunkt ist das Gleichgewicht zwischen diesen Zytokinen gestört und eine Entzündung kann sich manifestieren. Die Expression der Zytokine ist sehr komplex reguliert. Durch Zugabe von anti-TNF-αkonnte in vitro gezeigt werden, dass die Expression anderer pro-inflammatorischer Zytokine wie IL-1 (Brennan et al. (1989)) aber auch von IL-6, IL-8 und GM-CSF reduziert werden konnte. Die Blockierung von IL-1 führt zu einer reduzierten Produktion von IL-6 und IL-8 nicht aber von TNF-α (Feldmann et al. (1996)). Zusätzlich können die meisten Zytokine auf eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen und Gewebe einwirken, diese aktivieren oder chemotaktisch wirken. Daher wird die Funktion der Zytokine hier zusammenfassend geschildert. Eine wichtige Funktion der Zytokine ist vor allem die Aktivierung unterschiedlicher Zelltypen, insbesondere Makrophagen, die verstärkt Phagozytose betreiben und weitere pro-inflammatorische Zytokine freisetzen, T- und B-Zellen, die zu Effektor- und Plasmazellen differenzieren und proliferieren. Daneben wirken die Zytokine chemotaktisch und ziehen weitere Effektorzellen, wie z.B. Neutrophile, an den Entzündungsherd. Vielfach wirken sie aber auch direkt auf das Knorpelgewebe und aktivieren Osteoklasten, die an der Knochenresorption beteiligt sind und Chondrozyten, die degradierende Enzyme wie Metalloproteinasen freisetzen. Eine wichtige weitere Funktion der Zytokine liegt auch darin, die Expression von [Seite 6↓]Zelladhäsionsmolekülen zu induzieren. So konnte die Expression von E-Selektin auf synovialen Endothelzellen und VCAM-1 und ICAM-1 auf Endothelzellen und Makrophagen beobachtet werden (Koch et al. (1991), Tak et al. (1995)). Da viele der genannten Zytokine, insbesondere TNF-α, von Makrophagen exprimiert werden, wird davon ausgegangen, dass Makrophagen die wichtigsten Effektorzellen bei RA sind. Möglichweise spielen auch die Synoviozyten eine besondere Rolle, die fibroblast- und makrophagenähnliche Eigenschaften haben, die Zytokine produzieren können, phagozytierende Eigenschaften haben und als professionelle antigenpräsentierende Zellen mit T-Zellen interagieren können (Edwards (1994)).

1.1.4 Die Therapie der Rheumatoiden Arthritis

Bei der Therapie der rheumatoiden Arthritis kommen vier verschiedene Gruppen von Therapeutika zum Einsatz. Es handelt sich dabei um nicht-steroidale Antirheumatika (NSA), Glukokortikoide (GK), langfristig wirkende Antirheumatika (LWA) und seit kurzer Zeit auch Therapeutika biologischen Ursprungs, sogenannte „biologicals“. Bei den nicht-steroidalen Antirheumatika handelt es sich in erster Linie um Therapeutika, die die Prostaglandinsynthese hemmen. Die wichtigsten natürlich vorkommenden GK sind Kortison und Hydrokortison. Bei den LWA wird bei der RA vor allem Methotrexat (MTX) eingesetzt, einem Folsäureantagonisten. Die Gruppe der LWA umfasst neben MTX auch Goldsalze, Sulfasalazin, Penicillinderivate, Chloroquin und andere. Die seit kurzer Zeit eingesetzten biologischen Therapeutika sind gezielt gegen bestimmte Zytokine, wie z.B. TNF-α, gerichtet (Smolen und Steiner (2003)). Infliximab und Adalimumab sind genetisch modifizierte Antikörper, die gegen TNF-α gerichtet sind. Infliximab wird seit 1999 in der Therapie von RA eingesetzt und ist sehr effektiv vor allem in Kombination mit MTX (Elliott et al. (1994), Lipsky et al. (2000), Maini et al. (1998)). Etanercept ist ein Fusionsprotein. Es handelt sich dabei um einen dimeren löslichen TNF-Rezeptor, der mit dem Fc-Teil des IgG1 fusioniert wurde. Auch Etanercept ist sehr effektiv bei der Blockierung von TNF-α, hat aber im Gegensatz zu Infliximab keine synergistischen Effekte mit MTX und wird daher in Monotherapie angewendet (Weinblatt et al., (1999); Bathon et al. (2000)). Daneben existiert mit Anakinra auch ein schon zugelassener rekombinanter Rezeptor für IL-1 (Bresnihan et al. (1998), Cohen et al. (2002)). Neben den großen Erfolgen in der Behandlung von RA-Patienten haben aber auch diese Therapeutika einige schwerwiegende Nachteile. Die biologischen Therapeutika sind in einigen Fällen immunogen, so dass sie nicht beliebig lang angewendet werden können. Die Behandlung ist sehr teuer und somit nicht jedem zugänglich, und in wenigen Fällen treten schwere Nebenwirkungen auf. Dazu zählt ein erhöhtes Risiko, an Tuberkulose und anderen schweren Infek[Seite 7↓]tionen zu erkranken, oder ein erhöhtes Risiko, an Multiple Sklerose oder einem Lupus ähnlichem Syndrom zu erkranken. In Zukunft werden wahrscheinlich noch eine große Anzahl der biologischen Therapeutika auf den Markt kommen. Dabei wird es sich dann möglicherweise um Medikamente handeln, die Metalloproteinasen blockieren, gegen andere Zytokine wie IL-6 und IL-17 oder gegen Oberflächenmoleküle von B- und T-Zellen oder Makrophagen gerichtet sind.

1.2 Tiermodelle der Rheumatoiden Arthritis

Da RA ein so komplexes Syndrom ist, bietet es sich an Tiermodelle der RA zu entwickeln, um den Einfluss bestimmter Gene oder Mechanismen genauer zu untersuchen, aber auch um neue Therapeutika zu testen.

Das erste antigenspezifische Tiermodell der RA war das Kollagen-induzierte Modell, wo heterologes Kollagen II in Ratten injiziert wurde, welche dann eine Arthritis entwickelten (Trentham et al. (1977)). Daneben wurden noch andere Proteine entdeckt, die nach Immunisierung von Mäusen und Ratten eine Arthritis induzieren. Dazu zählen das Kollagen vom Typ IX (Cremer et al. (1998)), Kollagen vom Typ XI, COMP (engl.: cartilage oligomeric matrix protein) (Carlsen et al. (1998)), das Proteoglykan assoziierte Protein Aggrekan (Glant et al. (1998)) sowie das Knorpelglykoprotein gp39 (Verheijden et al. (1997)). Weiterhin existieren auch Tiermodelle, wo die Arthritis allein durch die Gabe von Adjuvantien induziert wird. In der Ratte konnte eine Arthritis durch Immunisierung mit komplettem Freundschen Adjuvans induziert werden (Pearson (1956)). Dazu zählen auch Immunisierungen, die mit kleinen Molekülen wie Muramyl Dipeptiden oder kleinen organische Substanzen wie z.B. Avridin durchgeführt wurden. Diese Substanzen sind zu klein, um als Antigen von T- und B-Zellen erkannt zu werden und induzieren in der Ratte eine Arthritis (Chang et al. (1980), Chang et al. (1981)). Auch in der Maus kann eine Arthritis durch Behandlung mit dem Adjuvans Pristan induziert werden (Wooley et al. (1989)). Durch die neuen Methoden der Gentechnik existieren mittlerweile auch einige transgene Tiermodelle der RA. Transgene Mäuse, die das humane TNF-α überexprimieren, entwickeln eine schwere Arthritis, die unabhängig von T- und B-Zellen ist (Keffer et al. (1991)). Mäuse, die das humane HLA-DR0401 exprimieren, sind auch suszeptibel für die Kollagen-induzierte Arthritis (Rosloniec et al. (1998)). Daneben existiert auch das K/BxN-Modell. In diesem Modell exprimieren Mäuse einen transgenen T-Zellrezeptor, der ein Epitop der Glukose-6-phosphat Isomerase erkennt, was zu einer spontanen Manifestation einer Arthritis führt (Kouskoff et al. (1996), Matsumoto et al. (1999)). Dieses Modell hat große Bedeutung, da es das erste Modell der RA ist, welches zeigt, dass eine [Seite 8↓]Immunreaktion gegen ein ubiquitär exprimiertes Antigen zu einer organspezifischen Erkrankung wie Arthritis führt. In einem weiteren Modell entwickeln Mäuse aufgrund einer Mutation in der SH2-Domäne von ZAP-70 spontan eine Arthritis, da die Selektion der T-Zellen im Thymus gestört ist (Sakaguchi et al. (2003)). Im Folgenden werden zwei Tiermodelle näher erläutert. Das Kollagen-induzierte Modell ist das Modell, welches bisher am Besten untersucht wurde und in vielen Bereichen der humanen RA ähnelt. Außerdem wird in diesem Modell eine Arthritis durch Immunisierung mit einem Antigen hervorgerufen. Auch in dieser Arbeit ist das Ziel, eine Arthritis durch Immunisierung durch ein Antigen, der G6PI, zu induzieren. Das zweite Modell ist das K/BxN-Modell. Dieses Modell ist die theoretische Grundlage für diese Arbeit, da die G6PI von transgenen T-Zellen erkannt wird und über eine antikörpervermittelte Immunreaktion spontan zu einer Arthritis in diesen Mäusen führt. In dieser Arbeit soll die Rolle der G6PI bei der Pathogenese der RA im Menschen charakterisiert werden und untersucht werden, ob G6PI als ein ubiquitär exprimiertes Antigen auch in nicht-transgenen Mäusen eine organspezifische Erkrankung in Form einer Arthritis induzieren kann.

1.2.1 Das Kollagen-induzierte Tiermodell (CIA)

Das Kollagen-induzierte Tiermodell (CIA) wurde zuerst in Ratten beschrieben. Die intradermale Immunisierung bestimmter Rattenstämme mit Kollagen vom Typ II (CII) aus Hühnern, dem Menschen oder auch aus den Gelenken von Ratten in komplettem Freundschen Adjuvans induzierte eine Arthritis (Trentham et al. (1977)). Später wurde dieses Modell auch in Mäusen und in Primaten etabliert (Cathcart et al. (1986), Courtenay et al. (1980)). In der Maus entwickelt sich die Arthritis ca. 3-4 Wochen nach der Immunisierung mit heterologem CII. Viele suszeptible Stämme sind resistent gegen die Arthritisentwicklung, wenn die Immunisierung mit autologem CII durchgeführt wird. Die Stämme, die jedoch eine Arthritis entwickeln, zeigen einen schweren und chronischen Verlauf (Holmdahl et al. (1986)).

1.2.1.1 Die Rolle der MHC-Proteine und der T-Zellen in der CIA

Ähnlich der humanen RA gibt es eine genetische Prädisposition für die Entwicklung der CIA. Mäuse vom H2-q (DBA/1 und B10.Q) und H2-r (B10.RIII) Haplotyp, die die MHC-II Moleküle I-Aq bzw. I-Ar exprimieren sind suszeptibel für die CIA (Wooley et al. (1981)). Mäuse, die I-Aq exprimieren, erkennen ein immunodominantes Epitop des bovinen, Hühner oder humanen CII(257-270) (Kjellen et al. (1998), Rosloniec et al. (1996)). Mäuse, die dagegen I-Ar exprimieren, erkennen eine andere Region des bovinen oder porcinen CII(442-456) (Myers et al. (1995)). Interessanterweise ist die Bindungsgrube des I-Aq Moleküls sehr ähnlich mit der [Seite 9↓]der DR4 und DR1 Moleküle, die mit RA assoziiert sind (Fugger et al. (1996)). DR4 oder DR1 transgene Mäuse sind suszeptibel für die CIA und erkennen ein Peptid der CII(260-273), das in der gleichen Region wie bei der Bindung an I-Aq liegt (Andersson et al. (1998), Rosloniec et al. (1998), Rosloniec et al. (1997)).

Aufgrund der MHC-II Assoziation lässt sich auf eine direkte Beteiligung der CD4+ T-Zellen schließen. Die Behandlung von Ratten mit Antiserum gegen Thymozyten und von Mäusen mit Antikörpern gegen CD4 verhindert die Entwicklung der Arthritis (Brahn und Trentham (1984), Ranges et al. (1985)). Trotzdem bleibt die Rolle der CD4+ T-Zellen kontrovers, da auch Mäuse, die aufgrund einer genetischen Deletion keine CD4+ T-Zellen exprimieren, eine Arthritis entwickeln (Tada et al. (1996)). Auch führt der Transfer CII spezifischer T-Zellen in suszeptiblen Mäuse- und Rattenstämmen nur zu der Entwicklung geringer pathologischer Veränderungen in den synovialen Gelenken der Empfänger (Holmdahl et al. (1985), Trentham et al. (1978)). Trotzdem können während der CIA im Gelenk T-Zellen detektiert werden, die spezifisch für murines CII sind (Svendsen et al. (2004)). CII spezifische CD4+ T-Zellen von CIA suszeptiblen Stämmen produzieren nach Restimulation mit dem Antigen in vitro große Mengen IL-2 und IFN-γ. Das CII Molekül, welches von den T-Zellen erkannt wird, ist posttranslational modifiziert. Innerhalb des I-Aq, HLA-DR4 und HLA-DR1 restringierten immunodominanten Epitops findet man eine Hydroxylierung von Prolin und Lysinresten, die einhergeht mit einer Glykolisierung. Besonders wichtig scheint dabei der Lysinrest 264 zu sein, der unterschiedlich modifiziert sein kann. Die Immunantwort wird dabei wahrscheinlich dominiert von einer T-Zellantwort gegen die galaktosylierte Form des CII (Malmstrom et al. (2000)). Aufgrund der unterschiedlichen Modifikationen innerhalb des Epitops, ist das T-Zellrepertoire, welches gegen dieses Peptid gerichtet ist, möglicherweise sehr groß. Unterschiede im Schweregrad der Arthritis können auch bei Verwendung rekombinanten CII in Abhängigkeit vom Grad der Glykosylierung beobachtet werden (Myers et al. (1998)). Interessanterweise sind die meisten T-Zellen, die spezifisch für das heterologe CII Epitop (256-270) sind, nicht kreuzreaktiv mit murinem CII. Der Unterschied beruht auf der Aminosäure an Position 266, wo Mäuse eine Aspartatsäure exprimieren, während die Ratte an dieser Stelle eine Glutaminsäure exprimiert (Michaelsson et al. (1992)).

1.2.1.2 Die Rolle der B-Zellen und Autoantikörper in der CIA

Neben den T-Zellen wird auch den B-Zellen eine bedeutende Rolle zugeschrieben. Im Gegensatz zum T-Zelltransfer ist der passive Transfer der Arthritis durch Transfer von Serum möglich (Englert et al. (1986), Holmdahl et al. (1990)). Dabei ist der Transfer auch in nicht-[Seite 10↓]suszeptible Stämme möglich (Watson et al. (1987)). Obwohl der Transfer zu einer Arthritis in den Empfängertieren führt, ist die Erkrankung nicht so stark ausgeprägt wie nach Immunisierung mit CII. Jedoch entwickeln nicht nur die suszeptiblen Stämme hohe Antikörpertiter gegen CII sondern auch die nicht-suszeptiblen, was für eine unterschiedliche Qualität der Antikörper in den unterschiedlichen Stämmen spricht (Holmdahl et al. (1988), Wooley et al. (1981)). Die Antikörper, die gegen CII in der CIA gebildet werden, sind hauptsächlich von der IgG2 Subklasse. Hohe Konzentration von den Subklassen IgG2a und IgG2b können während der Erkrankung gemessen werden. Die IgG1 Subklasse ist dagegen weniger prominent. In einer Studie wurde mit Hilfe monoklonaler Antikörper untersucht, welche Anforderungen an die Antikörper gestellt werden muss, damit sie in der Lage sind, die Arthritis zu transferieren. Einzelne gegen murines CII gerichtete Antikörper waren nicht in der Lage, die Arthritis zu transferieren. Erst eine Mischung aus drei IgG2a und einem IgG2b Antikörper konnte die Arthritis transferieren, wobei alle Antikörper unterschiedliche Epitope erkannten (Terato et al. (1992)).

1.2.1.3 Die Rolle des Komplements und der Fc-Rezeptoren in der CIA

Ein Effektormechanismus der angeborenen Immunität bei der Antikörper eine Rolle spielen ist das Komplement. Der klassische Weg der Komplementkaskade wird aktiviert, wenn der Komplementkomplex C1q an IgM oder IgG, die z.B. in Immunkomplexen vorhanden sind, bindet. Beim alternativen Weg lagert sich ein Faktor der Komplementkaskade, das C3b Molekül, spontan auf Oberflächen z.B. von Bakterien an und aktiviert darüber die Komplementkaskade. Das Komplement ist sehr wichtig für die CIA. Unter Verwendung des Kobra Venom Faktors kann das Komplement unspezifisch aktiviert werden, was zu einem schnellen Verbrauch der Komplementproteine und somit zum Zusammenbruch des Komplementsystems führt. Eine Behandlung von Ratten mit dem Kobra Venom Faktor führt zu einer verzögerten Manifestation der CIA (Morgan et al. (1981)). Die genetische Deletion von C5, C3 oder Faktor B in DBA/1 Mäusen führt zur Resistenz dieser Mäuse gegen CIA, obwohl sich hohe Antikörpertiter gegen CII bilden (Hietala et al. (2002), Wang et al. (2000)). Das zeigt, dass sowohl der klassische aber auch der alternative Weg der Komplementkaskade beteiligt sind. Daneben spielen über Fc-Rezeptoren vermittelte Effektormechanismen in der CIA eine große Rolle. In der Maus werden Fcγ-Rezeptoren auf allen hämatopoetischen Stammzellen exprimiert. Sie stellen eine wichtige Verbindung zwischen Antikörper-Antigen Komplexen und den zellulären Effektormechanismen der Zellen des Immunsystems dar. Eine Aktivierung von Zellen über Fc-Rezeptoren führt zu gesteigerter Phagozytose, der Produktion und Freiset[Seite 11↓]zung von Zytokinen, der Endozytose opsonierter Antigene und der antikörperabhängigen zellulären Zytotoxität. In der Maus existieren drei Fcγ-Rezeptoren. Die Fcγ-Rezeptoren FcγRI und FcγRIII sind aktivierende Fcγ-Rezeptoren. Beide Rezeptoren besitzen eine gemeinsame γ-Kette, welche über ein ITAM-Motiv verfügt und somit aktivierende Signale in das Zellinnere weiterleitet. Der Fcγ-Rezeptor FcγRII ist ein inhibierender Rezeptor, da er über kein ITAM-Motiv verfügt und keine aktivierenden Signale weiterleiten kann. DBA/1 Mäuse, die keine aktivierenden Fcγ-Rezeptoren exprimieren, da sie genetisch deletiert wurden, sind resistent gegen CIA trotz hoher Antikörpertiter gegen CII. Mäuse dagegen, die keinen inhibierenden Fcγ-Rezeptor (Fcγ-RIIB-/-) exprimieren, zeigen einen schwereren Verlauf (Kleinau et al. (2000)).

1.2.1.4 Die Rolle der Zytokine in der CIA

Neben den Antikörpern nehmen auch Zytokine entscheidenden Einfluss auf die CIA. Ähnlich der RA im Menschen ist auch in der CIA das TNF-α von besonderer Bedeutung. Antikörper gegen TNF-α oder der lösliche TNF Rezeptor (TNFR p75) haben therapeutische Effekte, sowohl wenn sie kurz vor der Manifestation der Arthritis oder auch erst kurz danach verabreicht werden (Piguet et al. (1992), Thorbecke et al. (1992), Williams et al. (1992), Wooley et al. (1993)). Daneben konnte aber auch eine wichtige Beteiligung von IL-17 und IL-6 in der CIA gezeigt werden. IL-17 hat einen wichtigen Anteil an der Ausbildung der T-Zellantwort gegen CII und an der IgG2a Produktion der B-Zellen. Mäuse, die eine genetische Deletion für IL-17 besitzen, sind resistent gegen die CIA (Nakae et al. (2003)). Mäuse, die defizient für IL-6 sind, entwickeln keine oder eine verzögerte, mildere Arthritis (Alonzi et al. (1998), Sasai et al. (1999)). IL-6 beeinflusst die Differenzierung von B-, T-Zellen und Makrophagen und aktiviert außerdem Osteoklasten, die an der Knochenresorption beteiligt sind. Somit wird deutlich, dass drei Zytokine, für die auch eine zentrale Rolle bei der Pathogenese der RA beschrieben wurde, in dem CIA Modell wichtig sind und wahrscheinlich pathologisch die gleichen Effekte haben. Interessantweise kann schon durch das Ausschalten eines dieser Zytokine die Arthritis in der CIA verhindert werden. Das ist ein weiterer Hinweis darauf, dass auch in der RA die Zytokine miteinander vernetzte Funktionen haben. Wird dieses Netzwerk an einer Stelle gestört, bricht die pro-inflammatorische Antwort ab.

1.2.2 Das K/BxN-Modell

In dem K/BxN-Modell werden zwei Mausstämme miteinander gekreuzt. Es handelt sich dabei zum Einen um den KRN Stamm. Dieser Stamm exprimiert einen transgenen T-Zellrezeptor [Seite 12↓](TZR), der ein Peptid der bovinen Pankreasribonuklease (RNAse) im Kontext einer I-Ak Präsentation erkennt. Dieser Stamm wird gekreuzt mit Mäusen des NOD-Stamms (engl.: non obese diabetes), der das MHC-II Molekül I-Ag7 exprimiert (Abb. 1.3). Der aus dieser Kreuzung resultierende K/BxN Stamm hat einen besonderen Phänotyp (Kouskoff et al. (1996)). Alle Nachkommen dieser Kreuzung entwickeln nach 4-5 Wochen spontan eine schwere, symmetrische Polyarthritis, die stark der humanen RA ähnelt.

Abb. 1.3: Das K/BxN Mausmodell der rheumatoiden Arthritis. Die K/BxN Mäuse entstehen aufgrund der Kreuzung des KRN Stamms, der transgen für einen T-Zellrezeptor (TZR) ist, der ein Peptid der bovinen Pankreas RNAse im Kontext einer I-Ak Präsentation erkennt, und des NOD-Stamms, der I-Ag7 exprimiert. Die K/BxN Mäuse entwickeln spontan eine antikörpervermittelte Arthritis aufgrund der Erkennung eines Epitops der Glukose-6-phosphat Isomerase durch den transgenen T-Zellrezeptors im Kontext einer I-Ag7 Präsentation. Dies führt zur Aktivierung der transgenen T-Zellen und später auch der B-Zellen, die hohe Titer pathogener anti-G6PI Antikörper produzieren.

1.2.2.1 Die Rolle des MHC und des transgenen T-Zellrezeptors im K/BxN-Modell

Die transgenen T-Zellen und das MHC-II Molekül I-Ag7 spielen ein entscheidende Rolle bei der Entwicklung der Arthritis. Die F1 Generation einer KRNxC57BL/6 oder KRNxBALB/c Kreuzung entwickelt keine Arthritis. Wird der KRN Stamm jedoch mit dem C57BL/6 Stamm gekreuzt, der kongen für das MHC-II Molekül I-Ag7 ist, so entwickeln wieder alle Nachkommen eine Arthritis. Gleiches gilt, wenn BALB/c Mäuse transgen für Aβ g7 sind und dadurch auch I-Ag7 exprimieren (Kouskoff et al. (1996)). Nur der transgene TZR und keine zusätzlichen endogenen T-Zellrezeptoren sind für die Arthritisentwicklung verantwortlich. Knochenmark aus KRN Mäusen oder aus KRN Mäusen, die RAG-/- sind, keine B-Zellen besitzen [Seite 13↓]und ausschließlich T-Zellen haben, die den transgenen TZR exprimieren, wurden in bestrahlte Cα0/BxN Mäuse transferiert, die eine Mutation in der alpha-Kette des TZR aufweisen und daher keine endogenen T-Zellen exprimieren können. Bis auf die Mutation entsprechen die Cα0/BxN Mäuse einer Kreuzung aus C57BL/6 und NOD. Der Cα0/BxN Stamm besitzt keine eigenen T-Zellen aber ein funktionsfähiges B-Zellkompartiment. In beiden Transferexperimenten entwickeln die Tiere einen gleichen Krankheitsverlauf, was zeigt, dass der transgene TZR entscheidend ist (Mangialaio et al. (1999)). Zusätzlich konnte die Bedeutung der CD4+ T-Zellen durch die Blockade von CD4 mit Hilfe eines Antikörper gezeigt werden. Bei einer Blockade von CD4 bis 5 Tage vor der klinischen Manifestation der Arthritis kann die Arthritis verhindert werden. Später hat die Blockade keinen Einfluss mehr (Kouskoff et al. (1996)).

1.2.2.2 Die Rolle der B-Zellen und anti-G6PI Antikörper im K/BxN-Modell

Besonders B-Zellen und die von ihnen produzierten Antikörper sind von Bedeutung. K/BxN Mäuse, die aufgrund einer µMTo Mutation keine reifen B-Zellen besitzen, entwickeln keine Arthritis (Kouskoff et al. (1996)). Der Transfer von Milzzellen aus K/BxN Mäusen in RAG-/- C57BL/6 Mäuse, die keine B- und T-Zellen haben, führt zur Entwicklung einer Arthritis in den Empfängern. Enthalten diese Milzzellen keine B-Zellen ist der Transfer nicht mehr möglich (Korganow et al. (1999)). B-Zellen brauchen für ihre arthritogene Funktion T-Zellhilfe, da K/BxN Mäuse, die CD40 defizient sind, keine Arthritis entwickeln (Korganow et al. (1999)). Die Arthritis kann allein durch geringe Mengen von Serum aus K/BxN Mäusen, die in Empfänger transferiert werden, induziert werden. Die Arthritis verläuft dann jedoch nicht chronisch und nimmt nach 15 Tagen wieder ab (Korganow et al. (1999)). Die Inkubation von Gewebe mit dem Serum der K/BxN Mäuse zeigte eine Bindung von IgG bei einem Protein von 55kDa. Dabei handelte es sich um die Glukose-6-phosphat Isomerase (G6PI) (Matsumoto et al. (1999)). Antikörper, die spezifisch gegen G6PI gerichtet sind, sind in der Lage die Arthritis zu transferieren und transgene T-Zellen aus den KRN Mäusen proliferieren, wenn G6PI im Kontext von I-Ag7 präsentiert wird (Matsumoto et al. (1999)). Die G6PI ist ein glykolytisches Enzym, welches die Umwandlung von Glukose-6-phosphat zu Fruktose-6-phosphat katalysiert. Zusätzlich hat G6PI auch extrazelluläre Funktionen und wirkt außerhalb der Zelle als Zytokin. Proteine, die ursprünglich als Neuroleukin, „autocrine motility factor“ (AMF) und „differentiation and maturation factor“ (DMM) beschrieben wurden, sind identisch mit G6PI (Chaput et al. (1988), Faik et al. (1988), Watanabe et al. (1996), Xu et al. (1996)). In der Milz und anderen lymphatischen Organen kann eine hohe Frequenz von G6PI-spezifischen B-Zellen detektiert werden. Dabei können 40 Tage nach Geburt der K/BxN [Seite 14↓]Mäuse nur Antikörper vom IgG1 Isotyp festgestellt werden (Maccioni et al. (2002)). Mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern konnte gezeigt werden, dass mehrere unterschiedliche Antikörper für den Arthritistransfer gebraucht werden (Maccioni et al. (2002)). Das spricht dafür, ähnlich dem CIA Modell, dass die Bildung von Immunkomplexen von Bedeutung ist. Nur Minuten nach der Injektion von anti-G6PI Antikörpern können diese in den distalen Gelenken der Vorder- und Hinterläufe der Mäuse lokalisiert werden (Wipke et al. (2002)). Außerdem konnte gezeigt werden, dass G6PI auf der Knorpeloberfläche exprimiert wird bzw. sich dort anlagert, was die Hypothese nahe legt, dass die Antikörper große Immunkomplexe mit G6PI im Gelenkspalt bilden (Matsumoto et al. (2002)).

1.2.2.3 Die Rolle des Komplements und der Fc-Rezeptoren im K/BxN-Modell

Das Transfersystem der Arthritis wurde verwendet, um die unterschiedlichen über Antikörper vermittelten Effektorfunktionen zu entschlüsseln. Da der Arthritistransfer in fast jedem Stamm funktioniert, konnten transgene Tiere verwendet werden, die über keinen bestimmten genetischen Hintergrund verfügen mussten. Eine wichtige Effektorfunktion von Antikörpern ist die Bindung an Fc-Rezeptoren. FcRγ-/- Mäuse, die keine funktionellen aktivierenden FcγRI und FcγRIII exprimieren, entwickelten nach Serumtransfer keine Arthritis. Dabei konnte mit FcγRIII-/- Mäusen gezeigt werden, dass dieser Rezeptor entscheidend für die Arthritisentwicklung ist (Ji et al. (2002)). Mäuse, die FcγRI-/- sind, entwickeln eine Arthritis vergleichbar mit den Wildtyptieren (Ji et al. (2001), Ji et al. (2002)). In einer Studie zufolge entwickeln FcγRII-/- Mäuse schneller eine Arthritis nach Antikörpertransfer als die Wildtyptiere (Corr und Crain (2002)) während eine weitere Studie behauptet, dass dieser Rezeptor keinen Einfluss auf die Arthritisentwicklung hat (Ji et al. (2001)). Jedoch sind die über den FcγRIII vermittelten Funktionen aber absolut notwendig, um eine Arthritis mit Hilfe von Antikörpern zu transferieren. Neben den Fc-Rezeptoren ist auch das Komplementsystem entscheidend für die Arthritisentwicklung. Eine Blockade des zentralen Komplementproteins C5 mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen C5 verhindert die Arthritisentwicklung nach Serumtransfer bzw. wirkt auch therapeutisch (Ji et al. (2002)). Auch der A/J Stamm, der defizient für C5 ist, entwickelt keine Arthritis. Mäuse die genetische Deletionen für die Komplementproteine des klassischen Weges der Komplementkaskade C1q oder C4 besitzen, entwickeln eine Arthritis mit einer Inzidenz von 100% (Ji et al. (2002)). Damit ist der klassische Weg der Komplementkaskade pathologisch nicht relevant. Mäuse dagegen, die keinen Faktor B exprimieren, entwickeln nur in einigen Tieren eine Arthritis. Die dort entwickelte Arthritis ist jedoch sehr schwach (Ji et al. (2002)). Somit spielt der alternative Weg der Komplementkaskade ein [Seite 15↓]große Rolle. Die im K/BxN-Modell über das Komplementsystem vermittelte Funktion besteht hauptsächlich über die Aktivierung des C5a-Rezeptors durch C5a. Dieser Effektorweg und die Aktivierung des FcγRIII führt wahrscheinlich zur Aktivierung von Makrophagen, Mastzellen und Neutrophilen, die daraufhin Zytokine wie TNF-α, IL-1 und Chemokine sowie degradierende Enzyme freisetzen.

Tatsächlich tragen Neutrophile und Mastzellen entscheidend zur Entwicklung der Arthritis in den K/BxN Mäusen bei. Neutrophile können sehr früh, nach 48 Stunden, in den betroffenen Gelenken nach Serumtransfer nachgewiesen werden, und die Depletion der Neutrophilen mit Hilfe eines Antikörpers verhindert die Arthritisentwicklung (Wipke und Allen (2001)). Die Degranulation von Mastzellen kann schon zwei Stunden nach dem Serumtransfer beobachtet werden, und zwei mastzelldefiziente Mausstämme (Sl/Sld und W/Wv) sind resistent gegen den Arthritistransfer durch Serum (Lee et al. (2002)). Werden in vitro generierte Mastzellen in die W/Wv Mäuse transferiert, so sind auch diese suszeptibel für die mit Serum transferierte Arthritis (Lee et al. (2002)).

1.2.2.4 Die Rolle von TNF-α, IL-1 und IL-6 im K/BxN-Modell

Auch die von Makrophagen, Mastzellen und Neutrophilen produzierten Zytokine TNF-α und IL-1 sind wichtig im Verlauf der Arthritis in den K/BxN Mäusen. Mäuse, die IL-1R-/- sind und keine IL-1α oder IL-1β vermittelten Signale weiterleiten können, entwickeln keine Arthritis nach dem Serumtransfer (Ji et al. (2002)). Die Rolle von TNF-α ist nicht so eindeutig. Nur ungefähr zwei Drittel der TNF-α-/- Mäuse entwickeln keine Arthritis nach dem Serumtransfer, und die Entwicklung der Arthritis in den suszeptibelen Mäusen war innerhalb dieser Gruppe sehr uneinheitlich bezüglich des Verlaufs (Ji et al. (2002)). In einer weiteren Studie zeigte die Behandlung von K/BxN Mäusen mit einem anti- TNF-α Antikörper keinen Einfluss auf die Arthritisentwicklung (Kyburz et al. (2000)). Somit wird deutlich, dass TNF-α eine wichtige Rolle spielt aber nicht unabdingbar für Arthritisentwicklung ist. Interessantweise spielt IL-6, welches sowohl im CIA Modell und wahrscheinlich auch in der humanen RA von großer Bedeutung ist, im K/BxN-Modell keine Rolle. Sowohl die IL-6-/- Mäuse aber auch die Wildtypmäuse entwickeln nach Serumtransfer eine Arthritis deren Verlauf und Inzidenz zwischen beiden Stämmen vergleichbar ist (Ji et al. (2002)).


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24.06.2005