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Die Mäuse wurden soweit nicht anders angegeben unter SPF-Bedingungen (Spezifiziert Pathogen Frei) von der Versuchstierzucht Marienfelde des Bundesinstituts für Risikobewertung (BfR) gezüchtet. Folgende Mäuse wurden eingesetzt:
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DBA/1 |
H2-q Haplotyp |
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DBA/2 |
H2-d Haplotyp; die Tiere wurden vom Max-Delbrück-Zentrum in Berlin bezogen |
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AKR |
H2-k Haplotyp |
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B10.A |
H2-k Haplotyp |
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B10.Q |
H2-q Haplotyp; die Mäuse wurden von Jackson Laboratories bezogen |
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BALB/c |
H2-d Haplotyp |
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C57BL/6 |
H2-b Haplotyp |
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DBA/1 x C57BL/6 |
H2-q/b; F1 Generation einer DBA/1 und C57BL/6 Kreuzung |
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SWR |
H2-q Haplotyp; die Mäuse wurden von Jackson Laboratories bezogen |
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Mrl/lpr |
Diese Mäuse besitzen eine Mutation im Fas Gen. Dadurch wird weniger Fas mRNA exprimiert und die Mäuse leiden an einer SLE ähnlichen Erkrankung. |
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HLA-DR4mix |
Diese Mäuse sind transgen für humanes HLA-DRB0401, humanes CD4 und wurden rückgekreuzt mit H-2I-E negativen Mäusen und exprimieren daher kein endogenes MHC-II. Sie befanden sich auf einem gemischten Hintergrund. |
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HLA-DR4-Kim |
Diese Tiere exprimieren eine MHC-II Chimäre aus dem humanen HLA-DRB0401 Molekül und dem endogen Maus MHC-II. Die Tiere wurden auf den DBA/1 Hintergrund zurückgekreuzt. |
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Ziege anti-human IgG-POD |
Sigma; spezifisch für die γ-Kette und konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase |
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Ziege anti-Maus IgG-POD |
Sigma; spezifisch für den Fc-Teil von IgG und konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase |
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Ziege anti-Maus IgG-Biotin |
Sigma; mit Biotin konjugiert |
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Ziege anti-Maus IgM-POD |
Sigma; spezifisch für die μ-Kette von IgM und konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase |
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Ziege anti-Maus IgG1 |
Sigma; spezifisch für die schwere Kette |
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Ziege anti-Maus IgG2a |
Sigma; spezifisch für die schwere Kette |
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Ziege anti-Maus IgG2b |
Sigma; spezifisch für die schwere Kette |
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Ziege anti-Maus IgG3 |
Sigma; spezifisch für die schwere Kette |
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Ziege anti-Maus IgM |
Sigma; spezifisch für die μ-Kette von IgM |
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Esel anti-Ziege IgG-POD |
Santa Cruz Biotechnology; 0,4mg/ml; konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase |
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Maus IgG |
Jackson Immuno Research; 11,4mg/ml |
Die Antikörper waren teilweise mit Flourescein Isothiocyanat (FITC), R-Phycoerythrin (PE), Biotin, Indodicarbocyanin (Cy5) oder Allophycocyanin (APC) konjugiert. Streptavidin wurde entweder konjugiert mit PE oder mit Peridinin-Chlorophyll (PerCP) eingesetzt. Vor der Verwendung zur Markierung von Zellen, wurden die Antikörper austitriert.
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anti-Maus CD25 |
Klon pC61.5; wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt |
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anti-Maus CD4 |
Klon YTS191.1; wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt |
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anti-Maus Komplementprotein C5 |
Klon BB5.1; wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt |
Alle Primer wurden von TIB MOLBIOL gekauft und auf eine Konzentration von 50µM gebracht.
Primer für die mG6PI-cDNA Amplifikation
mG6PI5: 5´- ACT GAC ATA TGG CTG CGC TCA CCC – 3´
mG6PI3: 5´- ACT GAA GCT TAT TCT AGT TTG GTG TCC C – 3´
Sequenzierungsprimer für den Vektor pQE100S
pQE5: 5´- CGG ATA ACA ATT TCA CAC AG - 3´
pQE3: 5´- GCC CTG CCA CTC ATC G – 3´
Primer für die Genotypisierung der Fc γ RIIB -/- Mäuse
Neo: 5´ - CTG GTG CTT TAC GGT ATC GCC - 3´
5´EC1 5´ - AAA CTC GAC CCC CCG TGG ATC - 3´
3´EC1 5´ - TTG ACT GTG TTA AAC GTG TAG - 3´
Primer für die Genotypisierung der FcR γ -/- Mäuse
Neo: 5´ - CTG GTG CTT TAC GGT ATC GCC - 3´
OL4087: 5´ - ACC CTA CTC TAC TGT CGA CTC AAG - 3´
OL4081 5´ - CTC ACG GCT GGC TAT AGC TGC CTT - 3´
Der Vektor pQE100S ist ein Geschenk von Mark Rosowski von der AG Lauster am DRFZ. Mit Hilfe dieses Vektors kann in Bakterien eine klonierte cDNA mit einer N-terminalen Histidinmarkierung exprimiert werden.
Die eingesetzten Patientenseren stammen aus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Rheumatologie und klinische Immunologie der Charité in Berlin und aus der Medizinischen Klinik I des Universitätsklinikums Benjamin Franklin in Berlin. Die Seren der gesunden Spender stammen aus dem Deutschen Rheumaforschungszentrum in Berlin.
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Kulturmedium (KM) |
RPMI-1640 10 % FCS 100 mM HEPES 50 µM 2-Mercapotoethanol 100 U/ml Penicillin 100 µg/ml Streptomycin |
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Waschmedium(WM) |
RPMI-1640 5 % Kulturmedium |
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LB-Medium |
25 Kapseln LB-Medium/l 100 µg/ml Ampicillin |
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Agarplatten |
LB-Medium 15 g/l Agar |
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10x Laufpuffer |
30 g/l Tris-HCl 144g/l Glycin 10 g/l SDS |
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3x Probenpuffer |
0,77 g DTT 1 g SDS 4 ml 1M Tris/HCl pH 6,8 5 ml Glycerin 0,3 ml Bromphenolblau ad 17 ml H2O |
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Coomassie-Lösung |
1,6 g Coomassie G-250 500 ml Methanol 500 ml Eisessig |
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Entfärbelösung |
430 ml Methanol 70 ml Eisessig 500 ml H2O |
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Laufpuffer (50x TAE) |
242 g/l Trisbase 57,1 ml/l 96% Essigsäure 10% EDTA 0,5M pH 8,6 |
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5x Probenpuffer |
50 ml Glycerin 2 ml Tris 0,5 M pH 7,5 1 g Orange G ad 100 ml H2O |
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Transferpuffer |
25 mM Tris Base 150 mM Glycin 20% Methanol |
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Blockpuffer |
3% BSA in TBS |
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TBS-Puffer |
10 mM Tris/HCl pH 7,5 150 mM NaCl |
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TBS-Tween |
10 mM Tris/HCl pH 7,5 150 mM NaCl 0,05% (v/v) Tween 20 |
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Lysispuffer |
50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM Imidazol pH 8,0 |
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Waschpuffer |
50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 20 mM Imidazol pH 8,0 |
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Elutionspuffer |
50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 150 mM Imidazol pH 8,0 |
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Bindungspuffer |
20 mM Na2HPO4 mit 20 mM NaH2PO4 auf pH 7,0 eingestellt |
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FACS-Puffer (PBA) |
PBS 1 % (w/v) BSA 0,5 % NaN3 |
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Lysis-Puffer |
10 mM KHCO3 155 mM NH4Cl 0,1 mM EDTA |
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PFA |
2 % in PBS |
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Saponin-Puffer |
0,5 % (w/v) Saponin in PBA |
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Bindungspuffer |
PBS |
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Blockpuffer |
PBS 0,5 % BSA |
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Inkubationspuffer (PBT) |
PBS 0,5 % BSA 0,05 % Tween-20 |
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Waschpuffer |
PBS 0,05 % Tween-20 |
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TMB-Puffer |
0,2 M Na2HPO4 0,1 M Zitronensäure auf pH 5,0 eingestellt |
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Proteinase K Verdauungspuffer |
0,5 mg/ml Proteinase K 0,1% SDS 0,1 M NaCl 50 mM Tris/HCl pH 8,0 10 mM EDTA |
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10 x PCR-Puffer |
Peqlab |
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Puffer H |
Boehringer Mannheim |
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10x Ligationspuffer |
Peqlab |
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Gelatin Veronal Puffer (GVB2+) |
Sigma |
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