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2  Material

2.1 Mäuse

Die Mäuse wurden soweit nicht anders angegeben unter SPF-Bedingungen (Spezifiziert Pathogen Frei) von der Versuchstierzucht Marienfelde des Bundesinstituts für Risikobewertung (BfR) gezüchtet. Folgende Mäuse wurden eingesetzt:

DBA/1

H2-q Haplotyp

DBA/2

H2-d Haplotyp; die Tiere wurden vom Max-Delbrück-Zentrum in Berlin bezogen

AKR

H2-k Haplotyp

B10.A

H2-k Haplotyp

B10.Q

H2-q Haplotyp; die Mäuse wurden von Jackson Laboratories bezogen

BALB/c

H2-d Haplotyp

C57BL/6

H2-b Haplotyp

DBA/1 x C57BL/6

H2-q/b; F1 Generation einer DBA/1 und C57BL/6 Kreuzung

SWR

H2-q Haplotyp; die Mäuse wurden von Jackson Laboratories bezogen

Mrl/lpr

Diese Mäuse besitzen eine Mutation im Fas Gen. Dadurch wird weniger Fas mRNA exprimiert und die Mäuse leiden an einer SLE ähnlichen Erkrankung.

HLA-DR4mix

Diese Mäuse sind transgen für humanes HLA-DRB0401, humanes CD4 und wurden rückgekreuzt mit H-2I-E negativen Mäusen und exprimieren daher kein endogenes MHC-II. Sie befanden sich auf einem gemischten Hintergrund.

HLA-DR4-Kim

Diese Tiere exprimieren eine MHC-II Chimäre aus dem humanen HLA-DRB0401 Molekül und dem endogen Maus MHC-II. Die Tiere wurden auf den DBA/1 Hintergrund zurückgekreuzt.

2.2 Chemikalien und Enzyme


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Acrylamid/Bisacrylamid

Biorad

Agar

Roth

Agarose

Gibco

Ammoniumchlorid

Merck

Ampicillin

Roth

APS

Sigma

2-Mercaptoethanol

Sigma

Brefeldin A

Sigma

Bromphenolblau

Sigma

BSA

Sigma

C5-defizientes humanes Serum

Sigma

CFA

Sigma

CFDA-SE

Molecular Probes

Coomassie G-250

Sigma

DNA aus Kälberthymus

Serva

dNTP

Peqlab

DTT

Sigma

ECL-Detektionsreagenz

Amersham Biosciences

EDTA

Roth

Essigsäure

Sigma

Etanercept

Immunex

Ethanol

Roth

Ethidiumbromid

Biorad

ExtrAvidin-Peroxidase

Sigma

FACS Lysing solution

BD Biosciences

Glycerin

Roth

Glycin

Sigma

H2O2

Merck

H2SO4

Sigma

HEPES-Puffer

PAA Laboratories

HindIII

New England Biolabs

Hühner Ovalbumin

Sigma

Imidazol

Sigma

Ionomycin

Sigma

IPTG dioxanfrei

Roth

Kaliumchlorid

Roth

Kaliumhydrogencarbonat

Merck

Kaninchen CK-M

Sigma

Kaninchen G6PI

Sigma

LB-Medium

Bio101

Magnesiumchlorid

Merck

Marker VI

Vektor pBR3.28 geschnitten mit HinfI/BglI

Methanol

Roth

Microscint

Packard

Natriumazid

Sigma

Natriumchlorid

Roth

Natriumdihydrogenphosphat

Roth

Natriumdodecylsulfat (SDS)

Merck

NdeI

New England Biolabs

Ni-NTA

Qiagen

NP-40

ICN

Orange G

Sigma

Paraformaldehyd

Sigma

Peniccillin

PAA Laboratories

Perm buffer II

BD Biosciences

PMA

Sigma

Polyethylenglykol 20000

Merck

Ponceau S

Sigma

Propidiumiodid

Sigma

Protein G Sepharose 4 Fast Flow

Amersham Biosciences

Proteinase K

Sigma

PwoI Polymerase

Peqlab

rekombinantes OspA

TIB MOLBIOL

RPMI-1640

PAA Laboratories

SDS-PAGE Standard (Low range)

Biorad

SEB

Sigma

sensitivierte Schafserythrozyten

Virion

Streptomycin

PAA Laboratories

T4 DNA-Ligase

Peqlab

Taq Polymerase

Roche Diagnostics

TEMED

Sigma

[Methyl-3H]-Thymidin

Amersham Biosciences

TMB-Tabletten

Sigma

Tris

Roth

TrypanBlue solution (0,4%)

Sigma

Tween-20

Merck-Schuchardt

Wasser

Millipore

Zitronensäure

Merck

2.3 Antikörper

2.3.1 Antikörper für die Verwendung im ELISA und Immunoblot

Ziege anti-human IgG-POD

Sigma; spezifisch für die γ-Kette und konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase

Ziege anti-Maus IgG-POD

Sigma; spezifisch für den Fc-Teil von IgG und konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase

Ziege anti-Maus IgG-Biotin

Sigma; mit Biotin konjugiert

Ziege anti-Maus IgM-POD

Sigma; spezifisch für die μ-Kette von IgM und konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase

Ziege anti-Maus IgG1

Sigma; spezifisch für die schwere Kette

Ziege anti-Maus IgG2a

Sigma; spezifisch für die schwere Kette

Ziege anti-Maus IgG2b

Sigma; spezifisch für die schwere Kette

Ziege anti-Maus IgG3

Sigma; spezifisch für die schwere Kette

Ziege anti-Maus IgM

Sigma; spezifisch für die μ-Kette von IgM

Esel anti-Ziege IgG-POD

Santa Cruz Biotechnology; 0,4mg/ml; konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase

Maus IgG

Jackson Immuno Research; 11,4mg/ml

2.3.2 Antikörper und Sekundärfarbstoffe für die Durchflusszytometrie

Die Antikörper waren teilweise mit Flourescein Isothiocyanat (FITC), R-Phycoerythrin (PE), Biotin, Indodicarbocyanin (Cy5) oder Allophycocyanin (APC) konjugiert. Streptavidin wurde entweder konjugiert mit PE oder mit Peridinin-Chlorophyll (PerCP) eingesetzt. Vor der Verwendung zur Markierung von Zellen, wurden die Antikörper austitriert.


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anti-human CD4-Biotin

BD Bioscience; Klon SK3

anti-human CD69-PE

BD Bioscience; Klon L78

anti-Maus CD3-FITC

Klon 145-2C11; 0,54mg/ml; wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt und mit FITC konjugiert

anti-Maus CD4-Cy5

Klon GK1.5; 0,43mg/ml; wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt und mit Cy5 konjugiert

anti-Maus CD4-Biotin

Klon GK1.5; 0,52mg/ml; wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt und mit Biotin konjugiert

anti-Maus CD8-PE

Klon 53-C6.7; wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt und mit PE konjugiert

Maus IgG1-FITC (Isotypkontrolle)

BD Biosciences; Klon MOPC-21

Maus IgG1-Cy5 (Isotypkontrolle)

BD Biosciences; Klon MOPC-21

anti-Maus CD25-Biotin

BD Biosciences; Klon 7D4

anti-Maus IL-2-APC

BD Biosciences; Klon JES6-5H4

anti-Maus IL-4-PE

BD Biosciences; Klon 11B11

anti-Maus IL-6-PE

BD Biosciences; Klon MP5-20F3

anti-Maus IL-10-PE

BD Biosciences; Klon JES5-16E3

anti-Maus IL-17-PE

BD Biosciences; Klon TC11-188H10.1

anti-Maus IFN-γ-FITC

BD Biosciences; Klon XM61.2

anti-human IFN-γ-Cy5

Klon 4SB3; 0,6mg/ml wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt und mit PE konjugiert

anti-Maus TNF-α-FITC

BD Biosciences; Klon MP6-XT22

anti-human TNF-α-FITC

BD Biosciences; Klon MAb11

Ratten IgG1-FITC (Isotypkontrolle)

BD Biosciences; Klon R3-34

Ratten IgG1-PE (Isotypkontrolle)

BD Biosciences; Klon R3-34

Ratten IgG1-APC (Isotypkontrolle)

BD Biosciences; Klon R3-34

Ratten IgG2b-FITC (Isotypkontrolle)

BD Biosciences; Klon A95-1

Ratten IgG2b-PE (Isotypkontrolle)

BD Biosciences; Klon A95-1

Ratten IgG2b-APC (Isotypkontrolle)

BD Biosciences; Klon A95-1

Streptavidin-PerCP

BD Biosciences

Streptavidin-PE

BD Biosciences

anti-Maus CD16/CD32

Klon 2.4G2; 0,6mg/ml; wurde am DRFZ aus dem

Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt

Beriglobin

Aventis Behring; 160mg/ml

Ratten IgG

Jackson Immuno Research; 11,4mg/ml

2.3.3 Antikörper für in vivo Studien

anti-Maus CD25

Klon pC61.5; wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt

anti-Maus CD4

Klon YTS191.1; wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt

anti-Maus Komplementprotein C5

Klon BB5.1; wurde am DRFZ aus dem Überstand eines B-Zellhybridoms aufgereinigt

2.4 Primer und Vektoren

Alle Primer wurden von TIB MOLBIOL gekauft und auf eine Konzentration von 50µM gebracht.

Primer für die mG6PI-cDNA Amplifikation

mG6PI5: 5´- ACT GAC ATA TGG CTG CGC TCA CCC – 3´

mG6PI3: 5´- ACT GAA GCT TAT TCT AGT TTG GTG TCC C – 3´

Sequenzierungsprimer für den Vektor pQE100S

pQE5: 5´- CGG ATA ACA ATT TCA CAC AG - 3´

pQE3: 5´- GCC CTG CCA CTC ATC G – 3´

Primer für die Genotypisierung der Fc γ RIIB -/- Mäuse

Neo: 5´ - CTG GTG CTT TAC GGT ATC GCC - 3´

5´EC1 5´ - AAA CTC GAC CCC CCG TGG ATC - 3´

3´EC1 5´ - TTG ACT GTG TTA AAC GTG TAG - 3´

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Primer für die Genotypisierung der FcR γ -/- Mäuse

Neo: 5´ - CTG GTG CTT TAC GGT ATC GCC - 3´

OL4087: 5´ - ACC CTA CTC TAC TGT CGA CTC AAG - 3´

OL4081 5´ - CTC ACG GCT GGC TAT AGC TGC CTT - 3´

Der Vektor pQE100S ist ein Geschenk von Mark Rosowski von der AG Lauster am DRFZ. Mit Hilfe dieses Vektors kann in Bakterien eine klonierte cDNA mit einer N-terminalen Histidinmarkierung exprimiert werden.

2.5 Patientenseren

Die eingesetzten Patientenseren stammen aus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Rheumatologie und klinische Immunologie der Charité in Berlin und aus der Medizinischen Klinik I des Universitätsklinikums Benjamin Franklin in Berlin. Die Seren der gesunden Spender stammen aus dem Deutschen Rheumaforschungszentrum in Berlin.

2.6 Zellkulturmedien, Puffer und Lösungen

2.6.1 Zellkulturmedien

Kulturmedium (KM)

RPMI-1640

10 % FCS

100 mM HEPES

50 µM 2-Mercapotoethanol

100 U/ml Penicillin

100 µg/ml Streptomycin

Waschmedium(WM)

RPMI-1640

5 % Kulturmedium

LB-Medium

25 Kapseln LB-Medium/l

100 µg/ml Ampicillin

Agarplatten

LB-Medium

15 g/l Agar


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2.6.2  Puffer und Lösungen

2.6.2.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

10x Laufpuffer

30 g/l Tris-HCl

144g/l Glycin

10 g/l SDS

3x Probenpuffer

0,77 g DTT

1 g SDS

4 ml 1M Tris/HCl pH 6,8

5 ml Glycerin

0,3 ml Bromphenolblau

ad 17 ml H2O

Coomassie-Lösung

1,6 g Coomassie G-250

500 ml Methanol

500 ml Eisessig

Entfärbelösung

430 ml Methanol

70 ml Eisessig

500 ml H2O

2.6.2.2 Agarosegelelektrophorese

Laufpuffer (50x TAE)

242 g/l Trisbase

57,1 ml/l 96% Essigsäure

10% EDTA 0,5M pH 8,6

5x Probenpuffer

50 ml Glycerin

2 ml Tris 0,5 M pH 7,5

1 g Orange G

ad 100 ml H2O

2.6.2.3 Immunoblot


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Transferpuffer

25 mM Tris Base

150 mM Glycin

20% Methanol

Blockpuffer

3% BSA in TBS

TBS-Puffer

10 mM Tris/HCl pH 7,5

150 mM NaCl

TBS-Tween

10 mM Tris/HCl pH 7,5

150 mM NaCl

0,05% (v/v) Tween 20

2.6.2.4 Puffer zur Aufreinigung von rekombinanter G6PI

Lysispuffer

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

10 mM Imidazol

pH 8,0

Waschpuffer

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

20 mM Imidazol

pH 8,0

Elutionspuffer

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

150 mM Imidazol

pH 8,0

2.6.2.5 Puffer bei der Aufreinigung von IgG aus murinem Serum

Bindungspuffer

20 mM Na2HPO4

mit 20 mM NaH2PO4 auf pH 7,0 eingestellt

2.6.2.6 FACS


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FACS-Puffer (PBA)

PBS

1 % (w/v) BSA

0,5 % NaN3

Lysis-Puffer

10 mM KHCO3

155 mM NH4Cl

0,1 mM EDTA

PFA

2 % in PBS

Saponin-Puffer

0,5 % (w/v) Saponin in PBA

2.6.2.7 ELISA

Bindungspuffer

PBS

Blockpuffer

PBS

0,5 % BSA

Inkubationspuffer (PBT)

PBS

0,5 % BSA

0,05 % Tween-20

Waschpuffer

PBS

0,05 % Tween-20

TMB-Puffer

0,2 M Na2HPO4

0,1 M Zitronensäure

auf pH 5,0 eingestellt

2.6.2.8 Andere Puffer

Proteinase K Verdauungspuffer

0,5 mg/ml Proteinase K

0,1% SDS

0,1 M NaCl

50 mM Tris/HCl pH 8,0

10 mM EDTA

10 x PCR-Puffer

Peqlab

Puffer H

Boehringer Mannheim

10x Ligationspuffer

Peqlab

Gelatin Veronal Puffer (GVB2+)

Sigma

2.7 Verbrauchsmaterialien


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Acrylküvetten

Roth

BCATM Protein Assay Kit

Pierce

Combitips, Reaktionsgefäße

Eppendorf

Dialyseschlauch

Roth

Filterplatten (Unifilter GF7B),

Abdeckklebeetiketten, Versiegelungsfolie

Packard

Handschuhe, Kimwipes

Kimberly Clark

Hyperfilm ECL

Amersham Biosciences

Kanülen, Spritzen

HSW, Braun,

MiniCollect Röhrchen

Greiner

Pasteurpipetten

Brand

Petrischalen, Zellkulturflaschen,

96- und 48-Muldenplatten, ELISA Platten,

Reagents Reservoir, Plastikpipetten

Corning/Costar

Phosphohexose Isomerase Kit

Sigma

QIAprep® Miniprep Kit

Qiagen

QIAquick® Gel extraction Kit

Qiagen

Quarzküvette

Hellma

Sterifilter 0,45µm und 0,2µm, 15- und 50 ml

Propylenröhrchen

Saarstedt

Whatman Filterpapiere,

Nitrozellulosemembran Optitran 0,45µM

Schleicher-Schuell

Zellsiebe (cell strainer) 70µM

Falcon

2.8 Geräte


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Agarosegelelektrophoresekammer

Peqlab

b-Szintillationszähler

Topcount NXT von Packard

Durchflusszytometer

FACCalibur von Becton Dickinson

ELISA-Lesegerät

Spectra Max 250 von Molecular Devices

Feinwaage

Sartorius

French press

American Instruments

Gel/Blot-Dokumentationsgerät

Gel Doc 2000 von Biorad

Heizblock

Roth

Inkubatoren mit Schüttler

TH 25 von Edmund Bühler

B6 von Heraeus

BB16CU von Heraeus

Kühlschränke und Gefrierschränke

Liebherr

Heraeus Herafreeze

Magnetrührer

IKA RCTbasic

Mikroskop

Zeiss

Netzgerät

Biorad PowerPac 300

PCR-Maschine

Perkin Elmer Gene Amp 2400

pH-Meter

Knick Calimatic 766

Photometer

UV-1202 von Shimadzu

Pumpe

Miniplus2 von Gilson

Schreiber

Colora Recorder 1100

SDS-PAGE

Elektrophoresekammer

Biorad

Sterilbank

HeraSafe von Heraeus

Trockenschrank

T6030 von Heraeus

Ultraschallgerät

Sonoplus HD70 von Bandelin

UV-Meter

Uvicord SII von Pharmacia

Zellerntegerät

Harvester Filtermate 196 von Packard

Zentrifugen

Megafuge 1.0 von Heraeus

Megafuge 1.0R von Heraeus

Biofuge 13R von Heraeus

Biofuge 22R von Heraeus

Biofuge pico von Heraeus

RC-5B von Sorvall


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24.06.2005