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3  Methoden

3.1 Methoden der Mikrobiologie

3.1.1 Kultivierung von E.coli BL21(DE3)

Der mit dem Vektor pQE100S-hG6PI bzw. pQE100S-mG6PI transformierte E.coli Stamm BL21(DE3) wurde bei 37°C in LB-Medium mit 100µg/ml Ampicillin kultiviert. Aus dem bei –70°C gelagerten Bakterienvorrat wurden 100ml LB-Medium/Amp angeimpft und über Nacht im Schüttler kultiviert. Dazu wurde mit Hilfe einer abgeflammten und noch heißen Inokulationsöse in die gefrorene Bakteriensuspension gestochen und eine kleine Menge der Bakteriensuspension in das Medium überführt

3.1.2 Expression der rekombinanten humanen und murinen G6PI

Methode:Auf den Plasmid pQE100S ist das Gen lacIq lokalisiert. Dieses Gen codiert für das lac Repressor Protein, welches nach Expression an den lac-Operator bindet und dadurch die Expression der durch den lac-Operator kontrollierten Gene inhibiert. Nach Zugabe von Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranosid (IPTG) wird diese Inhibition aufgehoben. IPTG bindet an den Repressor und induziert eine Konformationsänderung, wodurch der Repressor vom Operator dissoziiert und das Gen exprimiert wird.

Durchführung:

Die über Nacht kultivierte Bakterienkultur wurde in 2l LB-Medium/Amp transferiert und erneut bei 37°C inkubiert. Bei einer optischen Dichte (OD) von 0,55 - gemessen bei 600nm – wurde die Bakterienkultur mit 4 ml IPTG (1M) versetzt.Nach einer weiteren Inkubation bei 37°C für 3h wurde die Bakteriensuspension bei 4°C und 5000gfür 15min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Bakterienpellet für die weitere Aufarbeitung bei –20°C eingefroren.

3.2 Methoden der Molekularbiologie

3.2.1 Klonierung der murinen G6PI-cDNA in pQE100S

Die cDNA der murinen G6PI wurde aus einer murinen cDNA, die aus dem Herzen der Maus generiert wurde, über die Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert, mit den Restriktionsenzymen HindIII und NdeI geschnitten und in den ebenfalls geschnittenen Vektor pQE100S ligiert. Folgender Ansatz wurde für die Amplifikation der murinen G6PI cDNA verwendet:


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PCR-Ansatz

 

PCR-Programm

  

10x Puffer

5µl

 

94° C

4 min

  

Primer mG6PI5

50 pmol

 

94° C

0:45 min

 

Primer mG6PI3

50 pmol

 

58° C

1 min

32 Zyklen

DNTP´s

0,2 mM

 

72° C

1:45 min

 

murine cDNA

0,1µg

 

72° C

10 min

  

MgCl2

1,5 mM

 

4° C

  

Taq/PwoI (3:1)

0,5µl (4U/µl)

     

Aqua dest.

ad 50µl

     

Nach der Amplifikation wurde die amplifizierte cDNA der murinen G6PI über eine Agarosegelelektropherese aufgetrennt und aus dem Agarosegel mit dem QIAquick® Gel extraction Kit isoliert. Die cDNA und der Vektor pQE100S wurden wie folgt mit den Restriktionsenzymen HindIII und NdeI bei 37°C über Nacht geschnitten.

pQE100S

 

mG6PI cDNA

10x Puffer H

5µl

 

10x Puffer H

5µl

HindIII

20 U

 

HindIII

20U

NdeI

20 U

 

NdeI

20U

pQE100S

2,5µg

 

mG6PI cDNA

28µl Eluat

Aqua dest.

ad 50µl

 

Aqua dest.

ad 50µl

Anschließend wurde die DNA erneut über ein Agarosegel aufgetrennt und mit dem QIAquick® Gel extraction Kit isoliert. Die isolierten DNA Fragmente wurden mit Hilfe der T4 Ligase über Nacht bei 16°C ligiert und der generierte Vektor pQE100-mG6PI über einen Hitzeschock von 45s bei 42° C in den Bakterienstamm BL21(DE3) transformiert und auf Ampicillin-haltigen Agarplatten ausplattiert. Für die Ligation wurde folgender Ansatz benutzt:

 

Ligation von pQE100s und der mG6PI cDNA

 
 

pQE100S (HindIII/NdeI verdaut)

1µl Eluat

 
 

mG6PI cDNA (HindIII/NdeI verdaut)

4µl Eluat

 
 

T4 DNA Ligase

1 U

 
 

T4 10x Puffer

1µl

 
 

Aqua dest.

ad 10µl

 

Von 10 Kolonien wurden aus einer 3ml Kultur mit dem QIAprep® Miniprep Kit Plasmide isoliert und das ligierte cDNA Fragment über einen HindIII/NdeI Inkubation ausgeschnitten. Die Größe des Fragments wurde auf einem Agarosegel kontrolliert. Sowohl die für die Ex[Seite 30↓]pression von rhG6PI als auch von rmG6PI verwendeten Vektoren in dieser Arbeit wurden einer Doppelstrang-Sequenzierung durch die Firma AGOWA unterzogen. Der Vektor pQE100S-hG6PI wurde in der Diplomarbeit kloniert und lag daher schon vor.

3.2.2 Agarosegelelektrophorese

1g Agarose wurde mit 100ml TAE-Puffer versetzt und in der Mikrowelle für ca. 1min bei 600W aufgekocht. Nachdem die Agarose bis auf Handwärme abgekühlt war, wurden 5µl Ethidiumbromid (10mg/ml) zugesetzt und das Gel gegossen. Dabei wurde besonders darauf geachtet, dass keine Luftblasen entstanden. Die Proben wurden im Verhältnis 7:1 mit Probenpuffer versetzt, aufgetragen und bei 100V aufgetrennt. Als Laufpuffer diente wieder TAE-Puffer. Nach dem Lauf wurden die DNA-Fragmente durch UV-Licht sichtbar gemacht, bei Bedarf ausgeschnitten, dokumentiert und auf einem elektronischen Datenträger gesichert. Um die Größe der detektierten Banden bestimmen zu können, wurden zusätzlich immer auch ein Größenstandard auf das Gel aufgetragen.

3.3 Methoden der Proteinbiochemie

3.3.1 Aufreinigung der G6PI

Methode:Das im E.coli Stamm überexprimierte G6PI enthält am N-Terminus eine Markierung aus 6 Histidinresten. Diese Histidinreste koordinieren mit Ni2+, welches mit Säuren der Matrix koordiniert ist und einen Chelatkomplex bilden. Dadurch werden die mit Histidin markierten Proteine an die Matrix gebunden. Durch Erhöhung der Imidazolkonzentration im Elutionspuffer wird das Protein von der Säule verdrängt und kann eluiert werden.

Durchführung: Die gesamte Aufreinigung wurde auf Eis bzw. bei 4°C durchgeführt. Das Bakterienpellet der 2l Expressionskultur (siehe 3.1.2) wurde mit 20ml Lysispuffer resuspendiert. Anschließend wurden die Bakterien über eine french press aufgeschlossen. Das Lysat wurde für 1h bei 13000g und 4° C zentrifugiert, um die schweren Zellfragmente zu pelletieren. Der Überstand wurde auf 100ml mit Lysispuffer verdünnt und über eine mit Lysispuffer äquilibrierte Ni-NTA Säule (5ml) geben. Die gesamte Aufreinigung wurde mit einer Flussgeschwindigkeit von ca. 1 ml/min durchgeführt. Anschließend wurde die Säule mit 100ml Waschpuffer gewaschen. Die Elution erfolgte mit ca. 50ml Elutionspuffer. Das Eluat wurde über Nacht gegen PBS dialysiert. Die Proteinlösung im Dialyseschlauch wurde in PEG20000 eingelegt und dadurch aufkonzentriert. Die konzentrierte Proteinlösung wurde steril filtriert und die Konzentration über das BCATM Protein Assay Kit bestimmt. Die Reinheit der Präparation wurde in einem 12%igen SDS-Gel überprüft.


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3.3.2  IgG-Aufreinigung

Methode: Die Aufreinigung der IgG-Antikörper aus dem Serum von arthritischen Mäusen erfolgte über Affinitätschromatographie, wobei Protein G an die Säulenmatrix gebunden war. Protein G ist ein Zelloberflächenprotein aus Streptokokken der G-Klasse und hat eine hohe pH-abhängige Affinität zu murinen IgG-Antikörpern. Durch Absenken des pH-Wertes nimmt die Affinität ab und an Protein G gebundene Antikörper können eluiert werden.

Durchführung: Serum aus arthritischen Mäusen wurde gewonnen und gemischt. 15ml des Serums wurden bei 4°C für 30min bei 10000g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 150ml mit Bindungspuffer aufgefüllt und über eine mit 200ml Bindungspuffer äquilibrierte Sepharose Säule gegeben, die mit Protein G gekoppelt war. Die Säule wurde anschließend mit 200ml Bindungspuffer gewaschen. Die Elution erfolgte mit 0,1M Glycin pH 2,8 über eine automatisierte Antikörperreinigungsanlage, die über einen UV-Detektor und ein Schreibgerät verfügte. Das Eluat wurde sofort mit 1M Tris/HCl pH 9,0 neutralisiert, über Nacht gegen PBS dialysiert, mit PEG20000 aufkonzentriert und steril filtriert. Die Konzentration der Antikörper wurde über die Absorption bei 280nm photometrisch bestimmt.

3.3.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Reinheit der G6PI Aufreinigung sowie der kommerziellen G6PI Präparation aus dem Muskel der Kaninchen wurde über SDS-PAGE bestimmt. Die SDS-PAGE wurden zusätzlich für die Immunoblotanalyse der Patientenseren eingesetzt. Standardmäßig wurde ein 12%iges SDS-Polyacrylamidgel gegossen:

Trenngel 12%

 

Sammelgel 5%

30% Acrylamid/Bisacrylamid

8,0ml

 

30% Acrylamid/Bisacrylamid

0,83ml

Aqua dest.

6,6ml

 

Aqua dest.

3,4ml

1,5 M Tris pH 8,8

5,0ml

 

1,0 M Tris pH 6,8

0,63ml

10% SDS

0,2ml

 

10% SDS

0,05ml

10% APS

0,2ml

 

10% APS

0,05ml

TEMED

8µl

 

TEMED

5µl

Die Proteinproben (5-10µg) wurden im Verhältnis 1:3 mit reduzierenden Probenpuffer versetzt, für 5min bei 95° C denaturiert und anschließend aufgetragen. Um die Größe der Banden später bestimmen zu können, wurde zusätzlich ein Proteinstandard aufgetragen. Der Gellauf wurde bei 200V durchgeführt. Nachdem der Farbmarker das Gel verlassen hatte, wurde der Lauf gestoppt und die Gele über Nacht unter Schütteln mit einer Coomassie-Färbelösung an[Seite 32↓]gefärbt. Anschließend wurden die Gele kurz mit Wasser gespült und solange in Entfärberlösung geschüttelt bis das Ergebnis zufriedenstellend war. Die Gele wurden dokumentiert und auf einem elektronischem Datenträger festgehalten. Gele, die für die Immunoblots eingesetzt wurden, wurden nicht gefärbt.

3.3.4 Immunoblot

Die Proteine der rekombinanten humanen G6PI (rhG6PI) und der kommerziellen Kaninchen G6PI Präparation wurden über ein 12%iges SDS-Gel aufgetrennt (siehe 3.2.4). Die Proteine in diesem Gel wurden auf Nitrozellulosemembran transferiert. Dieser Transfer wurde in Transferpuffer in einem speziellen Transfereinsatz für die SDS-Gelkammer vorgenommen, in dem das Gel in direktem Kontakt zur Nitrozellulosemembran umgeben von Whatmanfilterpapieren stand. Der Transfer wurde für 1h bei 100V durchgeführt. Um den Erfolg des Transfers zu überprüfen, wurde die Membran mit Ponceau S angefärbt und die Markerbanden markiert. Um unspezifische Antikörperbindungen zu blockieren, wurde die Membran für eine Stunde mit 3% BSA in TBS Puffer unter Schütteln inkubiert und anschließend dreimal mit TBS/Tween-Puffer 10min bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend wurde die Membran für eine Stunde mit 1:200 verdünnten Patientenseren in TBS/BSA/Tween Puffer inkubiert und erneut dreimal mit TBS/Tween Puffer für 10 min gewaschen. Dann wurde die Membran mit 1:5000 verdünntem Ziege-anti-human-IgG Antikörper, der mit Peroxidase konjugiert war, in TBS/BSA/Tween Puffer für 1h bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal gewaschen. Die Membran wurde leicht angetrocknet. Dann wurde die Membran für ca. 1min in frisch angesetzte ECL-Detektionsreagenz eingelegt und anschließend vorsichtig in Folie eingewickelt. Die spezifische Bindung von IgG Antikörpern wurde in der Dunkelkammer nach Belichten und Entwickeln eines speziellen ECL-Films detektiert.

3.3.5 Enzymaktivität der G6PI

Methode: Die G6PI katalysiert die Umwandlung von Fruktose-6-phosphat zu Glukose-6-phosphat. Die Enzymaktivität der G6PI wurde indirekt über die Oxidation von Glukose-6-phosphat zu 6-Phosphoglukonat bestimmt. Diese Reaktion wird von der Glukose-6-phosphat Dehydrogenase katalysiert bei der gleichzeitig NAD zu NADH reduziert wird. Die Umwandlung von NAD zu NADH kann photometrisch bei 340nm verfolgt werden. Nach dem Gesetz von Lambert und Beer ist die Konzentrationsänderung von NADH proportional zur Absorptionsänderung. Dabei gilt dann:


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ΔcNADH= Konzentrationsänderung der NADH in mmol/l

d= Schichtdicke der Küvette in cm

ε= molarer Extinktionskoeffizient des NADH in

ΔA340nm= Absorptionsänderung bei 340nm pro Minute

Eine Einheit (U) ist dabei als die Enzymmenge definiert, die 1µmol Fruktose-6-phosphat zu Glukose-6-phosphat pro Minute bei 25°C umsetzt. Je nachdem, ob die U/ml Serum oder die U/mg Protein bestimmt werden sollten, musste die entsprechende Verdünnung des Serums oder eingesetzte Menge Enzym mit einberechnet werden.

Durchführung:Die Enzymaktivität der G6PI im Serum unterschiedlicher Mausstämme bzw. der rekombinant hergestellten Proteine wurde mit einem Phosphohexose Isomerase Kit ermittelt. Die Reaktionslösung wurde nach Angaben des Herstellers angesetzt und auf Raumtemperatur erwärmt. Zur Bestimmung der Enzymaktivität im Mausserum wurden 500µl der Reaktionslösung in eine Quarzküvette überführt. Der Beginn der Messung wurde durch Zugabe von 10µl Serum markiert. Anschließend wurde die Änderung der Absorption bei 340nm über 5min photometrisch verfolgt. Über die Zunahme der Absorption/min unter Berücksichtung der Verdünnung wurde die Enzymaktivität bestimmt. Zur Bestimmung der Enzymaktivität der rekombinanten G6PI wurde die G6PI mit PBS auf eine Konzentration von 6µg/ml gebracht. 666µl der Reaktionslösung wurden erneut in der Quarzküvette mit 22µl G6PI gemischt und die Absorption bei 340nm für 6min photometrisch verfolgt und die Enzymaktivität bestimmt.

3.3.6 MALDI-MS Analyse

Ein Protein der kommerziellen G6PI Präparation aus dem Muskel von Kaninchen wurde über das Massenspektrum des Proteins nach MALDI-MS (engl.: matrix assisted laser desorption-ionization mass spectometry) Analyse identifiziert. Die G6PI Präparation wurde über ein 12%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert (siehe 3.2.4 und 3.2.5). Die entsprechende Proteinbande im Gel bzw. auf der Membran wurde ausgeschnitten und der MALDI-MS Analyse zugeführt. Die gesamte weitere Aufarbeitung inklusive Trypsinverdau des Proteins, Aufnahme des Massenspektrums und Auswertung des PMF (engl.: peptide mass fingerprint) wurde von Monika Schmidt und Dr. Peter R. Jungblut am Max-Planck Institut für Infektionsbiologie in Berlin durchgeführt.


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3.4  Methoden der Zellbiologie

3.4.1 Zellkultur

Bei der Kultivierung von Zellen wurden bestimmte Verhaltensregeln beachtet, um steriles Arbeiten zu gewährleisten. Zur Gewinnung von Zellen aus der Milz und den Lymphknoten wurden die Scheren und Pinzetten für 5min abgekocht und anschließend in 70% Ethanol eingelegt. Sämtliche andere Geräte, Puffer und Medien wurden autoklaviert oder sterilfiltriert. Beim Umgang mit eukaryotischen Zellen wurde ausschließlich unter der Sterilbank gearbeitet. Die eukaryotischen Zellen wurden immer bei 37°C, einer Luftfeuchtigkeit von 95% sowie einer CO2 Konzentration von 5% mit Kulturmedium (KM) kultiviert.

3.4.2 Gewinnung von Zellen aus der Milz und den Lymphknoten

Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet. Bevor die Milz und Lymphknoten entnommen wurden, wurde der Körper der Maus mit 70% Ethanol besprüht. Anschließend wurden die Mäuse seziert und die Milz und die inguinalen Lymphknoten entnommen. Die Organe wurden in ein Organsieb überführt, mit Hilfe eines Stempels zerrieben und die Zellsuspension in Waschmedium (WM) überführt. Das Homogenat wurde nun bei 470g und 4°C für 5 min zentrifugiert. Das Pellet wurde resuspendiert und das Lymphknotenhomogenat mit KM aufgefüllt, durch ein 70µm Zellsieb gegeben und nach Zellzahlbestimmung in der Neubauer Zählkammer auf eine bestimmte Konzentration gebracht. Auch das Milzhomogenat wurde resuspendiert. Zusätzlich wurden jedoch die Erythrozyten durch Zugabe von 10 ml Lysispuffer und 8 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur lysiert. Während der Lyse wurde die Zellsuspension über ein 70 µm Zellsieb gegeben, um Zelldebris zu entfernen. Danach wurde die Lyse durch Zugabe von 30ml Waschmedium unterbrochen und die Zellsuspension erneut zentrifugiert. Das Zellpellet wurde resuspendiert und mit KM aufgefüllt.

3.4.3 Gewinnung von Zellen aus dem Blut

Blut wurde aus Mäusen gewonnen und in einem MiniCollect® Röhrchen gesammelt (siehe 3.5.3). Das Blut wurde in Polystyrenröhrchen überführt und mit 3ml Lysispuffer versetzt und für 8 min inkubiert, um die Erythrozyten zu lysieren. Anschließend wurden die Röhrchen mit PBA (PBS/BSA/Azid) aufgefüllt und für 5min bei 470g und 4°C zentrifugiert. Je nachdem, ob noch viele Erythrozyten im Pellet vorhanden waren, wurden die Zellen resuspendiert und erneut mit Lysispuffer versetzt und zentrifugiert. Die Zellen wurden anschließend einmal mit PBA gewaschen und konnten dann für die durchflusszytometrische Messung weiter verarbeitet werden.


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3.4.4  Proliferationstest

Mit Hilfe des Proliferationstestes kann festgestellt werden, ob Zellen einer Lymphknotensuspension nach Stimulation mit einem Antigen proliferieren. Die Proliferation der Zellen wird dabei über den 3H-Thymidineinbau verfolgt, der im β-Szintillationszähler gemessen werden kann. 2x105 Zellen der inguinalen Lymphknoten der untersuchten Mausstämme wurden in 200µl KM für 72h in den Mulden einer 96 Muldenplatte entweder mit 10µg/ml rhG6PI oder mit PBS bei 37°C im Inkubator stimuliert. Für die letzten 18h wurde der Kultur zusätzlich 1µCi 3H-Thymidin zugefügt und weiter bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden nun mit Hilfe eines Zellerntegerätes auf Szintillationsfilterplatten transferiert. Die Filterplatten wurden bei 65°C für 20 min getrocknet. Auf jeden Filter wurden 40 µl Szintillationsflüssigkeit pipettiert. Anschließend wurden die Filterplatten versiegelt und im β-Szintillationszähler für 1min / Filter gemessen. Die Proliferation wurde in Form des Stimulationsindex angegeben. Der Stimulationsindex ist der Quotient aus den gemessenen mittleren Dreifachmessungen nach Restimulation mit rhG6PI und den gemessenen mittleren Dreifachmessungen der unstimulierten mit PBS kultivierten Kultur.

3.4.5 Komplementaktivitätstest

Beim Komplementaktivitätstest wurde die Fähigkeit des murinen Serums zur Lyse sensitivierter Erythrozyten aus dem Schaf nach Depletion des Komplementproteins C5 untersucht. Die zu testenden Seren behandelter und unbehandelter Mäuse wurden 1:10 in GVB2+ Puffer verdünnt. Für die Lyse wurde auch humanes Serum benötigt. Da der Erfolg der C5 Depletion untersucht wurde, wurde C5 defizientes humanes Serum verwendet und 1:10 in GVB2+ Puffer verdünnt. Pro Messung wurden als Dreifachbestimmung 50µl einer Suspension aus sensitivierten Schafserythrozyten wurde in eine Mulde einer rundbodigen 96-Muldenplatte überführt. Zusätzlich wurden zu den 50µl der Erythrozyten je 25µl des verdünnten murinen Serums als auch des verdünnten humanen Serums zugegeben. Zur Kontrolle wurden die murinen und das humane Serum auch einzeln zu den Erythrozyten gegeben und auf 100µl mit GVB2+ aufgefüllt. Um die Hintergrundlyse zu bestimmen, wurden die Erythrozyten ausschließlich mit GVB2+ auf 100µl aufgefüllt. Für die maximale Lyse wurden die Erythrozyten mit 50µl NP-40 (0,1%) gemischt. Anschließend wurde die Platte für 45min bei 37°C im Inkubator inkubiert und dann für 10min bei 800g zentrifugiert. 50µl des Überstandes wurden abgenommen und bei 415nm photometrisch vermessen. Die Lyse berechnete sich wie folgt:

 

 


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3.4.6  ELISA

Methode: Antikörper, die spezifisch für ein Antigen sind, können über einen ELISA (engl.: enzyme linked immunosorbent assay) detektiert werden. Beim ELISA wird das nachzuweisende Antigen an die Matrix einer speziellen 96-Muldenplatte gebunden. Antikörper aus Serum, die das Antigen spezifisch binden, verbleiben auf der Platte. Der Nachweis dieser Bindung erfolgt über einen zweiten Antikörper, der spezifisch Antikörper eines Isotyps einer Spezies erkennt und mit Biotin oder direkt mit einer Meerrettich-Peroxidase konjugiert ist. Biotin besitzt eine hohe Bindungsaffinität zu Streptavidin, das an eine Meerrettich-Peroxidase gekoppelt vorlag. Diese Peroxidase katalysiert die Reaktion von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff in Gegenwart des Elektronendonors Tetramethylbenzidin (TMB). Der Elektronendonor wird bei dieser Reaktion oxidiert, was durch einen Farbumschlag sichtbar wird.

 

TMB (reduzierte Form)

 

TMB + 4e- (blau)

 
      
 

2 H2O2 + 4e

 

4 H2O + O2

 

Insgesamt wurden unterschiedliche ELISA in dieser Arbeit durchgeführt. Bei allen ist der allgemeine Ablauf gleich gewesen. Daher folgt erst eine Beschreibung der mit Mausserum durchgeführten G6PI ELISA. Anschließend wird auf die unterschiedlichen Antigene und Besonderheiten bei der Durchführung der anderen ELISA eingegangen.

Durchführung: 100 µl der rhG6PI oder rmG6PI (5µg/ml) in PBS (Beschichtungslösung) wurde in jede Mulde einer 96-Muldenplatte für ELISA überführt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Lösung wurde dann ausgeschüttelt und die Platten auf Zellstoff kurz abgeklopft. Unspezifische Bindungen wurden danach durch Zugabe von 100 µl Blockierungspuffer (PBS/BSA) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer gewaschen und mit 100µl Serum in unterschiedlichen Verdünnungen (1:100 – 1:409.600) als Tripletts in PBT (PBS/BSA/Tween) inkubiert. Nach 1h wurden die Platten erneut dreimal gewaschen. Zur Detektion wurden die Platten mit 100 µl eines Ziege-anti-Maus-IgG Antikörpers in PBT inkubiert. Dieser Antikörper war entweder direkt mit einer Peroxidase konjugiert (Verdünnung 1:1.000) oder mit Biotin (Verdünnung 1:500) gekoppelt. Im Fall des biotinylierten Antikörpers wurde die Platte erneut gewaschen und mit 100µl ExtrAvidin® (dem Streptavidin-Peroxidase-Komplex) in PBT bei einer Verdünnung von 1:1.000 für 30 min inkubiert. Der Farbreaktion erfolgte nach gründlichem Wa[Seite 37↓]schen durch Zugabe von 100µl einer frisch hergestellten Lösung aus 10 ml TMB-Puffer pro Tablette TMB und 4 µl 30%igem H2O2. Die Farbreaktion wurde durch Zugabe von 50µl 12,5%iger H2SO4 gestoppt, nachdem die Negativkontrolle anfing, blau zu werden. Durch Zugabe von H2SO4 erfolget ein Farbumschlag von blau zu gelb und die Absorption wurde in einem ELISA-Meßgerät bei 450 nm bestimmt.

Isotypspezifischer ELISA gegen rhG6PI mit murinen Seren:

Die ELISA Platten wurden mit rhG6PI (5µg/ml) in PBS beschichtet. Das Mausserum wurde seriell von 1:100 – 1:409.600 verdünnt. Für die Detektion der unterschiedlichen Isotypen wurden die Platten mit Ziege-anti-Maus-IgG1, -IgG2a, -IgG2b, -IgG3 und IgM Antikörpern (1:1.000) in PBT inkubiert. Die Bindung der isotypspezifischen Antikörper wurde mit einem Peroxidase-gekoppelten Esel-anti-Ziege-IgG Antikörper (1:3.000) in PBT detektiert.

G6PI und Kreatinkinase M-Kette (CK-M) ELISA mit humanem Serum:

Die ELISA Platten wurden mit rhG6PI, kommerziellen Kaninchen G6PI oder kommerzieller Kreatinkinase M-Kette in PBS inkubiert. Die Proteinlösung hatte dabei eine Konzentration von 5µg/ml. Die eingesetzten humanen Seren waren 1:50 in PBT verdünnt. Die Detektion erfolgte mit einem Peroxidase gekoppelten Ziege-anti-human-IgG Sekundärantikörper, der 1:5.000 in PBT verdünnt wurde.

Kollagen II ELISA mit Mausserum:

Die ELISA Platten wurden mit murinem Kollagen II (4µg/ml) in PBS beschichtet. Die Seren wurden seriell von 1:100 – 1:409.600 in PBT verdünnt. Die Detektion erfolgte mit einem Peroxidase-gekoppelten Ziege-anti-Maus-IgG Sekundärantikörper, der 1:1.000 in PBT verdünnt wurde.

Rheumafaktoren (anti-IgG-Maus-IgM)

Die ELISA Platten wurden mit murinem IgG (2µg/ml) in PBS beschichtet. Die Seren wurden seriell von 1:100 – 1:6.400 in PBT verdünnt. Die Detektion erfolgte mit einem Peroxidase-gekoppelten Ziege-anti-Maus-IgM Sekundärantikörper, der 1:5.000 in PBT verdünnt wurde.

anti-dsDNA- ELISA

Die ELISA Platten wurden zuerst für 24h mit PBS/BSA (1mg/ml) bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit doppelsträngiger DNA (10µg/ml) in PBS für weitere 24h [Seite 38↓]beschichtet. Die Seren wurden seriell von 1:100 – 1:6.400 in PBT verdünnt. Die Detektion erfolgte mit einem Peroxidase-gekoppelten Ziege-anti-Maus-IgG Sekundärantikörper, der 1:1.000 in PBT verdünnt wurde.

3.4.7 Durchflusszytometrie

3.4.7.1 Methode

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie können Zellen aufgrund der Expression von Oberflächenmolekülen oder Zytokinen unterschieden und getrennt werden. Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte monoklonale Antikörper gegen verschiedenen Oberflächenproteine oder Zytokine werden für die Markierung der Zellen eingesetzt. Bei der Analyse sind die Zellen umgeben von einem Flüssigkeitströpfchen und passieren einen fokussierten Laserstrahl. Das von den Zellen in Richtung des Laserstrahls gestreute Licht wird als sogenanntes Vorwärtsstreulicht (engl.: forward scatter FSC) gemessen. Das hinter dem Strahl gemessene Licht ist das Seitenstreulicht (engl.: side scatter SSC) und das emittierte Fluoreszenzlicht der Antikörper-Fluoreszenz-Konjugate. Das Fluoreszenzlicht der verschiedenen Fluorochrome wird durch optische Filter nach Wellenlängen getrennt und von Lichtsensoren verarbeitet. Insgesamt können von dem Messgerät 6 Parameter gleichzeitig bestimmt werden. Über das Vorwärtsstreulicht und Seitenstreulicht werden Aussagen über die Größe und Granularität gemacht. Der in dieser Studie verwendete FACSCalibur kann zusätzlich noch 4 Fluoreszenzfarbstoffe analysieren. Die Fluoreszenzintensität 1 (FL1) ist proportional zur Intensität der Anfärbung mit Fluorescein Isothiocyanat (FITC). FITC hat ein Absorptionsmaximum bei 495 nm und eine Emissionsmaximum bei 519 nm. FL2 ist proportional zur Anfärbung mit R-Phycoerythrin (PE), welches ein Absorptionsmaximum bei 498 nm und Emissionsmaximum bei 578 nm hat. FL3 ist proportional zur Anfärbung mit Peridinin-Chlorophyll (PerCP), welches ein Absorptionsmaximum bei 490 nm und Emissionsmaximum bei 675 nm hat. FL4 ist proportional zur Anfärbung mit Indodicarbocyanin (Cy5), welches ein Absorptionsmaximum bei 650 nm und Emissionsmaximum bei 670 nm hat. Dieser Farbstoff wird mit einem zusätzlichen Laserstrahl angeregt.

3.4.7.2 Oberflächenfärbung

Die gesamte Vorbereitung und Markierung von Zellen mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern wurde in FACS-Puffer (PBA) auf Eis durchgeführt. Die Markierung der Zellen wurde in 100µl PBA durchgeführt. Je nach Anwendung wurden bis maximal 1x107 Zellen in ein Polystyrenröhrchen überführt. Anschließend wurde die Röhrchen mit PBA aufgefüllt [Seite 39↓]und bei 4°C und 470g für 5min zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch einmal wiederholt. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in dem Restvolumen von ca. 70µl resuspendiert. Um die unspezifische Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren zu verhindern, wurden die Zellen mit Ratten IgG und antiCD16/CD32 in PBA für 10min inkubiert. Anschließend wurden die Detektionsantikörper in PBA für weitere 10min zugefügt. Die Konzentration der eingesetzten Antikörper wurde zuvor austitriert, betrug aber ca. 1µg pro Färbung. Danach wurden die Zellen mit PBA gewaschen und, wenn nötig, für weitere 10min in 100µl mit einem streptavidinkonjugierten Farbstoff inkubiert und dann gewaschen. Die Zellen wurden dann in 100 bis 300µl PBA aufgenommen, bei Bedarf mit Propidiumiodid versetzt, um die toten Zellen ausschließen zu können, und am FACSCalibur analysiert. Die Auswertung wurde mit dem Programm FCSExpress durchgeführt.

3.4.7.3 Intrazelluläre Färbung muriner Zellen

Vor der intrazellulären Färbung der Zytokine wurden 3x106 Zellen aus den inguinalen Lymphknoten und der Milz 6 Stunden mit 10µg/ml rhG6PI in 1ml KM restimuliert. Nach 2 Stunden wurden die Zytokinsekretion durch Zugabe von 5 µg/ml Brefeldin A gestoppt. Neben den mit Antigen stimulierten Zellen wurden als Positivkontrolle auch Zellen mit 5 ng/ml PMA und 1 µg/ml Ionomycin stimuliert. Nach der Stimulation wurde die Zellsuspension in Polystyrenröhrchen überführt, gewaschen und gegen CD4 gefärbt. Bevor die Zellen intrazellulär angefärbt werden konnten, mussten sie fixiert werden. Dazu wurden die Zellen einmal mit PBA und anschließend mit PBS gewaschen. Nachdem der Überstand verworfen wurde und das Pellet resuspendiert wurde, wurden die Zellen in 500µl 2% PFA für 20 min bei Raumtemperatur fixiert. Durch Zugabe von 500µl PBA wurde die Fixierung gestoppt. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBA gewaschen und konnten über Nacht bei 4°C gelagert werden. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit dem Sekundärfarbstoff SA-PerCP angefärbt und schließlich gewaschen. Danach wurden die Zellen mit Saponinpuffer gewaschen, der die Zellmembran permeabilisiert. Die Zellen wurden mit den entsprechenden Detektionsantikörpern in Saponinpuffer für 10min markiert und anschließend zweimal mit Saponinpuffer und einmal mit PBA gewaschen. Die Zellen wurden dann in 300µl PBA aufgenommen und am FACSCalibur analysiert.

3.4.7.4 Intrazelluläre Färbung humaner Zellen

1 ml heparinisiertes Blut oder 1x106 mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC) wurden für 6 Stunden mit 1µg/ml anti-CD28 und zusätzlich mit 1µg/ml des Superantigens SEB als Positivkontrolle, 10µg/ml rhG6PI und 10µg/ml bzw. 44µg/ml der irrelevanten Anti[Seite 40↓]gene Hühner-Ovalbumin bzw. rekombinantes Histidin-markiertes OspA (outer surface protein A) der Spirochete Borrelia burgdorferi in Polypropylenröhrchen restimuliert. Nach 6h wurde 100µl eiskaltes 2mM EDTA in PBS zu den Zellen gegeben und für 15min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Erythrozyten, sofern erforderlich, für 10min mit 9ml FACS Lysing Lösung lysiert. Dann wurden die Zellen bei Raumtemperatur mit 500g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde resuspendiert und die Zellen mit 500µl Perm buffer II® für 10min fixiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBA gewaschen und mit den Detektionsantikörpern in PBA gefärbt. Zur Vermeidung unspezifischer Bindungen der Detektionsantikörper an Fc-Rezeptoren wurden die Zellen gleichzeitig auch mit Beriglobin inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und wie beschrieben analysiert.

3.4.7.5 Färbung mit CFDA-SE

Um die Proliferation von stimulierten Lymphknotenzellsuspensionen zu verfolgen, wurde der Farbstoff CFDA-SE eingesetzt. CFDA-SE (5-(6) Carboxyflourescein Diacetat, succinimidyl Ester) ist ein nichtpolarer Farbstoff, der durch die Zellmembran in das Zellinnere eindringt und dort durch zelleigene Esterasen aktiviert wird und grün fluoresziert. Außerdem kann CFDA-SE mit freien Amingruppen reagieren und bleibt dadurch dauerhaft in den Zellen. Nach einer Zellteilung verteilt sich das CFDA-SE zu gleichen Teilen auf die Tochterzellen, wodurch die Fluoreszenzintensität zur Hälfte abnimmt. 2x107 Zellen der inguinalen Lymphknoten wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in einem Volumen von 2 ml in PBS resuspendiert. Danach wurden die Zellen 1:1000 mit der 5µM CFDA-SE Lösung versetzt und für genau 4 min bei Raumtemperatur bei dreimaligem Schwenken inkubiert. Die Reaktion wurde durch dreimaliges Waschen mit Kulturmedium gestoppt. Anschließend wurden 2x106 Zellen in 1ml Kulturmedium ausplattiert und mit 10µg/ml rhG6PI oder rmG6PI für drei Tage restimuliert. Zur FACS-Analyse wurden die Zellen mit Antikörpern gegen das Oberflächenprotein CD4 gefärbt und analysiert.

3.5 Tierversuche

3.5.1 Genotypisierung der Fcγ-Rezeptor defizienten Mäuse

Für die Genotypisierung der Fcγ-RIIB-/- DBA/1 und FcR-γ-/- DBA/1 Mäuse wurde den Mäusen ca. 0,5cm des Schwanzendes abgeschnitten. Aus diesen Schwanzproben wurde die genomische DNS isoliert. Dazu wurden die Proben über Nacht bei 55°C mit 300µl eines Proteinase K haltigen Verdauungspuffers inkubiert. Zu den verdauten Proben wurde 300µl Rotiphenol [Seite 41↓]gegeben, vorsichtig gemischt und für 5min bei 16.000g zentrifugiert. 150µl der wässrigen Phase wurden abgenommen und die darin enthaltene DNS durch Zugabe von 300µl Ethanol und 90µl Natriumacetat gefällt und für 20min bei 16.000g pelletiert. Anschließend wurde das Pellet mit 500µl 70%igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 150µl destilliertem Wasser resuspendiert. Mit der gewonnenen DNS wurde folgende PCR durchgeführt:

Fc γ RIIB -/- PCR

 

FcR- γ -/- PCR

10x Puffer

2µl

 

10x Puffer

2µl

Primer Neo

0,22 µM

 

Primer Neo

0,22 µM

Primer 5´EC1

0,22 µM

 

Primer OL4087

0,22 µM

Primer 3´EC1

0,22 µM

 

Primer OL4081

0,22 µM

MgCl2

4,4 mM

 

MgCl2

4,4 mM

dNTP´s

0,2 mM

 

dNTP´s

0,2 mM

Taq Polymerase

1 U

 

Taq Polymerase

1 U

DNA

0,5 µl

 

DNA

0,5 µl

aqua dest.

ad 20 µl

 

aqua dest.

ad 20 µl

 

PCR-Programm

   
 

94°C

4 min

   
 

94°C

30s

  
 

60°C

30s

30 Zyklen

 
 

72°C

40s

  
 

72°C

10 min

   
 

4°C

   

Das PCR Produkt wurde auf einem 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt und die Banden unter dem UV-Licht detektiert. Folgende Banden wurden erwartet:

Fc γ -RIIB -/- DBA/1:

wt:

161 Bp

 

-/-:

232 Bp

   

FcR-y -/-  :

wt:

224 Bp

 

-/-

302 Bp

3.5.2 Immunisierung

Für die Immunisierung wurde eine Emulsion aus komplettem Freundschen Adjuvans (CFA) und der Proteinlösung mit rhG6PI, rmG6PI oder kommerziellen Kaninchen G6PI hergestellt. Für die Immunisierung wurde die Proteinlösung mit PBS verdünnt und mit dem gleichen Vo[Seite 42↓]lumen CFA in einem 2ml Eppendorfgefäß gemischt. Bei Immunisierung mit denaturierter rhG6PI wurde die Proteinlösung zuvor noch für 5min bei 95°C gekocht und anschließend wieder auf 4°C abgekühlt. Das Gemisch mit zwei Phasen wurde für einige Sekunden mit Ultraschall behandelt, bis eine weiße, feste Emulsion entstand. Diese Emulsion wurde luftblasenfrei in eine Spritze aufgezogen. Je 100µl der Emulsion wurden links und rechts an der Schwanzbasis subkutan injiziert. Der Ort der Injektion wurde vorher mit 70%igem Ethanol vorsichtig desinfiziert. Die Mäuse wurden mit 200-500µg Protein immunisiert. Zur Kontrolle wurden einige Mäuse auch nur mit PBS in CFA immunisiert. Nach der Immunisierung wurden die Mäuse in den Käfig zurückgesetzt und so lange beobachtet bis die Vitalitätszeichen dem Normalzustand entsprachen.

3.5.3 Serum- und Blutgewinnung

Zur Serumgewinnung wurde die Schwanzvene der Mäuse punktiert und Blut gewonnen. Dazu wurden die Mäuse für kurze Zeit mit Rotlicht bestrahlt, um eine stärkere Durchblutung der Schwanzvene zu erreichen. Anschließend wurden sie in eine Kiste gesetzt, die die Mäuse in ihren Bewegungen einschränkt. Durch eine kleine Öffnung ragte der Schwanz. Die Schwanzvene wurde in der Nähe der Schwanzbasis vorsichtig mit dem Skalpell punktiert. Der Maus wurden somit zwischen 3-5 Tropfen Blut entnommen. Sollten die Zellen aus dem Blut durchflusszytometrisch untersucht werden, wurde das Blut in MiniCollect® Röhrchen gesammelt, welche eine EDTA-Lösung enthielten und dadurch die Gerinnung des Blutes verhinderten. Anschließend wurde die Punktion vorsichtig mit einem Papiertuch abgewischt und die Maus in den Käfig zurückgesetzt. Sie wurde dort so lange beobachtet, bis die Blutung vollständig zum Stillstand kam. Das Blut wurde für 30 min bei Raumtemperatur zur Gerinnung stehen gelassen und anschließend für 10 min bei 10.000g in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und bei –20°C weggefroren.

3.5.4 Intraperitoneale Injektionen

Für die intraperitoneale Injektion wurde die entsprechende Menge an Antikörpern oder dem löslichen dimeren TNF-Rezeptor (sTNFR-p75) in 200µl sterilem PBS verdünnt. Bei der Depletion der CD4+ Zellen bzw. der CD4+CD25+ Zellenwurden 300µg des depletierenden anti-Maus-CD4 Antikörper YTS191.1 bzw. 400µg des anti-Maus-CD25 Antikörpers pC61.5 bei jeder Gabe injiziert. Die Depletion des Komplementproteins C5 wurde mit 750µg des Antikörpers BB5.1 durchgeführt und die Behandlung mit sTNFR-p75 erfolgte mit 100µg. Die Lösungen in PBS wurden blasenfrei in eine Insulinspritze aufgezogen, die schon mit einer dünnen Kanüle versehen war. Die Maus wurde am Nacken und Rücken so gefasst, dass sie in [Seite 43↓]ihrer Bewegung eingeschränkt war. Anschließend wurden 200µl der Lösung vorsichtig in das Peritoneum injiziert. Nach der Injektion wurden die Mäuse in den Käfig zurückgesetzt und so lange beobachtet bis die Vitalitätszeichen dem Normalzustand entsprachen. Die Effizienz der Depletion wurde bei der Depletion der CD4+ bzw. CD4+CD25+ Zellen durchflusszytometrisch kontrolliert und bei der Inhibition der Komplementkaskade durch den Komplementaktivitätstest.

3.5.5 Histologie

Für die histologische Untersuchung wurden die Mäuse an den entsprechenden Tagen durch zervikale Dislokation getötet. Die Tiere wurden mit 70%igen Ethanol eingesprüht und anschließend seziert. Dabei wurden zuerst die inneren Organe, anschließend die Vorder- und Hinterpfoten und zuletzt die Wirbelsäule präpariert. Von den Vorder- und Hinterpfoten wurde zusätzlich das Fell entfernt, da es bei der weiteren Aufarbeitung störte. Alle Organe, Pfoten und die Wirbelsäule wurden in eine 10%ige Formalinlösung überführt und für mindestens eine Woche fixiert. Die gesamte weitere Aufarbeitung wurde von Frau Gabriele Fernahl und Frau Janine Karle in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Veit Krenn am Institut für Pathologie der Charité in Berlin durchgeführt. Dort wurden die Hämatoxylin und Eosin gefärbten Gewebeschnitte von Dr. Lars Morawietz oder Prof. Dr. Veit Krenn begutachtet und bewertet.


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24.06.2005