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5  Diskussion

In dieser Arbeit wurden die arthritogene Rolle der Glukose-6-phosphat Isomerase (G6PI) in der Maus und die Relevanz der G6PI bei der Pathogenese der humanen rheumatoiden Arthritis untersucht. Im ersten Teil der Arbeit stand die Rolle der G6PI bei der Pathogenese der RA im Vordergrund. Bisher beschränkte sich die Suche nach Autoantigenen bei RA vor allem auf organspezifische, also gelenkspezifische, Autoantigene. DBA/1 Mäuse entwickeln eine symmetrische Polyarthritis nach Immunisierung mit G6PI. Damit konnte hier zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine Immunisierung mit einem systemischen Antigen eine organspezifische Erkrankung in normalen nicht-transgenen Mäusen induziert. Dieses Modell schließt die Lücke zwischen dem transgenen K/BxN-Modell und der komplexen humanen Situation. Außerdem unterscheidet sich das G6PI-induzierte Arthritismodell in einigen Punkten deutlich von der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA) und vom K/BxN-Modell. Die Untersuchung der Pathogenese der G6PI-induzierten Arthritis könnte neue Anhaltspunkte für das Verständnis der Pathogenese der RA liefern.

5.1 Die Rolle von G6PI als Autoantigen in RA

5.1.1 Die Rolle der CD4+ T-Zellen

Es gibt viele Hinweise darauf, dass CD4+ T-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der RA spielen, z.B. aufgrund der Prädisposition durch bestimmte MHC-II Allele. Therapeutisch wird gerade damit begonnen, Patienten mit RA mit einem CTLA-4-Ig Fusionsprotein zu behandeln, welches verhindert, dass T-Zellen ein kostimulatorisches Signal bekommen (Kremer et al. (2003), Moreland et al. (2002)). Mäuse mit einer Mutation in der SH2-Domäne von ZAP-70, einem wichtigen Molekül bei der Signaltransduktion in T-Zellen, entwickeln spontan eine schwere Arthritis (Sakaguchi et al. (2003)). Obwohl klar ist, dass CD4+ T-Zellen eine Rolle bei der Pathogenese der RA spielen, konnte noch kein Autoantigen identifiziert werden, für das eine klare pathogenetische Beteiligung bei der Entwicklung der RA bewiesen werden konnte. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob Patienten eine erhöhte Frequenz autoreaktiver G6PI spezifischer CD4+ T-Zellen besitzen. Sollte eine erhöhte Frequenz dieser Zellen vorhanden sein, so müsste in einem nächsten Schritt deren Beteiligung an der Pathogenese untersucht werden. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass Patienten mit RA vorwiegend das Th1 spezifische Zytokin IFN-γ produzieren (Dolhain et al. (1996), Morita et al. (1998)). Weiterhin konnte in den T-Zellen von RA-Patienten in der Synovialflüs[Seite 99↓]sigkeit auch TNF-α detektiert werden (Steiner et al. (1999)). Deshalb wurden CD4+ T-Zellen mit rhG6PI und anderen Antigenen restimuliert und die Produktion von TNF-α und IFN-γ über durchflusszytometrische Analysen bestimmt. Das Staphylokokken Enterotoxin B (SEB) wurde als Positivkontrolle gewählt. Als Negativkontrollen wurden die irrelevanten Antigene Ovalbumin (Ova) und das rekombinante und histidinmarkierte outer surface protein A (OspA) von Borrelia burgdorferi verwendet. Die Verwendung der irrelevanten Antigene diente dazu, die Hintergrundproduktion der Zytokine in den CD4+ T-Zellen zu messen und den Einfluss von mikrobiellen Rückständen bzw. der Histidinmarkierung auszuschließen. Wie die Ergebnisse in Kapitel 4.1.1 zeigen, produzierten sowohl die RA-Patienten als auch die gesunden Spender kaum TNF-α oder INF-γ nach Restimulation mit rhG6PI, Ova und OspA. Die Restimulation mit SEB zeigt jedoch, dass das Experiment an sich funktioniert, da dort hohe Zytokinantworten zu messen waren. Die Unterschiede in der Zytokinproduktion zwischen RA-Patienten und gesunden Spendern ist in keiner Gruppe signifikant unterschiedlich. Aus diesen Ergebnissen könnte der Schluss gezogen werden, dass es keine G6PI-spezifischen CD4+ T-Zellen in den Patienten mit RA gibt. Es müssen jedoch zusätzliche Faktoren in Betracht gezogen werden. Zum Einen wurden bisher nur die Zytokine INF-γ und TNF-α untersucht. Wenn eine G6PI assoziierte RA jedoch nur eine kleine Subpopulation von RA-Patienten betrifft, so könnten in dieser Subpopulation auch andere Zytokine, wie zum Beispiel IL-4, eine Rolle spielen. Das K/BxN-Modell für RA ist ein antikörpervermitteltes Modell. IL-4 spielt bei B-zellvermittelten Immunantworten eine große Rolle. Es ist daher durchaus möglich, dass die CD4+ T-Zellen der RA-Patienten, wo G6PI als Autoantigen fungiert, eher mit Th2 assoziierten Zytokinen wie IL-4 antworten. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Gewinnung der T-Zellen. In den hier beschriebenen Experimenten wurden Zellen verwendet, die aus dem Blut stammen. Es ist durchaus denkbar, dass die autoreaktiven CD4+ T-Zellen schon an den Ort der Entzündung ins Gelenk migriert sind. Weiterhin muss auch bedacht werden, dass die untersuchten Patienten sich in Therapie befanden. Da keine detaillierten Informationen über den Behandlungsstatus der Patienten bei Verwendung des Blutes vorlag, kann nicht ausgeschlossen werden, dass einige dieser Patienten auch mit stark immunsupprimierenden Therapeutika, wie z.B. Glukokortikoiden behandelt wurden und daher nur geringe Mengen der Zytokine gemessen werden konnten. SEB dagegen ist so ein starker Stimulus für die Zellen, dass eine Schwelle überschritten wird, die diese Zellen dann doch noch antworten lässt. Möglicherweise liegen die CD4+ T-Zellen auch in einem anergen oder zumindest partiell tolerantem Zustand vor. Es konnte schon früher beobachtet werden, dass CD4+ T-Zellen aus dem Blut von RA-Patienten nur schlecht mit Antigenen restimuliert werden können, gegen die es schon [Seite 100↓]einmal zu einer Immunreaktion, z.B. in Form einer Influenza oder Herpes simplex Infektion, gekommen war (Verwilghen et al. (1990)). In T-Zellen im Synovium von RA-Patienten konnte auch die Expression von Genen beobachtet werden, die relevant für Anergie sind (Ali et al. (2001)), sowie eine verminderte Expression der Antioxidantie Glutathion, was eine Störung des Redoxgleichgewichtes hervorruft und dadurch für eine verminderte Aktivierbarkeit der T-Zellen verantwortlich ist (Maurice et al. (1997)). In einem transgenen Mausmodell, wo das endogene Kollagen II so mutiert wurde, dass es dem Ratten Kollagen II entsprach, konnte gezeigt werden, dass die CD4+ T-Zellen nach Immunisierung mit Ratten Kollagen II zwar noch IFN-γ produzieren, auch eine Kollagen-induzierte Arthritis entwickeln, aber nicht mehr so stark proliferieren. In diesem Modell kam es zu einer partiellen Tolerisierung gegen das Kollagen II (Malmstrom et al. (1996)). Es wird spekuliert, dass CD4+ T-Zellen hauptsächlich an der Initiation beteiligt sind (Firestein und Zvaifler (1990)) und später möglicherweise in einen anergen und toleranten Zustand übergehen. Die oben erwähnten Studien, bei der das CTLA-4-Ig Fusionsprotein, welches auf T-Zellen wirkt und bei der Therapie von RA eingesetzt wird, widersprechen dieser Theorie.

5.1.2 Die Rolle der B-Zellen und anti-G6PI Antikörper

Neben den T-Zellen wird auch den B-Zellen und den von ihnen produzierten Autoantikörpern bei der Pathogenese der RA eine große Rolle zugeschrieben. Hauptsächlich rührt dies daher, dass mehr als zwei Drittel der RA-Patienten die sogenannten Rheumafaktoren (RF) entwickeln (Dorner et al. (2004)). Neben den RF konnten noch zahlreiche andere Autoantikörper identifiziert werden, deren Beteiligung an der Pathogenese von RA bisher aber nicht bewiesen werden konnte (Smolen und Steiner (1998)). Hier wurde untersucht, ob Patienten mit RA Autoantikörper gegen G6PI produzieren. Bei der Untersuchung von Seren von RA-Patienten und Patienten mit anderen rheumatischen Erkrankungen konnten keine signifikanten Unterschiede zu den gesunden Spendern festgestellt werden. Erhöhte anti-G6PI Titer konnten nur in sehr wenigen Patienten aber auch in gesunden Spendern detektiert werden (Kapitel 4.1.2). Dieses Ergebnis lässt den Schluss zu, dass anti-G6PI Antikörper im Serum nicht vorhanden sind. Weiterhin stellt diese Arbeit einen starken Kontrast zu zwei Studien dar, die behaupten, dass 64% bzw. 45% der RA-Patienten einen erhöhten Titer gegen G6PI entwickeln (Jouen et al. (2004), Schaller et al. (2001)). Das G6PI, welches in diesen Studien verwendet wurde, stammt aus dem Kaninchen Muskel und ist kommerziell bei Sigma erhältlich. Sowohl in der Studie von Schaller et al. als auch in dieser Arbeit wurde eine Verdünnung des Serums von 1:50 verwendet. Damit ist das Serum sehr stark konzentriert, und es besteht leicht die Gefahr, [Seite 101↓]das aufgrund von unspezifischen Bindungen Falschpositive Resultate erzielt werden. Da die Ergebnisse so stark variierten, war die Frage, ob das in dieser Arbeit verwendete G6PI möglicherweise nicht richtig gefaltet war, da es rekombinant in Bakterien hergestellt und histidinmarkiert vorlag und aufgrund von Konformationsunterschieden nicht von den anti-G6PI Antikörpern erkannt wurde. Da das rhG6PI aber enzymatisch aktiv war, kann davon ausgegangen werden, dass die Konformation dem endogenen humanen G6PI entspricht. Auch eine falsche Versuchsdurchführung scheidet aus, da unter Verwendung des kommerziellen Kaninchen G6PI auch in dieser Studie erhöhte Titer gegen G6PI in Patienten nicht aber in gesunden Patienten gemessen werden konnten. Der Unterschied musste daher an den unterschiedlichen Präparationen liegen. Wie die Auftrennung beider Präparationen im SDS-Gel zeigte (Kap. 4.1.3), wies die Kaninchen G6PI Präparation mehrere kontaminierende Banden auf. Im Immunoblot zeigten einige der gegen das Kaninchen G6PI positiv getesteten Seren eine Bindung an ein Protein bei 40 kDa. Dieses Protein konnte in der MALDI-MS Analyse als die M-Kette der Kreatinkinase (CK-M) identifiziert werden und stellt ein neues potentielles Autoantigen in RA da (Kap. 4.1.3 und Kap. 4.1.4). Die Hauptquelle der Kreatinkinase, der Muskel, deutet jedoch nicht daraufhin, dass dieses Antigen bei der Entstehung der RA eine Rolle spielen kann, und es ist fraglich, ob sie auch im Gelenk zu finden ist. Trotzdem besteht die Möglichkeit, dass sich Immunkomplexe aus CK-M und Antikörpern bilden, die sich im Gelenk ablagern und dadurch pathogen sind. In der Literatur ist beschrieben, dass die CK Aktivität im Serum bei Patienten mit RA oder SLE reduziert ist (Lee et al. (2000), Sanmarti et al. (1996)). Möglicherweise beruht dieser Effekt auf der Bildung von Immunkomplexen, so dass die CK nicht mehr zur Verfügung steht. Ob tatsächlich auch einige Patienten G6PI erkannten, war im Immunoblot nicht zu beurteilen, da nur lineare Epitope detektiert werden konnten. Auch in anderen Studien konnten keine erhöhten Antikörpertiter gegen G6PI in einer Mehrzahl der RA-Patienten nachgewiesen werden (Herve et al. (2003), Kassahn et al. (2002), Matsumoto et al. (2003)). In unserer und in einer anderen Gruppe konnte zudem gezeigt werden, dass Antikörper gegen G6PI auch nicht in Patienten mit juveniler Arthritis auftreten (Schepp et al. (2004), Schmitt et al. (2004)). Es ist nicht auszuschließen, dass anti-G6PI Antikörper hauptsächlich im Synovium des entzündeten Gelenks vorkommen, was durch zwei Studien gestützt wird, die anti-G6PI Antikörper verstärkt in entzündeten Gelenken und in der Synovialflüssigkeit detektieren können (Cha et al. (2004), Schaller et al. (2001)). Daneben gibt es Hinweise, dass anti-G6PI Antikörper bei einer speziellen besonders aggressiven Form der RA dem Felty-Syndrom auftreten (van Gaalen et al. (2004)). Insgesamt ist die Frage, ob diese Antikörper pathologisch relevant sind oder nur ein Epiphänomen darstellen. Da G6PI in jeder lebenden [Seite 102↓]Zelle vorkommt, könnte es möglicherweise sein, dass sich Antikörper gegen G6PI aufgrund der Destruktion des Gewebes bilden, da G6PI bei Zerstörung des Gewebes freigesetzt wird. Auch wenn Antikörper gegen G6PI nicht sehr häufig auftreten, ist trotzdem die Frage, wie diese Antikörper gebildet werden. Im Menschen sind mehrere Polymorphismen der G6PI bekannt und eine Hypothese besagt, dass die Bildung von Antikörpern gegen G6PI mit der Expression bestimmter G6PI Varianten assoziiert ist (Muraki et al. (2004)). In RA-Patienten, die über anti-G6PI Antikörper verfügen, tauchen dieser Studie zufolge signifikant vermehrt G6PI-Varianten auf. Zusammenfassend kann jedoch der Schluss gezogen werden, dass G6PI wahrscheinlich nicht das wesentliche Autoantigen ist, welches für RA verantwortlich ist.

5.2 Die Rolle der G6PI als Autoantigen in der Maus

5.2.1 Die Suszeptibilität für G6PI-induzierte Arthritis in unterschiedlichen Mausstämmen

Da Patienten mit RA weder eine T-Zellantwort noch eine ausgeprägte B-Zellantwort gegen G6PI in Form der Produktion von Autoantikörpern entwickeln, kann vermutet werden, dass G6PI bei der Pathogenese der RA - wenn überhaupt - nur eine untergeordnete Rolle bzw. bei nur einer sehr kleinen Subpopulation von RA-Patienten eine Rolle spielt. Damit steht aber weiter die Frage im Raum, ob G6PI bei der Entstehung von organspezifischen Autoimmunerkrankungen eine pathologisch signifikante Rolle spielen kann. In Mäusen wurde daher versucht durch Immunisierung mit rhG6PI, eine Arthritis zu induzieren. Durch die Induktion einer Arthritis in genetisch nicht veränderten Tieren konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine Autoimmunreaktion gegen ein ubiquitär exprimiertes Antigen zu einer organspezifischen Erkrankung in normalen Tieren führt. Dieses Modell erlaubt möglicherweise die Identifizierung neuer Mechanismen, die für die Pathogenese von RA bedeutend sind. Für die Arthritisinduktion mit rhG6PI wurden unterschiedliche Mausstämme ausgewählt. Diese Stämme waren zuvor schon in anderen Modellen für Autoimmunerkrankungen in Erscheinung getreten bzw. sind Stämme, die häufig im Labor bei vielen Fragestellungen eingesetzt werden. Nach Immunisierung mit rhG6PI entwickelte nur der DBA/1 Stamm eine Arthritis mit einer Inzidenz von über 95% (Kap. 4.2.1). Damit ist der DBA/1 Stamm neben der CIA auch für die G6PI-induzierte Arthritis suszeptibel. Bis heute ist nicht genau bekannt, warum der DBA/1 Stamm suszeptibel ist für Arthritis. Ein bekannter Faktor ähnlich wie beim Menschen ist der MHC locus. Mäuse, die den MHC-Haplotyp H2-q exprimieren, weisen eine erhöhte Suszeptibilität für die CIA auf (Wooley et al. (1981)). DBA/1 und B10.Q exprimieren beide den [Seite 103↓]MHC-Haplotyp H2-q und sind suszeptibel für die CIA. Dagegen sind Mäuse vom B10.A Stamm resistent gegen CIA und exprimieren den MHC-Haplotyp H2-k, obwohl sie sonst genetisch identisch mit dem B10.Q Stamm sind. Durch Verwendung der Stämme B10.A und B10.Q sollte untersucht werden, ob der MHC-Haplotyp eine ähnlich wichtige Rolle bei der Entwicklung der G6PI-induzierten Arthritis spielt wie in der CIA. Da in dieser Arbeit die B10.Q Mäuse nicht-suszeptibel waren, konnte die Beteiligung des MHC-Haplotyps nicht gezeigt werden. In jüngster Vergangenheit gab es jedoch Hinweise, dass der H2-q Haplotyp doch eine ähnlich wichtige Rolle spielt wie im CIA-Modell. Im C3H.Q und auch im B10.Q Stamm konnte eine Arthritis mit G6PI-induziert werden, die im Fall des C3H.Q Stamm sogar chronisch verlief (Bockermann, Schubert et al., Manuskript eingereicht). Das widerspricht dieser Studie, wo B10.Q Mäuse keine Arthritis entwickelten. Ein Grund dafür könnte in der Verwendung von B10.Q Mäusen liegen, die von Jackson Laboratories bezogen wurden. B10.Q Mäuse von Jackson Laboratories besitzen eine natürliche Mutation auf Chromosom 9 im Gen der Januskinase Tyk2 und sind auch resistent gegen CIA (Shaw et al. (2003)). B10.Q Mäuse anderer Anbieter, die nicht über diese Mutation verfügen, entwickeln eine G6PI-induzierte Arthritis mit einem milderen Verlauf als die DBA/1 Tiere (Bockermann, Schubert et al., Manuskript eingereicht). Durch dieses Ergebnis wird deutlich, dass der MHC-Haplotyp von entscheidender Bedeutung für die G6PI-induzierte Arthritis ist. Unterstützt wird dieser Befund durch die Resistenz der DBA/2 Mäuse, die dem DBA/1 Stamm genetisch sehr ähnlich sind, aber den MHC-Haplotyp H2-d exprimieren. Daraus lässt sich auch direkt schlussfolgern, dass T-Zellen eine entscheidende Bedeutung bei der G6PI-Arthritis zuteil wird. Das neben dem MHC-locus auch noch andere Gene beteiligt sind, zeigt der Fakt, dass C3H.NB Mäuse eine ausgeprägte G6PI-induzierte Arthritis entwickeln. B10.P Mäusen, die zwar über den gleichen MHC locus verfügen, ansonsten genetisch völlig unterschiedlich zu den C3H.NB Mäusen sind, entwickeln keine Arthritis (Bockermann, Schubert et al., Manuskript eingereicht). Auch die F1 Generation einer Kreuzung aus DBA/1 und C57BL/6 entwickelte keine Arthritis, was zeigt, dass die relevanten nicht-MHC Gene nicht dominant sind. Ein weiterer H2-q kongener Stamm ist der SWR Stamm. Dieser Stamm ist trotz der Expression von H2-q nicht für die G6PI-induzierte Arthritis und CIA suszeptibel (Reife et al. (1991)). Der SWR Stamm weist einen T-Zelldefekt auf, da ihm ca. 50% des Vβ Gens fehlt (Behlke et al. (1986)). Zusätzlich ist der SWR Stamm defizient für das Komplement Protein C5 (Erickson et al. (1964)). Da in der G6PI-induzierten Arthritis sowohl die CD4+ T-Zellen als auch das Komplement von Bedeutung sind (siehe Kap. 4.3.6, Kap. 4.4.6 und Kap. 4.4.7) entwickeln die SWR Mäuse möglicherweise aufgrund des T-Zelldefekts und der C5 Defizienz keine Arthri[Seite 104↓]tis. Menschen, die ein bestimmtes Allel des HLA-DR locus exprimieren sind prädispositioniert für die Entwicklung von RA. HLA-DRB0401 transgene Tiere sind jedoch resistent gegen die G6PI-induzierte Arthritis, obwohl einer der verwendeten Stämme auf den DBA/1 Stamm zurückgekreuzt war und suszeptibel für die CIA ist. Interessanterweise ist in der CIA das von HLA-DRB0401 erkannte Epitop des Kollagens II (257-270) das Gleiche, welches auch von I-Aq in den DBA/1 Mäusen erkannt wird (Andersson et al. (1998)). Man kann also davon ausgehen, dass beide MHC-Moleküle ähnliche Bindungseigenschaften haben. Möglicherweise werden jedoch in der G6PI-induzierten Arthritis unterschiedliche Epitope von I-Aq und HLA-DRB0401 präsentiert, wobei die immunodominanten Epitope in den DBA/1 Mäusen pathogen sind und bei den HLA-DRB0401 transgenen Tieren nicht. Außerdem ist nicht klar, ob in diesen Mäusen der MHC-II auch genauso stark exprimiert wird wie in den Wildtyp DBA/1 Mäusen.

5.2.2 Der histologische Befund in den unterschiedlichen Mausstämmen und die Eignung als Modell für die rheumatoide Arthritis

Neben dem klinischen Erscheinungsbild wurden alle Stämme nach Immunisierung mit G6PI auch histologisch untersucht (Kap. 4.2.4). Die klinischen Merkmale in den DBA/1 Mäusen waren stark ausgeprägt, so dass in diesem Stamm kein Zweifel bestand, dass diese Tiere eine Arthritis entwickelten. In den anderen Stämmen waren diesen Merkmale nicht zu beobachten. Es ist nicht auszuschließen, dass auch andere Stämme eine Entzündung des Gelenks ausbildeten, die jedoch klinisch nicht zu sehen war. Diesen Fall kann z.B. bei der Induktion der Lyme Arthritis in C57BL/6 Mäusen beobachtet werden (Maier, et al., unveröffentlichte Daten). Die histologische Analyse der Gelenke der Vorder- und Hinterläufe dieser Stämme zeigte jedoch, dass keiner der klinisch unauffälligen Stämme eine Infiltration inflammatorischer Zellen in den Gelenken aufwies. Zusätzlich wurden auch die DBA/1 Mäuse histologisch untersucht (Kap. 4.2.3). Diese Untersuchung ist wichtig, da die Histopathologie Aufschluss darüber gibt, wie stark die G6PI-induzierte Arthritis der Pathologie der RA ähnelt und auf ähnliche pathologische Mechanismen schließen lässt. In den DBA/1 Mäusen kann nach Induktion der Arthritis übereinstimmend mit der RA eine symmetrische Polyarthritis beobachtet werden, die sich in den Vorderläufen in den Handgelenken, den metacarpalen sowie den proximalen interphalangealen Gelenken und in den Hinterläufen in den tarsalen Gelenken manifestiert. Zusätzlich gibt es aber auch kleine Unterschiede zur RA. In den Vorderläufen sind auch die distalen interphalangealen Gelenke betroffen. In den Hinterläufen manifestiert sich die Arthritis sehr stark vor allem in den Fußknöcheln. Das Kniegelenk dagegen ist nur bei sehr schweren Ver[Seite 105↓]läufen betroffen. Im Unterschied zur RA sind die Schultern nicht betroffen. Neben den Gelenken wurden auch die inneren Organe in den DBA/1 Mäusen untersucht (Kap. 4.2.5). Weder die inneren Organe, noch das ZNS, sind betroffen. Das ist ein ganz entscheidender Punkt. Da G6PI ein systemisches Antigen ist, konnte spekuliert werden, dass nicht nur die Gelenke betroffen sind, sondern zusätzlich auch andere Organe. Im K/BxN-Modell konnte gezeigt werden, dass G6PI auf der Oberfläche von Muskeln und der Niere zu finden ist (Matsumoto et al. (2002)). Obwohl durch die Immunisierung mit G6PI eine Immunreaktion gegen ein ubiquitär exprimiertes Antigen induziert wurde, entwickeln die Mäuse eine auf die Gelenke beschränkte, also organspezifische, Entzündung. Auch der histopathologische Befund zeigt, dass die Entzündung stark der RA ähnelt. So kann vor allem eine schwere Synovitis festgestellt werden, die in Pannusformation und Knorpel- und Knochendestruktion mündet. Merkmale, die exakt auf RA zutreffen. Die G6PI-induzierte Arthritis zeigt zum ersten Mal, dass die Immunisierung von normalen Mäusen mit einem systemischen Antigen eine Arthritis induzieren kann, die stark der humanen RA ähnelt. Dieses Modell eignet sich daher sehr gut, die pathologischen Mechanismen der Arthritisentwicklung zu untersuchen.

5.2.3 Die Induktion der G6PI-induzierten Arthritis mit endogener, denaturierter und heterologer G6PI

Im Modell der G6PI-induzierten Arthritis entwickeln die Tiere 9 Tage nach Immunisierung eine Arthritis, die an Tag 14 ihren Höhepunkt erreicht und dann langsam wieder abnimmt (Kap. 4.2.2). Die Arthritis entwickelt sich sehr früh, zu einem Zeitpunkt, wo gerade erst erste zelluläre und humorale Antworten gegen G6PI gemessen werden können. Damit unterscheidet sich der Verlauf maßgeblich von der CIA aber auch vom K/BxN-Modell. Im K/BxN-Modell entwickeln sich spontan Antikörper gegen G6PI, die sobald sie eine gewisse Affinität und Konzentration überschritten haben, zu einem chronischen Verlauf der Arthritis in den K/BxN Mäusen führen. Auch in der CIA reicht eine primäre Immunisierung mit heterologem CII aus, um ein Arthritis in DBA/1 Mäusen zu induzieren. In diesem Modell können T- und B-Zellantworten schon nach 5-10 Tagen detektiert werden. Erste Infiltrationen inflammatorischer Zellen im Gelenk können jedoch erst zwei Wochen später beobachtet werden, die dann nach 3-4 Wochen langsam in eine sich entwickelnde Arthritis im Gelenk münden (Holmdahl et al. (2002), Holmdahl et al. (1988), Holmdahl et al. (1985)). Interessant an diesen beiden unterschiedlichen Verläufen ist, dass Kollagen II im Gelenk sehr prominent vorhanden ist, während G6PI ubiquitär vorliegt. Auch wenn das Kollagen möglicherweise sehr isoliert im Gelenk vorliegt und daher in den lymphatischen Organen von professionellen APC selten [Seite 106↓]präsentiert wird, so führt doch die Immunisierung mit CII zu einer frühen und starken Antwort gegen CII. Daher wäre zu erwarten, dass sich die CIA schneller entwickelt, da eine Immunreaktion von Beginn an gegen das Gelenk gerichtet sein müsste. Bei der G6PI liegt der Fall genau andersherum. G6PI kommt überall vor, und bei einer Immunreaktion gegen G6PI könnte eher mit einer systemischen Entzündung gerechnet werden. Eine wichtige Rolle für die frühe Entwicklung der Arthritis könnte dabei die biologische Funktion des G6PI spielen. Die Glukose-6-phosphat Isomerase ist vor allem bekannt als ein glykolytisches Enzym. Neben dieser intrazellulären Funktion im Energiestoffwechsel hat G6PI aber auch extrazelluläre Funktionen. Außerhalb der Zelle agiert G6PI mehr als Zytokin. G6PI ist das gleiche Protein wie Neuroleukin (Chaput et al. (1988), Faik et al. (1988)) und agiert als Zytokin, welches B-Zellen anregen kann, Antikörper zu sezernieren (Gurney et al. (1986)) und wirkt als Nervenwachstumsfaktor, der das Überleben und Wachstum embryonaler Rückenmarksnerven und sensorischer Nerven unterstützt (Gurney et al. (1986)). Neben Neuroleukin ist G6PI auch als autocrine motility factor (AMF) bekannt und wirkt als Zytokin, welches wahrscheinlich eine große Bedeutung bei der Bildung von Metastasen bei Krebs hat (Watanabe et al. (1996)). AMF bindet an einen 78 kDa großen stark glykolisierten G-Protein gekoppelten Sieben-Transmembranrezeptor, den AMF-Rezeptor (gp78) (Shimizu et al. (1999), Tsutsumi et al. (2002), Watanabe et al. (1991)). Weiterhin ist G6PI auch unter „differentiation and maturation mediator“ (DMM) bekannt und ist an der Differenzierung von humanen myeloiden leukämischen HL-60 Zellen zu terminalen Monozyten beteiligt (Xu et al. (1996)). Bis jetzt ist wurde noch nicht gezeigt, welche Zellen G6PI sekretieren und welche Zellen den Rezeptor exprimieren. Die Tatsache, dass G6PI von Lektin stimulierten T-Zellen sezerniert wird und die Produktion von Immunglobulinen anregt, zeigt jedoch, dass G6PI auf das Immunsystem Einfluss nehmen kann (Gurney et al. (1986)). Es ist daher durchaus denkbar, dass bei einer Immunantwort gegen G6PI, das G6PI als sein „eigenes Adjuvans“ wirkt. Durch die Immunisierung mit G6PI wird die Konzentration von G6PI in der Maus erhöht und G6PI kann verstärkt an den AMF-Rezeptor binden. Möglicherweise wird dadurch die anti-G6PI Antikörperproduktion verstärkt, indem G6PI nicht nur vom B-Zellrezeptor sondern gleichzeitig auch vom AMF-Rezeptor gebunden wird und die B-Zelle eine Art kostimulatorisches Signal über diesen Rezeptor erhält. Denkbar ist auch, dass andere Effektorzellen durch G6PI an den Entzündungsherd wandern, aktiviert werden und über den AMF-Rezeptor aufgenommenes G6PI verstärkt auf der Oberfläche präsentieren. Um zu untersuchen, ob die biologische Funktion der G6PI bei der Entwicklung der Arthritis eine Rolle spielt, wurden DBA/1 Mäuse mit denaturierter G6PI immunisiert (Kap. 4.2.7). Die G6PI wurde dazu gekocht, fiel aus und besaß keine en[Seite 107↓]zymatische Aktivität mehr. Trotz Denaturierung der G6PI entwickelten die Tiere eine Arthritis mit stark ähnelnder Inzidenz und Verlauf der Erkrankung im Vergleich zu der Immunisierung mit nativer G6PI. Dies zeigte deutlich, dass die enzymatische Aktivität der G6PI keinen Einfluss auf die Entwicklung der Arthritis hat. Daneben kann aber die Hypothese der besonderen biologischen Aktivität der G6PI nicht völlig ausgeschlossen werden, da die endogene murine G6PI weiter frei verfügbar ist. In der Zukunft wird es von besonderem Interesse sein, welche Zellen des Immunsystems den AMF-Rezeptor exprimieren und ob die Bindung von G6PI an den Rezeptor die Produktion von Antikörpern oder pro-inflammatorischer Zytokine induziert. Möglicherweise liegt das besondere Potential der G6PI darin zum Einen ein Antigen zu sein, welches von den Zellen des Immunsystem erkannt wird und zum Anderen aber auch gleichzeitig bestimmte Effektorfunktionen auf das Immunsystem ausüben kann. Daneben zeigt die Arthritisinduktion mit denaturierter G6PI, dass die dreidimensionale Struktur des Antigens keine große Rolle spielt. Das legt die Vermutung nahe, dass insbesondere T-Zellen an der Induktion beteiligt sind. Bei der Aktivierung von T-Zellen spielt die Struktur keine Rolle, da das Antigen in Form eines Peptid-MHC Komplexes den T-Zellen präsentiert wird und somit nicht in seiner nativen Form vorliegt. Neben der Immunisierung mit denaturierter G6PI wurde auch untersucht, ob die Konzentration der G6PI im Serum des DBA/1 Stammes und der nicht-suszeptiblen Stämme BALB/c und C57BL/6 unterschiedlich ist (Kap. 4.2.9). Das endogene G6PI in der Maus, vor allem im Serum, könnte unterschiedlichen Einfluss auf die Arthritisinduktion nehmen. Eine hohe Konzentration im Serum könnte dazu führen, dass autoreaktive G6PI-spezifische T-Zellen, die im Blut zwischen den lymphatischen Organen hin- und herwandern in einen anergen Zustand übergehen, da ihnen ständig G6PI ohne kostimulatorisches Signal präsentiert wird. Eine niedrige Konzentration könnte den Effekt haben, dass die periphere Toleranz z.B. in Form der Anergie nicht vorhanden ist und dadurch eine erhöhte Frequenz aktivierbarer autoreaktiver Zellen vorhanden ist, die nach Immunisierung mit G6PI zu einer starken Immunantwort führt. Die Ergebnisse zeigen aber, dass die G6PI-Konzentrationen vergleichbar sind und der DBA/1 Stamm von der Konzentration her sogar genau zwischen den beiden nicht-suszeptiblen Stämmen BALB/c und C57BL/6 liegt. Die Serumkonzentration des G6PI allein scheint also keinen Einfluss auf die Arthritisentwicklung zu nehmen. Bei dieser Untersuchung konnte jedoch nicht geklärt werden, ob die Gesamtverfügbarkeit in den unterschiedlichen Stämmen unterschiedlich ist. Möglichweise ist die Konzentration im Serum ähnlich aber die Konzentration auf der Oberfläche von Gelenken und anderen Organen unterschiedlich.


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Bei den bisher diskutierten Daten wurde die Arthritisinduktion in den DBA/1 Mäusen immer mit heterologer G6PI durchgeführt. Obwohl die humane und die murine G6PI starke Ähnlichkeiten aufweisen, unterscheiden sie sich jedoch zu 10% in ihrer Sequenz. Das könnte zur Konsequenz haben, dass die Epitope, die den T-Zellen präsentiert werden zwischen Mensch und Maus unterschiedlich sind, so dass keine Selektion gegen diese T-Zellen im Thymus stattgefunden hat. Auch in der CIA können in einigen Ratten- und Mausstämmen die Tiere mit autologem Kollagen II immunisiert werden und entwickeln dann eine Arthritis. Im Gegensatz zur Immunisierung mit heterologem CII entwickeln die Tiere jedoch erst 4- 12 Wochen nach Immunisierung eine Arthritis und zeigen zudem einen chronischen Verlauf (Boissier et al. (1987), Holmdahl et al. (1986)). In der G6PI-induzierten Arthritis wurden DBA/1 Tiere mit muriner G6PI immunisiert (Kap. 4.2.6). Der klinische Verlauf der Arthritis stimmte mit den human G6PI immunisierten Tieren bei leicht reduzierter Inzidenz überein. Dabei machte es keinen Unterschied, ob die Tiere männlichen oder weiblichen Geschlechts waren. In der CIA erkranken weibliche DBA/1 Mäuse mit geringer Inzidenz und mit weitaus milderem Verlauf als die männlichen Tiere (Boissier et al. (1987)). Damit unterscheidet sich das G6PI-induzierte Modell von der CIA, da die DBA/1 Mäuse keinen chronischen Verlauf der Erkrankung zeigen und auch nicht erst viel später erkranken. Die etwas geringere Inzidenz macht deutlich, dass es mit der autologen G6PI scheinbar schwieriger ist, die Toleranz gegenüber der G6PI zu überwinden und eine Arthritis zu induzieren. Der Verlauf nach Induktion der Arthritis mit muriner G6PI lässt die Frage zu, warum die Tiere keine chronische Arthritis entwickeln. Im Serum der Maus lässt sich lösliches G6PI feststellen und jede Zelle enthält viel G6PI. Das bedeutet, dass das Antigen stets zur Verfügung steht. Weiterhin lässt sich durch die Immunisierung mit muriner G6PI zeigen, dass eine erhöhte Frequenz autoreaktiver Zellen vorhanden ist, die zur Entwicklung einer Arthritis bei 80% der Mäuse ausreicht. Wenn also die Vorläuferfrequenz autoreaktiver Zellen und das Antigen frei verfügbar ist, so muss ein weiterer Faktor eine wichtige Rolle bei der Induktion der Arthritis spielen. Das könnte z.B. das Adjuvans sein bzw. bakterielle Rückstände, die in der G6PI-Präparation vorhanden sind. Tatsächlich ist schon seit langem bekannt, dass durch die Immunisierung von Ratten mit komplettem Freundschen Adjuvans eine Arthritis induziert werden kann Pearson (1956). Es ist auch bekannt, dass Adjuvantien in Form kleiner Moleküle, die keine antigenen Epitope ausbilden können, eine Arthritis in bestimmten Rattenstämmen auslösen können (Chang et al. (1980), Kohashi et al. (1982)). Somit ist der immunogene Effekt des Adjuvans möglicherweise in der Lage die ausgebildete Toleranz gegen ein Antigen, welches eine Arthritis zu induzieren vermag, zu überwinden. Dies kann möglicherweise auch passieren, wenn die Tiere altern [Seite 109↓]und selbst nicht mehr in der Lage sind die Toleranz aufrechtzuerhalten. Eine Studie zeigt, dass alternde männliche DBA/1 Mäuse in 80% der Tiere eine chronische entzündliche Arthritis entwickeln (Nordling et al. (1992)). Ob in diesen Tieren G6PI eine Rolle als Autoantigen spielt, ist bisher nicht untersucht worden. Klar ist, dass die Induktion der G6PI-induzierten Arthritis abhängig ist vom Antigen, da DBA/1 Mäuse, die nur mit PBS in CFA immunisiert wurden, keine Arthritis entwickelten.

Die in dieser Arbeit verwendete humane und murine G6PI wurde rekombinant in Bakterien hergestellt. Es ist daher von großer Bedeutung herauszufinden, ob bakterielle Rückstände in der Präparation und die Modifikation der G6PI einen Einfluss auf die Arthritisentwicklung haben. Sowohl die rekombinante humane als auch die murine G6PI wurden N-terminal mit einer sechsfachen Histidinmarkierung versehen, die zur Aufreinigung über eine Ni-NTA Säule benötigt wurde. Es ist bekannt, dass kationische Antigene mit Strukturen des Gelenks interagieren können und Einfluss auf die Entwicklung z.B. bei der Antigen induzierten Arthritis nehmen können. Eine chronische Arthritis in den Gelenken entwickelt sich nur bei der intraartikulären Injektion von kationischem BSA, nicht aber bei herkömmlichen BSA (van den Berg et al. (1984)). Außerdem ist durchaus denkbar, dass eine Immunreaktion auch gegen die Histidinmarkierung gerichtet sein kann. DBA/1 Mäuse wurden mit kommerziellem Kaninchen G6PI immunisiert, welches aus dem Muskel von Kaninchen stammt und keine bakteriellen Rückstände enthält. Außerdem war diese G6PI nicht modifiziert, so dass keine pH-abhängigen Effekte bzw. immunodominanten Effekte durch die Histidinmodifikation vorhanden waren. Die Homologie zwischen der Kaninchen G6PI und der humanen bzw. murinen G6PI liegt bei über 90%. Ein Nachteil dieser Präparation ist jedoch, dass sie durch andere Proteine kontaminiert ist. Einige dieser kontaminierenden Proteine, z.B. die Fruktose-1,6-bisphosphatase und die M-Kette der Kreatinkinase, erwiesen sich jedoch als nicht arthritogen (Schmitt A. und Marschinke F., unveröffentlichte Beobachtungen). Mit Hilfe der Kaninchen G6PI konnte in DBA/1 Mäusen eine Arthritis induziert werden (Kap. 4.2.8). Auch wenn die Präparation mit einigen Proteinen verunreinigt war, kann davon ausgegangen werden, dass der arthritogene Effekt auf der in der Präparation vorhandenen G6PI zurückzuführen ist. Die G6PI ist in dieser Präparation die am stärksten konzentrierteste Fraktion und zwei andere prominent vorhandene Kontaminationen haben sich als nicht arthritogen herausgestellt. Unabhängig von der Reinheit der Präparation wurde durch diese Experimente jedoch deutlich, dass bakterielle Rückstände und auch die Histidinmarkierung keinerlei Einfluss auf die Entwicklung der Arthritis hatten.


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5.2.4  Die Rolle der Antikörper und des Komplementsystems in der G6PI-induzierten Arthritis

Im CIA-Modell ist die Bildung von Autoantikörpern gegen murines CII wahrscheinlich der primäre Mechanismus in der Immunpathogenese. Der Transfer von Serum arthritischer Mäuse oder Ratten in naive Empfängertiere induziert eine schwere Entzündung in den Empfängern (Englert et al. (1986), Holmdahl et al. (1990), Stuart et al. (1982)). Auch im K/BxN-Modell spielen B-Zellen und Antikörper eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese (Korganow et al. (1999), Matsumoto et al. (1999)). Durch Transfer von Serum oder monoklonalen Antikörpern vom IgG1 Isotyp kann in den Empfängermäusen eine Arthritis induziert werden, die allerdings nicht chronisch verläuft. Sobald im K/BxN-Modell genügend Antikörper gegen G6PI gebildet wurden, sind die T-Zellen nicht mehr notwendig. Da gerade im K/BxN-Modell die Antikörper wichtig sind, wurde die Produktion von anti-G6PI Antikörpern auch im G6PI-induzierten Arthritismodell untersucht (Kap. 4.3.1). Beginnend von Tag 6 nach Immunisierung mit rekombinanter humaner G6PI können hohe Titer gegen rekombinante humane und murine G6PI detektiert werden. Das bedeutet, dass die Antikörper kreuzreaktiv zwischen humaner und muriner G6PI sind. Die niedrigeren Titer gegen murine G6PI sind durchaus erwartet. Zwar besteht zwischen humaner und muriner G6PI eine starke Homologie, und auch die 3-dimensionale Struktur ist zwischen den unterschiedlichen Spezies fast identisch (Graham Solomons et al. (2004)). Dennoch existieren sowohl lineare und wahrscheinlich auch konformationelle Epitope, die zwischen Mensch und Maus unterschiedlich sind, weshalb mehr Antikörper gegen humane G6PI gebildet werden. Geht man davon aus, dass die pathologische Relevanz der Antikörper in der Erkennung der murinen G6PI besteht, so kann durch diese Experimente gleichzeitig auch gezeigt werden, dass Antikörper gegen G6PI nicht ausschließlich verantwortlich sein können für die Arthritis in DBA/1 Mäusen. Nach 30 Tagen können immer noch hohe Antikörpertiter sowohl gegen murine als auch gegen humane G6PI gemessen werden, obwohl die Arthritis schon zurückgegangen ist. Damit unterscheidet sich das G6PI-induzierte Modell stark vom K/BxN-Modell. Haben sich dort erst einmal Antikörper gegen G6PI gebildet, so verläuft die Arthritis chronisch und ist nicht mehr abhängig von anderen Faktoren wie z.B. T-Zellen (Kouskoff et al. (1996)). Ein weiterer Punkt, der gegen die Beteiligung von Antikörpern und B-Zellen in der G6PI-induzierten Arthritis spricht, ist der Fakt, dass der Transfer großer Mengen aufgereinigter IgG nicht in der Lage ist, eine Arthritis in den Empfängermäusen auszulösen (Kap. 4.3.4). Sowohl im CIA-Modell als auch im K/BxN-Modell ist dies möglich.. Man könnte auch die Hypothese aufstellen, dass die gespritzte humane G6PI das eigentliche Ziel der Immunantwort ist, die zur Arthritis führt. Unter [Seite 111↓]der Annahme, dass sich gewisse Anteile der gespritzten G6PI im Gelenk ablagern, könnten sich dort Immunkomplexe bilden, die dann zur Zerstörung des Gewebes führen. Eine Abnahme der Arthritis trotz hoher Antikörpertiter könnte dann durch das Fehlen des Antigens erklärt werden. Weiterhin könnte damit auch erklärt werden, warum der Arthritistransfer durch Transfer der Antikörper im G6PI-induziertem Modell nicht funktioniert, da das Zielantigen gar nicht vorhanden ist. Wenn spekuliert wird, ob Antikörper eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der G6PI-induzierten Arthritis spielen, dann ist natürlich auch die Frage, welche Antikörpertiter die Stämme entwickeln, die nicht-suszeptibel für die G6PI-induzierte Arthritis sind. Die Experimente zeigen, dass alle untersuchten Stämme sowohl gegen murine als auch gegen humane G6PI hohe Antikörpertiter entwickeln (Kap. 4.3.1). Dieser Befund spricht erneut deutlich gegen eine Beteiligung der Antikörper. Jedoch kann auch im CIA-Modell die gleiche Beobachtung gemacht werden. Obwohl hier Antikörper eindeutig pathologisch relevant sind, entwickeln auch nicht-suszeptible Stämme hohe Titer gegen CII (Wooley et al. (1981)). Möglicherweise ist die Qualität der Antikörper in den unterschiedlichen Stämmen unterschiedlich. Es könnte durchaus sein, dass in DBA/1 Mäusen Antikörper gebildet werden, die gegen frei zugängliche Epitope gerichtet sind und daher im Gelenk Immunkomplexe bilden können. Da bisher nicht bekannt ist, wie sich G6PI im Gelenk anlagert, könnten Epitope, die von Antikörpern anderer Stämme erkannt werden, nicht frei zugänglich sein und somit die Bildung von Immunkomplexen verhindern. Ein anderer wichtiger Punkt sind auch die Isotypen der gebildeten Antikörper gegen G6PI. Sowohl im K/BxN-Modell als auch im CIA-Modell spielen die Isotypen der Antikörper eine wichtige Rolle. Im K/BxN-Modell sind es anti-G6PI Antikörper der IgG1 Subklasse, die in der Lage sind, die Arthritis zu transferieren (Maccioni et al. (2002)). In der CIA sind es vor allem Antikörper der IgG2 Subklasse, die eine Rolle spielen (Terato et al. (1992), Watson und Townes (1985)). In DBA/1 Mäusen konnten von allen Subklassen der anti-G6PI-IgG Antikörper hohe Konzentrationen gemessen werden (Kap. 4.3.2). Beim Vergleich der Antikörpertiter zwischen dem DBA/1 Stamm und den anderen Stämmen fällt auf, dass die anderen Stämme deutlich höhere Titer gegen humane und murine G6PI entwickelten. Die Bestimmung der Antikörpertiter in den DBA/1 Mäusen wurde jedoch mit einem anderen ELISA Verfahren durchgeführt, bei der die Bindung der IgG Antikörper an G6PI mit einem biotinylierten Sekundärantikörper und einer Streptavidin-gekoppelten Peroxidase detektiert wurde. Die Detektion in den anderen Stämmen wurde mit einem Peroxidase-konjugiertem Sekundärantikörper durchgeführt. Dabei entwickelte sich gerade mit dem biotinylierten Sekundärantikörper ein hohes Hintergrundsignal, welches zu den geringeren Titern führte. Die Antikörpertiter sind daher nicht direkt vergleichbar. Die [Seite 112↓]bisher diskutierten Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass Antikörper möglicherweise keine entscheidende Rolle spielen. Bis jetzt wurde nur die Produktion der Antikörper untersucht und nicht deren mögliche Effektorfunktion. Eine wichtige Funktion von Antikörpern ist zum Beispiel die positive und negative Regulation von Immunantworten durch das Binden an Fc-Rezeptoren. Die Bindung führt zur Proliferation von B-Zellen, zur Phagozytose bei Makrophagen und zur Degranulation bei Mastzellen. Über Fc-Rezeptoren werden auch Immunkomplexe aufgenommen und deren gebundenen Antigene anschließend präsentiert (Amigorena et al. (1998), Hamano et al. (2000)). Viele von Antikörpern vermittelte Funktionen werden von Effektorzellen ausgeübt, die über Fc-Rezeptoren verfügen. Der Einfluss der Fc-Rezeptoren auf die G6PI-induzierte Arthritis wurde daher untersucht (Kap. 4.3.5). Es konnte gezeigt werden, dass DBA/1 Mäuse, die keine aktivierenden FcγRI und FcγRIII exprimieren konnten, eine Arthritis mit geringer Inzidenz und mildem Verlauf entwickelten. DBA/1 Mäuse dagegen, die kein FcγRIIB exprimierten, zeigten eine erhöhte Inzidenz von 100% und einen chronischen Verlauf. Beide Stämme entwickeln dabei hohe anti-G6PI Titer. Damit ist ganz deutlich, dass auch in der G6PI-induzierten Arthritis den über die Fc-Rezeptoren vermittelten Funktion der Antikörper eine große Bedeutung zukommt. Da die bisher einzig bekannte extrazelluläre Funktion der Fc-Rezeptoren die Bindung von Antikörpern ist, konnte indirekt bewiesen werden, dass Antikörper eine wichtige Rolle spielen. Im CIA-Modell konnten ähnliche Beobachtungen gemacht werden. DBA/1 Mäuse, die defizient für die gemeinsame γ-Kette sind, sind resistent gegen CIA, obwohl sie hohe Antikörpertiter gegen CII entwickeln (Kleinau et al. (2000)). Die Verwendung von FcγRIIB-/- DBA/1 Mäusen dagegen führte zu einem schwereren Verlauf der Arthritis (Kleinau et al. (2000)). Außerdem konnte gezeigt werden, dass ein nicht-suszeptibler Mausstamm eine CIA entwickelt, wenn FcγRIIB fehlt (Yuasa et al. (1999)). Auch im K/BxN-Modell konnte in unterschiedlichen Stämmen mit genetischen Deletionen für Fcγ-Rezeptoren gezeigt werden, dass sowohl der aktivierende FcγRI als auch der inhibierende FcγRIIB keine Rolle bei der Induktion oder im Verlauf der Arthritis spielen, während der FcγRIII, der auch über IgG1 aktiviert werden kann, sehr wichtig ist (Ji et al. (2002)). Damit konnte in allen drei Modellen gezeigt werden, dass den gebildeten Antikörpern und ihren über Fcγ-Rezeptoren vermittelten Funktionen ein großer Anteil bei der Induktion der Arthritis zukommt. In der Zukunft ist eine wichtige Frage, ob die entscheidenden Antikörper tatsächlich auch eine Spezifität für G6PI besitzen müssen und es sich hierbei um einen immunkomplexvermittelten Prozess handelt. Weiterhin muss untersucht werden, welcher der aktivierenden Fc-Rezeptoren wichtig ist, da die Aktivierung über FcγRI oder FcγRIII unterschiedliche Immunantworten nach sich zieht. Neue Erkenntnisse [Seite 113↓]könnten möglicherweise monoklonale Antikörper liefern, die aus arthritischen Mäusen nach G6PI Immunisierung generiert wurden. Mit Hilfe dieser Antikörper ist es möglich, die Epitope zu identifizieren, die von diesen Antikörpern gebunden werden. Im K/BxN-Modell wurden zwei lineare Epitope identifiziert. Antikörper, die diese Epitope erkennen, können die Arthritis transferieren (Solomon (2003)). Ein Vergleich der Epitope könnte Aufschluss geben, warum der Transfer in der G6PI-induzierten Arthritis nicht funktioniert. Außerdem ist interessant, ob die nicht-suszeptiblen Stämme andere Epitope erkennen als die DBA/1 Mäuse. Sowohl im CIA-Modell als auch im K/BxN-Modell ist der Transfer nur möglich, wenn mindestens zwei Antikörper unterschiedlicher Spezifität das Antigen binden (Maccioni et al. (2002), Terato et al. (1992)), was impliziert, dass Immunkomplexe von Bedeutung sind. Die nicht-suszeptiblen Stämme entwickeln hohe Antikörpertiter gegen G6PI. Möglicherweise sind die Epitope jedoch so angeordnet, dass keine Immunkomplexe ausgebildet werden können. Neben der Bestimmung der Epitope spielt sicherlich auch die Affinität der Antikörper eine Rolle. Im K/BxN-Modell wurden monoklonale Antikörper generiert und deren Affinität über Plasmon Resonanz Messungen bestimmt (Maccioni et al. (2002)). Hier wird interessant sein, ob die Antikörper aus den DBA/1 Mäusen möglicherweise andere Affinitäten aufweisen als im K/BxN-Modell. Dies ist sogar sehr wahrscheinlich, da im K/BxN-Modell die B-Zellen aufgrund des transgenen T-Zellrezeptors starke B-Zellhilfe erhalten und somit einer massiven Affinitätsreifung unterzogen werden. Möglicherweise kann die Arthritis im G6PI-induzierten Modell nicht mit Antikörpern transferiert werden, weil die Affinität der Antikörper zu gering ist.

Ein weiterer Mechanismus, bei dem eine Verbindung zwischen der angeborenen und der humoralen Immunität hergestellt wird, ist das Komplementsystem. Ein mögliches Modell der Arthritisinduktion könnte so funktionieren, dass kreuzreaktive Antikörper gegen murine G6PI im Gelenk Immunkomplexe bilden. Durch diese Immunkomplexe wird das Komplementsystem aktiviert, welches seinerseits das Gewebe zerstört und andere Zellen des Immunsystems in das Gelenks lockt, die dann, z.B. über die Bindung von Antikörper an Fc-Rezeptoren, aktiviert werden. Auch bei der Pathogenese der RA wird dem Komplement eine große Bedeutung zugeschrieben (Jose et al. (1990), Morgan et al. (1988), Ward und Zvaifler (1971)). Dabei spielen wahrscheinlich der klassische und der alternative Weg der Komplementkaskade eine Rolle (Brodeur et al. (1991)). Um zu untersuchen, ob das Komplementsystem eine Rolle bei der Pathogenese in der G6PI-induzierten Arthritis spielt, wurde das zentrale Protein der Komplementkaskade C5 mit Hilfe des anti-C5 Antikörpers BB5.1 inhibiert (Frei et al. (1987)). Die mit BB5.1 behandelten Tiere entwickelten eine Arthritis mit einer Inzidenz von nur 66% und [Seite 114↓]einem verzögerten milderen Verlauf der Arthritis, obwohl die Aktivität des Komplementsystems im hämolytischen Test nur zu ca. 30 % eingeschränkt war (Kap. 4.3.6). Daraus kann geschlossen werden, dass die Komplementaktivität einen zentralen Mechanismus in der G6PI-induzierten Arthritis darstellt. Das G6PI-induzierte Arthritismodell weist in dieser Hinsicht Parallelen zur CIA und zum K/BxN-Modell auf (Ji et al. (2002), Wang et al. (1995)). Durch gänzliche Blockade des Komplements, z.B. in einer C5-ko Maus, könnte die Arthritisentwicklung möglicherweise vollständig verhindert werden. Ein Nachteil an diesem Experiment ist jedoch, dass nicht klar ist, welcher Weg des Komplements aktiviert wird, da alle Wege im zentralen Molekül C5 münden. Aus den bisher bekannten Daten kann spekuliert werden, welcher Weg eine große Rolle spielen könnte. DBA/1 Mäuse verfügen zu dem Zeitpunkt an dem sie erkranken über alle IgG Subklassen. Die Subklasse, die zuerst gemessen werden kann, ist erwartungsgemäß IgG1. IgG1 interagiert aber nur schwach mit C1q, so dass der klassische Weg der Komplementkaskade von dieser Subklasse kaum aktiviert werden kann. Im K/BxN-Modell sind IgG1 Antikörper der vorherrschende Isotyp und der alternative Weg der Komplementkaskade ist von Bedeutung. IgG1 könnte durch Bindung an C3b, einer Komponente des alternativen Weges, die Inaktivierung von C3b durch den Faktor H verhindern (Ji et al. (2002), Klaus et al. (1979)). Es ist also durchaus vorstellbar, dass die gegen G6PI gebildeten Antikörper der IgG1 Subklasse in der G6PI-induzierten Arthritis bei der Aktivierung des alternativen Weg der Komplementkaskade eine Rolle spielen. Interessanterweise erkranken die Tiere dann, wenn auch die IgG2 Subklasse im Serum detektierbar ist. Die IgG2 Subklassen sind in der Lage, an C1q, dem ersten Komplex des klassischen Weges der Komplementkaskade, zu binden und die Komplementkaskade zu aktivieren (Duncan und Winter (1988)). DBA/1 Mäuse, die defizient für C3, einem Protein des klassischen Weges der Komplementkaskade, aber auch für den Faktor B, einem Protein des alternativen Weges der Komplementkaskade, sind resistent gegen die CIA (Hietala et al. (2002)). Das zeigt, dass in der CIA der alternative und der klassische Weg der Komplementkaskade eine Rolle in Abhängigkeit der IgG2 Subklasse spielen. In der G6PI-induzierten Arthritis sind alle IgG-Subklassen vorhanden und es kann spekuliert werden, dass diese Antikörper sowohl an der Aktivierung des klassischen Weges als auch des alternativen Weges der Komplementkaskade beteiligt sind.

Zusammenfassend ist in der G6PI-induzierten Arthritis deutlich geworden, dass Antikörper ganz entscheidend zur Pathogenese beitragen. Die von Antikörpern über Fcγ-Rezeptoren übermittelten Signale auf Effektorzellen und auch die Aktivierung bzw. Verstärkung der Komplementkaskade durch die gebildeten Antikörper sind dabei die entscheidenden Funktionen. Damit konnten in diesem Modell Effektormechanismen aufgezeigt werden, die auch bei der [Seite 115↓]Pathogenese von RA ein wichtige Rolle spielen. Das G6PI-induzierte Arthritismodell eignet sich daher sehr gut dafür, immunmodulatorische Therapeutika, die z.B. gegen Komponenten des Komplementsystem aber auch als Antagonisten für Fcγ-Rezeptoren entwickelt wurden, zu testen.

5.2.5 Die Rolle der T-Zellen und der von ihnen produzierten Zytokine in der G6PI-induzierten Arthritis

Sowohl bei der RA als auch im Tiermodell spielen CD4+ T-Zellen eine große Rolle. Im K/BxN-Modell sind die transgenen T-Zellen für die Induktion der Arthritis notwendig (Kouskoff et al. (1996), Mangialaio et al. (1999)). Auch in der CIA haben CD4+ T-Zellen eine immense Bedeutung. Sie leisten dort B-Zellhilfe, um arthritogene Antikörper zu produzieren (Corthay et al. (1999)). Außerdem wird vermutet, dass sie selbst eine aktive Rolle bei der Gelenkentzündung spielen, indem sie andere Zellen, wie z.B. Makrophagen, aktivieren (Holmdahl et al. (2002)). Klares Indiz für die wichtige Rolle der CD4+ T-Zellen bei der CIA ist auch hier die MHC Assoziation. Trotz dieser Studien bleibt die Rolle der CD4+-T-Zellen kontrovers, da auch CD4-/- Mäuse, eine Arthritis nach Immunisierung mit heterologem CII entwickeln (Tada et al. (1996)). Um die Rolle der CD4+ T-Zellen in der G6PI-induzierten Arthritis näher zu untersuchen, wurde versucht, autoreaktive CD4+ T-Zellen nach Immunisierung mit G6PI zu restimulieren und die Proliferation über den Einbau von 3H-Thymidin zu verfolgen. Bei allen untersuchten Stämmen konnte nur in den Zellen der drainierenden Lymphknoten der DBA/1 Mäuse zwischen den Tagen 9 und 12 eine Proliferation gemessen werden (Kap. 4.4.1). Damit wird deutlich, dass die nicht-suszeptiblen Stämme nicht in der Lage sind, mit einer CD4+ T-Zellantwort auf die Immunisierung mit G6PI zu reagieren. Dadurch kann z.B. die B-Zellhilfe nur eingeschränkt funktionieren. Zwar werden auch hohe Titer in diesen Mäusen produziert, es ist aber nicht klar, ob sie auch die gleiche Spezifität und Affinität haben. Fehlt nun diese spezifische CD4+-T-Zellantwort nach Immunisierung mit G6PI, so können diese T-Zellen nicht in das Gelenk migrieren, um dort ihre Effektorfunktion auszuüben. Die Antikörper alleine reichen dann nicht aus, um eine Arthritis zu induzieren. Obwohl die DBA/1 Mäuse hohe Titer gegen G6PI entwickeln, nimmt die Arthritis nachdem keine CD4+ T-Zellantwort mehr gemessen werden kann wieder ab (Kap. 4.2.2 und Kap. 4.4.1). Diese Daten sind erste Hinweise darauf, dass auch in der G6PI-induzierten Arthritis CD4+-T-Zellen entscheidend für die Entwicklung der Arthritis sind. Ein weiterer Punkt, der sehr interessant ist, ist der Fakt, dass auch die CD4+ T-Zellen der SWR und B10.Q Mäuse nicht proliferieren. Da beide Stämme über das gleiche MHC-II Protein verfügen wie die [Seite 116↓]DBA/1 Mäuse, müsste den T-Zellen auch das oder die gleichen Epitope präsentiert werden, und es sollte eigentlich mit einer CD4+-T-Zellantwort gerechnet werden. Diese konnte nicht gemessen werden und dafür kann es mehrere Gründe geben. Die B10.Q Mäuse wurden von Jackson Laboratories bezogen und sind aufgrund einer Mutation resistent gegen die CIA (Shaw et al. (2003)). Diese Mutation könnte auch Auswirkungen auf das Proliferationsverhalten der CD4+-T-Zellen haben. Der SWR Stamm hat einen T-Zelldefekt, da ihm ca. 50% des Vβ Gens fehlt (Behlke et al. (1986)). Auch das könnte sich auf das Proliferationsverhalten der CD4+ T-Zellen auswirken, da möglicherweise das T-Zellrepertoire beschränkt ist. Abgesehen davon könnten aber auch noch zwei andere Aspekte eine wichtige Rolle spielen, die im übrigen auch für die anderen nicht-suszeptiblen Stämme gelten. Der erste Aspekt beinhaltet die Mechanismen der zentralen Toleranz, also die positive und negative Selektion G6PI spezifischer CD4+ T-Zellen im Thymus. Unter Umständen ist die Frage der Suszeptibilität damit verknüpft, ob die meisten G6PI spezifischen autoreaktiven CD4+ T-Zellen im Thymus deletiert werden können oder nicht. Es wäre daher interessant, das H2-q restringierte Epitop zu bestimmen und zu untersuchen, ob noch andere H2-q kongene Stämme existieren, die suszeptibel sind oder nicht. Mit Hilfe von MHC-II spezifischen Tetrameren kann dann nachgewiesen werden, wie viele autoreaktive CD4+-T-Zellen die Peripherie erreichen und wie die Selektion im Thymus reguliert wird. Möglicherweise existiert in den DBA/1 Mäusen ein Defekt, der es vielen autoreaktiven CD4+-T-Zellen, sei es mit Spezifität für CII oder G6PI, erlaubt, den Thymus zu verlassen. Ein anderer Aspekt ist die periphere Toleranz. Auch wenn es autoreaktiven CD4+-T-Zellen aller Stämme gelingen sollte, die Peripherie zu erreichen, könnten sogenannte regulatorische CD4+CD25+ T-Zellen eine CD4+ T-Zellantwort gegen G6PI unterdrücken. Die Proliferation der CD4+ T-Zellen wurde zusätzlich auch mit CFDA-SE nachgewiesen. Dabei konnte beobachtet werden, dass die CD4+-T-Zellen nicht proliferieren, wenn die Mäuse nur mit PBS in CFA immunisiert wurden und anschließend mit muriner oder humaner G6PI restimuliert wurden (Kap. 4.4.2). Das ist ein wichtiger Punkt, da gezeigt werden konnte, dass G6PI über den möglicherweise exprimierten AMF-Rezeptor nicht als Mitogen auf CD4+ T-Zellen wirkt. Somit beruht die gemessene Proliferation der CD4+ T-Zellen nach Immunisierung und Restimulation mit G6PI tatsächlich auf eine spezifische CD4+ T-Zellantwort. Nach Immunisierung mit humaner G6PI proliferierten die CD4+ T-Zellen an Tag 11, ohne dass es der Zugabe von Antigen bedarf. Diese Beobachtung ist nicht ungewöhnlich, da zu diesem Zeitpunkt die G6PI spezifischen CD4+-T-Zellen wahrscheinlich in den drainierenden Lymphknoten selbst massiv G6PI von den APC präsentiert bekommen und proliferieren. Unter Zugabe von humaner G6PI wird die Proliferation in vitro noch verstärkt. Die Zugabe von muri[Seite 117↓]ner G6PI lässt die CD4+ T-Zellen nur unwesentlich stärker proliferieren als ohne Zugabe von Antigen. Das könnte bedeuten, dass die G6PI spezifischen CD4+-T-Zellen nicht kreuzreaktiv zwischen humaner und muriner G6PI sind. Auch in der CIA kann beobachtet werden, dass die CD4+-T-Zellantwort vor allem gegen das heterologe CII gerichtet ist und nur eine schwache Antwort gegen das autologe CII messbar ist (Andersson und Holmdahl (1990)). Das könnte auch eine Erklärung sein, warum die Arthritis nach der maximalen CD4+ T-Zellantwort wieder abnimmt. Da keine CD4+ T-Zellen aktiviert werden, die auch auf die murine G6PI antworten, kann die Immunantwort gegen G6PI nicht aufrechterhalten werden, wenn die Antwort gegen die humane G6PI abgeklungen ist. Es konnte aber gezeigt werden, dass eine Arthritis auch mit muriner G6PI induziert werden kann. Dies spricht eindeutig für das Vorhandensein autoreaktiver CD4+ T-Zellen, die auch gegen murine G6PI gerichtet sind. Wahrscheinlich sind Supressormechanismen in der Peripherie für die geringe CD4+ T-Zellantwort gegen murine G6PI verantwortlich.

Die gemessene Proliferation von CD4+ T-Zellen nach Restimulation mit humaner G6PI beweist aber noch nicht, dass diese CD4+ T-Zellen tatsächlich auch eine Rolle bei der Pathogenese in der G6PI-induzierten Arthritis spielen. Durch die Depletion von CD4+ Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten vor oder nach Immunisierung mit humaner G6PI mit Hilfe des depletierenden anti-CD4 Antikörper YTS191.1 (Cobbold et al. (1990)) konnte dies bewiesen werden. Ein Depletion vor den ersten klinischen Zeichen der Arthritis verhindert die Entwicklung der Arthritis fast vollständig (Kap. 4.4.6). Die CD4+-T-Zellen sind also maßgeblich an der Induktion der Arthritis beteiligt und ähneln in diesem Aspekt der CIA und dem K/BxN-Modell (Hom et al. (1988), Kouskoff et al. (1996), Mangialaio et al. (1999), Ranges et al. (1985)). Eine Depletion vor Immunisierung mit G6PI verhindert die Antikörperproduktion fast völlig gegen humane und gänzlich gegen murine G6PI. Somit konnte hier auch gezeigt werden, dass die gebildeten Autoantikörper gegen G6PI abhängig von der T-Zellantwort sind. Somit ist ähnlich wie im K/BxN und auch im CIA Modell eine zentrale Funktion der CD4+ T-Zellen die B-Zellhilfe bei der Generierung von Autoantikörpern. Bei einer Depletion zu einem späteren Zeitpunkt an den Tagen 6 und 9 entwickeln die Tiere keine Arthritis aber genauso hohe Titer gegen humane und murine G6PI wie die Kontrolltiere. Dadurch wird noch einmal deutlich, dass Antikörper alleine nicht in der Lage sind, eine Arthritis zu induzieren. Dieser Effekt wird besonders dann deutlich, wenn die CD4+ T-Zellen zu einem Zeitpunkt depletiert werden, wo die Arthritis voll etabliert ist. Nach der Depletion an den Tagen 11 und 14 nimmt der Schweregrad der Arthritis sofort ab und die Mäuse werden sehr schnell wieder gesund. CD4+ T-Zellen werden daher nicht nur für die Induktionsphase sondern auch in der Effek[Seite 118↓]torphase zur Aufrechterhaltung der Arthritis benötigt. Damit unterscheidet sich das G6PI-induzierte Modell maßgeblich vom K/BxN-Modell und auch von der CIA, wo CD4+ T-Zellen in der Effektorphase keine Rolle mehr spielen (Kouskoff et al. (1996), Williams und Whyte (1996)). Neben ihrer Funktion in Form der B-Zellhilfe müssen die CD4+ T-Zellen auch noch andere Funktionen wahrnehmen. Diese Funktionen könnten in erster Linie durch die von den CD4+-T-Zellen produzierten Zytokine vermittelt werden. In dieser Arbeit wurde die Expression von Zytokinen in CD4+ T-Zellen an den Tagen 6,9 und 11 nach Immunisierung und Restimulation mit humaner G6PI gemessen (Kap 4.4.3). Dabei wurde von den CD4+ Zellen der drainierenden inguinalen Lymphknoten TNF-α, IL-6 und IL-17 exprimiert, während die CD4+ Zellen der Milz hpts. TNF-α und viel IL-6 und nur wenig IL-17 produzierten. Daneben exprimierten einige wenige CD4+ Zellen auch IL-4, IL-2 und IFN-γ. Die Zytokine TNF-α, IL-6 und IL-17 sind schon häufiger in Zusammenhang mit entzündlichen Erkrankungen in Erscheinung getreten. TNF-α ist ein äußerst wirksames pro-inflammatorisches Zytokin, welches in einer Vielzahl von entzündlichen Erkrankungen eine große Rolle spielt (Vassalli (1992)). Durch Neutralisierung von TNF-α mit Hilfe von Antikörpern kann in der CIA eine deutliche Verbesserung des klinischen Verlaufs hervorgerufen werden (Williams et al. (1992)). Bei Patienten mit RA werden seit kurzer Zeit erfolgreich ein löslicher TNF-Rezeptor (Enbrel®) oder Antikörper gegen TNF-α (Remicade®) in der Therapie eingesetzt (Olsen und Stein (2004)). Möglicherweise ist auch in der G6PI-induzierten Arthritis das Zusammenspiel dieser von den CD4+-T-Zellen exprimierten Zytokinen entscheidend für die Entwicklung der Arthritis. Die wichtige Rolle des TNF-α rührt unter anderem daher, dass TNF-α von vielen Zelltypen, wie z.B. T-Lymphozyten, Makrophagen, Mastzellen, polymorphkernigen Leukozyten und wahrscheinlich noch vielen anderen Zelltypen exprimiert und ausgeschüttet werden kann. Neben der Ausschüttung durch viele Zelltypen vermittelt TNF-α auch viele Funktionen. Unter anderem zählen dazu die Aktivierung und Differenzierung von Makrophagen, eine verstärkte Antwort von aktivierten T-Zellen, durch verstärkte Expression des IL-2 Rezeptors, möglicherweise auch das Wachstum und die Reifung von B-Zellen. TNF-α induziert die Freisetzung unterschiedlicher Wachstumsfaktoren und Zytokine und wirkt zusätzlich chemotaktisch. Es induziert oder verstärkt die Expression von Zelladhäsionsmolekülen wie ELAM-1, ICAM-1 und VCAM-1 und führt zu einer verstärkten Expression von MHC-Proteinen (Vassalli (1992)). Gerade in Hinblick auf entzündliche Reaktionen im Gelenk sind unter dem Einfluss von TNF-α eine verstärkte Synthese von Kollagenase in synovialen Zellen, eine verstärkte Resorption von Proteoglykanen und die Inhibition ihrer Synthese, sowie die Knochenresorption durch Osteoklasten und die Inhibition der Knochenbildung zu beobachten (Beutler und Cerami (1989)). TNF-α könnte in der G6PI-induzierten Arthritis also dazu beitragen, andere Zellen des Immunsystems zu aktivieren, was z.B. auch zu einer verstärkten Fc-Rezeptor Expression auf Makrophagen führen könnte, die für die Bindung von Immunkomplexen verantwortlich sein könnte. Gleichzeitig könnte es aufgrund seiner chemotaktischen Eigenschaften zusätzliche Zellen an den Entzündungsherd locken und aktivieren. Im Gelenk selbst könnte es aufgrund seiner oben beschriebenen Eigenschaften die Regeneration von Knochen und Knorpel inhibieren. Durch die Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen können zusätzlich Zellen in das Gelenk einwandern. Um die Rolle von TNF-α genauer zu untersuchen, wurden DBA/1 Mäuse direkt nach Immunisierung mit humaner G6PI mit unterschiedlichen Mengen Etanercept, einem dimeren löslichen TNF-Rezeptor, der TNF-α blockiert, behandelt (Kap. 4.4.4). Dabei konnte beobachtet werden, dass durch die Behandlung mit Etanercept nur 30% der Tiere eine Arthritis entwickeln, wenn sie mit 100µg behandelt wurden, aber 70%, wenn sie mit 30µg behandelt wurden. Das zeigt, dass TNF-α massiv an der Induktion beteiligt ist und eine große Menge als Antwort auf die G6PI-Immunisierung freigesetzt wird. Eine tägliche Gabe von 30µg Etanercept reicht dabei scheinbar kaum aus, um die TNF-α Effekte aufzuheben. Die Dosis von 30µg ist vielleicht auch deswegen zu niedrig, da die Tiere den Rezeptor möglicherweise so schnell verstoffwechseln, dass in der Maus nie eine Konzentration erreicht wird, welche die Funktion von TNF-α vollständig blockieren kann. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass die Therapie bei einer bereits entwickelten Arthritis so gut wie keine Effekte zeigt. Das bedeutet, dass die durch TNF-α vermittelten Effekte zwar bei der Induktion eine wichtige Rolle spielen, zur Aufrechterhaltung der Erkrankung dagegen aber nur wenig beitragen. Damit unterscheidet sich die G6PI-induzierte Arthritis von der humanen RA, wo nur ein kleiner Anteil der Patienten nicht auf die Therapie mit Etanercept anspricht. Möglicherweise sind die Gründe dafür in der G6PI-induzierten Arthritis und bei diesen Patienten die gleichen, so dass mit Hilfe des G6PI-induzierten Arthritismodells neue therapeutische Ansätze gefunden werden können, z.B. durch die Blockade von IL-6 oder IL-17. Auch IL-6 kann in synovialem Gewebe von RA-Patienten gefunden werden (Okamoto et al. (1997)). Die Konzentration von IL-6 und seinem löslichen Rezeptor in der Synovialflüssigkeit von RA-Patienten ist erhöht und korreliert mit der Gelenkzerstörung (Kotake et al. (1996)). DBA/1 IL-6-/- Mäuse entwickeln keine, bzw. nur eine verzögerte CIA, deren Verlauf milder ist als in den Wildtyp Tieren (Alonzi et al. (1998), Sasai et al. (1999)). IL-6 ist unter anderem bekannt dafür, dass es die Proliferation und Differenzierung von B-Zellen induziert (Van Damme et al. (1987)). Eine entscheidende Rolle des IL-6 könnte also darin liegen, dass es unterstützend bei der Generierung von Antikörpern gegen G6PI in der Milz wirkt. Ein Fak[Seite 120↓]tor, der diese Hypothese unterstützt ist, dass IL-6 hauptsächlich von CD4+ T-Zellen der Milz produziert wird, dem Ort, wo wahrscheinlich die B-Zellreifung zu anti-G6PI Antikörper produzierenden Plasmazellen stattfindet. Auch in RA-Patienten konnte eine direkte Korrelation zwischen der IL-6 Konzentration in der Synovialflüssigkeit und der Konzentration von IgG gezogen werden (Hermann et al. (1989)). IL-6 besitzt stimulatorische Aktivität auf Osteoklasten, so dass ähnlich wie beim TNF-α auch IL-6 die Knochenbildung inhibieren und -resorption fördern könnte (Roodman (1992)). Für diesen Punkt spricht auch, dass in IL-6 defizienten Mäusen eine Antigen induzierte Arthritis sehr mild verläuft, ohne dass es zu einer Zerstörung des Knochens kommt (Ohshima et al. (1998)). In DBA/1 IL-6-/- Mäusen wird die T-Zellantwort in Richtung einer Th2 Antwort verschoben (Sasai et al. (1999)), so dass eine Funktion des IL-6 auch sein könnte, dass eine Immunreaktion gegen G6PI eher in Th1 Richtung läuft und somit die Entzündung vermittelt. IL-6 spielt auch eine Rolle bei der durch IL-1 induzierten Produktion von einigen Matrixmetalloproteinasen und deren Inhibitoren. IL-6 kann in das Gleichgeweicht zwischen degradierenden Enzymen und ihren Inhibitoren eingreifen und dieses Gleichgewicht empfindlich in Richtung Degradation stören kann (Ito et al. (1992)). Alle diese beschriebenen Funktionen könnten auch in der G6PI-induzierten Arthritis zu der massiven Zerstörung des Knorpels und der Knochen beitragen.

In der Synovialflüssigkeit von RA-Patienten kann IL-17 gemessen werden und T-Zellklone, die aus RA-Patienten gewonnen und expandiert wurden, exprimieren IL-17 (Aarvak et al. (1999), Ziolkowska et al. (2000)). In der CIA konnte gezeigt werden, dass IL-17-/- Mäuse eine Arthritis mit geringer Inzidenz entwickeln (Nakae et al. (2003)). IL-17 induziert allein oder zusammen mit IL-1 die Expression von Metalloproteinasen in Synoviozyten. Dieser Effekt kann durch einen blockierenden anti-IL-17 Antikörper aufgehoben werden (Chabaud et al. (2000)). IL-1, IL-17 und TNF-α haben einen synergistischen Effekt auf die Expression von MIP3α, einem Chemokin, welches einen Einfluss auf die Migration von T-Gedächtniszellen und immaturen dendritischen Zellen von RA-Patienten hat (Chabaud et al. (2001)). Zusammengefasst wird deutlich, dass die in der G6PI-induzierten Arthritis von CD4+ T-Zellen exprimierten Zytokine jedes für sich massive pro-inflammatorische Eigenschaften besitzt, die durch synergistische Effekte noch verstärkt werden können. Die Tatsache, dass die Depletion der CD4+ T-Zellen in der Effektorphase zu einer schnellen Abnahme der Arthritis führt, zeigt, dass die CD4+ T-Zellen und somit möglicherweise auch ihre produzierten Zytokine massiv an der Entwicklung beteiligt sind. In Zukunft muss auch mit Hilfe von IL-6 und IL-17 defizienten Mäusen oder aber mit Hilfe von Antikörpern bzw. löslicher Rezeptoren gegen IL-6 und IL-17 gezeigt werden, welche Rolle sie in der G6PI-induzierten Arthritis spielen. Daneben [Seite 121↓]gibt es auch noch andere Zytokine, die für die Entwicklung der Arthritis von Bedeutung sein könnten. Hierzu zählt insbesondere IL-1, wo schon deutlich gezeigt werden konnte, dass es in RA und auch in unterschiedlichen Tiermodellen wichtig ist.

5.2.6 Die Rolle von CD4+CD25+ T-Zellen in der G6PI-induzierten Arthritis

Die CD4+ T-Zellen der nicht-suszeptiblen Stämme lassen sich nicht mit G6PI restimulieren. In den DBA/1 Mäusen nimmt die Arthritis zwei Tage nach der maximalen CD4+ T-Zellantwort in den inguinalen Lymphknoten wieder ab. An diesen Beobachtungen könnten möglicherweise regulatorische CD4+CD25+ Zellen beteiligt sein. Diese Zellen könnten in den nicht-suszeptiblen Stämmen verhindern, dass potentiell autoreaktive G6PI-spezifische CD4+-T-Zellen aktiviert werden und proliferieren. Außerdem könnten diese Zellen auch dafür verantwortlich sein, dass nach der Induktion der G6PI-induzierten Arthritis in den DBA/1 Mäusen die CD4+ T-Zellantwort bzw. die gesamte Immunantwort gegen G6PI herunter reguliert wird. Bei den regulatorischen T-Zellen handelt es sich um eine Population von ca. 10% der CD4+ T-Zellen, den CD4+CD25+ T-Zellen (Sakaguchi et al. (1995)). Diese Zellen sind anerg und unterbinden die Proliferation anderer nicht-regulatorischer T-Zellen. Im Laufe der Jahre konnte gezeigt werden, dass diese Population von T-Zellen das Potential hat, Autoimmunkrankheiten wie zum Beispiel Diabetes, Arthritis und entzündliche Darmerkrankungen in Tierversuchen zu verhindern bzw. durch deren Fehlen, die Erkrankungen zu verschlimmern (Homann und von Herrath (2004), Martin et al. (2004), Morgan et al. (2003)). In der G6PI-induzierten Arthritis sollte daher untersucht werden, ob CD4+CD25+ T-Zellen den Verlauf der Arthritis in DBA/1 Mäusen beeinflussen können bzw. in den nicht-suszeptiblen Stämmen eine Arthritis verhindern. Dazu wurden in DBA/1 Mäusen und in nicht-suszeptiblen BALB/c Mäusen die CD4+ CD25+ T-Zellen durch einen depletierenden Antikörper entfernt und die Tiere anschließend mit G6PI immunisiert. Die DBA/1 Mäuse entwickelten eine Arthritis mit chronischem Verlauf, während die BALB/c Mäuse klinisch kaum Zeichen einer Arthritis zeigten (Kap. 4.4.8). Histologisch konnte in den BALB/c Mäusen jedoch in einigen Tieren eine leichte Synovitis festgestellt werden. Diese Ergebnisse zeigen ganz deutlich, dass regulatorische T-Zellen einen wichtigen Einfluss auf den Verlauf der G6PI-induzierten Arthritis in DBA/1 Mäusen haben. Diese Zellen scheinen die CD4+ T-Zellantwort nach einer primären Antwort gegen G6PI zu regulieren. Dies könnte eine Erklärung sein, warum die Arthritis nach 15 Tagen langsam wieder abnimmt. Somit stimmen die Ergebnisse gut mit dem vorher beschriebenen Depletionsexperiment überein. In einem Fall werden die CD4+ T-Zellen ganz entfernt und können dadurch die Arthritis nicht aufrechterhalten, im anderen Fall wird ihre Funktion durch CD4+CD25+ T-Zellen supprimiert. In der Zukunft muss durch Transferexpe[Seite 122↓]rimente gezeigt werden, ob die CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen erst durch die Immunreaktion gegen G6PI gebildet werden oder schon vorher vorhanden waren. Dies könnte ein bedeutender Unterschied zwischen dem DBA/1 Stamm und den anderen nicht-suszeptiblen Stämmen sein. Die Entwicklung einer leichten Synovitis in den BALB/c Tieren macht deutlich, dass auch in diesem Stamm die Toleranz gegenüber G6PI durch die Depletion der CD4+CD25+ T-Zellen teilweise überwunden werden konnte. Somit scheint es in der Peripherie tatsächlich autoreaktive G6PI-spezifische CD4+ T-Zellen zu geben, die nach Entfernung der regulatorischen Zellen in der Lage sind, eine schwache Entzündung in den Gelenken hervorzurufen. Gleichzeitig wird aber auch deutlich, dass die CD4+CD25+ T-Zellen allein nicht verantwortlich sind für das Ausbleiben einer Arthritis in den nicht-suszeptiblen Stämmen, da die beobachtete Entzündung nur minimal ist.

5.3 Zusammenfassung und Ausblick

G6PI ist mit großer Wahrscheinlichkeit nicht das wesentliche Autoantigen ist, welches für die Pathogenese der RA verantwortlich ist und spielt möglicherweise nur in einer Subpopulation von RA-Patienten eine Rolle. Die G6PI-induzierte Arthritis, die in dieser Arbeit etabliert wurde, reflektiert histopathologisch sehr gut die rheumatoide Arthritis und eignet sich deshalb und auch wegen der leichten Induzierbarkeit sehr gut als ein Tiermodell für RA. Dieses Modell kann sehr gut verwendet werden, um mögliche therapeutisch relevante Zielmoleküle zu testen. Mit Hilfe des löslichen Rezeptors für TNF-α (Enbrel®) konnte das für TNF-α schon gezeigt werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die G6PI-induzierte Arthritis durch eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen reguliert wird. In diesem Modell findet man eine Verknüpfung der adaptiven, humoralen und angeborenen Immunität und es scheint, dass eine Arthritis nur dann induziert werden kann, wenn alle Komponenten in einem streng reguliertem Rahmen zusammenwirken. Das modulieren einzelner Komponenten, sei es durch die Depletion der CD4+-Zellen, das Entfernen des Komplementfaktors C5, der Blockierung von TNF-α, der Verwendung Fcγ-R defizienter Mäuse oder der Depletion regulatorischer T-Zellen führt sofort zu einem veränderten Verlauf der Arthritis. In der Zukunft muss vor allem die Rolle der anti-G6PI Antikörper genauer untersucht werden. Mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen G6PI kann dann deren Spezifität, ihre Epitope und Affinität mit Antikörpern anderer Stämme verglichen werden. Zusätzlich muss besonderen Wert auf die Rolle der T-Zellen gelegt werden, da sie das zentrale Element in der G6PI-induzierten Arthritis sind. Hier sollte vor allem untersucht werden, welche Eigenschaften die T-Zellen haben, die in das Gelenk migrieren, z.B. in Form der Zytokine, die sie dort exprimieren und mit welche Zellen sie [Seite 123↓]interagieren. Weiterhin muss auch die Generierung autoreaktiver G6PI-spezifischer T-Zellen im Thymus und ihre Kontrolle in der Peripherie analysiert werden. Zusätzlich sollte auch die Rolle der Makrophagen, Neutrophilen und Mastzellen untersucht werden. Insgesamt wurde mit der G6PI induzierten Arthritis zum ersten Mal gezeigt, dass die Immunisierung mit einem systemischen Antigen eine organspezifische Erkrankung in Form einer Arthritis induzieren kann. Damit wurde ein Modell etabliert, welches die Lücke zwischen dem K/BxN-Modell und der komplexen humanen Situation schließt und die Untersuchung pathologisch relevanter Mechanismen und therapeutischer Strategien ermöglicht.


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24.06.2005