Tab. 4.1: Liste der detektierten Peptide der M-Kette der Kreatinkinase nach MALDI-MS und Datenbankanalyse durch MS-Fit. Die nach Trypsinverdau und MALDI-MS gemessenen Massen der detektierten Peptide im Masenspektrum wurden einer Datenbanksuche mit dem Programm MS-Fit (http://falcon.ludwig.ucl.ac.uk-/ucsfhtml3.2/msfit.htm) unterzogen. Die Analyse identifizierte das Protein als die M-Kette der Kaninchen Kreatinkinase. Dargestellt wurden die Massen der einzelnen Peptide in Da (m/z), sowie der Bereich und die Sequenz der Kreatinkinase, die das entsprechende Peptid abdeckt. Außerdem wurden Modifikationen an den entsprechenden Peptiden dargestellt. Insgesamt deckten die detektierten Peptide 64% der Sequenz der M-Kette der Kaninchen Kreatinkinase ab.

Tab. 4.2: Arthritisinduktion durch Immunisierung mit rhG6PI. Mäuse unterschiedlicher Stämme wurden mit rekombinanter humaner G6PI in komplettem Freundschen Adjuvans an der Schwanzbasis immunisiert und über einen Zeitraum von mindestens 30 Tagen auf klinische Zeichen einer Arthritis beobachtet.

Tab. 4.3: Transfer der Arthritis durch Transfer aufgereinigter Antikörper in DBA/1 Mäuse. Serum von DBA/1 Mäusen mit Arthritis 14-18 Tage nach Immunisierung mit rhG6PI wurde gewonnen und die Ig Fraktion über eine Protein G Säule aufgereinigt. Unterschiedliche Mengen der Ig-Fraktion wurden an Tag 0 und Tag 2 naiven DBA/1 Mäusen oder DBA/1 Mäusen, die 7 Tage zuvor mit PBS/CFA immunisiert wurden, i.p. in PBS verabreicht. Einige der naiven DBA/1 Mäuse erhielten 2 Tage nach der ersten Antikörpergabe zusätzlich 50µg LPS in PBS i.p. Über eine Zeitraum von 30 Tagen wurden die Tiere auf klinische Zeichen einer Arthritis beobachtet.

Abb. 1.1: Rheumatoide Veränderungen an der Hand. Die chronische Entzündung der metacarpophalan-gealen Gelenke führt zur Deformation der Hände mit einer Deviation der Finger. Copyright©2002, The School of Medicine of the University of California, San Diego, Katalog für medizinische Bilder

Abb. 1.2: Schematische Darstellung eines normalen Gelenks und seine Veränderung in RA. Ein normales synoviales Gelenk (links) besteht aus zwei Knochenenden, die mit Knorpel überzogen sind und von der Gelenkkapsel umgeben sind. Das Synovium ist dünn und die Deckzellschicht besteht aus einer Schicht von 1-3 Synoviozyten. Im Gegensatz dazu ist im rheumatoiden Gelenk (rechts) die Synovialmembran entzündet, und eine massive Infiltration durch T-, B- und Plasmazellen, sowie dendritische Zellen, Makrophagen und Mastzellen kann beobachtet werden. Zusätzlich findet Angiogenese statt und es kommt zur Pannusformation, der Osteoklasten enthält. ( Leicht verändert aus: Smolen JS und Steiner G. Nat Rev Drug Discov. 2003 Jun;2(6):473-88)

Abb. 1.3: Das K/BxN Mausmodell der rheumatoiden Arthritis. Die K/BxN Mäuse entstehen aufgrund der Kreuzung des KRN Stamms, der transgen für einen T-Zellrezeptor (TZR) ist, der ein Peptid der bovinen Pankreas RNAse im Kontext einer I-A^k Präsentation erkennt, und des NOD-Stamms, der I-A^g7 exprimiert. Die K/BxN Mäuse entwickeln spontan eine antikörpervermittelte Arthritis aufgrund der Erkennung eines Epitops der Glukose-6-phosphat Isomerase durch den transgenen T-Zellrezeptors im Kontext einer I-A^g7 Präsentation. Dies führt zur Aktivierung der transgenen T-Zellen und später auch der B-Zellen, die hohe Titer pathogener anti-G6PI Antikörper produzieren.

Abb. 4.1: Kein Nachweis G6PI spezifischer T-Helferzellen im Blut von RA-Patienten. Blut eines Patienten mit rheumatoider Arthritis wurde für 6 Stunden mit anti-CD28 alleine oder zusätzlich mit rhG6PI, dem Superantigen SEB (Staphylokokken Enterotoxin B), dem Ova-Protein (Ovalbumin) oder rekombinanten OspA (outer surface protein A) restimuliert. 2 Stunden nach Beginn der Restimulation wurde die Zytokinsekretion durch Zugabe von Brefeldin A gestoppt. Nach 6 Stunden wurden die Zellen gegen CD4 und CD69 gefärbt, fixiert und intrazellulär gegen TNF-α und IFN-γ gefärbt und im FACS analysiert. Gezeigt ist eine beispielhafte Messung eines von insgesamt 13 untersuchten Patienten.

Abb. 4.2: Keine unterschiedliche IFN-γ Produktion der T-Helferzellen von RA-Patienten und gesunden Spendern nach Restimulation mit unterschiedlichen Antigenen. Blut oder mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC) von Patienten mit rheumatoider Arthritis oder von gesunden Spendern wurde für 6 Stunden mit anti-CD28 alleine oder zusätzlich mit rhG6PI, dem Superantigen SEB (Staphylokokken Enterotoxin B) oder den irrelevanten Antigenen Ovalbumin (Ova) und dem rekombinanten OspA (outer surface protein A) restimuliert. 2 Stunden nach Beginn der Restimulation wurde die Zytokinsekretion durch Zugabe von Brefeldin A gestoppt. Nach 6 Stunden wurden die Zellen gegen CD4 und CD69 gefärbt, fixiert und intrazellulär gegen IFN-γ gefärbt und im FACS analysiert. Jede Messung ist als % IFN-γ produzierender CD4⁺CD69⁺ Zellen dargestellt. Zusätzlich sind alle Messungen einer Gruppe auch gemittelt dargestellt.

Abb. 4.3: Keine unterschiedliche TNF-α Produktion der T-Helferzellen von RA-Patienten und gesunden Spendern nach Restimulation mit unterschiedlichen Antigenen. Blut oder mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC) von Patienten mit rheumatoider Arthritis oder von gesunden Spendern wurde für 6 Stunden mit anti-CD28 alleine oder zusätzlich mit rhG6PI, dem Superantigen SEB (Staphylokokken Enterotoxin B), dem Ovalbumin (Ova) oder rekombinanten OspA (outer surface protein A) restimuliert. 2 Stunden nach Beginn der Restimulation wurde die Zytokinsekretion durch Zugabe von Brefeldin A gestoppt. Nach 6 Stunden wurden die Zellen gegen CD4 und CD69 gefärbt, fixiert und intrazellulär gegen TNF-α gefärbt und im FACS analysiert. Jede Messung ist als % TNF-α produzierender CD4⁺CD69⁺ Zellen dargestellt. Zusätzlich sind alle Messungen einer Gruppe auch gemittelt dargestellt.

Abb. 4.5: SDS-PAGE der G6PI Präparationen und Immunoblot Analyse eines Patienten Serums. Die Präparationen der rekombinanten humanen G6PI und der kommerziell erhältlichen Kaninchen G6PI wurden in einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und die Proteine mit Coomassie Blau angefärbt. Zusätzlich wurden beide Präparationen auf Nitrocellulose transferiert. Das Serum einiger Patienten, die im ELISA erhöhte Antikörpertiter gegen das Kaninchen G6PI aufwiesen, wurden im Immunoblot auf die Spezifität ihrer Antikörper gegen G6PI getestet. Die Bindung von Antikörpern an eines der aufgetrennten Proteine beider Präparationen wurde mit einem Peroxidase-konjugiertem anti-human IgG Sekundärantikörper detektiert. Ein Beispiel ist gezeigt.

Abb. 4.6: Massenspektrum eines potentiellen Autoantigens bei RA. Nach Auftrennung der Kaninchen G6PI Präparation mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde eine Bande bei ca. 40kDa ausgeschnitten. Dieses Protein wurde zuvor im Immunoblot von IgG-Antikörpern aus dem Serum einiger Patienten mit RA und anderen rheumatischen Erkrankungen spezifisch gebunden. Das Protein wurde mit Trypsin verdaut und einem peptide mass fingerprint (PMF) mittels einer MALDI-MS (matrix assisted laser desorption – ionization mass spectrometry) Messung unterzogen. Die dargestellten Signale stellen die detektierten Peptide dar. Die Zahlen an der Spitze der Signale geben die Masse der detektierten Peptide in Da an. Es wurden keine Peptide berücksichtigt, die kleiner als 500 Da waren. Insgesamt wurden 21 der 24 gemessenen Peptide für die Analyse des PMF herangezogen. Die MALDI-MS Analyse wurde von Peter Jungblut und Monika Schmidt am MPI für Infektionsbiologie durchgeführt.

Abb. 4.7: Detektion von Autoantikörpern gegen die M-Kette der Kreatinkinase. Serum von 61 Patienten mit RA, 21 Patienten mit anderen rheumatischen Erkrankungen sowie Serum von 32 gesunden Spendern wurde 1:50 verdünnt und im ELISA auf die Anwesenheit von anti-Kreatinkinase M-Kette Antikörpern untersucht. Ein Serum wurde als positiv auf die Anwesenheit von anti-CK-M Antikörpern bewertet, wenn die Absorption bei 450nm größer war als die mittlere Absorption der gesunden Spender plus zwei Standardabweichungen. Die durchgezogene Linie markiert diese Absorption.

Abb. 4.8: Arthritisinduktion bei DBA/1 Mäusen. DBA/1 Mäuse wurden mit rekombinanter humaner G6PI in CFA oder mit PBS/CFA subkutan an der Schwanzbasis immunisiert. PBS/CFA immunisierte Mäuse zeigten 15 Tage nach Immunisierung keine klinischen Anzeichen einer Arthritis in den Vorder- (links oben) und Hinterpfoten (links unten). Im Gegensatz dazu entwickelten DBA/1 Mäuse nach subkutaner Immunisierung mit rhG6PI/CFA eine schwere symmetrische Arthritis in den Vorder- (rechts oben) und Hinterpfoten (rechts unten).

Abb. 4.9: Klinischer Verlauf der G6PI induzierten Arthritis. 27 DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert und auf die Entwicklung einer Arthritis in den Vorder- und Hinterpfoten beobachtet. Jede Pfote einer Maus wurde einzeln bewertet. Dabei wurde die Arthritis in drei Grade unterteilt. Grad 0: klinisch unauffällig, Grad 1: leichte Schwellung und Rötung, Grad 2: Maximalbefund – massive Schwellung und Rötung. Die Bewertung der 27 Tiere zu jedem Zeitpunkt wurde gemittelt und als Mittel mit SEM dargestellt.

Abb. 4.10: Histologische Arthritisbewertung. HE-Färbungen (100fache Vergrößerung) von Gelenkschnitten der hinteren Pfoten von DBA/1 Mäusen, die mit rhG6PI immunisiert wurden und eine Arthritis entwickelten, bzw. gesunden mit PBS/CFA immunisierten DBA/1 Mäusen. Bei der Bewertung der Entzündung in den Gelenken der Mäuse wurden fünf Kriterien berücksichtigt: Synovitis, Tenosynovitis, Periostitis, Periarthritis und das Maß der Destruktion des Knorpels und des Knochens des betroffenen Gelenks. Jedes Kriterium wurde in vier unterschiedliche Schweregrade eingeteilt. Der Grad 0 entsprach dem Normalbefund bei einer gesunden Maus. Die Grade 1-3 entsprachen leichten, mittleren und schweren Befunden eines jeden Kriteriums. Die Punkte aller Kriterien wurden addiert und bildeten den Arthritisgrad des untersuchten Gelenks. 15 war somit der maximale Arthritisgrad, der bei einem Gelenk erreicht werden konnte.

Abb. 4.11: Histologischer Verlauf der G6PI-induzierten Arthritis in DBA/1 Mäusen. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. Zu jedem Zeitpunkt wurden 3 Mäuse histologisch nach oben eingeführtem Arthritisskalierungssystem bewertet. Dabei wurde jede Pfote einzeln bewertet und die Ergebnisse addiert. Die Ergebnisse der einzelnen Mäuse pro Zeitpunkt wurden gemittelt und sind als Mittel mit SEM dargestellt.

Abb. 4.12: Reparaturprozesse nach Arthritisinduktion mit rhG6PI. HE-Färbung (100fache Vergrößerung) eines Gelenkschnittes einer DBA/1 Maus nach Immunisierung mit rhG6PI und abgeklungener Arthritis an Tag 22 nach Immunisierung. Histologisch konnte kein aktiver inflammatorischer Prozess mehr beobachtet werden. Regenerative Prozesse wie Fibrose und Knorpelregeneration überwogen.

Abb. 4.13: Keine Infiltrate in den Gelenken der klinisch unauffälligen Mausstämme nach G6PI Immunisierung. Unterschiedliche Mausstämme wurden mit rhG6PI immunisiert, um eine Arthritis zu induzieren. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Gelenke der Vorder- und Hinterläufe der Mäuse histologisch untersucht. Gezeigt wird eine HE-Färbung (100fache Vergrößerung) der Gelenkschnitte einer hinteren Pfote von den Mausstämmen B10.A, B10.Q, AKR, DR4mix, BALB/c und C57BL/6 an Tag 10 nach Immunisierung mit G6PI in CFA. Zum Vergleich werden Gelenkschnitte der gleichen Mausstämme gezeigt 40 Tage nach Immunisierung mit PBS in CFA. Pro Zeitpunkt wurden zwei Tiere jedes Stammes untersucht. In keinem der Gelenke konnte eine Infiltration inflammatorischer Zellen beobachtet werden.

Abb. 4.14: Keine Entzündung der inneren Organe und Wirbelsäule in der G6PI-induzierten Arthritis. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. An den Tagen 9, 12, 15, 18, 22, 26 und 30 nach Immunisierung wurden die inneren Organe und die Wirbelsäule von je drei Tieren histologisch untersucht. Gezeigt wird eine HE-Färbung (100fache Vergrößerung) von Schnitten der Milz, Leber, Herz, Lunge, Niere und Wirbelsäule einer DBA/1 Maus mit Arthritis an Tag 12 nach Immunisierung mit rhG6PI. Weder in den Gelenken der Wirbelsäule noch in den inneren Organen konnte eine inflammatorische Aktivität beobachtet werden.

Abb. 4.15: Murine G6PI induziert Arthritis in DBA/1 Mäusen. DBA/1 Mäuse wurden mit rekombinanter muriner G6PI (Quadrate) oder rekombinanter humaner G6PI (Dreiecke) immunisiert und über 30 Tage beobachtet. 8/10 DBA/1 Mäuse nach Immunisierung mit rmG6PI und 9/9 DBA/1 Mäuse nach Immunisierung mit rhG6PI entwickelten eine Arthritis (A). Der klinische Verlauf zwischen beiden Gruppen zeigte keine signifikanten Unterschiede auf, da der Mann-Whitney Test zu jedem Zeitpunkt P > 0,05 lieferte (B). Im klinischen Verlauf wurden nur die Tiere dargestellt, die auch erkrankten.

Abb. 4.16: Arthritisinduktion mit denaturierter rhG6PI.DBA/1 Mäuse wurden mit nativer rhG6PI (Quadrat) oder denaturierter rhG6PI (Dreieck) immunisiert und über 30 Tage auf die Entwicklung einer Arthritis beobachtet. 9/9 DBA/1 Mäuse immunisiert mit nativer rhG6PI bzw. 9/10 DBA/1 Mäuse immunisiert mit denaturierter rhG6PI entwickelten eine Arthritis (A). Der klinische Verlauf beider Gruppen zeigte keine signifikanten Unterschiede auf (P > 0,05)(B).

Abb. 4.17: Arthritisinduktion mit Kaninchen G6PI. 5 DBA/1 Mäuse wurden mit Kaninchen G6PI immunisiert und über einen Zeitraum von 32 Tagen auf klinische Zeichen einer Arthritis beobachtet. Alle Tiere entwickelten nach 10 Tagen eine Arthritis (A), die an Tag 15 ihr Maximum erreichte und bis Tag 24 auf diesem Niveau blieb (B). An Tag 30 waren kaum noch klinische Zeichen einer Arthritis zu beobachten.

Abb. 4.18: Aktivität der Glukose-6-phosphat Isomerase im Serum. Serum aus je 3 naiven DBA/1, BALB/c und C57BL/6 Mäusen wurde gewonnen. Die Aktivität der G6PI im Serum wurde enzymatisch bestimmt. Je Stamm wurden 3 Tiere untersucht.

Abb. 4.19: IgG-Antwort gegen rhG6PI oder rmG6PI in DBA/1 Mäusen nach Immunisierung mit rhG6PI. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden von je drei Tieren Serum gewonnen, seriell verdünnt und die IgG-Antwort gegen rmG6PI (gefüllte Balken) und rhG6PI (offene Balken) im ELISA gemessen. Die höchste Serumverdünnung bei der anti-G6PI Antikörper noch detektierbar waren, wurden als Mittel ± SEM dargestellt.

Abb. 4.20: Auch die nicht-suszeptiblen Stämme entwickeln Antikörper gegen G6PI. Mäuse nicht-suszeptibler Mausstämme für die G6PI-induzierte Arthritis wurden mit rhG6PI immunisiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurde von je zwei Tieren Serum gewonnen, seriell verdünnt und die IgG-Antwort gegen rhG6PI (Abbildung A) und rmG6PI (Abbildung B) im ELISA gemessen. Die höchste Serumverdünnung bei der anti-G6PI Antikörper noch detektierbar waren, wurden als Mittel ± SEM dargestellt.

Abb. 4.21: Antikörperantwort unterschiedlicher Ig-Isotypen gegen rhG6PI nach Immunisierung mit rhG6PI in DBA/1 Mäusen. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde von 3 Mäusen Serum gewonnen. Das Serum wurde seriell verdünnt und im ELISA auf die Anwesenheit isotypspezifischer anti-rhG6PI Antikörper getestet. Die Antikörpertiter der unterschiedlichen Isotypen zu jedem Zeitpunkt wurden als Mittel ± SEM dargestellt.

Abb. 4.22: Die Bildung von anti-dsDNS- und anti-Kollagen II Antikörpern sowie Rheumafaktoren nach Arthritisinduktion.DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. Zwischen den Tagen 14-18 nach Immunisierung wurde Serum von 35 Mäusen mit Arthritis gewonnen und gemischt. Außerdem wurde Serum aus einer 12 Wochen alten MRL/lpr Maus gewonnen. Im ELISA wurden die Seren seriell verdünnt und auf die Anwesenheit von Rheumafaktoren (anti-IgG-Maus-IgM) (A) und Antikörper gegen doppelsträngige DNS (anti-dsDNS-IgG) untersucht (B). Zusätzlich wurde Serum von einer mit PBS/CFA bzw. mit murinem Kollagen II/CFA (CII) immunisierten DBA/1 Maus gewonnen und im ELISA zusammen mit dem gemischtem Serum der Mäuse nach G6PI Immunisierung auf die Anwesenheit von anti-Kollagen-II Antikörpern untersucht (C).

Abb. 4.23: Histologische Untersuchung einer hinteren Pfote nach Ig-Transfer und LPS-Aktivierung. Einer DBA/1 Maus wurde 2x5mg einer aus dem Serum von arthritischen DBA/1 Mäusen aufgereinigten Ig-Fraktion i.p. injiziert. Zusätzlich wurde dem Tier 50µg LPS i.p. an Tag 2 injiziert. Gezeigt sind HE-Schnitte (100x Vergrößerung) 24 Tage nach Ig-Transfer vom Fußknöchel (A) und von einem tarsalem Gelenk (B).

Abb. 4.24: Die Rolle der Fcγ-Rezeptoren in der G6PI-induzierten Arthritis. Wildtyp DBA/1 Mäuse, DBA/1 FcγRIIB^-/- Mäuse und DBA/1 Mäuse, die defizient für die gemeinsame γ-Kette waren wurden mir rhG6PI immunisiert und der klinische Verlauf der Arthritis über einen Zeitraum von 54 Tagen verfolgt. Gezeigt wird der mittlere klinische Index ± SEM der Tiere, die eine Arthritis entwickelten. Die Inzidenz der Arthritis lag bei den Wildtyp DBA/1 Mäusen bei 10/11 Tieren, bei den FcγRIIB^-/- Mäusen bei 16/16 und 8/24 bei den DBA/1 Mäusen, die defizient für die gemeinsame γ-Kette waren.

Abb. 4.25: HE-färbung eines Gelenkschnit-tes (100x Vergrößerung) an Tag 21 nach Arthritisinduktion in einer DBA/1 Fc γ RIIB ^-/- Maus. DBA/1 FcγRIIB^-/- Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert und an Tag 21 histologisch untersucht. Gezeigt wurde eine schwere Synovitis (Pfeil), Periostitis (*), Tenosynovitis (Pfeilkopf) und Periarthritis (Ο) des Sprunggelenks an einer hinteren Pfote der Maus. Der eingefügte Schnitt zeigt einen Ausschnitt (200x Vergrößerung) aus dem Überblicksschnitt. Hier konnten deutlich multinukleäre Osteoklasten (Ο), eine gerissene Sehne mit nekrotischem Gewebe (Pfeil), sowie dichte inflammatorische Infiltrate beobachtet werden (Pfeilköpfe). Außerdem kam es zur Pannusformation (*), welcher aus Lymphozyten, Fibroblasten, Mastzellen, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten bestand und zur Zerstörung des Knochen führte.

Abb. 4.26: Antikörpertiter gegen G6PI nach Arthritisinduktion in DBA/1 Fc γ RIIB ^-/- und Fc γ R ^-/- Mäusen. Je fünf DBA/1 FcγRIIB^-/- und ^{FcRγ-/- Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. An Tag 21 wurde Serum gewonnen und im ELISA auf die Anwesenheit von Antikörpern, die gegen rhG6PI und rmG6PI gerichtet waren, untersucht. Die höchste Serumverdünnung bei der anti-G6PI Antikörper noch detektierbar waren, wurde als Mittel ± SEM dargestellt.}

Abb. 4.27: Die Rolle des C5 Komplementfaktors in der G6PI-induzierten Arthritis. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. An Tag 6, 9 und 12 wurden 10 Tiere mit dem C5 depletierenden Antikörper BB5.1 durch i.p. Injektion behandelt (Quadrate). 5 Tiere blieben unbehandelt (Dreiecke). Die Tiere wurden über einen Zeitraum von 30 Tagen hinsichtlich der Inzidenz mit der die Arthritis auftrat (A) beobachtet. Die Tiere, die eine Arthritis entwickelten, gingen in den klinischen Verlauf ein (B). Gezeigt wurde der mittlere klinische Index ± SEM.

Abb. 4.28: Komplementaktivität nach Depletion von C5 in DBA/1 Mäusen. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. Das Komplementprotein C5 wurde durch i.p. Injektion von 750 µg des Antikörpers BB5.1 an den Tagen 6, 9 und 12 depletiert. Das Serum dieser Tiere und von unbehandelten Kontrolltieren wurde an Tag 14 nach Immunisierung gewonnen. Sensitivierte Schafserythrozyten wurden mit dem gewonnenen Serum zusammen mit einem C5-defizientem humanen Serum inkubiert. Zur Kontrolle wurden die Erythrozyten nur mit den murinen Kontrollseren oder nur mit dem C5 defizientem Serum inkubiert. Das durch die Lyse freigesetzte Hämoglobin wurde photometrisch vermessen und daraus die mittlere % Lyse ± SEM bestimmt. Die Werte setzten sich aus 10 Tieren, die behandelt wurden, und drei Kontrolltieren zusammen.

Abb. 4.29: Poliferation von Zellen der inguinalen Lymphknoten nach Restimulation mit rhG6PI. Zellen der inguinalen Lymphknoten von DBA/1 Mäusen (A) oder anderer nicht-suszeptibler Mausstämme (B) wurden zu unterschiedlichen Zeiten nach Immunisierung mit rhG6PI für 72h in 96 Muldenplatten kultiviert. Die Zellen blieben unstimuliert oder wurden mit 10µg/ml rhG6PI restimuliert. In den letzten 16h der Kultur wurde 1µCi ³H-Thymidin zugegeben. Die Proliferation wurde am β-Szintillationszähler gemessen. Der Stimulationsindex war dabei der Quotient aus den Werten, die für rhG6PI restimulierte Zellen gemessen wurden und den Werten , die für die unstimulierten Zellen gemessen wurde. Der Stimulationsindex wurde als Mittel ± SEM angegeben. Zu jedem Zeitpunkt wurden 3 DBA/1 Mäuse bzw. 2 Mäuse anderer Stämme benutzt.

Abb. 4.30: Proliferation der CD4 T-Lymphozyten nach Restimulation mit rhG6PI. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI/CFA oder mit PBS/CFA immunisiert. An Tag 11 nach Immunisierung wurden die inguinalen Lymphknoten entnommen und die Zellen mit CFDA-SE markiert. Anschließend wurden die Zellen mit rhG6PI oder rmG6PI restimuliert bzw. blieben unstimuliert. Danach wurden die Zellen gegen CD4 gefärbt, im FACS analysiert und über die Abnahme der CFDA-SE-Intensität die Proliferation bestimmt. Dargestellt ist exemplarisch eine Messung für 1 von 3 Tieren zu diesem Zeitpunkt.

Abb. 4.31: CD4 ⁺ Zellen exprimieren TNF- α , IL-6 und IL-17 nach Restimulation mit rhG6PI. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. 11 Tage später wurden die Milz und die inguinalen Lymphknoten entnommen. Die Zellen wurden für 6h mit rhG6PI restimuliert, anschließend CD4 gefärbt, fixiert und intrazellulär gegen IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ und TNF-α gefärbt. Die Spezifität der Färbungen wurde mittels Isotypantikörper kontrolliert. Die Frequenz der positiven Zellen in den Quadranten ist in % der CD4⁺ Zellen angegeben. Gezeigt wird die repräsentative Färbung der inguinalen Lymphknoten einer von drei Mäusen an Tag 11.

Abb. 4.32: Zytokinexpression von CD4⁺ Zellen nach Restimulation mit rhG6PI. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. 6, 9 und 11 Tage später wurden die Milz und die inguinalen Lymphknoten entnommen. Die Zellen wurden mit rhG6PI restimuliert, anschließend CD4 gefärbt, fixiert und intrazellulär gegen IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ und TNF-α gefärbt. Dargestellt wurden die Ergebnisse von 3 Tieren pro Zeitpunkt als Mittel der Zytokinproduktion der CD4⁺-Zellen ± SEM.

Abb. 4.33: Prävention der G6PI-induzierten Arthritis durch TNF-Blockade. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. 20 DBA/1 wurden mit 100µg des dimeren löslichen TNF-Rezeptors p75, der mit dem Fc-teil des humanen IgG₁ fusioniert wurde, behandelt (Etanercept). Die Behandlung erfolgte an den Tagen 0 bis 9 täglich und anschließend jeden dritten Tag. Die Entwicklung der Arthritis wurde über 30 Tage verfolgt (A + B). Etanercept behandelte Tiere entwickelten eine Arthritis mit einer Inzidenz von 30% (6/20) (Quadrate) (A). Dagegen erkrankten 85% der Kontrolltiere (17/20) (Dreiecke). Die erkrankten, mit Etanercept behandelten Tiere zeigten eine verzögerte Entwicklung der Arthritis (B) (Quadrate) mit einem geringeren maximalen mittleren Arthritisgrad als die erkrankten Kontrolltiere (Dreiecke). In dem klinischen Verlauf wurden nur die Tiere berücksichtigt, die eine Arthritis entwickelten und diese wurden als Mittel ± SEM dargestellt.

Abb.4.34: Prävention der G6PI-induzierten Arthritis mit einer geringen Dosis Etanercaept. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert. 15 DBA/1 wurden mit 30µg des dimeren löslichen TNF-Rezeptors p75 behandelt. Die Behandlung erfolgte täglich bis Tag 25 nach Immunisierung. Die Entwicklung der Arthritis wurde über 30 Tage verfolgt (A + B). Etanercept behandelte Tiere entwickelten eine Arthritis mit einer Inzidenz von 67% (10/15) (A, Quadrate). Dagegen erkrankten 100% (8/8) der Kontrolltiere (Dreiecke). Die erkrankten, mit Etanercept behandelten Tiere zeigten eine verzögerte Entwicklung der Arthritis (B, Quadrate) mit einem geringeren maximalen mittleren Arthritisgrad als die erkrankten Kontrolltiere (Dreiecke). In dem klinischen Verlauf wurden nur die Tiere berücksichtigt, die eine Arthritis entwickelten und wurden als Mittel ± SEM dargestellt.

Abb. 4.35: Therapie einer entwickelten Arthritis nach G6PI Immunisierung mit Etanercept. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert, um eine Arthritis zu induzieren. 10 DBA/1 Mäuse wurden mit 100µg des dimeren löslichen TNF-Rezeptors p75 behandelt. Die Behandlung erfolgte täglich von Tag 11 bis Tag 23 nach Immunisierung. Die Entwicklung der Arthritis wurde über 30 Tage verfolgt (A + B). Etanercept behandelte Tiere (A, blaue gefüllte Quadrate) und die 6 Kontrolltiere (A, schwarze gefüllte Dreiecke) entwickelten eine Arthrtis mit einer Inzidenz von 100%. In dem klinischen Verlauf (B) wurden der klinische Index als Mittel ± SEM dargestellt.

Abb. 4.36: Effizienz der CD4-Depletion. DBA/1 Mäusen wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten 300µg des depletierenden Ratte-anti-Maus-CD4 Antikörpers YTS191.1 i.p. injiziert. Zur Kontrolle der Depletion wurde den Mäusen vier Tage nach der letzten Injektion Blut entnommen und gegen CD3, CD4 und CD8 gefärbt und im FACS analysiert. Gezeigt ist die CD4 und CD8 Expression nachdem nur die lebenden CD3⁺ Lymphozyten angezeigt wurden. Im linken Teil der Abbildung ist die CD4 und CD8 Expression der CD3⁺ T-Zellen im peripheren Blut naiver DBA/1 Mäuse gezeigt. Der rechte Teil der Abbildung zeigt die CD4 und CD8 Expression der CD3⁺ T-Zellen im peripheren Blut vier Tage nach der letzten Injektion des Antikörpers YTS191.1.

Abb. 4.37: CD4⁺ Zelldepletion in der Induktionsphase verhindert die G6PI-induzierte Arthritis. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert und der klinische Verlauf der Arthritis über 30 Tage beobachtet. Die CD4⁺ Lymphozyten wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten vor oder nach Immunisierung mit dem depletierenden Ratte-anti-Maus-CD4 Antikörper YTS191.1 durch i.p. Injektion depletiert (Quadrate). Die Kontrolltiere erhielten zu den gleichen Zeitpunkten polyklonales Ratten IgG (Dreiecke). Die Depletion erfolgte zu einem frühen Zeitpunkt an den Tagen –3, 0 und 5 vor bzw. nach Immunisierung (A). Hier ist beispielhaft ein Experiment aus zweien mit je fünf Tieren gezeigt. Bei der Untersuchung des mittleren Abschnittes der Induktionsphase erfolgte die Depletion an den Tagen 6 und 9 nach Immunisierung (B). Auch hier wurde beispielhaft ein Experiment aus zweien mit je fünf Tieren gezeigt. Außerdem wurde die Rolle der CD4⁺ Lymphozyten zu einem sehr späten Zeitpunkt der Induktionsphase untersucht. Hier erfolgte die Depletion an den Tagen 8 und 11 (C). Dargestellt wurden je fünf Mäuse pro Gruppe. Der Verlauf der Arthritisentwicklung wurde als Mittel ± SEM dargestellt.

Abb. 4.38: Antikörpertiter gegen G6PI nach Depletion der CD4⁺ Lymphozyten in der Induktionsphase. DBA/1 Mäuse wurden immunisiert und die CD4⁺ Lymphozyten zu drei Zeitpunkten (früh: Depletion an Tag –3, 0 und 5; mittel: Depletion an Tag 6 und 9; spät: Depletion an Tag 8 und 11) der Induktionsphase mit dem Ratte-anti-Maus-CD4 Antikörper YTS191.1 depletiert. Die Kontrollgruppe erhielt zum gleichen Zeitpunkt polyklonales Ratten IgG. An Tag 23 nach Immunisierung mit rhG6PI wurde das Serum der Tiere gewonnen und im ELISA auf die Anwesenheit von anti-G6PI Antikörpern getestet. Die höchste Serumverdünnung von je fünf Tieren pro Gruppe bei der anti-G6PI Antikörper noch detektierbar waren, wurden als Mittel ± SEM dargestellt. Die Antikörpertiter der Kontrolltiere wurden zusammengefasst und wurden als Mittel ± SEM von insgesamt 14 Tieren dargestellt.

Abb. 4.39: CD4⁺ Zelldepletion in der Effektorphase der G6PI-induzierten Arthritis. DBA/1 Mäuse wurden mit rhG6PI immunisiert und die Inzidenz (A) und der klinische Verlauf der Arthritis (B) über 30 Tage beobachtet. Die CD4⁺ Lymphozyten wurden an den Tagen 11 und 14 nach Immunisierung mit dem Antikörper YTS191.1 durch i.p. Injektion depletiert (Quadrate). Die Kontrolltiere erhielten zur gleichen Zeit polyklonales Ratten IgG (Dreiecke). Insgesamt wurden je 10 Tiere pro Gruppe untersucht. Der klinische Verlauf wurde als Mittel ± SEM je Gruppe dargestellt.

Abb. 4.40: Antikörpertiter gegen G6PI nach Depletion der CD4⁺ Lympozyten in der Effektorphase. DBA/1 Mäuse wurden immunisiert und die CD4⁺ Lymphozyten an den Tagen 11 und 14 in der Effektorphase mit dem Ratte anti-Maus CD4 Antikörper YTS191.1 depletiert. Die Kontrollgruppe wurde zum gleichen Zeitpunkt mit polyklonalem Ratten IgG behandelt. An Tag 23 nach Immunisierung mit rhG6PI wurde das Serum der Tiere gewonnen und im ELISA auf die Anwesenheit von anti-G6PI Antikörpern getestet. Die höchste Serumverdünnung bei der anti-G6PI Antikörper noch detektierbar waren, ist als Mittel ± SEM dargestellt.

Abb. 4.41: Depletion der CD4⁺ CD25⁺ Zellen in der G6PI-induzierten Arthritis. 10 DBA/1 Mäuse wurden an den Tagen –28, -25, -21 und –14 vor Immunisierung mit rhG6PI mit 400µg des CD25⁺ Zellen depletierenden Antikörpers pC61.5 i.p. behandelt (Quadrate). 9 DBA/1 Mäuse blieben unbehandelt und wurden an Tag 0 mit rhG6PI immunisiert (Dreiecke). Die Inzidenz (A) und der klinische Verlauf der Arthritis (B) wurden über einen Zeitraum von 51 Tagen beobachtet. Der klinische Verlauf wurde als Mittel der erkrankten Tiere ± SEM dargestellt.

Abb. 4.42: Histologische Analyse nach Depletion der CD25⁺ Zellen in DBA/1 Mäusen. DBA/1 Mäuse wurden an den Tagen –28, -25, -21 und –14 vor Immunisierung mit rhG6PI mit 400µg des CD25⁺ Zellen depletierenden Antikörpers pC61.5 i.p. behandelt oder blieben unbehandelt. An Tag 34 nach Immunisierung wurden die Mäuse histologisch untersucht. Gezeigt ist eine HE-Färbung (100fache Vergrößerung) eines Gelenkschnittes einer Pfote einer Maus, die mit pC61.5 behandelt wurde (A). Der Pfeil markiert die hochgradig florierende, chronische und destruktive Synovitis vom Grad 3 und eine Pannusbildung. Im Gegensatz zeigt das unbehandelte Tier (B) eine leicht verdickte Synovialmembran und mit einer leichten Synovitis (Pfeil).

Abb. 4.43: CD25 Depletion und Arthritisinduktion mit G6PI in BALB/c Mäusen. 5 DBA/1 Mäuse (gefüllte blaue Dreieicke). bzw. 5 BALB/c Mäuse (umgedrehte blaue Dreiecke) wurden an den Tagen –28, -25, -21 und –14 vor Immunisierung mit rhG6PI mit 400µg des CD25⁺ Zellen depletierenden Antikörpers pC61.5 i.p. behandelt. DBA/1 Mäuse wurden zur gleichen Zeit mit polyklonalem Ratten IgG behandelt und an Tag 0 mit rhG6PI immunisiert (gefüllte schwarze Dreiecke). Der klinische Verlauf der Arthritis wurde über einen Zeitraum von 22 Tagen verfolgt. Der klinische Verlauf wurde als Mittel aller Tiere einer Gruppe ± SEM dargestellt. 5/5 pC61.5 behandelte Tiere, 4/5 mit Ratten IgG behandelte Tiere und 1:5 der BALB/c Mäuse erkrankten.

Abb. 4.44: Histologische Analyse nach Depletion der CD25⁺ Zellen in BALB/c Mäusen. BALB/c Mäuse wurden an den Tagen –28, -25, -21 und –14 vor Immunisierung mit rhG6PI mit 400µg des CD25⁺ Zellen depletierenden Antikörpers pC61.5 i.p. behandelt. An Tag 22 nach Immunisierung wurden die Mäuse histologisch untersucht. Gezeigt ist eine HE-Färbung (100fache Vergrößerung) eines Gelenkschnittes einer Pfote einer Maus, die klinisch eine leichte Arthritis entwickelte. Der Pfeil markiert die Synovitis vom Grad 1 in einem Gelenk dieser Pfote.