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3.  Methodik

3.1. Tierexperimentelle Untersuchung

Es wurde ein tierexperimentelles Modell in Zusammenarbeit mit Herzchirurgen, Kardiotechnikern und Anästhesisten entwickelt, mit dem Ziel, ein möglichst eng an der Klinik orientiertes Protokoll einzusetzen und sowohl die technischen Mittel, als auch die Prozeduren, möglichst realistisch und originalgetreu umzusetzen.

Die quantitative morphologische Beurteilung neuronaler Veränderungen wurde nach dem Versuch durchgeführt, bei gleichzeitiger Messung hämodynamischer, serologischer und metabolischer Parameter während des Versuchs. Diese Ergebnisse wurden zueinander in Beziehung gesetzt.

3.2. Versuchsgruppen

3.2.1. Art der Versuchstiere

Es wurden 50 neonatale Schweine mit einem Körpergewicht von 2.300 ± 200g und einer durchschnittlichen Lebenszeit von 5,8 Tagen verwendet. Für die Versuche galten die entsprechenden Vorschriften der Tierschutzverordnung des Landesamtes für Gesundheit und Soziales in Berlin mit der Genehmigungsnummer G0146/98. Sie wurden durchgeführt in der tierexperimentellen Einrichtung des Forschungshauses der Charite´ Campus Virchow unter Anleitung des Tierschutzbeauftragten der Charite´, Herrn PD Dr. Grosse-Siestrup, und mit Unterstützung durch Herrn Dr. med. vet. M. Meissler.

Es wurden drei Versuchsgruppen gebildet:

3.2.2. Kontrolltiere

Zwölf Tiere ohne Vorbehandlung (Kontrolle) wurden einem cardiopulmonalem Bypass (CPB) mit 120 Minuten Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) unterzogen, mit anschließender Reperfusion und Erwärmung und einer postoperativen Überwachungsphase von mindestens 6 Stunden.

3.2.3. Vorbehandlung mit systemischer Methylprednisolongabe

In dieser Gruppe wurden 7 Tiere jeweils 4-6 Std. vor Beginn des Bypasses mit 30 mg/kg Methylprednisolon (Urbason solubile 32, Hoechst, Frankfurt) intravenös per Kurzinfusion behandelt. Die Tiere wurden dann einem CPB mit 120 Minuten KSTH in tiefer Hypothermie ausgesetzt. Anschließend erfolgte Reperfusion und Erwärmung und postoperativ 6 Stunden intensivmedizinische Überwachung.


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3.2.4.  Vorbehandlung mit intrathekaler Methylprednisolongabe

Fünf Tieren wurden 30 mg/kg Methylprednisolon (Urbason solubile 32, Hoechst, Frankfurt) intrathekal 4-6 Stunden vor Beginn des Bypasses nach steriler lumbaler Punktion mit einer Spinalnadel (Terumo Spinal Needle, Japan) verabreicht. Die Tiere wurden dann einem CPB mit 120 Minuten KSTH in tiefer Hypothermie ausgesetzt. Anschließend erfolgte Reperfusion und Erwärmung und postoperativ 6 Stunden intensivmedizinische Überwachung.

3.3. Versuchsablauf

3.3.1. Prämedikation

Zum Versuch wurden 50 neugeborene Schweine mit einem Gewicht von 2.300 ± 200 g und einem Alter von 5-9 Tagen verwendet. Sie wurden am Tag des Versuches von einem Bauern aus Brandenburg geliefert und von unserem Tieranästhesist Herrn Dr. M. Meissler innerhalb einer Stunde nach Ankunft intramuskulär (i.m.) mit 50 µg/kg KG Ketaminhydrochlorid (Ketanest, Parke-Davis Gmbh, Berlin) und 2 mg/kgKG Dormicum prämediziert.

3.3.2. Anästhesie und OP-Vorbereitung

Während der gesamten Zeit erfolgte die perioperative Überwachung mit Hewlett Packard OP-Monitoring System (HP Modell 66S) für EKG und HF, MAD, ZVD, O2-Sättigung, und weitere invasive Druckmessungen.

Es wurden zu Beginn EKG-Elektroden, periphere Pulsoximetrie und eine rektale Temperatursonde angebracht. Die linke und rechte Ohrvene wurden für zwei intravenöse Zugänge punktiert. Anschließend folgte nach Präoxygenierung die orale-endotracheale Intubation und der Anschluss an die maschinelle druckkontrollierte Beatmung (Dräger Babylog Ventilator, Hamburg) mit einem Druck von 15 – 20 mmHg, einer Frequenz von 20-30/min und einer FIO2 von ca. 21-30 %. Für die Narkose wurde eine total-intravenös Anästhesie (TIVA) mit 50 µg/kg/min Fentanyl (Curamed, Pharma GmbH, Karlsruhe) und 0,2 mg/kg/min Dormicum eingesetzt. Eine Relaxierung erfolgte mit 0,1-0,2 mg/kg Pancuronium (Curamed, Pharma GmbH, Karlsruhe) bedarfsorientiert. Die präoperative Lumbalpunktion wurde mit einer Spinalnadel (TERUMO spinal needle 22G) durchgeführt und es wurde maximal 0,5-0,7 ml klare Liquorflüssigkeit tröpfchenweise in sterile Kryo-Röhrchen (Cryovial, Carl Roth GmbH-Co, Karlsruhe) asserviert und sofort bei –80°C eingefroren.


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Abbildung 3.1: Anästhesie und Beatmung

Körperoberfläche

 

qm

0.16-0.18

Anästhesie

Fentanyl

µg/kg/h

50

 

Dormicum

mg/kg/h

2

 

Pancuronium

mg/kg

0,2

Beatmung

Frequenz

1/min

30-40

 

FIO2

%

30 bis 100

 

PEEP

mmH20

5 bis 10

 

Inspir. Druck

mmH20

10 bis 25

Diurese

Vor

ml/kg/min

2

 

Nach

ml/kg/min

2

HLM

Vollblut-Priming

ml

360

 

Minimale Temp

°C

15

 

Höchste ACT

sek.

400

 

Total Heparin

IE

2500

 

HLM-Fluß

ml/kg

250

Medikation

Dopamine

µg/kg/min

5 bis 10

 

Protamine

ml

2,5

 

Adrenaline

mg/kg

0,1

 

Lasix

mg/kg

1-2

Es wurde ein standardisiertes Protokoll für Anästhesie, Beatmung und Medikation eingesetzt.

Für kontinuierliche Urinsammlung erhielt das Tier einen suprapubischen Blasenkatheter. Dann wurde das Versuchstier für die Operation vorbereitet und in Rückenlage fixiert. Die Wärmeerhaltung bei einer Temperatur von 38.2 ° C erfolgt mittels Wärmematte ( THERMOMAQUET ) und Wärmelampe ( HAERAUS: SOLLUX 500 ).

Unter sterilen Bedingungen wurde in Seldinger-Technik jeweils ein arterieller Zugang (BRAUN Abbocat) in der A. femoralis und ein zentralvenöser Zugang (ZVK) in der Vena femoralis gelegt,. Es wurde ebenfalls eine retrograde Katheterisierung der Vena jugularis interna für die kontinuierliche Blutabnahme aus dem gemischt-venösen Rückstromgebiet des Gehirns durchgeführt. Es wurden an alle Gefäßkatheter die entsprechenden Druckmessungen installiert, um MAD, ZVD und die Drücke im zerebrovenösen Rückstrom der V. jugularis kontinuierlich zu messen. Der OP-Monitor (HP Modell 66S) ermöglichte ebenfalls die kontinuierliche Überwachung aller Vitalparameter wie Herzfrequenz, Arterieller Blutdruck, ZVD, Druck im Bulbus jugularis, periphere Sättigung, rektale Temperatur, EtCO2, Atemfrequenz. Während des Versuchs erfolgte eine kontinuierliche Überwachung und Registrierung der Blutgase und der Elektrolyte mit einer Blutgas-Analyse (BGA) durch ABL (RADIOMETER Kopenhagen) und eine Messung des Hämoglobins und Hämatokrits durch Hämoximeter OSM3 (RADIOMETER Kopenhagen). Die Werte wurden jeweils simultan für das arterielle und venöse Blut, sowie für das Blut des zerebralen Rückstromes (Vena jugularis int.) bestimmt. Außerdem erfolgte eine Blutzucker-Überwachung mit Haemo Glukotest 20 –800 R (BOEHRINGER).

3.3.3. Herz-Lungen-Maschine (HLM)

Wir benutzten eine nicht-pulsatile Multiflow Rollerpumpe (STÖCKERT/SHILEY, Deutschland) mit dem dazugehörigen Wärmeaustauscher für Normo- und Hypothermie (STÖCKERT, Deutschland).


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An die HLM waren ein Air –Oxygen-Mixer (SECHRIST) angeschlossen und ein ¼ Zoll Polytrode - Sensor mit Messgerät (POLYSTAN, Vaerlose, Dänemark) für die Messung der Sättigung und Temperatur in der arterielle Linie. Zusätzlich wurde eine arterielle Druckmessung (TELOS MEDICAL CORP.) mit automatischer Pumpenabschaltung bei hohen Drücken installiert und die Gerinnungshemmungsüberwachung mit Hilfe der aktivierten Klottungszeit ACT (HEMOCHRON), wobei während des CPB eine ACT von größer als 400 Sekunden aufrecht gehalten wurde. Als Pumpenschlauch verwendeten wir einen Silikon Schlauch (1/4 x 3/32 Zoll Pumpensegment WIPAK MEDICAL), und eine ¼ Zoll PVC–Tischlinie (MEDOS, Stolberg), mit jeweils angeschlossener 8 FR arterieller Kannüle (JOSTRA, Hirrlingen) und 14 FR venöse Kannüle (MEDTRONIC, USA). Zusätzlich verwendeten wir einen 40 µm arteriellen Filter für Neugeborene (DIDECO, Miranduly, Italy). Als Oxygenator verwendeten wir einen Safe Micro Neugeborenen Oxygenator (POLYSTAN, Vaerlose Dänemark) mit integriertem 40 µm Kardiotomie-Sauger Reservoir.

3.3.4. Priming

Das Priming der Maschine wurde durchgeführt mit ca. 400 ml Vollblut, wobei es sich um Spenderblut von einem Tier der gleichen Rasse meist vom gleichen Tag handelte, aufbewahrt in einem Bluttransfusionsbeutel (BIOTRANS, Dreireich) mit Gerinnungshemmung durch Na-Citrat und mit einer prophylaktischen Antibiotika-Gabe Cefotiamhydrochlorid (Spitzef, Takeda Pharma GmbH, Aachen) in einer Dosierung von 100 mg/kg KG. Dieses sogenannte „Vollblutpriming“ wurde mit zusätzlich 30-50 ml HAES 10%ig (FRESENIUS), 2500 IU/L Heparin (BRAUN), 20 ml Isotonische Kochsalz -Lsg (BRAUN) und bei Bedarf Natriumbicarbonat. Das Priming besaß dann einen Hämoglobingehalt von ca. 9.0 ± 1.0 g/dl mit ausgeglichenem physiologischen Säure-Basen Haushalt von 7.40 ± 0.05 erzielt wurde.

3.3.5. Thorakotomie

Der Zugang zum Herzen erfolgte mittels mediane Thorakotomie unter großer Vorsicht vor Verletzung der Thoraxgefäße und der umgebenden Organe. Nach mechanischer Spreizung des Thorax und der durchgeführter Blutstillung, erfolgte unter Sicht die Präparation von Perikard, Pleura und der großen Gefäße. Das Perikard wurde geteilt und alle Herzkompartimente, sowie Aortenbogen und A. pulmonalis wurden zugänglich gemacht. Die Kanülierung erfolgte in der Aorta ascendenz nach Inzision mit einer 8 FR Aorten-Kanüle und in das rechte Herzohr mit einer 14 FR venösen Kanüle. Die Kanülen wurden mittels Tabaksbeutelnaht fixiert. Dann erfolgte der Anschluss der Kanülen an die Tischlinie und damit die Verbindung zu der HLM, wobei das gesamte System entlüftet wurde.


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Abbildung 3.2: Versuchsabbildung mit HLM

3.3.6. HLM-Regime

Wir benutzten einen CPB mit vollem Fluss („full-flow-CPB“), d.h. mit einem einen Maschinenfluss von 250 ml/kg KG. Ein аlpha-stat-Management für die Blutgase wurde angewendet mit für die jeweilige absinkende Temperatur unkorrigierten PCO2- und pH-Werten. Die Bypasszeit war standardisiert unterteilt in eine Phase des normothermen CPB bei 38,0 ±0.5 °C von 20 Minuten, mit darauffolgender Kühlungsphase über einen Zeitraum von 30 Minuten, mit einem Temperaturgradienten von maximal 9,0 ±0,8 °C zwischen Bluttemperatur und Oxygenator, bis zum kälteinduzierten Herzstillstand bei 15 ±0.5°C myokardialer Temperatur, welches durch ein EKG ohne jegliche elektrische Aktivität symbolisiert wurde. Nach dem Erreichen einer rektalen Temperatur von 15± 0.3 °C und einer peripheren Temperatur von 16°C, folgte dann die Phase des Kreislaufstillstandes in tiefer Hypothermie für 120 Minuten 153. Zusätzlich zur systemischen Kühlung durch die HLM benutzten wir die oberflächliche Myokard-Kühlung mit sogenanntem „Sludge“-Eiswasser, das eine myokardialen Temperatur unter 15 °C während des KSTH gewährleistete.

An den Kreislaufstillstand schloss sich dann die Phase der Reperfusion und Erwärmung an, dabei wurde in den ersten Minuten nur mit einem geringen Perfusionsfluß erwärmt bei einem Temperaturgradienten von 9 °C am Oxygenator, bis zum Erreichen einer myokardialen Erregung im EKG bei einer Myokardtemperatur von ca. 20°C und einer beginnenden myokardialen Bewegung. Nach beginnender Herzaktion nach ca. 3- 5 Minuten wurde der Perfusionsfluss stetig gesteigert bis der volle HLM-Fluss von 250 ml/kg erreicht wurde. Dabei wurden zum Erreichen eines optimalen Perfusionsregime der arterieller Mitteldruck im Bereich von 60 ±10 mmHg gehalten und der ZVD bei 5 ±1 mmHg . Wir erwärmten dann insgesamt bis zur physiologischen Temperatur von 38 ±1° C über eine Phase von 45 – 50 Minuten, worauf dann [Seite 35↓]nach venösem Anstauen und gleichzeitiger Flussreduktion der HLM der cardiopulmonale Bypass beendet wurde.

Abbildung 3.3: Versuchsprotokoll schematisch

Dargestellt ist der zeitliche Verlauf mit der Temperatur und den einzelnen Phasen des cardiopulmonalem Bypasses (CBP) sowie der präoperativen und postoperativen Phase. Die standardisierten Blutentnahmen sind jeweils markiert, sowie die Liquorentnahme vor und am Ende des Versuchs.

3.3.7. Postoperative Phase

Nach Beendigung des CPB folgt eine mindestens 6-stündige postoperative Phase mit intensivmedizinischer Überwachung. Dabei wurden alle Parameter im physiologischen Bereich gehalten: Hämoglobin bei 10 ± 1 g/dl, der MAD bei 60-80 mmHg, der ZVD bei 5-7 mmHg. Die Partialdrücke für O2 im Blut bei 100-150 mmHg und für CO2 bei 30-40 mmHg wurden entsprechend durch die Blutgasanalysen stabil gehalten. Wenn notwendig wurde pharmakologisch mit Katecholaminen interveniert. Die Beatmung erfolgte bedarfsadaptiert und druckkontrolliert mit Beatmungsfrequenzen von 25-35/min, Atemzugvolumina von 30 bis 50 ml/kg, einem PEEP von 5-10cm H2O, und Beatmungsdrücken von 30-40 mmHg. Postoperativ zeigten einige der Tiere Anzeichen einer pulmonalen Hypertension, welche jedoch durch die Beatmungsintensivierung beherrschbar war. Die Heparinisierung wurde mit Protamin antagonisiert, wobei 1ml 1000 IU Heparin neutralisiert. Eine Kontrolle erfolgte mittels ACT-Messung, die unter 160 sek. liegen sollte. Dann wurden die Tiere für sechs Stunden überwacht. Nach einem standardisiertes Protokoll wurden sämtliche Vitalparameter stabil gehalten, die Tiere blieben beatmet und narkotisiert.


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3.3.8.  Ende des Versuchs

Nach einer sechsstündigen postoperativen Phase unter stabilen hämodynamischen und metabolischen Bedingungen wurden die Tiere in Narkose geopfert. Dabei wurde bei stabilen hämodynamischen Verhältnissen das Herz entnommen, und innerhalb von 5 Minuten der dünne Schädelknochen medial gespalten, der Liquor aus der Zysterna magna und den Seitenventrikeln, sowie das Gehirn entnommen und das Hirngewicht ermittelt.

3.4. Morphologische Untersuchung des Gehirns

3.4.1. Einbettung

Das Gehirn wurden dann medial gespalten und die Hemisphären kamen zur Fixation für 48 Stunden in SOMOGYI-Lösung, eine Lösung aus gesättigter Pikrinsäure mit Paraformaldehyd und 25%igem Glutaraldehyd in PBS-Puffer 154, mit einem neutralem pH-Wert. Danach wurden aus der linken und rechten Hemisphäre standardisiert die Schnitte für die einzelnen Hirnregionen angefertigt, wobei jeweils circa 3 mm transversale dünne Schnitte der beiden Hemisphären für die Hirnregionen frontaler, parietaler, occipitaler Kortex, sowie der Bereich Stammganglien, Hippocampus, Kleinhirn und Medulla angefertigt und in Paraffin eingebettet wurden (siehe Abbildung 3.4). Die Paraffin-Blöcke wurden mit 3-Aminopropyltrietoxisilan (APTS von Sigma code A/3648) aufbereitet, zugeschnitten mit dem Mikrotom in 6 µm dicke Schnitte für die histologische und immunhistochemische Färbung.

Abbildung 3.4: Standardisierte Präparation des Gehirns

3.4.2. Histologische Untersuchung

Die lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte standardisiert und blind für die jeweiligen Versuchsgruppen in der neuropathologischen Abteilung der Freien Universität Berlin. Es wurden der Hippocampus, die Stammganglien mit Ncl. caudatus, Thalamus und Pallidum, der Cortex mit Gyrus cinguli, das Kleinhirn und die Medulla ausführlich untersucht. Die Färbung erfolgte mit Hämatoxylin und Eosin (HE)-Färbung und „Luxol fast blue“ (Markscheidenfärbung). Artefakte sogenannte „Dark neurons“ wurden ausgeschlossen nach Cammermeyer et al 155. Speziell der Hippocampus als komplexes und hypoxieempfindliches Areal des Gehirns wurde detailliert analysiert und die Auswertung entsprechend seiner anatomische Unterteilung in die Regionen Cornu ammonis CA 1-4, Gyrus dentatus mit Area dentata und das Subiculum. Für die lichtmikroskopische Untersuchung wurde ein Olympus-Mikroskop eingesetzt und die photographische und digitale Dokumentation erfolgte mit einem LEICA Photomikroskop.

3.4.3. Immunhistochemie for Protein S–100B

Die immunhistochemische Färbung des calciumbindenden Proteins S-100-B wurde durchgeführt mit Hilfe monoklonaler Antikörper und der alkalischen Phosphatase Anti-Phosphatase (APAAP-Methode) nach Cordell et al. 1984 156. Die Schnitte wurden inkubiert mit dem primären monoklonalen Mause Antikörper (IgG von DPC Immustain, CKS1S ) für 48 Stunden. Danach erfolgt die Zugabe des sogenannten Brückenantikörpers, ein Kaninchen-Anti-Mause-Antikörper im Überschuss und die Inkubation für 30 Minuten. Am Ende erfolgte dann die Zugabe des APAAP-complex 1:50 in TBS (Dakopatts, code D651), welcher an den Brückenantikörper bindet. Für die Visualisierung mittels der enzymatische Reaktion durch den Enyzm-Antikörper-Komplex wurden DPC-Immustain-Streptavidin-Biotin-Immunperoxidase (DPC Immustain-kit) angewendet. Zwischen den Schritten muss die Spülung mit phosphatfreier Pufferlösung erfolgen.

Abbildung 3.5: Immunenzymatische Färbung des Protein S100B

Alkalischen Phosphatase Anti-Phosphatase (APAAP) -Methode nach Cordell et al.

3.4.4. Detektion der Mikroglia mittels Lektin-Färbung

Es wurde versucht, eine mögliche inflammatorische Reaktion durch die Detektion der Mikrogliazellen mittels Lektin-Färbung nachzuweisen. Mikrogliazellen gehören zu der Familie der Monozyten/Makrophagen. Ihre Vorläufer wandern während der Embryonalphase in das ZNS ein und bilden dort das ortsständige Makrophagensystem. Die Zellen sind amöboid beweglich und mitotisch aktiv. Postnatal bilden sie Äste und Fortsätze aus und machen ca. 20% der Gliazelle im ZNS aus. Ein pathologischer Stimulus führt zu ihrer Aktivierung in eine mobile, phagozytierende und Zytokine/Proteasen sezernierende Zelle. Mikrogliazellen lassen sich mittels Immuncytochemie durch Bindung von Lektin und Metallimprägnation identifizieren. Die Mikroglia wurde in repräsentativen entparaffinierten Hirnschnitten mittels Biotinisiertes Tomato-Lektin von Lycopersicon Esculentum (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA 94010 USA, Charge Nr. M0503) in einer Verdünnung von 1:50 bis 1:200 selektiv detektiert und in einer Feuchtkammer bei 37°C für 90 Minuten inkubiert. Weiterhin wurden TBS-Puffer zum Spülen und Trypsin (Sigma T7409) zum Andauen verwendet. Die Färbung erfolgte mit DAB (Sigma D 5905) für braun und Hämatoxylin für die blaue Kerndarstellung 157.

3.4.5. Quantifizierung der neuronalen Nekrose

Nekrotische Zellveränderungen wurden am mit HE-gefärbten Schnitt anhand der entsprechenden charakteristischen Veränderungen wie Eosinophilie, Verlust der Nissl-Substanz und anderer zytoplasmatischer Strukturen, sowie der Kernpyknose mit Basophilie identifiziert. Frühe Formen nekrotischer Veränderungen, wie intrazelluläre mitochondriale Schwellung und perineurales Ödem, ebenso wie späte Veränderungen in Form von Zellnekrose der Neurone konnten beobachtet und dokumentiert werden.

Insgesamt wurden die Hippocampus-Formation als ein Ort der selektiven Neuronenveränderungen 88;158 umfassend analysiert und die Neuronenveränderungen quantitativ dokumentiert. Der Hippocampus wurde unterteilt in die anatomischen Regionen Cornu ammonis 1-4, Gyrus dentatus mit Fascia dentata und das Subiculum.

Die standardisierte histologische Auswertung erfolgte blind für alle Gruppen mittels lichtmikroskopischer computergestützter Quantifizierung durch interaktive Morphometrie, wobei in einer Fläche von 10 bis 40 mm² in den einzelnen Hirnregionen die nekrotischen Neurone klassifiziert und quantitativ der prozentuale Anteil dieser Neurone an der Gesamtzahl (500 ±70) aller gezählten Neurone errechnet wurde 159. Ebenfalls quantifiziert wurden die Veränderungen im Gyrus cinguli (GC) als Repräsentant des Neokortex, da der GC mit seinem Windungstal als besonders inert gegenüber einer artifiziellen externen Neuronenverletzung gilt. Im Bereich der Stammganglien wurden Nucleus caudatus und Kerne des Thalamus, sowie [Seite 39↓]das Kleinhirn analysiert und die nekrotischen Neuronenveränderungen quantifiziert. Dabei wurden im Kleinhirn vor allem die Veränderungen der Purkinje-Zellen registriert.

3.4.6. Detektion der Apoptose mittels spezifischer TUNEL-Färbung

Die apoptotischen Zellveränderungen wurden mittels TDT vermittelter-dUTP-Biotin-nick-end Labeling- Methode (TUNEL) und sogenannter in situ DNA-Fragmentation dargestellt.

Diese Färbung erfolgte an den mit Xylol und Ethanol entparaffinierten Schnitten. Dabei wurden die Schnitte mit Tris-Pufferlösung gespült, anschließend mit Proteinase K für 15 Min. inkubiert und erneut mit Tris-Pufferlösung gespült. Die Inkubation erfolgte mit in-situ-Tailing-Mix, welcher aus Digoxin-DNA mit Biotin-16-dUTP (Kat-Nr.1093979), sowie ca. 20µl/cm3 terminaler Transferase vom Kälber Thymus (Kat-Nr.220582) bestand. Weitere Bestandteile sind CoCl2 25mmol und Puffer (ROCHE Diagnostics GmbH, Mannheim). Die Inkubation erfolgte für 60 Minuten im Wärmeschrank. Darauf folgte eine erneute Pufferung und die Blockierung der unspezifischen Veränderungen mittels 10%iger FCS-Lösung für 15 Min. bei Raumtemperatur. Nach Anwendung von Anti-Digoxigenin-AP für 60 Minuten erfolgte die farbliche Entwicklung unter dem Mikroskop. Anschließend wurde noch die Gegenfärbung mit Kernechtrot und Aralsulfat für ca. 10 Minuten vollzogen.

Die apoptotische Veränderungen wurden ebenfalls im HE-Schnitt anhand der morphologischen Kriterien wie Chromatinkondensation, nukleäre Blasenbildung und Bildung sogenannter apoptotischer Körperchen („apoptotic bodies“) identifiziert und mittels einer Gitterplatte (OLYMPUS) quantifiziert 106.

3.4.7. Elektronenmikroskopische Untersuchung

Für die Elektronenmikroskopie wurden aus den SOMOGYI-fixierten Gewebe würfelförmige Anteile mit einer Kantenlänge von 2 mm, standardisiert für die Regionen Hippocampus, Gyrus cinguli, Stammganglien und Kleinhirn zugeschnitten und mit Osmiumtetraoxyd nachfixiert. Nach Entwässerung wurde das Gewebe in Araldite eingebettet. Anschließend wurden Semidünnschnitte angefertigt und mit Toluidinblau angefärbt. Nach Mikroskopie der Semidünnschnitte wurden die Bereiche für die Ultradünnschnitte am Mikroskop lokalisiert und entsprechend markiert. Die Ultradünnschnitte wurden nach Kontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat im Elektronenmikroskop (ZEISS EM 10) mikroskopiert.

3.5. Molekulargenetische Untersuchung des Gehirns

Die Bestimmungen des Hitze-Schock-Proteins 70 kDa (HSP 70), der Apoptose-Peptide Bak und FAS, und der anti-apototischen Peptide Bcl-xl aus der Bcl-2-Familie erfolgten mittels Real-time PCR in der molekular medizinischen Einrichtung des DHZB. Dabei wurde die RNA/DNA-Expression dieser im Zusammenhang mit der apoptotischen Kaskade stehenden Proteine ausgewählt, um einen eventuellen Effekt der Steroidintervention auf die Entstehung der Apoptose im Rahmen des KSTH von 120 Minuten molekulargenetisch zu untersuchen. Die Bestimmungen wurden am gefrorenen Hirnmaterial durchgeführt. [Seite 40↓]Dabei wurde aus dem frontalem Kortex unter Wahrung der Temperatur die benötigte Gewebemenge gewonnen, das Gewicht ermittelt und das Material weiter in flüssigem Stickstoff konserviert. Neben den drei Versuchsgruppen wurde auch noch die Bestimmung an Hirnproben von Tieren ohne jegliche Operation oder Eingriff (Sham-Tiere) durchgeführt, um Erkenntnisse über die normale Expression im Gehirn ohne den Einfluss einer Ischämie zu erhalten.

Aus dem Hirnmaterial folgte dann die standardisierte Aufbereitung der RNA mittels RNeasy-Kit von Quiagen. Dabei wurden nach standardisierter Aufreinigung und Bearbeitung aus den Schnitten die RNA Probe gewonnen. Die aufgereinigte RNA wurde dann für die weitere Bearbeitung bei –80°C konserviert. Danach wurde die Herstellung der komplementären DNA (c-DNA) durchgeführt, wobei aus der RNA dann mittels Reverser-Transkriptase (RT) nach Gibco Superscript II (Invitrogen) die komplementäre Einzelstrang-DNA (cDNA) hergestellt wurde. Darauf folgte die Realtime-PCR mit der cDNA (GeneAmp 5700, Perkin Elmer) mit SYBR Green, wobei die cDNA dann mit dem jeweils spezifischen Primer für 18s, GAPDH, HSP70, Bcl-xl, BAK, FAS eingesetzt wurde. Die spezifischen Primer wurden mit Primer Express hergestellt und die Spezifität der Oligonukliotidsequenzen wurde mit BLAST möglichst Intron-überspannend kontrolliert und bestätigt. Durch die spezifischen Primer wurde dann die DNA des entsprechenden Genes in der PCR hochamplifiziert.

Es erfolgte die Denaturierung und Auftrennung der DNA bei einer Temperatur > 92°C mittels “Hot start” PCR. Dann die Primer Anlagerung (Annealing), wobei über einen Zwischenschritt im 1.Zyklus aus der Einzelstrang-DNA die entsprechende Doppelstang DNA (ds-DNA) hergestellt. Darauf folgte dann pro Zyklus eine Verdopplung spezifischen Gensequenz für den jeweiligen Primer, wenn die PCR annähernd zu 100% verläuft. Insgesamt wurde in 30-40 Zyklen eine exponentielle Akkumulation des Primerzielbereichs durchgeführt, und somit pro PCR aus einer Matrize in z.B. 35 Zyklen 34x109 Kopien hergestellt wurden. Die Quantifikation der primerspezifischen DNA wurde während der PCR mittels Floureszenz-Detektion durchgeführt. Dabei wurde die Genexpressionsrate mittels SYBR Green analysiert, welches eine hohe Affinität zur Doppelstrang-DNA besitzt. Mit dem 5700 Sequenz-Detektor und dem Einsatz des SYBR Green konnte eine Echtzeit-Analyse der DNA-Vervielfältigung erhoben werden. Der 5700 Sequenz-Detektor besteht aus einer Halogen-Lichtquelle, welcher blaues Licht mit einer Wellenlänge von 485 nm durch einen optischen Filter emittiert. Das Licht wird durch eine Feldlinse auf die Probenfläche geleitet, und durch den an die DNA gebundenen Floureszenzfarbstoff wird das Licht mit der spezifischen Wellenlänge von circa 520 nm messbar. Während der gesamten Messzeit wird pro Zyklus ein Bild des emittierten grünen Lichts gespeichert, wobei die Emission des Lichts proportional zu der DNA Amplifikationsmenge ist. Da man am Anfang nicht weiß in welchem Verhältnis mit forward-Primer zu reverse-Primer das beste Primerverhältnis entsteht, wird als erstes eine Primer Matrix mit unterschiedlichen Primerverhältnissen ausgetestet. Am gängigsten sind die Verhältnisse 1:1; 1:3; und 3:1 des forward-Primers zum reverse-Primer. Dazu werden alle cDNA Proben, die untersucht werden sollen, „gepoolt“ (sogenannter Master-Pool). Nachdem das beste Primer Verhältnis für das jeweilige Gen ermittelt worden ist, macht [Seite 41↓]man eine Verdünnungsreihe aus diesem Pool der cDNA Proben, zur Erstellung der Standardkurve. Die mittleren cDNA Konzentration aller Proben wird dann in die PCR eingesetzt. Aus der PCR-Verdünnungsreihe wird dann eine Standardkurve generiert. Aus dieser ist ersichtlich, mit welcher Effizienz die PCR des jeweiligen Primerpaares gelaufen ist. Ist die PCR mit nahe zu 100% verlaufen kann man zur weiteren Analyse die Delta Delta CT (Threshold cycle) Methode anwenden.

Am Ende wurde die jeweilige Expression des entsprechenden Apoptose-Proteins bei den Tieren ohne jeglichen Eingriff auf einen Werte von eins gesetzt, und im Vergleich dazu die Expression bei den Versuchstieren graphisch dargestellt.

3.6. Statistische Methoden

Die Bearbeitung erfolgte mit MS-Office-Paket. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Mann-Whitney Test und dem Programm Statview für Windows Version 5.0.


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27.09.2004