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4.  Ergebnisse

4.1. Versuchsgruppen

Die 24 eingeschlossenen Tiere der drei Versuchsgruppen waren sieben bis elf Tage alt und unterschieden sich präoperativ nicht signifikant in Körpergewicht und Größe (siehe Abbildung 4.1).

Abbildung 4.1: Präoperatives Gewicht der eingeschlossenen Tiere

 

Kontrolle

Systemisch MP

Intrathekal MP

Anzahl

12

7

5

Gewicht

2378 ± 147

2393 ± 143

2344 ± 137

4.2. Morphologische Veränderungen im Gehirn

Die Gehirne zeigten eine dem Alter angemessene neuronale Entwicklung. In einigen Bereichen, vor allem aber um die Hirnventrikel, waren noch Matrixzellnester vorhanden. Alle drei Versuchsgruppen wurden hinsichtlich morphologischer Veränderungen blind beurteilt. Nur bei einem Tier konnte eine intraventrikuläre Blutung beobachtet werden, welches zum Ausschluss aus der Studiengruppe geführt hat. Es zeigten sich sonst keine Anzeichen einer intra-, periventrikulären oder intraparenchymatösen Blutung.

4.2.1. Entzündliche Veränderungen

In keiner der drei Gruppen traten entzündliche Veränderungen, wie Proliferation und Aktivierung der Mikroglia oder eine extravaskuläre Ansammlung von Leukozyten oder Lymphozyten auf. Eine perioperativ entstandene Infektion als mögliche Ursache für eine daraus resultierende Neuronenzellschädigung galt somit als nicht wahrscheinlich. Die Mikrogliafärbung beruht auf der Anfärbung von Lektinen (spezifische Zuckermoleküle), welche aber nicht nur auf den Mikrogliazellen zu finden sind, sondern auch auf den Endothelzellen. Daher färben sich die Endothelzellen ebenfalls braun an. Jedoch konnte in keinem Versuchstier eine Aktivierung der Mikrogliazellen detektiert werden. Als Vergleich ist ein Schnitt von einem Tier nach Trauma mit deutlicher Aktivierung der Mikroglia dargestellt.


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Abbildung 4.2: Mikroglia-Detektion mittel Tomato-Lektin-Färbung

Abbildung A zeigt einen repräsentativen Schnitt aus dem Gehirn der Studiengruppen. Es konnte keine Aktivierung der Microglia nachgewiesen werden. Abbildung B zeigt zum Vergleich eine Tomatolektinfärbung bei einem Tier nach Trauma mit aktivierter Microglia, zu erkennen an den vielen sternförmigen Fortsätzen. Eine Microgliareaktion spielte somit im Zusammenhang mit CPB und KSTH in diesen Versuchen keine Rolle. Mit Tomato-Lektin färben sich auch die Endothelzellen positiv.

4.2.2. Veränderungen der Astrogliazellen

Bei allen Tieren konnte neben den morphologischer Veränderungen der neuronalen Zellen auch charakteristische Veränderungen der Astrozyten in Form einer deutlichen Schwellung der perivaskulären und astrozytären Endfüsse beobachtet werden. Mikroskopisch kam es zur Ausbildung eines ausgeprägten perivaskulären Ödems (siehe Abbildung 4.3 und 4.4).

Abbildung 4.3: Perivaskuläres Ödem – Astrozytenfärbung mit Protein S100B

Deutlich zu erkennen sind die rot-gefärbten S-100B positiven Astrozyten. Umliegend sind gut erhaltene Neuronen zu erkennen, ohne ischämische Veränderungen. Das rechte Bild zeigt ein Kontrolltier ohne HLM oder OP. Die Veränderungen der Astrozyten gingen in der zeitlichen Abfolge den neuronalen Veränderungen voraus.

Abbildung 4.4: Perivaskuläres Ödem in der Elektronenmikroskopie

Die Abbildung zeigt einen Gefäßquerschnitt, umgeben von dem deutlich ödematös veränderten perivaskulären Raum, welcher durch die Endfüsse der Astrozyten gebildet wird.

Abbildung 4.5: Astrozytäres Ödem in der Elektronenmikroskopie

Dargestellt sind jeweils ein Neuron mit einem Astrozyten. Dabei erkennt man, dass die Astrozyten ödematös verändert sind, während die Neuronen intakt sind.

Die Beurteilung des Ödems wurde quantitativ über die prä- und postoperative Gewichtsdifferenz durchgeführt. Eine Beurteilung aufgrund der morphologischen Erscheinung im Rahmen der lichtmikroskopischen Untersuchung fand ebenfalls statt. Das perivaskuläre Ödem war vor allem bei den kleineren Gefäßen, wie Arteriolen und Venolen am ausgeprägtesten. Die Lokalisation war dabei sehr unspezifisch und das perivaskuläre Ödem war in allen Bereichen des ZNS nachweisbar.

Zusätzlich zeigte sich neben dem perivaskulären Ödem auch eine perineurale Schwellung, welche aber erst mit zunehmender Überlebenszeit deutlicher ausgeprägt und erkennbar war.

4.2.3. Veränderungen der Neuronen im Hippocampus

Die morphologische Auswertung wurde für den gesamten Hippocampus unter Berücksichtigung seiner anatomisch-morphologischen Strukturen durchgeführt. Es zeigte sich im Vergleich zu früheren Studien, wie z.B. bei Ye et al mit experimenteller globaler Ischämie, dass der Fokus der nekrotischen Veränderungen nicht im Sektor CA 1 des Hippocampus, sondern auch im CA 4 liegt 9899.

Abbildung 4.6: Untersuchte Regionen des Hippocampus

Hier sieht man einen Querschnitt durch den Hippocampus. Die einzelnen morphologisch und funktionell unterschiedlichen Regionen mit Cornu ammonis (CA) 1 bis 4 , Gyrus dentatus und Subiculum sind dargestellt.

Die nekrotischen Neurone waren durch Eosinophilie, Kernpyknose, Zellschrumpfung sowie durch die Veränderungen der zytoplasmatischen Zellorganellen gekennzeichnet. Perineural und perivaskulär war [Seite 46↓]ein ausgeprägtes Ödem zu beobachten. Es gab regionale Unterschiede im Gehirn nach KSTH, wobei der Hippocampus sich als deutlich geschädigt erwies.

In der Kontrollgruppe war nach 120 min. KSTH ohne Einfluss einer Steroidbehandlung das Ausmaß der Nervenzelluntergängen in Form von Nekrose mit 77,56 ± 10,32 % im Bereich des Cornu ammonis 4 (CA 4) am größten. Ebenfalls eine ausgeprägte Nekrose konnte mit einem Anteil von 69 ± 7,3 % der Neuronen im CA 1 beobachtet werden. Die Veränderungen in den anderen Sektoren CA 2 und 3 waren nicht so ausgeprägt.

Im Gyrus dentatus zeigten sich nur vereinzelte nekrotische Neurone, es konnten zusätzlich aber auch einige vereinzelte apoptotische Veränderungen beobachtet werden.

4.2.4. Schädigungsmuster in den anderen Hirnregionen

Die neuronalen Veränderungen und das Schädigungsmuster im zerebralen Kortex, in den Stammganglien und im Kleinhirn werden im Zusammenhang Kapitel „Einfluss der Steroidintervention“ diskutiert und detailliert dargestellt. Nach KSTH zeigte sich, dass Cortex mit ca. 50 % neuronale Nekrose deutlich geringer betroffen ist. Neben der Nekrose traten auch vereinzelte Apoptosen der Gliazellen und Neurone auf. Die Stammganglien waren mit ca. 45 % Nekrose noch geringer geschädigt. Jedoch zeigte sich im Kleinhirn ein höheres Maß an neuronaler Nekrose, ca. 70 % der Purkinje-Zellen waren verändert. Eine detaillierte Darstellung der Ergebnisse erfolgt weiter unten.

4.3. Einfluss der systemischen und intrathekalen Steroidbehandlung

4.3.1. Postoperatives Ödem

Zur Quantifizierung des entstandenen perioperativen Ödems nach 120 Minuten KSTH wurde unter anderem die prä- und postoperative Gewichtsdifferenz ermittelt. Dabei wurde auch die prozentuale Gewichtszunahme berechnet. Die prä- und postoperative Gewichtsdifferenz betrug nach CPB und 120 Minuten KSTH in der Kontrollgruppe 462 Gramm, dieses entsprach einer postoperative Gewichtszunahme von knapp 23 % gegenüber dem präoperativen Gewicht.

Die Prävention eines interstitiellen Ödems und die verminderte Einlagerung von Wasser durch eine hochdosierte Steroidapplikation sollte durch den Vergleicht der prä- und postoperativen Gewichtsdifferenz ermittelt werden.


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Abbildung 4.7: Postoperative Gewichtszunahme der Versuchsgruppen

Zwischen den untersuchten Gruppen zeigte sich präoperativ kein signifikanter Unterschied im Körpergewicht. Die postoperative Gewichtszunahme zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der systemischen Steroidgruppe (** p < 0.05). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der intrathekalen Steroidgruppe.

Morphologisch zeigte sich zwischen den Gruppen jedoch auch ein Unterschied in der Ausprägung des Ödems. In der Kontrollgruppe war das Ödem morphologisch am stärksten ausgeprägt, in der systemisch behandelten Steroidgruppe am schwächsten.

4.3.2. Zerebrales Ödem

Das zerebrale Ödem konnte nur semiquantitativ über den Anteil des Hirngewichts vom Gesamtkörpergewicht erschlossen werden. Ein signifikanter Einfluss der Steroidgabe auf die Ödembildung war auch hier erkennbar, wenn man den prozentuale Anteil des Hirngewichtes vom Gesamtkörpergewicht errechnet hat.

Dabei zeigte sich der Anteil des Hirngewichts am Gesamtkörpergewicht von 1.6 % in der Kontrollgruppe. Die intrathekale Gruppe wies mit 1.52 % einen ähnlichen Wert auf. In der systemischen MP Gruppe zeigte sich mit 1.37 % jedoch ein signifikant niedrigerer Anteil. Eventuell ist der Unterschied im prozentualen Gewichtsanteil des Gehirns durch eine geringer Wassereinlagerung und Ödembildung bedingt.

Bei den normalen Tieren ohne CPB und KSTH lag der Anteil des Hirngewichtes bei 1.3 % bis 1.4 %, und war somit sehr ähnlich wie in der systemischen MP Gruppe.


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Abbildung 4.8: Postoperativer Anteil des Hirngewichtes am Gesamtkörpergewicht

Das Gehirngewicht betrug nach standardisierter Entnahme 31 bis 40 g (ohne Fixation).

Man kann daher folgern, dass es unter der systemischen Steroidapplikation postoperativ zu einer geringeren Gewichtszunahme kam.

4.3.3. Hämodynamische Parameter

Die Auswertung der hämodynamischen Parameter ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (siehe Abbildung 4.7 und 4.8). Sowohl die Kontrollgruppe, als auch die beiden Steroidgruppen zeigten vergleichbare hämodynamische Werte ohne signifikante Unterschiede vor, während und nach KSTH.


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Abbildung 4.9: Originaldaten vom 10.07.2000

Langzeitverlauf des Blutdruckes und der Temperatur vor, während HLM und in der Reperfusion. Der postoperative Verlauf wurde nicht dargestellt. Markiert sind die wichtigsten Ereignisse und die Phase von 120 Minuten Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH). Die Werte des MAD in der Phase Reperfusion und postoperativ liegen circa 10-20 mmHg höher als das Ausgangsniveau. Deutlich zu erkennen ist der Druckabfall nach Abstellen des Bypasses und Beginn des KSTH.

Der Arterielle Mitteldruck (MAD) lag vor, während und nach dem CPB in einem Bereich von 60 bis 80 mmHg. Es zeigten sich ZVD-Werte zwischen 5 und 10 mmHg und auch die Herzfrequenz variiert in einem Bereich von 150 bis 220 Schläge pro Minute. In der Abbildung 4.9 ist deutlich zu erkennen die normotherme Phase des CPB mit anschließender Kühlung, und das Erreichen der 15°C Marke, mit anschließendem durch den Pumpenstop resultierendem Abfall des MAD auf Werte um Null mmHg. Nach 120 Minuten KSTH erfolgte dann die Wiedererwärmung, wobei entsprechend am Anfang der Reperfusion die Erwärmung mit einem langsam steigendem HLM-Fluß und einem maximalen Temperaturgradienten von 8°C zwischen dem Oxygenator und dem Blut begonnen wurde, der langsam bis zum Erreichen von circa 25 °C gesteigert wurde. Ab 25°C konnte dann mit normal hohem Maschinenfluss wiedererwärmt werden. Nach 50 Minuten war die Phase der Reperfusion abgeschlossen. Bei normaler Körpertemperatur folgte die langsame venöse Stauung mit gleichzeitiger Flussreduktion als sogenannter „Abgang von der HLM“ und das Ende des cardiopulmonalen Bypasses war erreicht.

Der Perfusionsdruck (MAD) und die Füllungsdrücke wie ZVD und PA lagen im physiologischen Bereich und zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen:


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Abbildung 4.10: Hämodynamische Daten

Es zeigten sich in allen Gruppen während des gesamten Versuchs keine signifikanten Unterschiede für die hämodynamischen Parameter.

4.3.4. Veränderungen der Oxygenationswerte

Die Werte für das Hämoglobin verliefen in den Gruppen ebenfalls sehr ähnlich in einem Bereich von 8 g/dl bis 12 g/dl, das Hämatokrit-Werten von 25-40 % entsprach.

Die pH-Werte lagen in allen Gruppen vor KSTH im Normbereich bei 7,4 ± 0.05, nach KSTH in einem Bereich zwischen 7,21 und 7,5. Die niedrigsten Werte mit 7,21 bzw. 7,22 entstanden nach dem KSTH in der Reperfusionsphase. Diese pH-Werte erreichten weiteren Verlauf nach 1-2 Std. postoperativ wieder den Normbereich.

Die Partialdrücke für Sauerstoff (PO2) unterschieden sich zwischen den einzelnen Gruppen und lagen in einem Bereich von 180 bis 326 mmHg. Durch die intensivierte Beatmung wurde der postoperativ erhöhte Sauerstoffbedarf gewährleistet und es gab in den durchgeführten Blutgasanalysen keinen Anhalt für ein vermindertes Angebot an Sauerstoff im arteriellen Blut. Die gemessenen Werte waren vergleichbar mit denen, die auch im klinischen Einsatz beobachtet werden. Die Werte für z.B. PO2 etc. liegen insgesamt höher als der physiologische Bereich ohne eine derartige Operation.

Abbildung 4.11: Arterielle Blutgase

Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede für pH-Wert, Sättigung, PO2 und PCO2 in der arteriellen Blutgasanalyse.


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Die Partialdrücke für Kohlendioxid (PCO2) lagen insgesamt im unteren Normbereich und variierten unter den Gruppen in einem Bereich zwischen 28 und 45 mmHg. Eine Hyperventilation war postoperativ bei allen Tieren notwendig, um bei erhöhtem pulmonalen Widerstand und einer nach zwei Stunden Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie beeinträchtigten Lungenmechanik eine ausreichende Belüftung und Oxygenation zu gewährleisten.

4.3.5. Veränderungen des Calciumstoffwechsels

Die präoperativen Werte waren in allen Gruppen mit ca. 0,8 mmol/l gleich. Nach KSTH lagen die Calcium-Werte nur in der intrathekalen Steroidgruppe mit 0,48 mmol/l gegenüber 0,85 mmol/l in den beiden anderen Gruppen deutlich niedriger. Postoperativ stiegen die Werte in allen Gruppen unterschiedlich an, wobei in der systemischen MP Gruppe die deutlichste Zunahme beobachtet werden konnte. In der postoperativen Phase wurde durch die systemische MP Gruppe eine Maximum von ca. 1,3 mmol/l nach 2-4 Std. erreicht. Die Calciumwerte in der intrathekale MP Gruppe blieben postoperativ jederzeit signifikant niedriger als in den beiden anderen Gruppen. Im späten postoperativen Verlauf kam es dann wieder zu einer langsamen Angleichung aller Gruppen auf Werte im Bereich von 0,8 und 1,2 mmol/l, jedoch blieben die Werte in der systemischen MP Gruppe auch nach 6 Std. weiterhin erhöht.

Der Calciumstoffwechsel ist für eine Ischämie-Reperfusion von Bedeutung. Betrachtet man die Calciumwerte, so ergaben sich bei gleichen präoperativen Werten deutliche Unterschiede in der postoperativen Phase nach KSTH, wobei die intrathekal behandelten Tiere im arteriellen und zerebralvenösen Blut signifikant niedrigere Werte (p=0.02) aufwiesen, als die Kontroll- und systemisch behandelte Steroidgruppe.

Abbildung 4.12: Calciumwerte im Serum

Präoperativ zeigten sich gleiche Werte für Calcium im Serum. Nach KSTH traten dann nur in der intrathekalen Gruppe signifikant niedrigere Werte auf (*p<0.02). Die systemische Gruppe wies die höchsten Calciumwerte auf, eine Normalisierung blieb aus.

4.3.6. Veränderungen des Natrium- und Kaliumstoffwechsels

Präoperativ lagen die Werte für Natrium, Kalium und Calcium im Normbereich. Auch im weiteren Verlauf der Untersuchung zeigten die Werte keinen signifikanten Unterschied. Die Kaliumwerte zeigten einen Unterschied, so waren in der intrathekalen Steroidgruppe nach KSTH Kalium mit 3.95 mmol/l niedriger, verglichen mit >5 mmol/l in den beiden anderen Gruppen. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant.

Abbildung 4.13: Kaliumwerte im Serum

Der Unterschied für Kalium im Serum war vor KSTH nicht signifikant, nach KSTH zeigten sich etwas höhere Werte in der systemischen Steroidgruppe, jedoch ohne signifikanten Unterschied. Die Werte nach KSTH waren in der intrathekalen Gruppe am niedrigsten.

4.3.7. Hyperglykämie

Die Messung der Blutzuckerwerte ergaben signifikante Abweichungen zwischen den Gruppen. Nach Beginn des cardiopulmonalen Bypasses kam es zu einem Anstieg der Blutzucker-Werte in allen Gruppen von circa 100 mg/dl auf Werte um ca. 200 mg/dl. Dieser Anstieg war wahrscheinlich durch das Maschinen-Priming und die Blutkonserven bedingt.

Nach 120 Minuten KSTH zeigte sich dann aber in beiden Steroidgruppen gegenüber den präoperativen Werten eine deutlich Erhöhung der Blutzuckerwerte, wobei unter systemischen MP Gabe signifikant höhere Werte erreicht wurden als durch intrathekale MP Applikation. Die Kontrollgruppe zeigte nur geringe Änderungen der BZ-Werte. Während sich in der intrathekalen Gruppe die Glucosewerte im weiteren [Seite 53↓]postoperativen wieder auf hoch normale Werte um 200 mg/dl anglichen, persistierten die signifikant höheren BZ-Werte in der systemischen MP-Gruppe bei Werten um 300-350 mg/dl (p=0.001).

Abbildung 4.14: Glucose im arteriellen Blut

Es zeigt sich eine signifikante persistierende Hyperglykämie in der systemisch Steroidgruppe (Systemische MP), im Vergleich zu der Kontrollgruppe (p=0.001). Die intrathekale MP Gruppe zeigte nur eine temporäre Erhöhung der BZ-Werte, welche sich im Verlauf wieder an die Kontrollgruppe anglich.

Abbildung 4.15: Glucose im zerebrovenösen Blut (V. jugularis)

Übersicht der Werte aus dem zerebralen und venösen Rückstrom in der Vena jugularis. Zu erkennen ist eine signifikante Hyperglykämie in der Systemischen MP Gruppe (p=0.001).

Die entstandene Hyperglykämie scheint im Rahmen einer Steroidgabe abhängig von der Applikationsart zu sein, und nach KSTH nur bei einer systemischen Verabreichung des Methylprednisolons signifikant höhere Werte aufzuweisen.

4.3.8. Neuronale Nekrose im Hippocampus nach Steroidbehandlung

Der Einfluss der systemischen Applikation des Methylprednisolons (Systemisch MP) führte nicht zu dem erwünschten neuroprotektiven Effekt. Durch die systemische MP-Gabe zeigte sich keinerlei Verbesserungen des neuronalen Schädigungsmusters. Im Gegenteil kam es zu einer Zunahme der neuronalen Nekrose im Hippocampus im CA 4 auf einen prozentualen Wert von 85,4 ± 8,48 %. Die Kontrolltiere wiesen ca. 77 % Nekrose auf. Im CA 1 kam es unter der systemischen Steroidgabe auch zu einer Zunahme der nekrotischen Neurone von ca. 40 % (Kontrollgruppe) auf 65 %.

Obwohl in der morphologischen Untersuchung das perivaskuläre Ödem subjektiv etwas milder ausfiel, kam es doch zu einem deutlichen perineuralem Ödem bei den betroffenen nekrotischen Zellen.

Abbildung 4.16: Nekrose im Hippocampus

Die Systemische MP Gabe führte zu einer signifikanten Zunahme der Zellschädigung im Sektor CA 1 und CA 4 (p= 0.03 bzw. p=0.006) und somit zu einer Verschlechterung des Schädigungsmusters nach KSTH. Bei der intrathekalen MP Gruppe zeigte sich dafür im Bereich CA 1 und CA 4 eine signifikante Abnahme der nekrotischer Neurone gegenüber der systemischen MP Behandlung (p= 0.01). Gegenüber den Kontrolltieren zeigte sich aber nur im CA 4 eine Reduktion der Zellschädigung (p=0.01). Die Auswertung erfolgte am Hämatoxylin-Eosin-Schnitt und gezählt wurden 500 ± 60 Neurone.


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Die intrathekale Behandlung mit Methylprednisolon (Intrathekal MP) zeigte einen unterschiedlichen Effekt im Gehirn. Nach der intrathekale Vorbehandlung der Tiere konnte eine signifikante Reduktion der nekrotischen Veränderungen im CA 4 des Hippocampus erreicht werden (p=0.01). Im CA 1 zeigten sich gegenüber der Kontrollgruppe nur eine geringe und nicht signifikante Reduktion.

Somit konnte durch eine Behandlung mit intrathekalen und nicht mit systemischen Steroiden eine signifikante Verbesserung des Schädigungsmusters im Hippocampus erreicht werden. Der Fokus der Schädigung lag bei der Kontrollgruppe und der systemischen MP-Gruppe in den Sektoren CA 4 des Hippocampus.

Abbildung 4.17: Nekrose im CA 1 und CA 4 des Hippocampus

Gegenübergestellt sind alle drei Gruppen mit repräsentativen histologischen Schnitten. Die Hypoxischen Neuronen sind mit einem Blockpfeil, die normalen mit dünnen Pfeil markiert. In der intrathekalen Gruppe zeigten sich signifikant weniger hypoxische Neurone.


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Abbildung 4.18: Nekrose in der Elektronenmikroskopie

In Bild A ist ein normales Neuron dargestellt. Bild B zeigt ein nekrotisches Neuron mit Kernpyknose und Zellschrumpfung, sowie deutlich geschwollenen Mitochondrien. Das Neuron ist von einem deutlichen Ödem umgeben.

4.3.9. Neuronale Apoptose im Hippocampus nach Steroidbehandlung

Der Einfluss der Steroide führte neben dem oben genannten Einfluss auf die Nervenzellnekrose zusätzlich zu einer Zunahme apoptotischer Zellenveränderungen im Hippocampus. Die apoptotischen Neurone unterschieden sich von den nekrotischen N. deutlich durch ihre typischen Kernveränderungen und die Kondensation des Chromatin`s bei intaktem Zytoplasma. Zusätzlich zeigten diese Zellen eine verstärkte Eosinophilie. Der Fokus der apoptotische Nervenzellveränderungen lag im Gyrus dentatus der Hippocampus-Formation. Der Anteil apoptotischer Zellveränderungen war dort in der Kontrollgruppe ohne den Einfluss einer Steroidbehandlung mit 8.6 ± 3.4 % aller Zellen relativ niedrig.

Unter dem Einfluss der systemischen Steroidintervention kam es zu einer signifikanten Zunahme der apoptotischen Veränderungen. Wobei der Anteil apoptotischer Neuronen an der Gesamtzahl der Neurone im Gyrus dentatus nach systemischer Gabe von Methylprednisolon auf 28 ±7 % und nach intrathekaler Gabe auf 20 ±3 % zunahmen. Das Auftreten apoptotischen Zellveränderungen stellte somit eine sehr wichtige „Nebenwirkung“ der Steroidtherapie dar und wurde einer differenzierten Analyse unterzogen.

Die Apoptose wurde anhand einer spezifische TUNEL-Färbung und im Semidünnschnitt morphologisch, die Abbildungen 4.17 und 4.18 zeigen die Ergebnisse der selektiven Anfärbung im Gyrus dentatus.


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Abbildung 4.19: Apoptose im Gyrus dentatus (GD) nach Steroidbehandlung

Deutlich zu erkennen ist der Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und den beiden Steroidgruppen. Wobei die systemisch behandelten Tiere mit 36 % einen signifikant höheren Anteil apoptotischer Veränderungen zeigten als die intrathekalen 25 %, die systemische Steroidgruppe unterschied sich aber signifikant (p=0.01) von der Kontrollgruppe. Das Zunahme der Apoptose nach intrathekaler Intervention gegenüber der Kontrollgruppe ebenfalls mit (p=0.03) signifikant.

Abbildung 4.20: Apoptotische Veränderungen im Gyrus dentatus

Vergleich der einzelnen Versuchsgruppen. Hierbei zeigte sich, dass in den Steroid behandelten Tieren die Anzahl apoptotischer Neurone deutlich höher ist, als bei den Kontrolltieren.


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Abbildung 4.21: Apoptotische Veränderungen im Gyrus dentatus

Die Hirnschnitte stammen von einem Versuchstier mit systemischer Methylprednisolon-Behandlung. In den beiden Abbildungen erkennt man apoptotische Neurone in einem Ausschnitt des Gyrus dentatus mit kaum geschrumpften Neuronen sowie mit gekörntem Zellkern und einem hellroten eosinophilen Zytoplasma.

Abbildung 4.22: Apoptose des Gyrus dentatus in TUNEL-Färbung

Selektiv werden hier die apoptotischen Neurone im Gyrus dentatus dargestellt (dunkel markierte Zellen). Von links nach rechts sind die Kontrolltiere, die systemischen MP und die intrathekalen MP Tiere dargestellt. Der Einfluss des systemischen MP zeigt eine vermehrte Anfärbbarkeit apoptotischer Neurone im GD (mittleres Bild). Nach intrathekaler MP Behandlung zeigten sich ebenfalls mehr Apoptosen als in der Kontrollgruppe, aber deutlich weniger TUNEL positive Zellen als bei den systemischen Steroiden.


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Abbildung 4.23: Apoptose in Semidünnschnitten

Man sieht normale Neurone mit sichtbar erhaltenem Zellkern und normalem Zytoplasma. In der Umgebung sieht man Neuronen mit dunklem geschrumpften und zu kleinen Blasen kondensiertem Zellkern bei noch erhaltenem Zytoplasma, welche die Veränderungen im Sinne der Apoptose mit Chromatinkondensation und Kernfragmentation aufzeigen.

Die Zunahme apoptotischer Nervenzellveränderungen im Hippocampus kann sicher nicht im Sinne eine neuroprotektiven Strategie gewertet werden. Die Form der Steroidapplikation scheint aber einen entscheidenden Einfluss auf das Schädigungsmuster nach KSTH von 120 Minuten im Hippocampus zu haben.

4.3.10. Neuronale Nekrose im Gyrus cinguli (parietaler Cortex)

Stellvertretend für den parietalen Neocortex wurden die Neurone des Windungstals im Gyrus cinguli für normale, nekrotische und apoptotische Zellveränderungen quantifiziert.

Die morphologische Einteilung des GC beruht auf einer Schichtung der Neurone nach Größe und Funktion. Dabei beginnt außen die Schicht I und nach innen folgen fortlaufend die Schichten II bis V. In der Schicht II und V sind die Neurone am größten und es zeigte sich, dass in diesen Schichten mehr nekrotische Neurone vorlagen. Dabei könnte ein Zusammenhang zwischen Neuronengröße und der Empfindlichkeit gegenüber einer Hypoxie bestehen.


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Abbildung 4.24: Nekrose im Gyrus cinguli (Neocortex)

Bei relativ ähnlich hohem Anteil nekrotischer Veränderungen in Kontroll- und systemischer Steroidgruppe, zeigte sich ein deutliche besseres Abschneiden der intrathekalen Steroidgruppe. Dabei waren die errechneten Unterschiede zwischen beiden Steroidgruppen signifikant (p=0.026), jedoch nicht signifikant war der Vergleich zu der Kontrollgruppe.

Das Ausmaß der Schädigung lag bei der Kontrollgruppe mit einem errechneten Mittelwert von mit 65 ± 25 % aller gezählten Neurone relativ hoch. In der systemischen Steroidgruppe bot sich ein ähnliches Ausmaß der Schädigung mit einem Mittelwert von 61 ±15 % neuronaler Nekrose. Die Intervention mit systemischen Steroiden zeigte somit keine Verbesserung der nekrotischen Schädigung im Neocortex. Im Gegensatz dazu lag in der intrathekalen Steroidgruppe der Mittelwert bei 30 ± 7 % und der Anteil nekrotischer Veränderungen fiel somit signifikant niedriger aus, als in den beiden anderen Gruppen (p=0.026).


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Abbildung 4.25: Nekrose im Gyrus cinguli (Neocortex)

Dargestellt sind HE-Schnitte aus dem Gyrus cinguli (GC), mit einer Schichtung der einzelnen Neurone unterschiedlicher Göße (Römische Ziffern I-V). Im linken Schnitt ist der GC eines Kontrolltieres gezeigt bei dem fast alle Neurone nekrotisch verändert sind. Rechts dargestellt ist der Gyrus cinguli eines Tieres der intrathekalen Gruppe. Hier zeigt sich ein sehr geringer Anteil neuronaler Nekrose. Die vergrößerten Ausschnitte zeigen hypoxische (breiter Pfeil) und normale (dünner Pfeil) Neurone.

Im Neocortex konnte ein protektiver Einfluss der Steroide bei intrathekaler Gabe und nicht bei systemischer Gabe erzielt werden. Die Kontrollgruppe und die systemische behandelte MP Gruppe zeigten einen sehr ähnlichen Anteil nekrotischer Veränderungen im Gyrus cinguli, einzig durch die intrathekale Behandlung mit MP konnte ein signifikant neuroprotektiver Effekt erzielt werden.

4.3.11. Neuronale Apoptose im Gyrus cinguli

Vereinzelt traten nach der Steroidbehandlung auch apoptotische Veränderungen im Gyrus cinguli auf, der Anteil lag bei ca. 10 % der Neuronen. Vor allem die kleineren Neurone waren apoptotisch verändert, aber es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Steroidgruppen beobachtet werden. Eine Quantifizierung wurde nicht durchgeführt. Zusätzlich konnte im Windungstal des Gyrus einige Apoptosen der Oligendrogliazellen beobachtet werden. Da es sich um einzelne Befunde handelte, wurde auf eine ausführliche Darstellung hier verzichtet.


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4.3.12.  Neuronale Nekrose im Nucleus caudatus

In den Stammganglien zeigte sich eher eine lokalisierte Schädigung in einigen Kerngebieten. Die Schädigung im Nucleus caudatus war nicht so ausgeprägt und mit 30-40 % in allen Versuchsgruppen sehr ähnlich war. Hierin bestand eine Abweichung von anderen Studien, in denen der Anteil der Schädigung im Ncl. Caudatus wesentlich höher lag 98 . Bei allen Tieren waren deutlich stärker die dem Hirnventrikelsystem zugewandten Bereich betroffen. Es zeichnete sich hier eine lokalisierte Schädigung in Nähe des Liquor cerebrospinalis ab, welche in einem Zusammenhang mit metabolischen oder perfusionsbedingten Veränderungen des Liquorraumes stehen könnte. Da zwischen den Gruppen kein signifikanter Unterschied bestand, wurden die Veränderungen in diesem Bereich nicht so ausführlich diskutiert.

Abbildung 4.26: Nekrose im Nucleus caudatus

Bei insgesamt moderater Schädigung gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen im Ncl. caudatus. Das Ausmaß nekrotischer Veränderungen lag im Bereich zwischen 40 und 50 % in allen Gruppen. Morphometrische Zählmethode am HE-Schnitt (320 ± 45 Neurone).


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Abbildung 4.27: Nekrotische Veränderungen im Nucleus caudatus

Hier sieht man normale (dünner Pfeil) und hypoxisch-nekrotische Neurone (Blockpfeil). Der Nucleus caudatus war in allen Gruppen nur mit 40-50 % durch Nekrose betroffen. Es gab keine signifikanten Unterschiede.

4.3.13. Neuronale Nekrose im Kleinhirn

Bei der Analyse des Kleinhirns wurden vor allem die Veränderungen der größten Zellen des Kleinhirns, nämlich die oberhalb der Körnerzellschicht liegenden Purkinje-Zellen, beurteilt. Dabei wurden mittels Gitterplatte jeweils 150±15 Zellen gezählt und auf nekrotische oder apoptotische Zellveränderungen hin beurteilt. Zellen mit Eosinophilie, Kernpyknose oder genereller Zellschrumpfung wurden als nekrotisch gewertet. Es zeigte sich ein sehr hoher Anteil nekrotischer Neurone mit 70 ± 17% bei den Kontrolltieren und mit 79 ± 9% ein etwas höherer Anteil in der Gruppe des systemischen MP. Die Purkinje-Zellen waren in beiden Gruppen durch Kernpyknose, Eosinophilie und Zellschrumpfung verändert. Die Nekrose der Purkinje-Zellen war in der intrathekalen Steroidgruppe mit einem mittleren Wert von 43±12 % signifikant geringer als in den anderen beiden Gruppen. Durch die intrathekale Intervention konnte somit ein neuroprotektiver Einfluss auf die Nekroseentstehung der Purkinje-Zellen im Kleinhirn erreicht werden.


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Abbildung 4.28: Nekrose der Purkinje-Zellen im Kleinhirn

Insgesamt zeigte sich ein deutlicher Unterschied zwischen den Gruppen bei der Betrachtung der Purkinje-Zellen im Kleinhirn. Die prozentuale Angabe erfolgte als Anteil nekrotischer Zellen an der Gesamtzahl (150± 15) der gezählten Neurone.

Abbildung 4.29: Nekrose der Purkinje-Zellen im Kleinhirn

Repräsentativer Schnitt aus dem Kleinhirn mit Darstellung der Purkinje-Zellen ringförmig oberhalb der Körnerschicht. Teilweise sind die großen Axone und Dendriten sichtbar und ebenfalls eosinophil verändert. Ähnliches bot sich bei der Kontrollgruppe.

Auch in den Kerngebieten des Kleinhirns zeigten sich Nekrosen der Neuronen. Es konnte aber kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden. Aufgrund der Größe der Neurone schienen sich nekrotische Veränderungen in allen Gruppen darzustellen. Die Steroidgabe scheint keinerlei Einfluss auf das Schädigungsmuster im Kleinhirn zu haben.


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Abbildung 4.30: Nekrose im Kerngebiet des Kleinhirn

Verändert sind die großen Neurone aus den medialen Kerngebieten des Kleinhirns: deutlich zu erkennen sind die nekrotisch veränderten Neurone mit Kernpyknose, Eosinophilie und Zellschrumpfung. Schnitt aus der Kontrollgruppe.

4.4. Molekurgenetische Untersuchungen

4.4.1. Bestimmungen des Hitze-Schock-Protein 70

Die Bestimmung der Expression des Hitze-Schock-Proteins 70 im frontalen Kortex ergab einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen. Die Expression bei den Tieren ohne CPB oder KSTH (Sham) wurden auf den Wert eins gesetzt und die Abweichung der Expression von HSP 70 in den Versuchstieren in Relation dazu gesetzt. Durch KSTH kam es zu einer Erhöhung der Expression für das HSP 70 in allen Gruppen, die höchsten Werte wurden in der intrathekalen Gruppe verzeichnet. Die intrathekale Steroidintervention führte zu einer signifikanten Zunahme der Expression von HSP 70 gegenüber der Kontrollgruppe und der systemisch behandelten Steroidgruppe. Die systemische Steroidbehandlung führte auch zu einer erhöhten Expression des HSP 70, der Unterschied war jedoch nicht signifikant.


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Abbildung 4.31: Expression des Hitze-Schock-Proteins 70kDa.

Dargestellt ist die Genexpression für das HSP 70 im frontalen Kortex. Die Expression von bei den Tieren ohne HLM oder KSTH (Sham) wurde auf den Wert eins festgelegt. KSTH und die systemische Steroidbehandlung führten zu einer nicht signifikanten Erhöhung der Expression des HSP 70. Nur die intrathekale Steroidbehandlung führt zu einer signifikanten Erhöhung der Genexpression des als protektiv geltenden HSP 70 (p=0.03).

4.4.2. Bestimmungen der pro-apoptotische Gene Bak und FAS

Bei der Messung der Expression der pro-apoptotischen Gene Bak und FAS konnte ein signifikanter Unterschied ermittelt werden. Gegenüber den Tieren ohne jegliche Operation mit Herz-Lungen-Maschine oder KSTH zeigte sich ein signifikante Zunahme der Expression beider Gene (p=0.01). Gegenüber der Kontrollgruppe konnte ein signifikante Zunahme der Expression nur für das intrazelluläre Gen Bak beobachtet werden. Die Expression des extrazellulären FAS-Genes war in der Kontrollgruppe nicht signifikant erhöht. Unter der Steroidintervention kam es dann sowohl zu einer vermehrten Expression für intrazelluläre Stimuli (Bak) als auch extrazelluläre Stimuli (FAS) der Apoptose. Dieses könnte eine molekulare Grundlage für die Induktion der morphologisch sichtbaren neuronalen Apoptose durch eine Steroidbehandlung zu sein. Dabei scheint auch die Applikationsart der Steroide eine Rolle zu spielen, denn die Expression von Bak und FAS war in der systemischen MP Gruppe am höchsten.


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Abbildung 4.32: Expression pro-apoptotischer Gene Bak und FAS

Dargestellt sind die mittels Realtime-PCR gemessene Expressionen der pro-apoptotischen Gene Bak und FAS im frontalen Kortex. Es zeigt sich gegenüber Tieren ohne CPB oder KSTH eine Zunahme dieser Gene in der Kontrollgruppe, welche jedoch nicht signifikant war. Dafür jedoch kam es durch die Steroidgabe zu einer signifikanten Zunahme der Genexpression für Bak und FAS.

4.4.3. Bestimmungen von Bcl-xl als anti-apoptotisches Gen

Die Expression des Bcl-xL Gens aus der Familie der anti-apoptotischen Bcl-2-Gruppe zeigte sehr ähnliche Werte für die Tiere ohne KSTH und für die Kontrollgruppe mit CPB und 120 Minuten KSTH. Zu einer Erhöhung der Genexpression für Bcl-xL kam es durch die Intervention mit Steroiden, wobei nur in der intrathekalen Gruppe ein signifikanter Unterschied gegenüber der Kontrollgruppe entstand (p=0.03). Ermittelt wurden die Werte mittels Realtime-PCR, die Expression in den Tieren ohne KSTH diente zur Ermittlung der normalen Expression und wurde auf eins festgesetzt.


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Abbildung 4.33: Expression des anti-apoptotischen Bcl-xl-Gens

Dargestellt ist die mittels Realtime-PCR gemessene Expressionen des anti-apoptotischen Gens Bcl-xl im frontalen Kortex. Es zeigt sich gegenüber Tieren ohne CPB oder KSTH (auf den Wert eins gesetzt) eine geringe Zunahme der Expression dieser Gene in den beiden Steroidgruppen, wobei sich nur die Zunahme in der intrathekalen Gruppe mit p=0.03 gegenüber der Kontrollgruppe signifikant unterschied.


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27.09.2004