[Seite 69↓]

5.  Diskussion

In der vorliegenden experimentellen Arbeit konnte demonstriert werden, dass im Zusammenhang mit Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie und CPB eine morphologisch sichtbare Schädigung auf zerebraler Ebene reproduzierbar ist. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass es bei der chirurgischen Korrektur angeborener Herzfehler im Neugeborenen- und Kleinkindalter auch unter systemischer Hypothermie es bei einer verlängerten Kreislaufstillstandszeit zu einer Beeinträchtigung der zerebralen Funktion kommen kann, mit daraus resultierender morphologischer Schädigung. Die Inzidenz dieser zerebralen Veränderungen beeinflusst wiederum entscheidend die spätere kognitive Leistung und psychomotorische Entwicklung der operierten Kinder 1;8.

Es besteht somit die Notwendigkeit die zugrundeliegenden Pathomechanismen der zerebralen Alterationen aufzudecken und entsprechende Strategien zum Schutz des Gehirns zu entwickeln. Diese Arbeit sollte der Beschreibung der morphologischen Veränderungen im Gehirn nach verlängertem hypothermen Kreislaufstillstand von 120 Minuten dienen. Anhand des detektierten Schädigungsmusters sollte in einem zweiten Schritt der Einfluss einer Behandlung mit Methylprednisolon auf die Prävention einer neuronalen Schädigung quantitativ überprüft werden. Zu diesem Zweck wurde ein neonatales Tiermodell entworfen, welches die Gegebenheiten in der Klinik möglichst realitätsgetreu wiederspiegelt. Die Ergebnissen bei verlängertem KSTH sollten dann auch Ansätze bilden für eine zerebrale Protektion bei wesentlich kürzeren Kreislaufstillstandszeiten.

Orientiert wurde sich beim Entwurf des Studiendesigns aber auch an anderen experimentelle Studien. Kreislaufstillstandszeiten von 90 bis 120 Minuten wurden in einigen experimentellen Studien zur Erforschung der zerebralen Veränderungen angewendet 152;160;161. Aber auch im klinischen Alltag können bei sehr komplexen Operationen, wie z.B. bei der Korrektur des hypoplastischen Linksherzsyndroms, Kreislaufstillstandszeiten von 60 bis zu 80 Minuten durchaus notwendig sein. Insgesamt konnte mit diesem Modell aber erst einmal gezeigt werden, dass eine Erhebung eines organspezifischer Schädigungsmuster nach KSTH und die Evaluation einer neuroprotektiven Intervention gut möglich ist 116. Bisher haben nur Kurth und Fessatidis et al. ein neonatales Modell zur Erforschung der zerebralen Veränderungen im Zusammenhang mit CPB und KSTH mit anschließender morphologischer Analyse des ZNS etablieren können 21;87.

5.1. Rolle der Steroide in der Organprotektion

Steroide und speziell das Methylprednisolon werden schon seit 1966 in der Herzchirurgie eingesetzt, ursprünglich mit dem Ziel eine reaktive Vasokonstriktion und eine kardiale Dysfunktion nach CPB zu beeinflussen 124;125. Ein protektiver Einfluss von Methylprednisolon auf das Herz wurde bei anoxischem Herzstillstand beschrieben, wobei die Vorbehandlung mit MP zur Vermeidung einer pathologischen Kontraktur des Herzmuskels nach elektromechanisch ausgelöstem Herzstillstand führte 162.


[Seite 70↓]

Durch die Erkenntnisse über eine Induktion inflammatorischer Kaskaden und der Entstehung eines generalisierten Ödems nach zerebraler Ischämie und Reperfusion wurden die Steroide in den letzten Jahrzehnten auch zur Neuroprotektion eingesetzt. Seitdem wird ein neuroprotektiver Effekt von Steroiden, wie z.B. Methylprednisolon (MP), in Zusammenhang mit zerebraler Ischämie in vielen Studien kontrovers diskutiert 121;163-168. Zur Evaluation eines neuroprotektiven Effekt einer Steroidbehandlung wurden verschiedene Modelle mit fokaler und globaler zerebraler Ischämie entworfen 121;169-171. Steroide wurden dabei eingesetzt zur Vorbeugung und Behandlung einer inflammatorisch bedingten Zellschädigung, Permeabilitätsstörung und zur Prävention eines zellulären und interstitiellen Ödems 120-123. Der hemmende Einfluss auf die Entstehung eines interstitiellen Ödems konnte durch eine Vielzahl klinischer und experimenteller Studien nachgewiesen werden 22;129;166;169. Ob jedoch eine Ödemprävention mit einer Zellprotektion gleichzusetzen ist, bleibt fraglich. Die erwünschte Wirkung der Steroide besteht unter anderem aus einer Hemmung der Freisetzung inflammatorischer Mediatoren. Steroide wirken hemmend auf Makrophagen und auf die Expression der pro-inflammatorischen Zytokine TNF-alpha, IL-6 und IL-8 53;131;132. Dadurch kommt es zu einer geringeren Komplementaktivierung 53;131;132. Gleichzeitig erhöhen sie die Konzentration anti-inflammatorischer Zytokine, wie z.B. von IL-10 54;55. Bei Annahme einer entzündlichen Genese der Nervenzellschädigung nach CBP interpretierten einige Studien die Reduktion der pro-inflammatorischen Parameter nach Steroidgabe als neuroprotektive Wirkung 126-128. Jedoch wurden in keiner Studie zusätzlich die morphologischen Veränderungen untersucht.

Aber die Kontroverse über einen neuroprotektiven Effekt durch Reduktion der inflammatorischen Antwort durch Steroidgabe bestand weiter durch die vor allem gegensätzliche Ergebnisse aus klinischen Studien. Dabei beschrieb Andersen et al z.B. in einer klinischen Studie zwar eine Reduktion der Komplement-Aktivierung während CPB unter einmaliger intravenöser „high-dose“ Steroidtherapie, es fehlte jedoch ein signifikanter Unterschied im Outcome der Patienten 137. Boscoe et al. zeigten, dass weder Steroide noch pulsatiler HLM-Fluß die Komplement-Aktivierung unter CPB beeinflussen 138. Karlstadt et al. untersuchten den Einfluss der Steroide auf eine Endotoxin-Entstehung während CPB und stellten fest, dass Methylprednisolon die Entstehung des Plasma-Endotoxin nicht beeinflusst 139.

Ebenfalls konnte durch die Steroidbehandlung in anderen experimentellen neurologischen Studien eine Verminderung exzitatorischer Aminosäuren nach zerebraler Ischämie beobachtet werden 20;122;128;133. Zusätzlich konnte in einigen Studien auch ein antioxidaktiver Effekt durch die Steroide beschrieben werden 121;130. Und Simard et al konnten auch einen protektiven Einfluss des Methylprednisolon auf die Astrozyten nach zerebraler Ischämie nachweisen 166. Dabei scheint MP die astrozytäre Calcium-Homöostase zu stabilisieren, und damit eine astrozytäre Dysfunktion mit einem Anstieg des für die Neuronen toxischen extrazellulären Calcium’s zu verhindern 166.

In den meisten klinischen und auch experimentellen Studien fehlen jedoch vor allem ausführliche morphologische Untersuchungen, um eine neuroprotektive Wirkung durch die Applikation der Steroide wirklich beweisen zu können. Um einen neuroprotektiven Effekt der systemischen Steroidgabe wirklich nach[Seite 71↓]zuweisen, bedarf es vor allem einer morphologischen Analyse im Gehirn nach Steroidapplikation im Zusammenhang mit einer hypoxisch-ischämischen Schädigung.

Die Vorbehandlung mit Steroiden mit einer „high-dose“ intravenösen MP-Gabe von 30 mg/kg vor einem ischämischen Ereignis, wie z.B. Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH), wird diskutiert 22;172;173. Nach der Vorbehandlung mit Steroiden und nach 100 Min. KSTH zeigte sich in einer Studie eine deutliche Reduktion des Körperödems, eine Verbesserung der vaskulären Funktion und eine Reduktion apoptotischer Zellveränderungen im ZNS 22. Jedoch zog diese Studie keinen Vergleich zu Tieren ohne Steroidapplikation und es fand nur eine immunhistochemische Analyse mit Anfärbung des „transforming growth factor-ß1“ (TGF-ß1) und des Apoptose-Markes Caspase-3 statt. Auf eine ausführliche quantitative regionale Analyse der neuronalen Veränderungen wurde verzichtet.

Ebenso berichtete eine Arbeitsgruppe der Duke-Universität von einer Reduktion der Immunantwort nach der Vorbehandlung mit hochdosierten Steroiden 8 Stunden vor dem CPB, verglichen mit der herkömmlichen intraoperativen Applikation in der Primeflüssigkeit des CPB 136. Die präoperative Applikation führte zur einer verbesserten Lungenfunktion durch verminderte pulmonale Wasserakkumulation: eine ähnliche Wirkung konnte auch im Gehirn durch Reduktion des perivaskulären Ödems und Verbesserung der zerebralen Hämostase aufgrund dieser Ergebnisse vermutet werden.

Auch die Ergebnisse einer Studie von Langley et al., welche den Einfluss einer Vorbehandlung mit hochdosiertem Methylprednisolon auf den zerebralen Blutfluss und die Oxygenation nach 60 Minuten KSTH untersuchten, fanden eine statistisch signifikante Erhöhung der regionalen zerebralen Perfusion nach CPB und KSTH. Auch hierbei fehlte jedoch eine histologische Evaluation post mortem, sowie weiterführende neuropsychologische Untersuchungen, die notwendig wären, um wirklich einen neuroprotektiven Effekt beschreiben und quantifizieren zu können 20. Die Veränderungen der zerebralen Perfusion und Oxygenation so kurz nach KSTH, stellen jedoch eher eine physiologische Variationen mit zugrundeliegender Kopplung aus Metabolismus und Perfusion dar, als ein Anzeichen für das Vorliegen einer signifikanten Organprotektion 17;135.

Chaney et al. stellte nach Methylprednisolongabe eine Verschlechterung der Hämodynamik und des Outcome nach während CBP fest 174. Auf eventuelle Nebenwirkungen einer Steroidtherapie vor allem im Neugeborenen– und Kleinkindesalter weisen aktuelle klinische Studien hin. Gerade durch eine postnatalen Steroidapplikation zur Behandlung einer Lungenunreife, konnten Störungen der neurologischen Entwicklung und des Verhaltens beobachtet werden 140.

5.2. Vergleich der drei Versuchsgruppen

Die Gruppen unterschieden sich nicht signifikant in ihren allgemeinen Parametern wie Gewicht, Alter oder Größe. Die relativ kleinen Versuchsgruppen waren bedingt durch die äußerst komplizierte Durchführung der Versuche und es wurde daher auch aufgrund strenger Kriterien eine große Anzahl von Tieren [Seite 72↓]ausgeschlossen. Insgesamt wären natürlich größere Gruppen statistisch wünschenswert, aber aufgrund der technischen Durchführbarkeit und der komplexen Bedingungen der Untersuchungen gestaltete sich dieses schwierig. Die intrathekal behandelte Gruppe ist mit 5 Tieren die kleinste, doch waren ihre Ergebnisse statistisch mit der geringsten Varianz versehen.

5.3. Morphologische Veränderungen des ZNS ohne Steroidbehandlung

Um einen neuroprotektiven Effekt überprüfen zu können war es notwendig, die zerebralen Veränderungen nach Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) und CPB zu beschreiben. Das Schädigungsmuster nach 120 Minuten KSTH ohne jegliche protektive Intervention bestand aus deutlichen und quantifizierbaren morphologischen Veränderungen auf astroglialer und neuronaler Ebene, mit einem regional unterschiedlichen Verteilungsmuster in den einzelnen Hirnbereichen. Die Ausprägung und die Genese von astroglialer Zellschädigung, sowie Nekrose und auch Apoptose der Neuronen ist sicherlich multifaktoriell bedingt und steht vorwiegend im Zusammenhang mit dem verlängertem Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie.

Für die Manifestation der morphologischen Veränderungen im Sinne neuronaler Nekrose und Apoptose waren bei dieser experimentellen Untersuchung das Erreichen einer postoperativen Überlebenszeit von 6 Stunden wichtig. Kurth et al. zeigte in seinen Untersuchungen ein Maximum der sichtbaren morphologischen nekrotischen und apoptotischen Veränderungen nach 6 postoperativen Stunden, wobei er nach 90 Minuten KSTH morphologische Untersuchungen mit unterschiedlichen postoperativen Zeitintervallen von 6 Stunden, 2 Tagen und 1 Woche durchführte 88.

Sicherlich wären bei noch längerem postoperativen Überlebenszeitfenster eventuell noch weitere Veränderungen zu erwarten gewesen, wie reaktive Veränderungen mit Gliose und zusätzliche immunologische Reaktionen. Wegen des komplexen Versuchsaufbaus war ein Aufwachen der Tiere und eine Entwöhnung so kurze Zeit nach dem Eingriff nicht möglich. Für ein weiteres Überleben der Tiere über 6 Stunden hinaus wäre weiterhin eine intensivmedizinische Überwachung mit Beatmung und ein komplettes intensivmedizinisches Monitoring erforderlich gewesen. Bei einer längeren postoperativen Überlebenszeit können auch zusätzliche Komplikationen unabhängig vom Versuchsaufbau, wie Blutungen, Infektionen, metabolische Störungen und hämodynamische Störungen, auftreten.

Wichtig zu erwähnen ist, dass die Dauer des KSTH einen signifikanten Einfluss auf die Entstehung und das Ausmaß der Neuronenveränderungen zu haben scheint. So stellten Fessatidis et al. schon nach 45 Minuten eine Zellschädigung in Form einer neuronale Nekrose fest, während Kin et al. diese erst nach 90 Minuten beobachteten 94;95. Einen sehr großen Einfluss scheint aber auch das Perfusionsprotokoll zu haben, wobei während eines „full-flow“-CPB eine Ischämie nicht zu erwarten ist.


[Seite 73↓]

5.3.1.  Veränderungen der Astrogliazellen

Im Rahmen der Versuche konnte gezeigt werden, dass nach KSTH nicht nur die Schädigung der Neuronen im ZNS eine wesentliche Rolle spielt, sondern auch die Veränderungen der Astrogliazellen, welche einen sehr wesentlichen Bestandteil aller Zellen im ZNS darstellen.

In den von uns durchgeführten Vorversuchen am Kaninchen und am Ferkel konnten wir nach 60 Minuten KSTH kaum ischämische Veränderungen der Neuronen feststellen 17. Dagegen lag eine deutliche primäre Schädigung auf Ebene der Gliazellen. Diese Veränderungen der Gliazellen konnten aber auch nach 120 Minuten KSTH beobachtet werden, zusätzlich zeigten sich aber dann auch die neuronalen Veränderungen.

Die Veränderungen der Astrozyten sind durch eine zelluläre Schwellung gekennzeichnet. Aus dieser Schwellung resultiert sicherlich ein Funktionsverlust. Die Gliazellen zeigen topographisch eine enge Beziehung zu den kleinen Gefäßen des ZNS. Sie umgeben die Gefäße mit ihren Fortsätzen und bilden einen sehr wesentlichen Bestandteil der Blut-Hirn-Schranke 175. Darüber gewähren sie die nutritive Funktion für die Neuronen und schützen die Neuronen durch die Metabolisierung von extrazellulären Glutamat und anderen Neurotransmittern vor einer excitotoxischen Schädigung 176;177.

Abbildung 5.1: Beziehung der Astrozyten zu den Gefäßen des ZNS

In vitro konnte eine astrozytäre Schwellung in Versuchen mit Zellkulturen durch Hypothermie, Hypoglykämie und Azidose hervorgerufen werden 175;178-180. Es konnten dabei komplexe Zusammenhänge zwischen der Störung des Glutamat-Metabolismus der Astrozyten während Hypothermie und einer astroglialen Schwellung nachgewiesen werden 176;180. Als Ursache der astroglialen Schwellung können somit Glutamat-Toxizität und Ionen-Imbalance angeführt werden, welche zu Veränderungen im Membranpotential der Astrozyten und einer resultierenden Schwellung führte 180-182. Die astrogliale Schwellung während [Seite 74↓]Hypothermie konnte jedoch durch eine Hyperoxie gemildert werden 180. Somit scheint neben der Ischämie auch die Hypothermie an sich eine Rolle bei der Gliazellschädigung zu spielen.

Nach 120 min. KSTH zeigte sich eine deutliche astrozytäre perivaskuläre Ödembildung, welche möglicherweise ebenfalls sekundär mit einer Verschlechterung des Neuronenstoffwechsel verbunden ist 17. Die Bestimmungen spezifischer astroglialer Proteine wie des Protein S100B in Serum und Liquor können auf morphologische und funktionale Alterationen der Astrogliazellen hinweisen 48. Die Ergebnisse der Bestimmung des astroglialen Proteins S100B bei KSTH wurden bereits publiziert 17.

5.3.2. Neuronale Nekrose

Die Ergebnisse unserer experimentellen Untersuchung ergaben, dass ein verlängerter KSTH von 120 Minuten zu der Entstehung von Nekrose und auch Apoptose der Neuronen im ZNS mit einer regional unterschiedlichen Ausprägung führt. Bei der genauen Betrachtung der einzelnen Hirnregionen zeigte sich ein deutlicher Fokus der Schädigung im Bereich des Hippocampus, des Kleinhirns und des Neokortex, bei geringer ausgeprägten Veränderungen in den Stammganglien und den anderen Bereichen des ZNS. Es zeigte sich damit eine Abweichung gegenüber früheren Studien mit KSTH und einer morphologischen Analyse des ZNS 94;99. Während bei den anderen Studiengruppen der Fokus der Schädigung vorwiegend im Sektor CA 1 lokalisiert war, zeigten die neuronalen Zellveränderungen in unserer Studie eine regional unterschiedliche Ausprägung. Der Hippocampus war in unserer Studie betroffen mit den Abschnitten CA 1-4 und Gyrus dentatus. Somit konnten in unserer Studie sehr ähnliche Ergebnisse erzielt werden, wie in der Studie von Kurth et al 88. Nur wenige experimentelle Studien führten eine regionale morphologische Untersuchung des Gehirns nach KSTH durch. Die meisten Studien begnügten sich jedoch dabei auch mit nur der Erhebung eines „Scores“ und somit einer semiquantitativen Auswertung 58;183-185.

Der Hippocampus bildet als Teile des limbischen Systems die Grundlage der kognitiven Kombinationsanwendung und des Langzeitlernens. Er bietet ein gutes Beispiel dafür, wie Neuronen abhängig von ihrer funktionaler und regionaler Zugehörigkeit eine unterschiedliche Reaktion auf eine Ischämie-Reperfusion zeigen können 88;186. Die Neuronen des Gyrus dentatus zeigten nach KSTH von 120 Minuten vor allem einen Zelluntergang in Form eines programmierten Zelltodes (Apoptose), wobei ca. 10 % der Neuronen verändert waren. Die Neurone des CA 1– CA 4 wiesen eine Zellschädigung in Form von Nekrose auf mit teilweise 70 % Anteil geschädigter Neurone. Über die Ursache der unterschiedlichen regionalen Manifestationen der Schädigung im Gehirn kann nur spekuliert werden. Funktionale und auch strukturelle Unterschiede der einzelnen Neuronengruppen im Hippocampus könnten, was in der Literatur als „selektive Vulnerabilität“ angegeben wird, für die unterschiedlichen Zellveränderungen verantwortlich sein 118;186;187. Die Analyse des Hippocampus für nekrotische Neuronenveränderungen, als Ort der „selektiven Vulnerabiliät“ nach Ischämie ist sehr gängig, doch in vielen Studien wurden meist nur das CA1 und nicht auch die anderen Bereiche CA 2 – CA 4 untersucht 94;186;188. Ein nekrotischer Zelltod kommt gegenüber einem kontrollierten und morphologisch abgrenzbaren apoptotischen Zelltod durch eine fulminante Störung der [Seite 75↓]Mitochondrienfunktion mit einem exzessiven Calcium-Einstrom, sowie einer Toxizität durch verschieden Metaboliten, wie z.B. Glutamat, zustande. Dieser Vorgang führt zu einer Reduktion der notwendigen zellulären Energie-Produktion und schließlich zum zellulären Energiemangel mit dem Erliegen der so wichtigen Zellhomöostase 59;60;189-191. Es gibt einige Hinweise, dass auch die Hyperglykämie einen Einfluss auf die Entstehung und Verstärkung einer selektiven neuronalen Nekrose besitzt 186.

Die in unserer Untersuchung dokumentierten neuronalen Veränderungen geben einen Hinweis darüber, dass es trotz einer erwiesenen neuroprotektiven Wirkung durch die Hypothermie, bei längeren Stillstandzeiten größer 60 Minuten zu einer möglichen Limitation der protektiven Wirkung kommen kann. Daraus resultiert ein Schädigungsmuster in Form neuronaler Nekrose und Apoptose.

Im Kortexbereich gab es ebenfalls eine unterschiedliche Verteilung für die vor allem nekrotischen Neuronenveränderungen, welche sich als abhängig von der Zugehörigkeit zu den einzelnen Schichten und der Neuronengröße zeigte. Je größer die Neuronen waren, desto mehr Schädigung zeigten sie. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von anderen Studien berichtet, wobei in der Studie von Kurth et al. erstmals die apoptotischen Veränderungen im Vordergrund standen 88;192 .

Im Kleinhirn dominierten die nekrotischen Veränderungen der großen Purkinje-Zellen. Es zeigte sich eine deutliche Schädigung mit teilweise 70 – 80 % nekrotischer Zellen. Das Kleinhirn wurde in anderen Studien mit KSTH selten betrachtet. Ein so hoher Anteil der hypoxisch-ischämischen Veränderungen wurde in Studien mit normothermer Ischämie beschrieben 188. In der Studie von Kurth et al. zeigten sich ebenfalls nekrotische Veränderungen im Kleinhirn, jedoch war der Anteil der Schädigung mit ca. 25 % geringer 88.

Die Veränderungen im Bereich der Stammganglien waren durch eine moderate Schädigung geprägt und unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Gruppen. Diese Ergebnisse decken sich gut mit denen anderer Studien, in denen die Stammganglien keine wesentliche neuronale Schädigung aufwiesen 88;192.

5.3.3. Neuronale Apoptose

Der Bergriff Apoptose stammt aus dem griechischen und bedeutet :„Herabfallen der Blätter im Herbst“. Er wurde durch Kerr und seine Mitarbeiter eingeführt. Sie beschrieben damit neben der Nekrose als passive Form die aktive Form des Zellunterganges 105. Im Gegensatz zur Nekrose ist die Apoptose ein energieabhängiger Prozess des Zellunterganges, welcher während der embryonalen Entwicklung und in dem sich regenerierendem Gewebe physiologisch vorkommt 193. Morphologisch zeichnet sich die Apoptose durch Kernfragmentation, Zellschrumpfung und Bildung „apoptotischen Körperchen“ bei initialem Erhalt der Zellorganellen und der Zellmembran aus 100. Der apoptotische Zelltod wird auch „programmierter“ Zelltod genannt. Er wird durch eine mitochondriale Dysfunktion und durch Freisetzung von Cytochrom C als „Apoptose-induzierendem Faktor“ aus den Mitochondrien getriggert 112;189. Sind die Mitochondrien nach einer Ischämie-Reperfusion einer Akkumulation von intrazellulären Calcium oder Sauerstoffradikalen ausgesetzt, öffnen sich in der mitochondriale Membran die „Ca++Poren“ („mitochondrial permeability [Seite 76↓]transition pore“). Dadurch gerät das Membranpotential aus dem Gleichgewicht und es kommt zu einem Versagen der Energie-Produktion. Hieraus resultiert die Freisetzung von Cytochrom C. Cytochrom C aktiviert wiederum eine Reihe von Enzymen der Transkription, wodurch es zur Auflösung und Fragmentierung der DNA kommt, und vor allem die Caspase-Kaskade 194. An den Mitochondrien befinden sich auch das anti-apoptotischen Protein Bcl-XL und weitere Vertreter der anit-apoptotischen Bcl-2-Familie 195. Diese können durch Interaktion mit dem Apoptose-Protease-Aktivierungsfaktor 1 (APAF-1) die Aktivierung der Caspase-Kaskade hemmen 196. Ob es zum programmierten Zelltod kommt oder nicht, wird durch eine Vielzahl von Proteinen und Mediatoren reguliert. Das Verhältnis der anti- und pro-apoptotischer Proteine ist u.a. ausschlaggebend. Ein Überwiegen der pro-apoptotischen Proteine Bax und FAS und eine Fehlen des anti-apoptotischen Proteins Bcl-XL führt demnach zur Induktion der Apoptose 150.

Aber im Rahmen einer Ischämie-Reperfusion können auch externe Stimuli wie TNF, lösliches Fas, toxische Produkte, Perioxide, Sauerstoffradikale oder NO via Rezeptoren in der Zellmembran zu einer Aktivierung des intrazellulären Caspase-Systems führen 59;114.

Das Auftreten apoptotischer Veränderungen im Hippocampus nach Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie wurde erst in neueren Studien von Kurth und Cooper et al. beschrieben 83;88.

Unsere Ergebnisse sind somit übereinstimmend mit den Ergebnissen von Kurth et al. 88. Die Apoptose als aktive und energieabhängige Form des Zellunterganges trat ohne Steroidbehandlung nur regionalspezifisch im Gyrus dentatus des Hippocampus auf und lag im Durchschnitt bei 9 % der Neuronen. Die Unreife der Zellen im Hippocampus könnten diese spezifische Veränderung und die regionalen Unterschiede bedingen 88.

5.4. Einfluss der Behandlung mit Methylprednisolon (MP)

Es wurde eine Vorbehandlung mit „high-dose“ Methylprednisolon 4-6 Std. intravenöse und intrathekal präoperativ durchgeführt, um eine mögliche molekulare Induktion spezifischer Steroide induzierter Mechanismen hervorzurufen. Die Vorbehandlung vor dem eigentlichen ischämischen Ereignis sollte eine verbesserte Zellprotektion bewirken. Nach intravenöser Gabe von MP wird die Maximalkonzentration im Organgewebe erst nach 1 bis 2 Stunden erreicht, wodurch eine Gabe während des CPB zu spät sein könnte, um eine wirksame Zellprotektion zu erzielen 22;53. Dabei ist zu beachten, dass Thompson et al. ein Absinken der Steroidkonzentration im Blut 4 Stunden nach intravenöser Applikation beschrieben hat und somit die Wirkungsdauer begrenzt zu sein scheint 136;197. Dieses könnte eine Einschränkung der Vorbehandlung bedeuten und eine weitere Gabe im Rahmen der Reperfusion könnte postuliert werden. Bisher hat jedoch keine Untersuchung zur Evaluation der Pharmakokinetik unter CPB und der unterschiedlichen Applikationsarten stattgefunden und der Einsatz der Steroide im Sinne der Neuroprotektion bleibt weiter ungeklärt.


[Seite 77↓]

Über einen Dosis-abhängigen Effekt und auch Nebenwirkungen kann spekuliert werden, aber die in dieser Untersuchung verwendeten 30 mg/kg KG wurden empirisch ausgewählt, gelten in der Literatur aber schon lange als ein Standard für eine „high-dose“ Methylprednisolon Behandlung und wurden auch in anderen Studien verwendet 134;173;197-201.

Die intrathekale MP-Gabe wurde präoperativ ebenfalls einmalig durchgeführt, sie diente der Überprüfung einer von der Permeation über die Blut-Hirn-Schranke unabhängigen Wirkung des MP im ZNS. Bei intrathekaler Gabe gilt eine deutlich höhere Konzentration verglichen mit intravenöser Gabe als wahrscheinlich, wie Untersuchungen beim Schwein zeigen konnten 202. Die Verträglichkeit der intrathekalen Applikation wird auch in der Literatur als unbedenklich angesehen 203. Einzig durch die Nebensubstanzen wie Polyäthylenglykol wurde einmalig eine Nebenwirkung mit Arachnoiditis beschrieben 204. Die Halbwertszeit für Steroide im Liquorraum ist relativ kurz, für Dexamethason liegt sie nach Angaben bei 2,2 Std 205. Ein Übertritt des MP aus dem Liquor in das Hirngewebe wurde durch Lehrer et al. dokumentiert, wobei das MP vorwiegend in der weißen Substanz nachgewiesen werden konnte 206. Die Fähigkeit zur Passage oder Permeation von MP über die Blut-Hirn-Schranke zeigt eine entscheidende Rolle für die neuroprotektive Wirkung des Methylprednisolons (MP) zu spielen, ist aber weiter ungewiss. Chen et al. veröffentlichten eine Studie bei der sie zeigten, dass MP sich an die Gehirnkapillaren bindet und dann in einem sehr langsamen aktiven sättigbaren Transport die Blut-Hirn-Schranke (BHS) passieren kann, welcher im Zusammenhang mit dem zytoplasmatischen Glukokortikoidrezeptor steht 207.

Aufgrund der Blut-Liquor-Schranke für eiweißgebundene Substanzen, zu denen auch das MP zählt, können nach einer Studie von Uete et al. bei systemischer Applikation im Liquor nur etwa 1/10 der Serumspiegel erreicht werden 208. Die lumbale Applikation erreicht somit deutlich höhere Konzentrationen im Liquor. Die Konzentration im kranialen Anteil der Liquorräume bei lumbaler Applikation ist jedoch weiter unklar 209. Es werden jedoch höchstwahrscheinlich deutlich höhere Konzentrationen erreicht, als bei systemischer Applikation. Trotzdem werden aber lipidlösliche Steroide mit dem Ziel entworfen, eine bessere Passage in das ZNS zu erreichen. Die Permeabilität der Steroide über die BHS bleibt ungeklärt, eine zelluläre Wirkung des MP auf die Neuronen kann nicht sicher nachgewiesen werden. Vielleicht erklärt die nur geringe Permeation in das ZNS die fehlende neuroprotektive Wirkung 171;202;207.

Eine Studie von Abram et al. untersuchte den Effekt einer intrathekalen Steroidgabe und den Einfluss eines lumbalen Dauerkatheters für eine intrathekale Applikation. Dabei konnten sie keinen direkt neurotoxischen Effekt einer intrathekalen Steroidgabe feststellen 203. Auch in dieser Studie konnte kein morphologisch sichtbarer direkt neurotoxischer Effekt durch die intrathekale Steroidapplikation festgestellt werden.

Die Unterschiede in unseren Ergebnissen bei der Intervention mit intrathekalen Steroide und der daraus resultierenden signifikanten Reduktion der nekrotischen Neuronenschädigung im Vergleich zur Kontroll- und auch zur systemische behandelten Steroidgruppe, weist stark auf einen Unterschied der Wirkungsin[Seite 78↓]tensität und der lokalen Verteilung im ZNS hin. Die MP-Wirkung scheint somit davon abhängig zu sein, ob und wie die Steroide das ZNS erreichen.

Als Limitation dieser Studie kann angeführt werden, dass bisher keine Bestimmungen der Steroidkonzentration durchgeführt und in Relation zu den Versuchsergebnissen gesetzt wurden. Diese Untersuchungen stehen noch aus, sind aber geplant.

5.4.1. Hämodynamische Veränderungen durch die Steroidbehandlung

Die hämodynamischen Untersuchungen ergaben keine signifikanten Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Postoperativ kam es phasenweise zu Veränderungen der Perfusion. Eine Auswertung der Perfusions- und Oxygenationsmessungen aus unserem Versuch werden folgen. Einige Aspekte sind zum Teil schon aus vorangehenden Versuchen publiziert 210. Die Intervention mit Steroiden scheint keinen signifikanten Einfluss auf die Vitalparameter zu haben und eine Wirkung der Steroide wie sie in einer Studie von Husum et al, bei der es nach einer schnellen intravenösen Bolusgabe zu einem Absinken des MAD und der SVR kam, konnte nicht beobachtet werden 211. Dass Steroide den Vasotonus und damit die Perfusion beeinflussen können, zeigte Dietzman et al. in einer Studie, wobei er eine signifikante Vasodilatation durch Steroide beobachtete 212. Ob diese Hyperperfusion im Sinne einer Neuroprotektion angesehen werden kann, oder ob es sich nur um eine temporäre reaktive Variation nach einer langen Kreislaufunterbrechung handelt, bleibt fraglich. Die Intervention mit Steroiden führte zu keiner Verbesserung der kardiorespiratorischen Parameter. Die postoperativ erhöhten ZVD-Werte waren sicherlich durch eine temporäre Herzfunktionsstörung vor allem des rechten Herzens im Rahmen einer Ischämie-Reperfusion bedingt, welches sicherlich nach einer Ischämiezeit von 120 Minuten zu erwarten ist 50213.

Einen Einfluss der Steroidgabe auf den Gesamt-Sauerstoffverbrauch konnten Thompson et al. klinisch feststellen. wobei sie keinen Unterschied in der kardialen Funktion gemessen an dem „cardiac Index“ angaben 197. Auch die Werte für die Blutgase entsprachen damit den Normalwerten in dieser Tierart und waren den physiologischen Werten beim Menschen sehr ähnlich 153;214;215. Die Hämoglobinwerte bei Ferkeln lagen ebenfalls im Normbereich, der mit 8-11 g/dl niedriger ist als beim Menschen 153. In unserer Studie kam es zu keinen signifikanten Unterschiede in den kardiorespiratorischen Parametern 41;183. Der Anstieg der PO2-Werte in der Kühlung ist bedingt durch die Aufsättigung des Blutes mit Sauerstoff und geringerem Organverbrauch bei sinkender Temperatur, wohingegen die hohen Werte in der Reperfusion und postoperativ mit PO2-Werten zwischen 200-300 mmHg sich an der oberen Grenze des Normbereiches befanden 183. Die Tiere wurden in dieser Phase optimal ventiliert.

5.4.2. Pulmonaler Effekt der Steroidbehandlung

In einigen aktuellen Studien wurde auch über einen möglichen positiven Einfluss des Methylprednisolons auf die Lunge diskutiert, wobei es in den klinischen Studien von Chaney et al. unter MP-Gabe zu einer verlängerten Intubationszeit kam, und postoperativ keine Verbesserungen der statischen und dynamischen [Seite 79↓]Lungen-Compliance festgestellt werden konnte 134216. Im Gegensatz dazu stellten Lodge et al. eine Verbesserung der pulmonalen Compliance, des pulmonal-vaskulären Widerstandes und des alveolär-arteriellen Gradienten als Maß für eine Oxygenierung der Lunge fest 136. Die Ergebnisse bezüglich der Wirkung von MP auf die Lungenfunktion bleiben also kontrovers. In unseren Versuchen konnten kein Unterschied der respiratorischen Funktion und der Oxygenationsparameter festgestellt werden.

5.4.3. Hyperglykämie durch die Steroidbehandlung

Die vorliegende tierexperimentelle Untersuchung konnte den Einfluss einer Vorbehandlung mit systemischen Steroiden auf die Entstehung einer persistierenden Hyperglykämie nachweisen. Zusätzlich kam es bei unterliegender Hyperglykämie auch zu einer stärkeren Ausprägung neuronaler nekrotischer und auch apoptotische Veränderungen. Die nur mit dem systemisch verabreichten Methylprednisolon (MP) verbundene Hyperglykämie scheint das Zellschädigungsmuster nach zerebraler Ischämie zu verstärken. Ob diese pathologische Stoffwechselsituation zu einer Mangel- oder Überversorgung der Nervenzellen mit Glucose führt ist unklar. Eine Hyperglykämie als Nebeneffekt einer Steroidtherapie ist vielfach auch in anderen Studien beschrieben worden 134. Einige Studien führten sogar die Verschlechterung der neuronalen Zellschädigung nach zerebraler Ischämie mit gleichzeitiger Steroidbehandlung auf die Entstehung einer Hyperglykämie und Laktatazidose zurück 170;186. Jedoch konnte eine signifikant vermehrte Azidose in unseren Versuchsgruppen nicht beobachtet werden.

Als endogene Ursache für eine Hyperglykämie kann sicherlich die im Rahmen einer stressbedingten Ausschüttung von Katecholaminen und Stresshormonen postuliert werden. Eine zusätzliche externe Glucose-Zufuhr wurde nicht durchgeführt, die Infusionstherapie war standardisiert.

Bei homogener Reduktion des Organverbrauchs unter Hypothermie, kam es auch postoperativ in der systemischen Steroidgruppe zu keiner Erholung der Stoffwechsellage. Der Verdacht liegt nahe, dass sowohl die Zunahme nekrotischer Veränderungen, als auch die zusätzliche vermehrte Entstehung apoptotischer Neuronenveränderungen im Hippocampus durch die unter der systemischen Steroidtherapie aufgetretene Hyperglykämie mitbedingt sein könnte. Denn in der Kontrollgruppe und in der intrathekal behandelten Gruppe zeigten sich bei normal hohen Blutglucose-Werten signifikant weniger apoptotische Zellveränderungen. Eine Hyperglykämie als Nebenwirkung einer intravenösen Steroidapplikation ist in der Literatur in zahlreichen klinischen und experimentellen Studien beschrieben worden 134;170;217.

Dass eine Hyperglykämie in Zusammenhang mit einer Ischämie zu einer Vermehrung der nekrotischen Zellveränderungen führt, konnte auch Cherian et al. zeigen 218. Vannuci et al. stellten zusätzlich fest, dass eine Hyperglykämie während oder nach einer Ischämie des ZNS zu einer Verstärkung des Zellschädigungsmusters führt. Er konnte aber regionalen Unterschiede aufzeigen, wobei der Nukleus Caudatus und die Stammganglien mehr betroffen waren, als z.B. der Kortex. Eine Untersuchung des Hippocampus blieb jedoch aus 219. Auch Kondo et al. beobachteten nach fokaler Ischämie bei begleitender Hyperglykämie eine Zunahme der nekrotischen Neuronenveränderung im Kortex 220. Die pathophysiologische Grundlage [Seite 80↓]für den Einfluss der Hyperglykämie auf die Neuronenveränderungen ist sicherlich multifaktoriell bedingt. Eine der Ursachen könnte aber in der Funktionseinschränkung der Blut-Hirn-Schranke nach Ischämie liegen, wie sie Kawai et al. experimentell beobachten konnten 221. Ebenso zeigte eine experimentelle Untersuchung, dass Hyperglykämie im Zusammenhang mit KSTH durch eine vermehrte anaerobe Glykolyse im ZNS zu einer verstärkten intrazellulären Azidose und Laktatazidose führt, aus der dann einer Zunahme der Zellnekrosen resultiert 222;223. Eine weitere Studie von Koide et al. zeigte ebenfalls den Zusammenhang zwischen einer chronischen Behandlung mit Steroiden, die über eine hyperglykämische Stoffwechsellage zu einer vermehrten Laktatazidose und einer vermehrten neuronalen Nekrose führte 170.

Zusätzlich wurde neben einer mit Hyperglykämie assoziierter vermehrten Entstehung neuronaler Zellnekrose auch eine vermehrte Induktion neuronaler Apoptose im Kortex nach fokaler Ischämie in einem Tiermodell gefunden 186;224. Eine vermehrte Freisetzung von Cytochrom C durch einer Hyperglykämie geht mit einer Aktivierung der Caspase 3 einher, worauf die Aktivierung der Apoptose-Kaskade folgt und es zu einer Fragmentation der DNA kommt 113.

Zusätzlich konnte in klinischen Untersuchungen nachgewiesen werden, dass eine Hyperglykämie zu einem schlechteren Outcome nach CPB und KSTH führte 217.

5.4.4. Einfluss der Steroidbehandlung auf den Calciumstoffwechsel

Die Ursache für die unterschiedlich hohen Calciumspiegel in den Versuchsgruppen bleibt unklar. Ein primärer oder auch sekundärer Einfluss von Methylprednisolon auf den Calciumstoffwechsel kann postuliert werden 225;226. Aber Steroide führen via die Aktivierung des Glucocorticoidrezeptoren zu einem erhöhten Einstrom von Calcium in die Zelle 227. Eine Erhöhung des intrazellulären Calcium führt wiederum zu einer gestörten Funktion der Mitochondrien und zu einer Alteration der zellulären Energieproduktion, wodurch es zu einer Aktivierung hydrolytischer Enzyme und zu einer zytoskeletalen Degradation mit anschließender Zellnekrose kommt 189. Auch Kristian und Siesjo et al. zeigten den Zusammenhang zwischen dem Anstieg des freien Calcium in der Zelle nach Ischämie und einer reaktiven Aufnahme des Calciums in die Mitochondrien. Im Rahmen des „Calcium-Overloading“ kommt es zu einer gestörten Funktion der Mitochondrien, woraus eine Überflutung des Zytoplasmas mit Calcium folgt mit resultierender Zellschwellung und Zellnekrose 228-231. Eine geringere Calciumfreisetzung und Hypokalzämie kann somit eine Ursache sein für eine weniger ausgeprägte calcium-induzierte Glutamattoxicität und weniger nekrotischen Neuronenschaden 60.

Calcium besitzt einen direkten Effekt auf intrazelluläre Proteine und bewirkt durch Interaktion mit deren Phosphorylierungszustand eine Aktivitätsänderung von Enzymen, Rezeptoren und Genen 60;189.


[Seite 81↓]

Abbildung 5.2: Zellulärer Calciumstoffwechsel

Eine weitere Wirkung der Steroide wird über die Steroidrezeptoren der Astrozyten hervorgerufen, wobei hier vor allem die Ca++ Homöostase beeinflusst wird 166. Der Unterschied zwischen systemischer und intrathekaler Applikation könnte sein, dass das an Albumin gebundene MP bei systemischer Applikation mit den Steroidrezeptoren der Endothelzellen interagiert und darüber, ohne die Blut-Hirn-Schranke überwunden zu haben, in die Calcium-Homöostase der Astrozyten eingreift. Dieses könnte eine Reduktion des perivaskulären Ödems bewirken 166. Methylprednisolon führt zu einer Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration der ruhenden astrozytären Zelle, bewirkt eine Verstärkung der Calcium-getriggerten Signalantwort der Astrozyten und führt zu einer verstärkten Aufnahmefähigkeit der Astrozyten für Calcium 166. Damit sind die Astrozyten in der Lage einen interstitiellen Calciumkonzentrationsanstieg teilweise zu kompensieren, bevor er die Neuronen beeinflusst. Dieses wurde bisher als ein Teileffekt einer neuroprotektiven Wirkung interpretiert 166.

5.4.5. Ödemprävention durch Steroidbehandlung

Eine Quantifizierung des zerebralen Ödems wurde in unserer Untersuchung nur indirekt über die Veränderungen des Hirngewichtes durchgeführt (siehe Abschnitt 4.3.1.). Es zeigte sich unter der systemischen Steroidbehandlung postoperativ eine signifikant geringere Gewichtszunahme und auch ein geringeres Hirngewicht (p=0.01). Die morphologische Analyse ergab auch semiquantitativ ein etwas geringer ausgeprägtes zerebrales Ödem bei den Tieren mit systemischer Steroidapplikation. Die Interaktion der Steroide mit den Astrogliazellen und auch die Prävention eines zerebralen Ödems bleiben jedoch weiter unklar. Ob z.B. Steroide durch eine Beeinflußung des Calcium-Metabolismus in den Astrozyten eventuell [Seite 82↓]eine toxische Calciumwirkung verhindern und somit auch eine Zellschwellung verhindern, bleibt unklar 166;211.

5.4.6. Neuronale Nekrose nach Steroidbehandlung

Die quantitative Auswertung der neuronalen Veränderungen ergab, dass die Behandlung mit systemischen Steroiden nicht den gewünschten Effekt einer signifikanten Reduktion des neuronalen Schädigungsmusters bewirken konnte, jedoch bei der intrathekalen Gabe des MP eine deutliche Verbesserung des Schädigungsmusters erreicht werden konnte. Ein möglicher neuroprotektiver Effekt einer Behandlung mit Methylprednisolon zeigt somit eine deutliche Abhängigkeit von der Applikationsart.

Unsere Ergebnisse sprechen bei Betrachtung des morphologischen Schädigungsmusters nach Applikation des MP im Rahmen von KSTH gegen einen postulierten protektiven Effekt der Steroide vor allem im Zusammenhang mit einer Vorbehandlung 20;136. Hier lässt sich aber somit auch eine Übereinstimmung mit anderen Studien finden, die ebenfalls eine generelle Zellprotektion durch Steroidgabe im Rahmen einer zerebralen Ischämie anzweifelten und bei denen es auch zu einer deutlichen Verstärkung der ischämischen neuronalen Schädigung kam 167;170;232.

Der neuroprotektive Effekt der systemischer MP-Gabe hängt überwiegend von der Passage der Albumin-gebundenen Steroide über die BHS in das ZNS ab. Bei intrathekaler Gabe und einer vermutlich erhöhten Wirkungskonzentration des MP an den Gliazellen und Neuronen kann es zu einer Verbesserung der nekrotischen Zellveränderungen kommen. Es zeigt sich nur, dass ein neuroprotektiver Effekt der Steroide möglich ist, aber entscheidend von der Applikationsform abhängig ist.

Der Mechanismus einer neuroprotektiven Wirkung durch MP bleibt aber weiter nicht geklärt. Die Steroidwirkung im Hippocampus scheint besonders durch eine Interaktion mit spezifischen Rezeptoren bedingt zu sein. In experimentellen Studien von Pfaff et al. zeigte sich eine hohe Dichte von Steroidrezeptoren im Bereich des CA 1 und Gyrus dentatus 227;233. Dieses könnte auch die Ursache sein für eine lokal unterschiedliche und dosisabhängige Wirkung einer peripheren Steroidegabe sein. Bei einer hohen Dosis von Steroiden konnte festgestellt werden, dass es im Hippocampus zu einer Reduktion der Nervenzellpotentiale kommt. Dieses konnten durch die Veränderungen des Membranpotentials nachgewiesen werden 233.

Hall et al. vermuteten eine protektive Wirkung im Zusammenhang mit posttraumatischer Neuronendegeneration durch einen antioxidaktiven Effekt des MP’s 234;235. Einige Studien zeigten eine deutliche Hemmung der Expression der Adhäsionsmoleküle, inflammatorischer Cytokine und eine Induktion anti-inflam­matorischer Cytokine wie IL-10 durch Steroide auch nach KSTH 53;54;236. Eine inflammatorisch bedingte Schädigung wird zwar auch im Zusammenhang mit KSTH vermutet, scheint jedoch eher eine untergeordnete Rolle zu spielen. Eine inflammatorischen Reaktionen der Mikroglia im Gehirn konnte im Gegensatz zu Ischämiemodellen ohne tiefe Hypothermie in unserem Modell nicht nachgewiesen werden. Die Hypothermie scheint eine reaktive Aktivierung der Microglia und somit auch eine Reaktion auf einen [Seite 83↓]inflammatorischen Stimulus zu verhindern, wobei dieser Effekt der Hypothermie sich auch in Zellkulturen bestätigte 237. Allerdings waren als immunologische Parameter für das neugeborene Schwein nur TNF-alpha und IL-8 verfügbar. Eine inflammatorisch begründete Neuronenschädigung scheint wohl eher nach Trauma und warmer fokaler oder globaler Ischämie ein Rolle zu spielen, wie sich u.a. in den Studien nach Rückenmarkstrauma zeigte 165;238.

Eine weitere Studie fand aber auch einen zellulärer Mechanismus für eine exzitatorisch vermittelte nekrotische Nervenzellschädigung durch Steroide heraus, wobei eine Dexamethason-Behandlung zu einer Unterdrückung des inhibitorischen serotinergen Systems mit gleichzeitiger Aktivierung des exzitatorischen dopaminergen Systems führt, woraus eine nekrotische Zellschädigung resultierte 167. Ob in unserer Untersuchung ebenfalls ein direkter Effekt der Steroide auf das komplexe System der Neurotransmitter des ZNS als Erklärung für eine durch Steroide induzierte Nervenzellschädigung in Frage kommt, bleibt unklar, da eine Untersuchung dieser Veränderungen nicht durchgeführt worden ist.

Ein wesentlicher Unterschied der neuroprotektiven Wirkung des MP bei systemischer und intrathekaler Applikation scheint mit der direkten Wirkung und einer ausreichenden Konzentration auf zerebraler Ebene zusammenzuhängen, wobei die Wirkkonzentration von der Permeation der Steroide in das ZNS abhängig zu sein scheint.

5.4.7. Neuronalen Apoptose nach Steroidbehandlung

Bei den mit Methylprednisolon behandelten Tieren wurde eine Zunahme der apoptotischen Veränderungen gefunden, mit Begrenzung auf den Bereich des Gyrus dentatus und des Sektor CA 4. Nur vereinzelt kam es zu apoptotischen Veränderungen in anderen Bereichen wie Kortex oder Kleinhirn. Das Auftreten von Apoptose bei Gabe von MP wurde in einigen wenigen Studien unter anderem in Lymphozyten nachgewiesen 239;240241;242. Wenige Studien zeigten aber bisher vor allem auch den Zusammenhang zwischen einer Hyperglykämie und einer Induktion von Apoptose der Neuronen des zentralen Nervensystems 113;191;220.

Die Zunahme apoptotischer Veränderungen in dieser Untersuchung könnte mit der beobachteten Hyperglykämie im Rahmen der Steroidintervention zusammenhängen. Der genaue Mechanismus der Entstehung von Apoptose nach Steroidapplikation ist unbekannt, es können aber vor allem regionale Unterschiede in der Verteilung der Steroidrezeptoren angeführt werden, woraus eine regional unterschiedlich starke Steroidwirkung resultiert 164. Der Hippocampus verfügt gegenüber anderen Hirnregionen über eine außergewöhnlich hohe Dichte der Steroidrezeptoren 164;226;227. Es konnten bisher zwei Steroidrezeptoren nachgewiesen werden, wobei die Verteilung dieser beiden Rezeptoren unterschiedlich ist, jedoch beide Formen im Hippocampus vorkommen 143. Das Vorkommen der Steroidrezeptoren in den Mitochondrien der Nervenzellen lässt auf eine direkte Beeinflussung der mitochondrialen Atmungskette und somit der zellulären Energiegewinnung schließen 145.


[Seite 84↓]

Bei intrathekaler Gabe des Methylprednisolon zeigte sich in experimentellen Studien, dass ein Teil der im Liquor enthaltenen Steroide in die weiße Substanz übergehen 206. Einen direkten Effekt der Steroide auf die Entstehung der Apoptose konnte Almeida et al. erstmals beschreiben 150. Wenn man davon ausgeht, dass die Konzentration nach intrathekaler Gabe im Gehirn höher ist, als bei systemischer Gabe, dann müsste die Apoptose in der intrathekalen Gruppe auch deutlich höher ausfallen 205.

Das Auftreten regionaler Apoptose im Gyrus dentatus scheint somit eher durch die systemische als durch die intrathekale Gabe von MP bedingt zu sein. Die Hyperglykämie war in der systemischen Gruppe signifikant höher, sowohl unmittelbar nach Kreislaufstillstand, als auch in der postoperativen Phase. Es ist daher anzunehmen, dass die Hyperglykämie bei der Entstehung einer regionalen Vermehrung apoptotischer Neuronenveränderungen auch nach kalter Ischämie eine relevante Rolle spielt 113;220.

Veränderungen des Calciumhaushaltes der Astrozyten oder Neuronen nach Ischämie können zur Entstehung exzitatorischer Transmitter oder freier Radikale und zur Aktivierung intrazellulärer Enzyme wie Caspase, Lipase, Protease führen, welches dann eine neuronale Apoptose mit Fragmentation der DNA zur Folge hat 60;114;189. Die signifikant niedrigeren Calciumwerte der intrathekalen Gruppe könnten somit ein wesentlicher Bestandteil einer neuroprotektiven Wirkung durch die Steroide sein.

Trotzdem stellen die apoptotischen Neuronenveränderungen eine wesentliche Nebenwirkung der Methylprednisolongabe im neugeborenem Alter und nach CPB und KSTH dar und sie können die pathophysiologische Grundlage sein, für die zerebralen Komplikationen nach Steroidgabe im Neugeborenenalter 140.

5.5. Molekulargenetische Untersuchungen

Die Bestimmung der Genexpression von den pro-apoptotischen Proteine Bak und FAS, sowie für das anti-apoptotische Protein Bcl-xl, erfolgte im frontalen Kortex. Zusätzlich wurde die Genexpression für das Hitze-Schock-Protein 70 (HSP 70) ermittelt.

Bei den Proteinen, die an der Entstehung der Apoptose beteiligt sind, unterscheidet man eine intrazelluläre (z.B. Bak) oder extrazelluläre (z.B. FAS) Lokalisation. Durch den Einfluss der hypothermen Ischämie im Rahmen des KSTH zeigte sich eine signifikante Zunahme der Expression für das intrazellulär lokalisierte Protein Bak. Die Expression von FAS war nach 120 min KSTH (i.e. Kontrollgruppe) im Vergleich zu den Tieren ohne KSTH jedoch nicht signifikant verändert.

5.5.1. Genexpression des Hitze-Schock-Proteins 70 kDa (HSP 70)

Hitze-Schock-Proteine (HSP) sind molekulare Chaperonen und werden normalerweise kontinuierlich synthetisiert von den glialen, vaskulären und neuronalen Zellen. Zusätzlich führen eine Reihe von Stressoren des ZNS zu einer Synthesesteigerung dieser Proteine. Den verschiedenen HSP`s werden unterschiedliche [Seite 85↓]Funktionen zugeschrieben, u.a. auch Funktionen der interzellulären Kommunikation und Funktionen im Zusammenhang mit der Zellwanderung und dem Zelluntergang durch Apoptose.

Eine verstärkte Expression des HSP 70 wird jedoch in der Literatur vielfach im Sinne einer Zellprotektion betrachtet. Dabei hemmt das HSP 70 auf der einen Seite die Entstehung der Apoptose durch Interaktion mit dem Apoptose-Protease-Aktivierungsfaktor 1 (APAF-1) und verhindert dabei die typische Chromatinkondensation durch den Apoptose-Induktionsfaktor 243. Der zelluläre Ursprung des HSP 70 ist bisher nicht ausreichend geklärt. Es wird vermutet das die Neuronen und die Gliazellen das HSP 70 nach entsprechendem Stimulus synthetisieren, und dass das Protein die Gliazellen und auch die Neuronen durch Exozytose verläßt, wie in der Zellkultur nach thermischem Stress beobachtet werden konnte 244. Foster et al. konnte das HSP 70 in den neuronalen Fortsätzen (Dendriten) nachweisen 245. Einige Studien, wie die von Liu et al. beschrieben nach zerebraler Ischämie eine Detektion des HSP 70 in den Pyramidenzellen des Hippocampus mittels Immunhistochemie 246. Zugleich wiesen sie durch die Bestimmung der spezifischen m-RNA eine frühe und eine späte Steigerung der Proteinsynthese des HSP 70 nach 246. Die frühe vermehrte Expression des HSP zeigte einen signifikant protektiveren Effekt für die Neuronen im Hippocampus 247. Eine Studie von Reshef et al. zeigte, dass die HSP 70 in den Neuronen durch Interaktion mit Kaliumkanälen und deren Öffnung zu einer Zellprotektion der Neuronen gegen Ischämie und Reperfusionsschaden führt. Wobei die neuronale sich deutlich von der kardialen Expression unterschied 248. In einer in-vitro Studie von Sato et al. an Hippocampus-Neuronen konnte bei vorhergehender Hyperthermie eine deutliche Reduzierung des durch Glutamat-Toxizität hervorgerufenem neuronalen Schadens an den CA1 Neuronen festgestellt werden 187. Dabei korrelierte die Induktion des HSP 70 mit einer morphologisch sichtbaren Zellprotektion der Hippocampus-Neurone in CA 1 und CA 4 187.

Ein signifikanter Anstieg der Expression des HSP 70 konnte nur in der intrathekalen MP-Gruppe festgestellt werden. Dabei war die Expression sowohl gegenüber der Kontrollgruppe, als auch gegenüber der systemischen Steroidgruppe signifikant erhöht. Bei gleichzeitig morphologisch sichtbarer neuronaler Protektion durch die intrathekale Steroidbehandlung kann die erhöhte Expression von HSP 70 als prädiktiver Faktor für eine neuronale Zellprotektion angesehen werden. Es kann vermutet werden , dass bei einer erhöhten Expression des HSP 70 es zu weniger neuronaler Nekrose kommt, wie es schon von Sato et al beobachtet werden konnte 187.

5.5.2. Expression apoptotischer Gene (Bak, FAS, Bcl-xL)

Für die Entstehung der Apoptose bedarf es einer aktiven Genexpression und u.a. der Aktivierung einer zytoplasmatischen Caspase-Kaskade. Diese Kaskade kann durch eine Reihe von Faktoren und Transmittern aus Mitochondrien, dem Zytoplasma und durch intrazelluläre oder extrazelluläre Proteine beeinflusst werden. Auch eine Auto-Aktivierung ist möglich 249. Für die intrazelluläre Aktivierung spielen vor allem zytoplasmatische Proteine wie z.B. Bak und Mediatoren der Mitochondrien, wie der sogenannte Apoptose-Induktions-Faktor (AIF) und Cytochrom C eine Rolle. Diese interagieren mit einem zytosolischen [Seite 86↓]Komplex, dem sogenannte Apoptosome, welcher zu einer Aktivierung der Caspase-Kaskade führt und die Zelle die einzelnen Stadien des programmierten Zelltodes durchlaufen kann. Das intrazellulär vorkommende pro-apoptotische Protein Bak kann zu einer Aktivierung der Caspase-Kaskade führen 250.

Als extrazelluläre Stimuli können verschieden Mediatoren über einen trimeren Rezeptor an der Zellmembran mit einem zytoplasmatisch Teil, dem „death inducing signaling Komplex“ (DISK), die Caspase-Kaskade aktivieren. Extrazelluläre Mediatoren sind dabei die löslichen Proteine FAS (FAS-L, Apo-1L), TNF-a und andere Cytokine. Diese Proteine binden an die spezifischen Rezeptoren (CD95=FAS-R, TNF-R1) der Zellmembran, welcher dann eine Modulation des sich an der Innenseite der Zellmembran befindlichen „death inducing signaling Komplex“ (DISK) bewirkt 251. Durch diese Konformationsänderungen werden Mechanismen aktiviert, die letzten Endes zu einer Aktivierung der Caspase-Kaskade führen 251. Die vermehrte Expression extrazellulären pro-apoptotischen Proteins FAS kann somit eine Induktion des programmierten Zelltodes bewirken 252.

Aber es gibt auch Proteine, die hemmend auf die Entstehung der Apoptose wirken. Hierzu gehört Bcl-xL, aus Bcl-2-Familie. Bcl-xL ist in den Mitochondrien lokalisiert und eine erhöhte Expression kann Entstehung des programmierten Zelltodes hemmen 196;253;59. Die vermehrte Expression des Bcl-xL Proteins nach Ischämie oder Hypoxie wurde in einigen Studien im Sinne einer Neuroprotektion gewertet, da sowohl neuronale Apoptose als auch Nekrose reduziert waren 254.

Abbildung 5.3: Zelluläre Steuerung der Apoptose

Dargestellt ist das komplexe Zusammenspiel zwischen zytoplasmatischen und mitochondrialen Segmenten bei dem apoptotischen Zelltod. Ein zentraler Mechanismus dabei ist die Freisetzung des Cytochrom C aus den Mitochondrien und dessen Interaktion mit dem Apoptose aktivierendem Komplex und der Caspase-Kaskade. Externe Stimuli wie TNF, FAS-Liganden und Zytokine führen alternativ zur Aktivierung der Caspase-Kaskade und induzieren die Apoptose.


[Seite 87↓]

Die Expression der Apoptose-Gene Bak und FAS waren nach KSTH erhöht (siehe Abb. 4-32). Nur die Expression des intrazellulären Bak schien aber durch KSTH signifikant erhöht zu sein (p=0.01). Die systemische und intrathekale Steroidbehandlung führte zu einer zusätzlichen Zunahme der Expression dieser pro-apoptotischen Gene (p=0.01).

Die Expression des anti-apoptotischen Bcl-xL Genes war in beiden Steroidgruppen erhöht, wobei nur der Unterschied in der intrathekalen Gruppe signifikant war (p=0.03). Für die Entstehung von Apoptose ist jedoch vor allem das Verhältnis von pro-apoptotischen Proteinen wie z.B. Bak und FAS zu den anti-apoptotischen wie z.B. Bcl-xL entscheidend 196. Betrachtet man dieses Verhältnis in den Versuchsgruppen, so zeigte sich nach systemischer Steroidbehandlung bei nur geringer Zunahme der Expression des anti-apoptotischen Genes Bcl-xL eine deutliche Zunahme der Expression der pro-apoptotischen Gene Bak und FAS. Das Verhältnis ändert sich damit zugunsten der pro-apoptotischen Gene in den systemisch behandelten Tiere. In der intrathekalen Gruppe zeigte sich ebenfalls eine Zunahme der pro-apoptotischen Gene und aber auch eine signifikante Zunahme der anti-apoptotischen Gene. Diese Ergebnisse korrelierten mit der Morphologie und dem vermehrten Auftreten von neuronaler Apoptose.

Man kann postulieren, dass eine Steroidbehandlung im Zusammenhang mit verlängertem KSTH zu einer Zunahme der pro-apoptotischen Proteine im Gehirn führt, was sich auch morphologisch beweisen läßt.

Da die Analyse bisher nur im frontalen Kortex durchgeführt wurde, ist es möglich, dass in den anderen Hirnregionen wie z.B. im Hippocampus noch deutlichere Unterschiede der Genexpression erfasst werden können.

5.6. Zusammenfassung der Veränderungen durch die Steroidbehandlung

Mit einer systemischen Steroidbehandlung lässt sich im Zusammenhang mit KSTH kein neuroprotektiver Effekt erzielen. Dieses ließ sich aus der Tatsache schließen, dass in der systemischen Steroidgruppe eine Zunahme der ischämischen Schädigung nach KSTH und eine Induktion neuronaler Apoptose beobachtet werden konnte. Ein Ausbleiben einer neuroprotektiven Wirkung ließ sich durch unterschiedliche Messungen dokumentieren, wobei es in der systemischen MP-Gruppe zu erhöhten postoperativen Werten für Calcium kam. Die morphologische Auswertung ergab ein signifikant höheres Ausmaß neuronaler Zellschädigung im Sinne neuronaler Nekrose und Apoptose. Die molekulargenetischen Untersuchungen zeigten die signifikante Zunahme pro-apoptotischer Proteine (Bak und FAS) bei nur geringer Zunahme des anti-apoptotischen Proteins Bcl-xL. Somit war das Verhältnis zugunsten der pro-apoptotischen Proteine verschoben. Eine Induktion „protektiver“ Proteine wie z.B. des HSP 70 blieb aus.

Die intrathekale Behandlung mit MP zeigte einen signifikanten neuroprotektiven Effekt mit Reduktion der neuronalen Nekrose und signifikanten Verbesserung des Schädigungsmusters nach KSTH. Zusätzlich blieben im Vergleich zu der systemischen Gruppe eine Hyperglykämie und Hyperkalzämie in dieser Gruppe aus. Intrathekales MP führt zu einer signifikanten Erhöhung der Expression des protektiven Hit[Seite 88↓]ze-Schock-Proteins (HSP 70). Auch bei intrathekaler Steroidbehandlung blieb eine Induktion neuronaler Apoptose nicht aus, sie war jedoch moderater als bei systemischer Behandlung. Apoptose scheint eine wesentliche Nebenwirkung der Steroidapplikation zu sein. Auf molekulargenetischer Ebene zeigte sich bei intrathekale MP-Gabe eine geringere Erhöhung der Expression für die pro-apototischen Proteine Bak und FAS, bei gleichzeitiger gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöhter Expression für das anti-apoptotische Proteine Bcl-xL. Im klinischen Einsatz wird eine intrathekale Behandlung vor kardiochirurgischen Operationen jedoch schwierig zu realisieren sein.

5.7. Limitationen

Eine wesentliche Limitation dieser durchgeführten experimentellen Studie ist die postoperative Überlebenszeit und das damit kurze Zeitfenster der morphologischen Analyse. Jedoch zeigte sich in der Studie von Kurth et al., der die Tiere mit unterschiedlich langer Überlebenszeit verglich, ein Maximum der morphologischen Veränderungen nach 6-12 Stunden 88. Zusätzlich konnte bisher noch keine Aussage über die Konzentration des Methylprednisolon`s im Gehirn gemacht werden. Ob neben der Vorbehandlung eine weitere Gabe nach Kreislaufstillstand das neuronale Schädigungsmuster hätte positiv beeinflussen können, oder ob das Ausmaß der Schädigung noch mehr zugenommen hätte, bleibt fraglich.

Weitere regionale molekulargenetische Untersuchungen an dem gefrorenem Hirnmaterial zur Evaluierung der neuronalen Apoptose werden folgen. Auch die immunhistochemische Anfärbung von HSP 70 zeigte bisher erste vielversprechende Ergebnisse. Die Steroidwirkung im Rahmen zerebraler Ischämie und Hypothermie wird auch Gegenstand weiterer Forschung sein. Obwohl mit der intrathekalen Vorbehandlung eine neuronale Protektion erzielt werden konnte, bleibt ihr klinischer Ansatz fraglich und technisch kompliziert. Eine weiterführende Evaluation des spezifischen Effektes der Steroide und der Hypothermie in Zellkulturen ist bereits angelaufen. Ebenso werden weitere Analyse bezüglich des Steroideffektes, sowie zur Entstehung apoptotischer Veränderungen durch Steroide an dem verbliebenden Hirnmaterial folgen. Diese Ergebnisse werden zusätzlich Gegenstand klinischer Forschung sein.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
27.09.2004