We evaluated the mode of neuronal cell injury and the possible neuroprotective effect of pretreatment with high dose steroids in a neonatal piglet model with CPB and 120 minutes deep hypothermic circulatory arrest (DHCA).
Methods: 24 neonatal piglets (age < 10 days and 2,1 ± 0,5 kg BW) were included in this study. Three groups were formed, one group without any additional pharmacological treatment (n=12) served as control group, two groups with a high dose methylprednisolone (MP) pretreatment, where 30 mg / kg/ BW MP (Urbason) was administered either systemically preoperatively (n=7), or intrathecally 4-6 hours preoperatively (n=5). All animals were anaesthetized, intubated and mechanically ventilated. After median sternotomy the animals were connected to CPB by cannulation of the aorta and right atrium. Full flow CPB (200 ml/kg/min) was initiated to achieve homogeneous systemic cooling. Circulatory arrest for 120 min. was induced when rectal temperature of 15°C was achieved. After rewarmed reperfusion and establishment of stable cardiac ejection the animals were weaned from CPB and monitored for 6-8 hours. Thereafter the animals were sacrificed and the brain was immediately removed, cut in standardized sections and fixated and frozen for further histological and immunohistochemical studies. Neuronal cells were counted in cerebral cortex, basal ganglia, hippocampal region and cerebellum in respect to apoptotic and hypoxic-necrotic neuronal cell changes in each animal. Real-time PCR was performed from frozen brain sections for analysis of expression of heat-shock-protein 70kD (HSP 70), FAS, Bak and Bcl-xl.
Results: The main preliminary findings of this neonatal ischemic brain model were the quantitative evaluation of cell injury including perivascular astroglial cells and necrotic and apoptotic neuronal cell changes. The systemic application of high dose methylprednisolone lead only to a slight reduction of edema, but it produced a significant hyperglycemia and aggravation of neuronal necrosis. Intrathecal MP was effective in reducing neuronal necrosis without appearance of hyperglycemia. Application of steroids lead to an induction of neuronal apoptosis in the hippocampus. Increased pro-apoptotic gene expression were detected with steroid pretreatment. Increased expression of HSP 70 may reflect reduction in neuronal cell death.
Conclusion: Systemic pretreatment with methylprednisolone seems not to be effective for neuroprotective goal during cardiac surgery with DHCA. In contrast intrathecal steroid treatment could reduce neuronal cell death significant. The pronounced apoptotic neuronal cell changes, which were seen after steroid pretreatment, raises concern with regard to the routine use of methylprednisolone during pediatric cardiac surgery.
Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) wird in der Herzchirurgie zur Korrektur komplexer angeborener Herzfehler angewendet. In den letzten Jahren zeigte sich eine Abnahme der Morbidität und Mortalität nach kardiochirurgischen Eingriffen. Es entstanden aber gleichzeitig Bedenken über eine Beeinträchtigung der neurologischen Funktion und psychomotorischen Entwicklung der operierten Kinder. Wir untersuchten das morphologische Schädigungsmuster im Gehirn nach extrakorporaler Zirkulation mit Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) in einem neonatalen Tiermodell. Zusätzlich evaluierten wir morphologisch den Einfluss einer neuroprotektiven Vorbehandlung mit systemischer und intrathekaler Applikation von Methylprednisolon (MP).
Material und Methoden: 24 neugeborenen Ferkeln mit einem Alter unter 1 Woche (Gewicht: 2,1 ± 0,5 kg KG) wurden mittels eines cardiopulmonalen Bypass(CPB) bei 15 °C rektaler Körpertemperatur einem totalen Kreislaufstillstand (KSTH) von 120 Minuten ausgesetzt. Nach Reperfusion wurden die Tiere vom CPB entwöhnt und für 6 Std. überwacht. Eine Gruppe ohne Intervention mit 12 Tieren diente als Kontrollgruppe, bei 7 Tieren wurde eine systemische und bei 5 Tieren eine intrathekale Methylprednisolongabe (Urbason) präoperativ durchgeführt. Das Gehirn wurde nach Fixierung regional histologisch und immunhistochemisch untersucht. Die nekrotischen und apoptotischen Neurone wurden quantitativ in Hippocampus, Kortex, Stammganglien und Kleinhirn erfasst. Molekulargenetische Untersuchungen erfolgten im frontalen Kortex und es wurde die Genexpression mittels "Real-time PCR" für das Hitze-Schock-Protein 70 kD (HSP 70) und die apoptotischen Gene Bak, FAS und Bcl-xL erfasst.
Ergebnisse: Das Schädigungsmuster nach KSTH von 120 Minuten bestand aus Nekrose der Neuronen mit einem Fokus in Hippocampus, Kleinhirn und Kortex. Zusätzlich kam es im Gyrus dentatus zum Auftreten apoptotischer Neuronenveränderungen, wobei durch die MP-Vorbehandlung die Anzahl apoptotischer Neurone zunahm. Unter der systemischen Steroidbehandlung kam es zu einer signifikanten Hyperglykämie. Molekulargenetisch zeigten sich bei systemischer Steroidvorbehandlung eine Induktion pro-apoptotischer Gene. Nach intrathekaler Steroidgabe war das Verhältniss zugunsten der anti-apoptotischen Gene signifikant verändert. Die Expression des HSP-70 war nur in der intrathekalen Gruppe signifikant erhöht und scheint im Zusammenhang mit einer geringeren neuronalen Zellschädigung zu stehen.
Schlussfolgerung: Eine systemische Vorbehandlung mit MP zeigte keinen neuroprotektiven Effekt, im Gegenteil kam es zu einer Zunahme nekrotischer und apoptotischer neuronaler Zellveränderungen. Bei intrathekaler Applikation des MP und Umgehung der Blut-Hirn-Schranke kam es zu einer signifikanten Reduktion der nekrotischen Zellveränderungen im Sinne einer neuroprotektiven Wirkung. Die routinemäßige Applikation von Steroiden in der Kinderherzchirurgie sollte aufgrund dieser Ergebnisse kritisch überdacht werden.
Die enormen Fortschritte in den letzten knapp 50 Jahren auf dem Gebiet der Kinderherzchirurgie und Kinderkardiologie führten zu einer bedeutenden Abnahme der kardialen Morbidität und Mortalität, und es wurde das Interesse zunehmend auf die spätere Beurteilung der Lebensqualität und der psychomotorischen Entwicklung dieser Kinder gelenkt 1-5. Die Inzidenz einer zerebraler Komplikationen nach Herzoperationen mit Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) und cardiopulmonalem Bypass (CPB) im Säuglings- und Kindesalter wurde auf circa 30 % geschätzt 1;6;7. Heute stellen die Kinder mit schweren angeborenen Herzmalformationen, wie z.B. das hypoplastische Linksherzsyndrom (HLHS) und die Transposition der großen Arterien (TGA), eine besondere Risikogruppe dar, weil sie innerhalb der Neugeborenen-Periode mit Kreislaufstillstand und tiefer Hypothermie operiert werden. In den vergangenen Jahren entstand daher ein neues Patientenkollektiv mit Kindern, die in der Säuglingsperiode kardiochirurgisch unter Verwendung des CPB operiert wurden und nun das Schulalter erreicht haben. In diesem Kollektiv war es zum ersten Mal möglich, Langzeitresultate kardiochirurgischer Operationen bei Kindern, die zu einem frühem Zeitpunkt ihrer psychomotorischen Entwicklung stattfanden, zu eruieren. In klinischen Follow-up Studien z.B. nach Norwood-Operationen und nach Switch-Operationen konnte herausgefunden werden, dass insbesondere die Operationstechniken, die mit Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) einhergehen, ein ernstes Risiko für eine Beeinträchtigung der neurologischen, psychomotorischen und mentalen Entwicklung darstellen 8-12. Der Pathomechanismus neurologischer Morbidität und die Beeinträchtigung der psychomotorischen Entwicklung nach herzchirurgischen Eingriffen bei Kindern scheint multifaktoriell zu sein und zum einen auf der Besonderheit der zentralnervösen Strukturen in diesem Alter zu beruhen, zum anderen aber auch durch ischämische oder embolische Ereignisse während und nach dem cardiopulmonalen Bypass bedingt zu sein. Die Schwankungen der multiplen physiologischen Parameter während des cardiopulmonalen Bypasses können zur Aktivierung der inflammatorische Kaskade führen und eine Hochregulation der Adhäsionsmoleküle auf neutrophilen und endothelialen Zellen bewirken 13-15. Einige dieser immunologischen Prozesse können mit der Generation von Sauerstoffradikalen assoziiert sein und führen dann zu einer radikalinduzierten Lipidperoxidation auf mikrovaskulärer Ebene des ZNS 16;17.
Wichtige Unterschiede der Neugeboren und der Patienten im Kleinkindesalter zu den Erwachsenen sind vorwiegend die Größe und Unreife der Organsysteme, die Unreife des Stoffwechsels und der Blut-Hirn-Schranke, der hohe Metabolismus, die hohe Herzgrundfrequenz, die geringe Herzmuskelmasse und die geringen Compliance des linken Ventrikels. Pathophysiologisch kommen bei den angeborenen Vitien, die im neonatalen Alter mit CPB und KSTH operiert werden, meistens eine Zyanose zusammen mit einer Herzinsuffizienz vor.
Die ersten chirurgischen Korrekturen angeborener Herzfehler fanden in den Jahren 1940 bis 1950 statt. 1944 wurde z.B. die erste Blalock-Taussig-Anastomose bei einem Kind mit ausgeprägter Pulmonalarterienstenose im Rahmen der damals erstmals beschriebenen Fallot’schen Tetralogie angelegt. Ebenfalls 1944 folgte dann die erste Resektion einer Aortenisthmusstenose 23.
Die Kinderherzchirurgie entwickelte sich vor allem mit der Entwicklung der Herz-Lungen-Maschine (HLM) weiter und es wurden dadurch vor allem ganz neue Operationstechniken möglich. Im Jahre 1937 entwickelten Gibbon et al eine experimentelle Maschine, die es ermöglichte, die Lungenstrombahn zu umgehen und die Herz- und Lungenfunktion zu ersetzen 24. Crafoord konstruierte dann 1948 aufgrund seiner klinischen und experimentellen Erkenntnisse zusammen mit seinem Assistenten Björg eine Herz-Lungen-Maschine für die Gehirnperfusion und auch einen Oxygenator für die Anreicherung des Blutes mit Sauerstoff, weil er in seinen Tierexperimenten erkannt hatte, dass die meisten Organe bei fehlender Perfusion eine Ischämie von ca. 25 Minuten ohne eine wesentlich Dysfunktion überstehen konnten, beim Gehirn lag die Ischämietoleranz jedoch bei nur 5-10 Minuten 25.
Die erste klinische Anwendung der Herz-Lungen-Maschine erfolgte dann 1951 in Philadelphia zur Korrektur eines ASD-I Defektes bei einem 6 jährigem Mädchen 26. Die Patientin überlebte jedoch den Eingriff nicht. Die ersten erfolgreichen Operationen mit cardiopulmonalen Bypass erfolgten dann 1952 und 1953 durch Gibbon et al. bei einem 18 jährigen Mädchen zum Verschluss eines Vorhofseptumdefektes (ASD-II) und durch Lewis und Tauffic ebenfalls zum Verschluss eines ASD-II mit Einsatz der Hypothermie 24;27. Im Jahre 1954 wurden dann die ersten intrakardialen Eingriffe mittels sogenannter „Cross-Zirkulation“ als eine neue Form des cardiopulmonalem Bypasses von Lille-Hei durchgeführt, dabei konnten bei den Patienten Korrekturen eines VSD’s und der Fallot’schen Tetralogie im Kindes- und Jugendalter durchgeführt werden, von denen bis heute noch circa 50 % der Patienten überlebt haben. 1954 wurde dann der Bubble-Oxygenator entwickelt, der durch die Möglichkeit der Entschäumung des Maschinenblutes mittels Silikon und damit einer deutlichen Reduktion der Gasembolien für eine klinische Anwendung besser geeignet war 28. 1955 wurden dann durch Kirklin et al in der Mayo-Klinik acht Patienten in Folge mit der HLM von Gibbon operiert 29. Crafoord et al. erforschten aber auch den Einfluss einer Reduktion der Körpertemperatur zur Organprotektion. Er entdeckte den Vorteil einer Oberflächenhypothermie während Herzoperationen. Die klinische Anwendung der Oberflächenhypothermie während cardiopulmonalem Bypass im Sinne einer Organprotektion wurde unter anderem von Sealy und Drew beschrie
In Deutschland fand 1957 das erste Mal durch Zenker die Herz-Lungen-Maschine nach „Mayo-Gibbon“ ihre Anwendung . In den sechziger Jahren folgte dann die Einführung der Membranoxygenatoren. Die Technik der Herz-Lungen-Maschine wurde durch Einführung besonderer Kunststoffe, durch die Möglichkeit zur Antikoagulation (1953), die Verbesserungen der Oxygenatoren, Filter, Maschinenarten und des Perfusionsregimes ständig weiterentwickelt. Heute werden in Deutschland circa 57.000 Eingriffe mit Herz-Lungen-Maschine pro Jahr durchgeführt. Man verwendet dabei hauptsächlich Membranoxygenatoren, unterschiedliche Perfusionstechniken und unterschiedliche Säure-Basen-Regime. In den USA kommen ca. 40.000 Kinder pro Jahr mit einem angeborenem Herzfehler auf die Welt. Davon müssen die Hälfte dieser Kinder sich in ihrem ersten Lebensjahr einer Operation am offenen Herzen mit CPB und evtl. auch KSTH unterziehen 32;33. In Deutschland werden ca. 6000 Patienten jährlich mit einem angeborenem Herzfehler geboren.
Neurologische Komplikationen nach Kreislaufstillstand in tiefe Hypothermie und CPB schienen lange Zeit im Zusammenhang mit Makroembolien durch Luft und Thromben, Mikroembolien, Mikroaggregation, und inflammatorische Reaktionen zu stehen. Zusätzlich wurden zerebral vasogene Reaktionen vor allem im Bereich der Kapillaren angeschuldigt, die durch das abnormale zerebrale Perfusionsmuster bei non-pulsatilen HLM-Fluß ausgelöst werden sollten. Vor allem das Embolisationsgeschehen spielte lange Zeit eine große Rolle in der pathophysiologischen Genese zerebraler Komplikationen nach CPB 32-35. Durch die Verbesserungen der Herz-Lungen-Maschine, durch die Einführung arterieller Filter, durch die Veränderungen von Oxygenatoren und Perfusionsregimen konnten zerebrale Komplikationen deutlich gesenkt werden. Der Umstieg von den Bubble-Oxygenatoren zu den Membranoxygenatoren und die Verwendung von arteriellen Filtern senkte die Rate der Gas- und Partikel-Mikroembolien während KSTH und CPB 36-38.
Alle bisher durchgeführten Studien vermochten nicht, die Kopplung zwischen Metabolismus und Blutfluss im Gehirn genau zu erklären. Besonders durch die Arbeiten von Kety und Schmidt et al. aus dem Jahre 1948 ist bekannt, dass der normale zerebrale Blutfluss (ZBF) circa 45-55 ml pro 100 g Gewebe und pro Minute beträgt 39;40. Bei vermehrter Aktivität in einem Hirnareal entsteht über eine metabolische Regulation eine lokale Hyperämie. Weiterhin führen Schmerzen und Stress zu einem vermutlich durch Adrenalin vermittelten Anstieg des zerebralen Blutflusses, jedoch geht eine maximale Sympathikus-
Der Nachweis einer globalen Minderperfusion gestaltet sich im klinischen Alltag schwierig. In klinischen Untersuchungen konnte mit radioaktiv-markiertem Xenon während und nach CPB eine Verminderung des zerebralen Blutflusses dargestellt werden 40. Dadurch konnte während CPB und nach KSTH eine Reduktion der zerebralen Blutflusses unter 0,2 ml g-1 min-1 dokumentiert werden 43. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten nach KSTH kurzzeitig eine Phase der Hyperperfusion, worauf eine Phase des reduzierten zerebralen Blutflusses mit einer Erhöhung des intravaskulären Widerstandes mit Dauer bis zu acht Stunden nach dem KSTH folgte 44;45. In nur wenigen tierexperimentellen Studien wurden die Veränderungen intravaskulärer und intrazellulärer Parameter, wie des PO2-, PCO2- und des pH-Wertes, während und nach CPB und KSTH systematisch untersucht 46.
Die Pathogenese der Hirnschädigung während cardiopulmonalem Bypass und Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie ist sicherlich multifaktoriell, und gerade die Veränderungen nach Hypothermie zeigen gegenüber Normothermie ein deutlich abweichendes Muster der zerebralen Perfusion47.
Der cardiopulmonale Bypass stellt mit der Herz-Lungen-Maschine, den Schläuchen und der damit sehr großen Kunststoffoberfläche, durch die das Blut gepumpt wird, ein großes Risiko für eine inflammatorischen Reaktion dar 14. Eine systemische Inflammation führt zu einer massiven Freisetzung inflammatorischer Mediatoren und zu einer Aktivierung des Komplementsystems, wobei die Patienten nach Kreislaufstillstand höhere Werte für IL-6 und IL-8 aufwiesen, als die Patienten welche nur einem cardiopulmonalen Bypass ausgesetzt waren 48. Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie führt aber nach der hypothermen Phase zu Beginn der Reperfusion und Wiedererwärmung zu einem erhöhten Anfall von Zytokinen und aktivierten Leukozyten 48-51. Insgesamt konnte durch die Erniedrigung der Temperatur während des hypothermen Bypasses aber eine deutlich geringere inflammatorische Reaktion beobachtet werden, als bei normothermem CBP 14. Es konnte nachgewiesen werden, dass milde Hypothermie immunologische Parameter beeinflusst. Eine durch den CPB initiierte Komplement-Aktivierung und somit auch eine verstärkte zelluläre Antwort der neutrophilen Granulozyten konnte durch Hypothermie reduziert werden 52.
Durch eine Methylprednisolongabe bei CPB und KSTH konnte eine Reduktion von Zytokinen und TNF-a dokumentiert werden 53. Es konnte sogar eine Erhöhung antiinflammatorischer Parameter wie IL-10 nachgewiesen werden 51;54-56. Diese Veränderung der inflammatorischen Reaktion durch die Methylprednisolongabe nach CPB und KSTH wurde als einer der möglichen Mechanismen einer neuroprotektiven Wirkung gewertet.
Zellulärer Adenosin-tri-phosphat(ATP)-Mangel der Neuronen führt zu erhöhten intrazellulären Ca++- und Glutamat-Spiegeln, sowie zur Bildung von zellschädigenden Sauerstoffradikalen durch eine Dysfunktion der Mitochondrien. Vom ATP abhängig werden Ca++-Ionen und Glutamat aus der Zelle befördert. Glutamat bewirkt durch Aktivierung des NMDA- und des AMPA-Rezeptors unter anderem einen Ca++-Einstrom in die Zelle. Durch ATP-Mangel versagt die Na/K-ATPase und Na wird zusammen mit Glutamat aus der Zelle geschleust. Dies führt zu einer Up-Regulation der Glutamat-Rezeptoren, zu erhöhten intrazellulären Glutamatspiegeln und dadurch zu höheren intrazellulären Ca++-Spiegeln – ein circulus vitiosus. Das Calcium wird im endoplasmatischen Retikulum (ER) und in den Mitochondrien gespeichert. Aufgrund unterschiedlicher Stimuli wird Ca++ freigesetzt und reguliert viele physiologische Stoffwechselprozesse. In einer ischämisch geschädigten Nervenzelle nehmen ER und Mitochondrien weniger Ca++ auf, so dass das zytosolische Ca++ bis auf toxische Werte ansteigen kann. Das intrazelluläre Ca++ aktiviert Prozesse, die zur Bildung von Arachidonsäure (Aktivierung via Phospholipase A2) und zur Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) führen können. Dieses kann am Ende zur Beeinträchtigung der Mitochondrienfunktion führen 57;58. Mitochondrien können aber auch neben den oben beschriebenen Vorgängen einen möglichen Zelltodes via Apoptose und Nekrose initiieren. Zur Initiierung der Apoptose aktivieren die in Mitochondrien aufgenommenen Ca++-Ionen die mitochondriale Permeabilitätspore (mtPTP). Diese lässt das intramitochondriale Ca++ ausströmen und bedingt so wiederum toxisch hohe zytosolische Ca++-Spiegel. Durch hohe intrazelluläre Calciumspiegel und mitochondrialen Dysfunktion kann es schnell zum zellulären Energiemangel kommen, was zu einer Zellnekrose führt. Auf der anderen Seite kann die Freisetzung mitochondrialen Cytochrom C in das Zytoplasma eine Aktivierung der Caspase-Kaskade mit anschließender Apoptose bedingen 59.
Die Hypothermie bedeutet eine Reduktion der systemischen Körpertemperatur. Man unterscheidet milde Hypothermie mit einer Temperatur von 35 bis 30°C, moderate Hypothermie mit Temperaturen von 29 bis 25 °C und tiefe Hypothermie mit einer Temperatur von 25 bis 15°C. Der Mensch kann einen normothermen Kreislaufstillstand für 3-5 Minuten ohne dauerhaften zerebralen Schaden überstehen. Bei 28° bis 30°C verlängert sich die ischämische Toleranz des Gehirns auf 8 bis 10 Minuten und bei einer systemischen Temperatur unter 20°C auf bis zu 40 Minuten 6465.
Der Gesamtmetabolismus des Gehirns setzt sich aus Aktivitätsstoffwechsel und Basalstoffwechsel zusammen. Dabei besteht der Aktivitätstoffwechsel aus dem Energiebedarf bei einer normalen neuronalen Aktivität und Erregungsleitung. Der Basalstoffwechsel ist der Energiebedarf, der nach vollständiger Suppression der hirnelektrischen Aktivität z.B. im Rahmen der Narkose noch existent und für das Überleben der Zelle essentiell ist. Ungefähr 50 % des Basalstoffwechsels wird für die Aufrechterhaltung des Membranpotentials aufgewandt und die andere Hälfte für Calcium-Transporter, Zellbausteinsynthese und axoplasmatischen Transport. Die Hypothermie setzt die Aktivität aller zerebralen Stoffwechselprozesse herab. Die Erniedrigung der zerebralen metabolischen Rate für Sauerstoff (CMRO2) ist ein wichtiger Effekt der Hypothermie, mit sinkender Temperatur sinkt die CMRO2 um circa 7-10 % pro Grad Celsius 64;66. Aber einzig dieser Mechanismus kann für eine neuroprotektive Wirkung nicht verantwortlich sein, denn eine pharmakologisch induzierte Erniedrigung der CMRO2 führte nicht zu einer vergleichbaren ischämische Toleranz 67. Obwohl ebenfalls die Hypothermie den ATP-Verbrauch senkt, so scheint aber wiederum der ATP-Verbrauch nicht mit einer zerebralen Schädigung zu korrelieren 68;69.
Milde Hypothermie beeinflusst auch immunologische Parameter: es wird eine durch den CPB initiierte Komplement-Aktivierung deutlich abgeschwächt und die zelluläre Antwort der neutrophilen Granulozyten reduziert 52. Doch ebenso wurde beobachtet, dass im Rahmen der Wiedererwärmung und Reperfusion nach Hypothermie eine verstärkte Komplementaktivierung stattfindet. Diese Aktivierung könnte wiederum zu einer verstärkten Komplement-induzierten Granulozytenaggregation führen, eine Quelle für die Bildung von Mikroemboli und einer globalen Entzündungsreaktion 52;71.
In Messungen mit transkranieller Dopplersonographie (TCD) fand man heraus, dass man nach Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie einen erhöhten zerebralen Perfusionsdruck braucht, um überhaupt einen zerebralen Fluss zu registrieren 72. Eine erhöhte Rate zerebraler Komplikationen nach Hypothermie wurde ursächlich auf die Entstehung eines Ischämie-Reperfusionsschadens zurückgeführt. Es wurden Laktatazidose und Hyperglykämien registriert 73;74, zusammen mit einer verspäteten Reaktivierung der zerebralen Funktionen durch EEG-Ableitung 75. Man beschrieb also für die Hypothermie eine durchaus neuroprotektive Wirkung, eingeschränkt durch das Wissen, dass es bei Wiedererwärmung und Reperfusion dann zu einer durchaus unphysiologischen Kombination aus einer Störung der zerebralen Perfusion und Oxygenation, sowie einer immunologischen Reaktion kommen kann 62.
Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie bewirkt auf zellulärer Ebene eine sogenannte „kalte Ischämie“, welche sich pathophysiologisch und auch in dem Ausmaß der Schädigung deutlich von den Veränderungen während einer normothermen Ischämie unterscheidet. Die Hypothermie erhöht die ischämische Toleranz des Gehirns bei fokaler und globaler Ischämie. Der Mechanismus der Neuroprotektion ist multifaktoriell durch eine intra- und extrazelluläre Wirkung bedingt. Ob es neben protektiven Effekten auch schädigende Effekte durch die Hypothermie gibt, bleibt weiter unklar, und das Risiko und die Nebenwirkungen scheinen gerade auf eine lange postoperative Zeit gesehen ungeklärt.
Eine zeitliche Begrenzung der allein durch Kühlung bedingten protektiven Wirkung der tiefen Hypothermie bei totalem Kreislaufstillstand scheint bei ungefähr 60-70 Minuten zu liegen 64;76. Bei längeren Stillstandsphasen scheint eine alleinige Hypothermie an die Grenzen ihrer Wirksamkeit zu treten 77.
Die während CPB und KSTH verursachte Hirnschädigung ist multifaktoriell. Es können eine Vielzahl von Ursachen zugrunde liegen, wobei nachfolgende Aufzählung einen Überblick verschaffen soll:
Als offensichtlich kritische Zeitpunkte einer durch CPB und Kreislaufstillstand ausgelösten Schädigung kommen in Betracht:
Anschluss an die Herz-Lungen-Maschine
Periode des Kreislaufstillstandes mit verbundener zellulärer Ischämie
Phase der Ischämie-Reperfusion nach dem Kreislaufstillstand
Postoperative Phase mit sekundärer Schädigung durch Metaboliten und Radikale
Ebenfalls wurde der Einfluss der Antikoagulation und auch die Möglichkeit eines protektiven Effektes auf das Gehirn während CPB untersucht. Es bestand kein signifikanter Unterschied bezüglich des neurologischen Outcomes der Patienten mit oder ohne Heparintherapie 78. Die Heparindosis sollte so niedrig wie möglich gewählt werden, die Art des Heparin`s aber hat keinen Einfluss auf das neurologische Outcome 78.
Die Auswirkung einer Erniedrigung des Hämatokrit-Wertes unter 25% (=Hämodilution) während CPB und KSTH ist umstritten. Eine Hämodilution sollte vor allem die Fließgeschwindigkeiten auf kapillärer Ebene verbessern und ein sogenanntes Sludge-Phänomen, bei dem sich die Erythrozyten in den Kapillaren stauen, verhindern. Zwar konnte eine Verbesserung der zerebralen Perfusion durch die Erniedrigung des Hämatokrits nachgewiesen werden, jedoch stand diese Veränderung im Gegensatz zu den Verschlechterungen der Oxygenation 79. Eine Hämodilution bewirkt im Gehirn eine deutliche Veränderung des zellulären Sauerstoffangebots, wodurch es zu einer kompensatorischen Erhöhung des zerebralen Blutflusses kommt. Es zeigt sich jedoch eine Limitation dieser Kompensation. Hämatokritwerte unter 15% zeigten eine deutliche Verschlechterung der zerebralen Oxygenation und des zerebralen Sauerstoffangebots 80. Hämodilution bedeutet eine Erniedrigung der Träger für Sauerstoff im Blut, was sich negativ auf die zelluläre Oxygenation auswirkt 78. Durch eine Hyperperfusion versucht das Gehirn dann das Sauerstoffangebot zu verbessern. Diese Hyperperfusion wurde in einigen Studien als Zeichen einer zerebralen Protektion gewertet 20;79. Die Optimierung des intravaskulären und damit auch interzellulären Sauerstoffangebots sollte während CPB und auch vor und nach Kreislaufstillstand im Vordergrund stehen. Dieses kann vor allem durch eine Optimierung der Anzahl Sauerstoffträger (Erythrozyten) im Blut und durch ein ausreichendes Angebot intravaskulär verfügbarem Sauerstoff (PO2) erreicht werden. Eine Hämodilution bedeutet eher eine Erniedrigung der Sauerstoffträger und somit auch eine Erniedrigung des intravaskulären und auch zellulären O2-Angebotes. Zahlreiche Studien wiesen daher auch auf den protektiven Effekt höherer Hämatokritwerte hin 81.
Neben vielen klinischen Studien und Untersuchungen gibt es zahlreiche Ansätze für Grundlagenforschung, Deduktion pathophysiologischer Zusammenhänge und Evaluierung von Interventionen ermittelt im Tiermodell mit KSTH. Das experimentelle Protokoll differiert deutlich zwischen den experimentellen Studien. Es gibt Abweichungen im Perfusionsprotokoll, der Tierart, der Dauer des KSTH, der Auswertung und der versuchten Intervention. Einige experimentelle Studien nutzten wesentlich kürzere Stillstandszeiten (etwa von 60 Minuten bis 90 Minuten) zur Evaluation der Veränderungen von Perfusion und Oxygenation 82. Jedoch wurde nur in wenigen Fällen eine morphologische Untersuchung durchgeführt, wie z.B. bei der Versuchsgruppe von Cooper et al. oder Bokesch et al., die bei 60 bis 90 Minuten KSTH keine Nervenzellschädigung detektieren konnten 77;83.
Neugeborene Ferkel (< 14 Tage) wurden nur in wenigen anderen experimentellen Studien benutzt. Dabei wurden Kreislaufstillstandszeiten in tiefer Hypothermie von 90 bis 120 Minuten angewendet, um überhaupt eine histologisch sichtbare ischämische Veränderung im Gehirn zu erhalten. Hierzu zählen die Studiengruppe der Duke University 84, die John Hopkins University Baltimore 85, die Studiengruppe der Har
Eine aktuelle Studie an neugeborenen Ferkeln aus dem Jahr 2000 verwendete 60 Minuten KSTH und eine neuroprotektive Intervention mit Methylprednisolon 20. Diese Studie verzichtete aber auf eine neuropathologische Untersuchung und die Untersucher interpretierten ihre Perfusions- und Oxygenationsmessungen als Anzeichen einer Neuroprotektion durch Steroide.
Weitere Interventionen wurden durch die Veränderungen des Perfusionsregimes evaluiert, zum Beispiel durch die Gegenüberstellung von pulsatilen zu nicht- pulsatilen Flussmustern 89, durch retrograde zerebrale Perfusion während KSTH 90, durch intermittierende Perfusion während KSTH 91 und durch Interventionen am Nitric Oxid Stoffwechsel mit Gabe des NO-Donors Arginine 92. Aber nur in wenigen Studien wurden die Morphologie nach dem Versuch beurteilt und daraus mögliche Rückschlüsse über eine Zellprotektion angestellt.
Die tierexperimentellen Studien zeigen unterschiedliche histologische Schädigungsmuster im Gehirn bei KSTH. Einen Einfluss auf die Ausprägung der Schädigung im Gehirn scheint die Dauer der Ischämiezeit in Hypothermie und die Temperatur zu haben. Einige Studien zeigten, dass es bei 60 Minuten KSTH in tiefer Hypothermie und einer postoperativen Überlebenszeit von bis zu 3 Tagen nur zu einer gering ausgeprägten Nervenzellschädigung kommt 17;93. Erst bei KSTH von mehr als 60 Minuten und 4-6 postoperativen Stunden war eine signifikante Neuronenschädigung sichtbar 77;87;94. Aus diesen Ergebnissen wurde gefolgert, dass bei Stillstandsphasen, die länger als 60 Minuten dauern, trotz tiefer Hypothermie Neuronenschäden zu erwarten sind 95. Zusätzlich konnte in einer experimentellen Studie ausgeschlossen werden, dass das Alter der Tiere in einem Bereich zwischen 1 und 10 Wochen einen Einfluss auf die morphologischen Ergebnisse hat 96.
Es gibt nur wenige Studien, die eine längere postoperative Überlebenszeit aufweisen. Eine dieser Studien ist die Untersuchung von Kurth et al, die unterschiedliche Überlebenszeiten von 6 Stunden und 1 bis 7 Tagen evaluiert hat 88. Dabei lag das Ausmaß der histologischen Schädigung nach 6 postoperativen Stunden nur gering unter der maximalen Nervenzellschädigung nach 2 Tagen, und es zeigte sich dann wieder eine signifikante Abnahme der Neuronenveränderungen nach einer Woche. Dieses Studie zeigte, dass ein postoperativer Intervall von 6 Stunden zu einer durchaus reproduzierbaren Detektion des Schädigungsmuster nach KSTH führt. Eine längere Überlebenszeit der Tiere ist technisch sehr schwierig umsetzbar.
Das Gehirn verfügt über einen hohen Metabolismus im Verhältnis zum restlichen Körper, ist sehr anfällig gegenüber Hypoxie und Ischämie und besitzt nur geringe Speichermöglichkeiten für Sauerstoff, energiereiche Phosphate und Kohlenhydrate. Ischämische Hirnschädigung wird durch eine Kombination einer Vielzahl von pathophysiologischer Faktoren verursacht. Auf der einen Seite spielt eine signifikante Alteration der zerebralen Perfusion eine Rolle, auf der anderen Seite werden viele biochemische und immunologische Kaskaden aktiviert, die eine sekundäre Zellschädigung begünstigen. Aber die Anfälligkeit der einzelnen Neurone variiert je nach Hirnregion und wird in der Literatur als „selektive Vulnerabilität“ bezeichnet 97. Bei der Untersuchung der Neurone im Hippocampus wurde in zahlreichen Studien eine „selektive Vulnerabilität“ nach ischämischer Schädigung beschrieben, was bedeutet, dass die einzelnen Strukturen – wie Cornu ammonis (CA) 1-4 und der Gyrus dentatus – in diesem Bereich ein unterschiedliches Schädigungsmuster aufweisen.
Bisher wurde in vielen Studien die hohe Anfälligkeit des Sektors CA 1 („Sommer-Sektors“) für hypoxische und ischämische Schädigung beschrieben, bei vergleichsweise geringen Veränderungen in den ande
Die lichtmikroskopische Klassifikation ischämisch geschädigter Neurone im Gehirn erfolgte in den meisten Studien und auch in dieser Untersuchung nach den gängigen neuropathologischen Kriterien 100;101. Zum Zelluntergang führt eine hypoxische oder ischämische Schädigung mit Störung der Sauerstoffverfügbarkeit auf zellulärem Level, der oxidativen Energiegewinnung und der Glykolyse. Zusätzlich führen auch endotheliale Vorgänge, wie Komplementaktivierung und Bildung von Sauerstoffradikalen zum Zelluntergang.
Für den Zellenuntergang bzw. Zelltod sind zwei unterschiedliche Formen beschrieben, die Nekrose und Apoptose.
Die Nervenzellnekrose ist charakterisiert durch Eosinophilie des Zytoplasmas mit untergeordneten Kernveränderungen in Form von Kernpyknose und Kernbasophilie 97;102-104. Ultrastrukturell wurde eine Schwellung und Dilatation der Mitochondrien und anderen Zellorganellen, sowie eine Ruptur der Zellmembran beobachtet. Die Detektion dieser Veränderungen erfolgt am besten mittels lichtmikroskopischer Betrachtung der Schnitte in Hämatoxylin und Eosin-Färbung (HE-Färbung).
Die Apoptose wurde das erste Mal 1972 von Kerr et al. so benannt und ist charakterisiert durch die Fragmentation der Zelle bei gleichzeitigem Erhalt der Zellmembran. Es zeigen sich charakteristische Kernveränderungen in Form einer Heterochromatin-Kondensation und einer Kernfragmentation 100;105. Die Apoptose ist ein aktiver Prozess und bedarf Energie. Morphologisch kommt es zu den charakteristischen Kernveränderungen mit zentrifugaler Chromatinansammlung am Rand der Zelle, Kondensation und einer DNA-Fragmentation mit großen und kleinen Fragmenten 105-107. Der Zellkern bildet sich dann um in kleine runde Chromatin-Körperchen, sogenannte apoptotische Körperchen. Aber die Zellorganellen des Zytoplasmas bleiben intakt, es kommt zu keiner Schwellung der Mitochondrien wie bei der Nekrose und eine inflammatorische Reaktion bleibt aus 59. Die Fragmente und apoptotischen Körperchen werden dann von Nachbarzellen phagozytiert, wobei diese Zellen normalerweise nicht zur Phagozytose fähig sind.
Die Integrität der Zellmembran bei der Apoptose ist einer der wesentlichen Unterschiede zur Nekrose. Dort wird die Zellmembran lytisch zerstört und es kommt zum Austreten schädlicher Substanzen und Transmitter, wie z.B. Calcium und Glutamat. Glutamat ist ein Exotoxin, wobei schon geringe zelluläre Konzentrationsänderungen zum nekrotischen Zelltod führen können.
Die Apoptose kann somit als Zelluntergang einzelner Zellen in einer Umgebung intakter Zellen stattfinden und durch die Phagozytose der apoptotischen Zellen in einem Zeitraum von zwei bis vier Stunden kommt es zu keinerlei Beeinflussung der umliegenden Zellen 108. Die Apoptose wird daher gegenüber der Nekrose auch als ein schonender und organisierterer Zelluntergang bezeichnet. Apoptose und Nekrose können aber auch zugleich stattfinden oder hintereinander ablaufen wenn z.B. nicht genügend Energie für eine Apoptose verfügbar ist, wodurch dann auch die apoptotischen Zellen lytische Prozesse durchlaufen 109-112.
Der Hippocampus ist ein typisches Beispiel dafür, dass Apoptose und Nekrose nebeneinander vorkommen können, sich aber in ihrer regionalen und lokalen Verteilung unterscheiden. Die Nervenzellen in dieser Region reagieren unterschiedlich und ihre Reaktion ist abhängig vom pathogenen Stimulus. Nach fokaler Ischämie fand man unmittelbar in der Nähe des verschlossenen Gefäßes eine umrahmte Region mit nekrotischem Zelluntergang, die sogenannte Kernregion. Abgrenzbar dazu zeigte sich um die Kernregion, dort wo der Energiemangel und auch die Ischämie schwächer ausgeprägt war, weniger Nervenzellnekrose, dafür aber signifikant mehr apoptotische Veränderungen 88;112;113. Ebenfalls wurde beobachtet, dass Unterschiede z.B. in der Verteilung der NMDA-Rezeptoren zwischen den Neuronen des Cornu ammonis (CA) und des Gyrus dentatus für die Veränderungen nach Ischämie verantwortlich sein können, sowie das
Das Verständnis des Pathomechanismus der Hirnschädigung und die Kenntnis der Veränderungen während und nach dem operativen Eingriff sollten die Grundlage bilden für die Entwicklung neuroprotektiver Strategien und pharmakologischer Interventionen. Diese Erkenntnisse können am besten in einem Tiermodell gewonnen und auf ihre Wirksamkeit überprüft werden.
Wir haben ein experimentelles Bypassmodell zur weiteren Evaluierung neurophysiologischer, biochemischer, histologischer und ultrastruktureller Veränderungen etabliert 17;116. Die ersten histologischen und immunhistochemischen Ergebnisse bei Kaninchen und bei neonatalen Schweinen zeigten bei einem Kreislaufstillstand von 60 Minuten ein neuropathologisches Schädigungsmuster in Form eines ausgeprägten perivaskulären astrozytären Ödems und weniger eine Schädigung der Neuronen. Die astroglialen Zellen, die 50-60% der Hirnmasse ausmachen, spielen eine vitale Rolle im nutritiven Transport, Metabolismus der Neurotransmitter und in der mechanischen Unterstützung und Plastizität des Zentralnervensystems. Die ausgeprägte Schwellung und extrazelluläre Flüssigkeitsansammlung bestätigten unsere Hypothese einer primären pathognomonischen Reperfusionschädigung in den einzelnen Hirnabschnitten, mit einer Störung des nutritiven Transports zu den Neuronen, aus der eine Neuronenschädigung resultieren könnte 17.
Eine zerebrale Protektion in der klinischen Praxis sollte vor allem die oben genannten neuropathologischen Aspekte berücksichtigen. In einem Tiermodell sollte zuerst eine Evaluierung der pathophysiologischen Zusammenhänge, die zu einer neuronalen Schädigung führen, überprüft werden. Dann sollten neuroprotektive Strategien angewendet und analysiert werden 33;88;95;117-119. Im Gegensatz zu der bisherigen Möglichkeit, bei Erwachsenen und Kindern erst nach einem hypoxisch-ischämischen Ereignis die unmittelbaren und späteren Folgen behandeln zu können, haben wir die Chance, durch die pharmakologische Behandlung vor und während der invasiven Prozedur, die Entstehung möglicher zerebraler Schädigungen entscheidend zu beeinflussen.
Steroide werden in vielen unterschiedlichen klinischen Fachdisziplinen eingesetzt zur Vorbeugung und Behandlung von inflammatorisch bedingten Zellveränderungen, endothelialer Permeabilitätsstörungen und einer posttraumatischen oder ischämischen Ödembildung 120-123. Im Rahmen der Herzchirurgie und des CPB werden Steroide und Methylprednisolon schon seit 1966 eingesetzt, ursprünglich mit dem Ziel die kardiale Funktion nach CPB zu verbessern 124;125.
Eine neuroprotektive Wirkung der Steroide wird seit langem zusätzlich vermutet, vor allem im Zusammenhang mit einer ischämisch-entzündlichen Genese, einer Nervenzellschädigung des zentralen und peripheren Nervensystems, wobei die Reduktion inflammatorischer Parameter und Interleukine experimentell und klinisch nachgewiesen werden konnte 126-128. Trotzdem wird die Fähigkeit der Steroide zur Prävention einer neuronaler Schädigung und einer zerebralen Ödembildung nach einem traumatischen oder ischämischen Einfluss seit langem kontrovers diskutiert.
Die pathophysiologische Grundlage für den Einsatz von Steroiden für den Zweck einer Zellprotektion bilden vielfältige Mechanismen, wobei ein ödemreduzierender Effekt durch Jamshidi et al beschrieben und ein antioxidaktiver Effekt in zwei weiteren Studien beobachtet wurde 121;129;130. Außerdem haben Steroide eine multi-inhibitorische Wirkung auf eine Vielzahl von Komponenten des inflammatorischen Systems im Körper. Steroide sind in der Lage, die Makrophagen-Funktion zu hemmen, die Expression der inflammatorischen Zytokine TNF-alpha, IL-6 und IL-8, sowie eine Komplementaktivierung zu reduzieren und gleichzeitig antiinflammatorische Zytokine wie IL-10 zu erhöhen 53;54;131;132. Die Quelle für die erhöhte Konzentration des antiinflammatorischen IL-10 scheint dabei die Leber zu sein 55. Eine weitere Wirkung zeigte sich in der Verminderung exzitatorischer Aminosäuren, und auch ein verbessernder Einfluss auf den zerebralen Blutfluss wurde beobachtet 12220133128. Jedoch lassen die Verabreichung der Steroide und die Art der ischämischen Schädigung in dem jeweiligen Studiendesign aufgrund der fehlenden ausführlichen morphologischen Untersuchung nicht unbedingt eine direkte neuroprotektive Wirkung erkennen. Und ein wirklicher Vorteil dieser Interaktion mit dem Entzündungssystem des Körpers ließ sich klinisch bisher nur schwer beweisen 134.
Der Einsatz von Steroiden in der Herzchirurgie wird bisher weiterhin kontrovers diskutiert, ein neuroprotektiver Effekt konnte bisher noch nicht bewiesen werden. Als sogenannte „high-dose“ Therapie zur Neuroprotektion werden 30 mg/kg Körpergewicht intravenös als Dosis in der Literatur angegeben.
Eine Studie von Langley et al. wies vor kurzem bei einer Behandlung mit hochdosiertem Methylprednisolon durch die Verbesserungen des zerebralen Blutflusse und der Oxygenation nach 60 Minuten KSTH auf eine neuroprotektive Wirkung hin. Auch hierbei fehlte jedoch eine histologische Evaluation post mortem, die notwendig wäre, um wirklich einen neuroprotektiven Effekt beschreiben und quantifizieren zu können 20. Einzig die Annahme, dass die Verbesserungen der Perfusion und Oxygenation so kurz nach KSTH
Eine Arbeitsgruppe der Duke-Universität berichtete ebenfalls vor kurzem über eine dramatische Reduktion der Immunantwort nach der Vorbehandlung mit hochdosierten Steroiden 8 Stunden vor der CPB, verglichen mit der herkömmlichen intraoperativen Applikation in der Primeflüssigkeit 136. Die präoperative Applikation führte zur einer verbesserten Lungenfunktion durch verminderte pulmonale Wasserakkumulation. Eine ähnliche Wirkung im Gehirn durch Reduktion des perivaskulären Ödem und eine Verbesserung der zerebralen Hämostase kann vermutet werden. Andersen et al beschrieben in einer klinischen Studie eine Reduktion der Komplement-Aktivierung während CPB unter einmaliger intravenöser „high-dose“ Steroidtherapie. Es zeigte sich jedoch kein Unterschied im klinischen Outcome 137. Im Gegensatz zu dieser Studie zeigten Boscoe et al, dass weder Steroide noch pulsatiler HLM-Fluß die Komplement-Aktivierung beeinflussen 138. Karlstadt et al. untersuchten den Einfluss der Steroide auf eine Endotoxin-Entstehung während CPB und stellten fest, dass Methylprednisolon die Entstehung des Plasma-Endotoxin als Faktor einer Alteration der Endothelfunktion nicht beeinflusst 139.
Seit kurzem wird auch durch klinische Studien auf eventuelle Nebenwirkungen einer Steroidtherapie hingewiesen, gerade im Bereich der postnatalen Steroidapplikation. Die Indikation der postnatalen Steroidgabe ist meist eine Lungenunreife. Es konnten Störungen der neurologischen Entwicklung und des Verhaltens nach Steroidgabe beobachtet werden. Eine Meta-Analyse aus Kanada zeigte den Zusammenhang auf zwischen neurologischen Störungen und postnataler Steroidapplikation 140.
Für den Wirkungsmechanismus der Steroide wird die Existenz eines Glucocorticoidrezeptor (GR-I) und ein Mineralcorticoidrezeptor (GR-II) mit einer unterschiedlichen zellulären Wirkung und mit einer unterschiedlichen Affinität der endogenen und exogenen Steroide für diese beiden Rezeptoren beschrieben.
Für den Glucocorticoidrezeptor I, den „klassischen“ Steroidrezeptor, existieren eine α- und ß-Isoform. Dabei ist nur die α-Isoform in der Lage, durch Bindung der Steroide die entsprechende Wirkung zu entfalten. Die ß-Form interagiert nicht mit den Steroiden und ist als Antagonist der α-Isoform bekannt 141. Der Steroidrezeptor (GR-I) ist im Zytosol lokalisiert und ein 770 Aminosäuren langes Protein, mit einem MG von 94000 Dalton. Er verfügt über einen Hitze-Schock-Protein abhängigen Aktivierungszustand, wobei der GR-Iα durch die Bindung an HSP 90 inaktiviert ist 142. Die Rezeptorenverteilung und Dichte hat einen erheblichen Einfluss auf die Steroidwirkung. So konnten im Gehirn regionale Unterschiede der Rezeptorendichte, der Wirkungsintensität und somit auch regionale Unterschiede in dem protektiven Effekt einer Steroidapplikation nach Ischämie aufgedeckt werden. Vor allem der Hippocampus verfügt über eine besonders hohe Dichte der Steroidrezeptoren 143;144.
Die Wirkung der Steroide via Steroidrezeptor (SR) bewirkt vor allem eine Beeinflussung von intrazellulären und mitochondrialen Zielgenen mit der Beeinflussung der Proteinsynthese 145. Im Zellkern kann der
Die Transrepression bewirkt eine Hemmung der Genexpression und Proteinsynthese, wie z.B. von Interleukinen aus der Entzündungskaskade und führt damit zu einer immunsuppressiven Wirkung. Diese Wirkung scheint durch eine Interaktion der „Glucocorticoid-Rezeptor-Einheit“ mit den für die Interleukine spezifischen aktivierten Transkriptionsfaktoren (Nuclear factor-kappa B, Aktivator protein-1 oder auch Fos und Jun) stattzufinden, welche die Genexpression dieser inflammatorischen Proteine regeln 126;128. Es wird ebenfalls angenommen, dass es über diese Transrepression auch zur Induktion der Apoptose kommen kann, was bisher in Lymphozyten nachgewiesen werden konnte 148;149. Almeida et al. konnten sogar zwischen einer Apoptose-Induktion via Glucocorticoid-Rezeptor (GR-I) und eine neuroprotektiven Wirkung via Mineralcorticoid-Rezeptor (GR-II) differenzieren, dabei scheint die Wirkung vom Einfluss auf das Tumor-Supressor-Gen p53 abhängig zu sein, denn unter Glucocorticoidwirkung kam es zu einer Erhöhung und unter Mineralcorticoid-Einfluss zu einer Erniedrigung des p53 150. Es zeigt sich somit eine sehr vielfältige und komplexe Wirkung der Steroide, wobei die zerebrale Wirkung durch die regional unterschiedliche Verteilung der Steroidrezeptoren, durch die unterschiedlichen molekularen Mechanismen und verschiedenen genetischen Aktivitäten, durch die Beeinflussung des Zellmetabolismus und durch die Besonderheiten im Neugeborenenalter, von vielen unterschiedlichen Faktoren abhängig zu sein scheint.
Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) ist heutzutage eine sehr wichtige Methode für die operative Korrektur angeborener und sehr komplexer Herzvitien, wie des HLHS, im Neugeborenen- und Kleinkindalter. Bei verbesserter Technik und Überwachung des Bypassregimes und deutlich verbessertem kardialem Outcome wird heute das Hauptaugenmerk auf die Detektion und vor allem Prävention von Alterationen der zerebralen Funktion, sowie auf die Vermeidung neurologischer Komplikationen und psycho- oder statomotorischer Alterationen gelegt.
Die Hypothermie ist eine wissenschaftlich belegte neuroprotektive Methode zur Erhöhung der Ischämietoleranz des Gehirns während Unterbrechung der systemischen Zirkulation. Jedoch zeigten einige Studien auf, dass es trotz der Anwendung der Hypothermie zu einer Alteration der neurologischen und psychomotorischen Entwicklung kommen kann 33;151. Ein wesentlicher Faktor dafür könnte ein noch vorhandener minimaler Metabolismus der Neurone sein, welcher auch in tiefer Hypothermie noch besteht und es dadurch im Kreislaufstillstand trotz Hypothermie zu einer Unterversorgung der Zellen des ZNS kommen kann.
Der derzeitige Stand der Wissenschaft lässt einen sehr großen Bedarf für die weitere Aufklärung pathophysiologischer Zusammenhänge zwischen CPB, KSTH und den Auswirkungen für das Gehirn vor allem im Neugeborenen- und Kleinkindesalter erkennen. Durch die aus klinischen Studien gewonnen Erkenntnisse über die zerebrale Auswirkung und die neurologische Symptomatik von Kindern nach kardialen Korrekturoperationen entstand der Bedarf zur Entwicklung einer neuroprotektiven Strategie. Die Möglichkeit mit einer geplanten pharmakologischen Intervention die Veränderungen eines möglichen globalen oder fokalen ischämischen Ereignis zu verbessern, wäre von besonderer therapeutischer Bedeutung. Doch mit welcher protektiven Maßnahme sich das multifaktorielle Geschehen verbessern ließe, bleibt weiterhin unklar. Und gerade das neonatale Alter stellt durch die Unreife der Organsysteme eine erheblich Gefährdung für die Entstehung multipler neurologischer Defekte dar.
Ziel unserer tierexperimentellen Untersuchung am neonatalen Tier sollte zunächst die Erfassung von Form und Ausmaß der zerebralen Schädigung nach KSTH sein. Es sollten weiterhin zahlreiche Parameter untersucht werden, wie die Oxygenation, die Perfusion und der Metabolismus. Es sollte dann eine pharmakologische Intervention im Sinne neuroprotektiven Strategie mit Steroiden durchgeführt und verglichen werden. Der Einfluss einer unterstützenden neuroprotektiven pharmakologischen Intervention sollte in diesem tierexperimentellen Modell unter realistischen klinischen Bedingungen der Kinderherzchirurgie überprüft werden. Daher sollte sowohl die technische Ausstattung mit Oxygenatoren und der Herz-Lungen-Maschine, als auch die Führung von Narkose, Beatmung und alle kontrollierbaren physiologischen Parameter mit der klinischen Anwendung vergleichbar sein.
Anhand eines entwickelten tierexperimentellen Modells an neugeborenen Schweinen wollten wir die Veränderungen der zerebralen Perfusion und Oxygenation und das Muster der Neuronenschädigung be
Es wurde daher ein standardisiertes Protokoll für ein neonatales Schweinebypassmodel mit anästhesiologischem Management, CPB und mit einer Periode von 120 Minuten Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie entwickelt, wobei die Tiere per Zufall vorher entweder einer Vorbehandlung mit Steroiden unterzogen wurden oder als Kontrollgruppe fungierten. Die Gruppenzugehörigkeit war während der Versuchdurchführung nicht bekannt.
Die Entscheidung für eine Behandlung mit Steroiden fand aufgrund der klinischen Anwendbarkeit statt und weil Steroiden schon standardisiert in der Kinderherzchirurgie bzw. in der Neurochirurgie klinisch eingesetzt werden.
Ziel des Versuchs war die Evaluation des neuroprotektiven Effekts hochdosierter Steroide auf einen
Ischämie-Reperfusionschaden. Bei der Intervention mit Steroiden sollte außerdem die Abhängigkeit der Applikation und somit auch der Zusammenhang einer protektiven Steroidwirkung von der Permeation über die Blut-Hirn-Schranke geprüft werden. Daher wurde die präoperative Applikation der Steroide systemisch (intravenös) und intrathekal, mit direkter Applikation in den Liquorraum, nach einem standardisierten Protokoll durchgeführt. Die Gehirne wurden blind standardisiert und umfassend histologisch und immunhistochemisch untersucht.
Es wurde ein tierexperimentelles Modell in Zusammenarbeit mit Herzchirurgen, Kardiotechnikern und Anästhesisten entwickelt, mit dem Ziel, ein möglichst eng an der Klinik orientiertes Protokoll einzusetzen und sowohl die technischen Mittel, als auch die Prozeduren, möglichst realistisch und originalgetreu umzusetzen.
Die quantitative morphologische Beurteilung neuronaler Veränderungen wurde nach dem Versuch durchgeführt, bei gleichzeitiger Messung hämodynamischer, serologischer und metabolischer Parameter während des Versuchs. Diese Ergebnisse wurden zueinander in Beziehung gesetzt.
Es wurden 50 neonatale Schweine mit einem Körpergewicht von 2.300 ± 200g und einer durchschnittlichen Lebenszeit von 5,8 Tagen verwendet. Für die Versuche galten die entsprechenden Vorschriften der Tierschutzverordnung des Landesamtes für Gesundheit und Soziales in Berlin mit der Genehmigungsnummer G0146/98. Sie wurden durchgeführt in der tierexperimentellen Einrichtung des Forschungshauses der Charite´ Campus Virchow unter Anleitung des Tierschutzbeauftragten der Charite´, Herrn PD Dr. Grosse-Siestrup, und mit Unterstützung durch Herrn Dr. med. vet. M. Meissler.
Es wurden drei Versuchsgruppen gebildet:
Zwölf Tiere ohne Vorbehandlung (Kontrolle) wurden einem cardiopulmonalem Bypass (CPB) mit 120 Minuten Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) unterzogen, mit anschließender Reperfusion und Erwärmung und einer postoperativen Überwachungsphase von mindestens 6 Stunden.
In dieser Gruppe wurden 7 Tiere jeweils 4-6 Std. vor Beginn des Bypasses mit 30 mg/kg Methylprednisolon (Urbason solubile 32, Hoechst, Frankfurt) intravenös per Kurzinfusion behandelt. Die Tiere wurden dann einem CPB mit 120 Minuten KSTH in tiefer Hypothermie ausgesetzt. Anschließend erfolgte Reperfusion und Erwärmung und postoperativ 6 Stunden intensivmedizinische Überwachung.
Fünf Tieren wurden 30 mg/kg Methylprednisolon (Urbason solubile 32, Hoechst, Frankfurt) intrathekal 4-6 Stunden vor Beginn des Bypasses nach steriler lumbaler Punktion mit einer Spinalnadel (Terumo Spinal Needle, Japan) verabreicht. Die Tiere wurden dann einem CPB mit 120 Minuten KSTH in tiefer Hypothermie ausgesetzt. Anschließend erfolgte Reperfusion und Erwärmung und postoperativ 6 Stunden intensivmedizinische Überwachung.
Zum Versuch wurden 50 neugeborene Schweine mit einem Gewicht von 2.300 ± 200 g und einem Alter von 5-9 Tagen verwendet. Sie wurden am Tag des Versuches von einem Bauern aus Brandenburg geliefert und von unserem Tieranästhesist Herrn Dr. M. Meissler innerhalb einer Stunde nach Ankunft intramuskulär (i.m.) mit 50 µg/kg KG Ketaminhydrochlorid (Ketanest, Parke-Davis Gmbh, Berlin) und 2 mg/kgKG Dormicum prämediziert.
Während der gesamten Zeit erfolgte die perioperative Überwachung mit Hewlett Packard OP-Monitoring System (HP Modell 66S) für EKG und HF, MAD, ZVD, O2-Sättigung, und weitere invasive Druckmessungen.
Es wurden zu Beginn EKG-Elektroden, periphere Pulsoximetrie und eine rektale Temperatursonde angebracht. Die linke und rechte Ohrvene wurden für zwei intravenöse Zugänge punktiert. Anschließend folgte nach Präoxygenierung die orale-endotracheale Intubation und der Anschluss an die maschinelle druckkontrollierte Beatmung (Dräger Babylog Ventilator, Hamburg) mit einem Druck von 15 – 20 mmHg, einer Frequenz von 20-30/min und einer FIO2 von ca. 21-30 %. Für die Narkose wurde eine total-intravenös Anästhesie (TIVA) mit 50 µg/kg/min Fentanyl (Curamed, Pharma GmbH, Karlsruhe) und 0,2 mg/kg/min Dormicum eingesetzt. Eine Relaxierung erfolgte mit 0,1-0,2 mg/kg Pancuronium (Curamed, Pharma GmbH, Karlsruhe) bedarfsorientiert. Die präoperative Lumbalpunktion wurde mit einer Spinalnadel (TERUMO spinal needle 22G) durchgeführt und es wurde maximal 0,5-0,7 ml klare Liquorflüssigkeit tröpfchenweise in sterile Kryo-Röhrchen (Cryovial, Carl Roth GmbH-Co, Karlsruhe) asserviert und sofort bei –80°C eingefroren.
Für kontinuierliche Urinsammlung erhielt das Tier einen suprapubischen Blasenkatheter. Dann wurde das Versuchstier für die Operation vorbereitet und in Rückenlage fixiert. Die Wärmeerhaltung bei einer Temperatur von 38.2 ° C erfolgt mittels Wärmematte ( THERMOMAQUET ) und Wärmelampe ( HAERAUS: SOLLUX 500 ).
Unter sterilen Bedingungen wurde in Seldinger-Technik jeweils ein arterieller Zugang (BRAUN Abbocat) in der A. femoralis und ein zentralvenöser Zugang (ZVK) in der Vena femoralis gelegt,. Es wurde ebenfalls eine retrograde Katheterisierung der Vena jugularis interna für die kontinuierliche Blutabnahme aus dem gemischt-venösen Rückstromgebiet des Gehirns durchgeführt. Es wurden an alle Gefäßkatheter die entsprechenden Druckmessungen installiert, um MAD, ZVD und die Drücke im zerebrovenösen Rückstrom der V. jugularis kontinuierlich zu messen. Der OP-Monitor (HP Modell 66S) ermöglichte ebenfalls die kontinuierliche Überwachung aller Vitalparameter wie Herzfrequenz, Arterieller Blutdruck, ZVD, Druck im Bulbus jugularis, periphere Sättigung, rektale Temperatur, EtCO2, Atemfrequenz. Während des Versuchs erfolgte eine kontinuierliche Überwachung und Registrierung der Blutgase und der Elektrolyte mit einer Blutgas-Analyse (BGA) durch ABL (RADIOMETER Kopenhagen) und eine Messung des Hämoglobins und Hämatokrits durch Hämoximeter OSM3 (RADIOMETER Kopenhagen). Die Werte wurden jeweils simultan für das arterielle und venöse Blut, sowie für das Blut des zerebralen Rückstromes (Vena jugularis int.) bestimmt. Außerdem erfolgte eine Blutzucker-Überwachung mit Haemo Glukotest 20 –800 R (BOEHRINGER).
Wir benutzten eine nicht-pulsatile Multiflow Rollerpumpe (STÖCKERT/SHILEY, Deutschland) mit dem dazugehörigen Wärmeaustauscher für Normo- und Hypothermie (STÖCKERT, Deutschland).
Das Priming der Maschine wurde durchgeführt mit ca. 400 ml Vollblut, wobei es sich um Spenderblut von einem Tier der gleichen Rasse meist vom gleichen Tag handelte, aufbewahrt in einem Bluttransfusionsbeutel (BIOTRANS, Dreireich) mit Gerinnungshemmung durch Na-Citrat und mit einer prophylaktischen Antibiotika-Gabe Cefotiamhydrochlorid (Spitzef, Takeda Pharma GmbH, Aachen) in einer Dosierung von 100 mg/kg KG. Dieses sogenannte „Vollblutpriming“ wurde mit zusätzlich 30-50 ml HAES 10%ig (FRESENIUS), 2500 IU/L Heparin (BRAUN), 20 ml Isotonische Kochsalz -Lsg (BRAUN) und bei Bedarf Natriumbicarbonat. Das Priming besaß dann einen Hämoglobingehalt von ca. 9.0 ± 1.0 g/dl mit ausgeglichenem physiologischen Säure-Basen Haushalt von 7.40 ± 0.05 erzielt wurde.
Der Zugang zum Herzen erfolgte mittels mediane Thorakotomie unter großer Vorsicht vor Verletzung der Thoraxgefäße und der umgebenden Organe. Nach mechanischer Spreizung des Thorax und der durchgeführter Blutstillung, erfolgte unter Sicht die Präparation von Perikard, Pleura und der großen Gefäße. Das Perikard wurde geteilt und alle Herzkompartimente, sowie Aortenbogen und A. pulmonalis wurden zugänglich gemacht. Die Kanülierung erfolgte in der Aorta ascendenz nach Inzision mit einer 8 FR Aorten-Kanüle und in das rechte Herzohr mit einer 14 FR venösen Kanüle. Die Kanülen wurden mittels Tabaksbeutelnaht fixiert. Dann erfolgte der Anschluss der Kanülen an die Tischlinie und damit die Verbindung zu der HLM, wobei das gesamte System entlüftet wurde.
Wir benutzten einen CPB mit vollem Fluss („full-flow-CPB“), d.h. mit einem einen Maschinenfluss von 250 ml/kg KG. Ein аlpha-stat-Management für die Blutgase wurde angewendet mit für die jeweilige absinkende Temperatur unkorrigierten PCO2- und pH-Werten. Die Bypasszeit war standardisiert unterteilt in eine Phase des normothermen CPB bei 38,0 ±0.5 °C von 20 Minuten, mit darauffolgender Kühlungsphase über einen Zeitraum von 30 Minuten, mit einem Temperaturgradienten von maximal 9,0 ±0,8 °C zwischen Bluttemperatur und Oxygenator, bis zum kälteinduzierten Herzstillstand bei 15 ±0.5°C myokardialer Temperatur, welches durch ein EKG ohne jegliche elektrische Aktivität symbolisiert wurde. Nach dem Erreichen einer rektalen Temperatur von 15± 0.3 °C und einer peripheren Temperatur von 16°C, folgte dann die Phase des Kreislaufstillstandes in tiefer Hypothermie für 120 Minuten 153. Zusätzlich zur systemischen Kühlung durch die HLM benutzten wir die oberflächliche Myokard-Kühlung mit sogenanntem „Sludge“-Eiswasser, das eine myokardialen Temperatur unter 15 °C während des KSTH gewährleistete.
An den Kreislaufstillstand schloss sich dann die Phase der Reperfusion und Erwärmung an, dabei wurde in den ersten Minuten nur mit einem geringen Perfusionsfluß erwärmt bei einem Temperaturgradienten von 9 °C am Oxygenator, bis zum Erreichen einer myokardialen Erregung im EKG bei einer Myokardtemperatur von ca. 20°C und einer beginnenden myokardialen Bewegung. Nach beginnender Herzaktion nach ca. 3- 5 Minuten wurde der Perfusionsfluss stetig gesteigert bis der volle HLM-Fluss von 250 ml/kg erreicht wurde. Dabei wurden zum Erreichen eines optimalen Perfusionsregime der arterieller Mitteldruck im Bereich von 60 ±10 mmHg gehalten und der ZVD bei 5 ±1 mmHg . Wir erwärmten dann insgesamt bis zur physiologischen Temperatur von 38 ±1° C über eine Phase von 45 – 50 Minuten, worauf dann
Nach Beendigung des CPB folgt eine mindestens 6-stündige postoperative Phase mit intensivmedizinischer Überwachung. Dabei wurden alle Parameter im physiologischen Bereich gehalten: Hämoglobin bei 10 ± 1 g/dl, der MAD bei 60-80 mmHg, der ZVD bei 5-7 mmHg. Die Partialdrücke für O2 im Blut bei 100-150 mmHg und für CO2 bei 30-40 mmHg wurden entsprechend durch die Blutgasanalysen stabil gehalten. Wenn notwendig wurde pharmakologisch mit Katecholaminen interveniert. Die Beatmung erfolgte bedarfsadaptiert und druckkontrolliert mit Beatmungsfrequenzen von 25-35/min, Atemzugvolumina von 30 bis 50 ml/kg, einem PEEP von 5-10cm H2O, und Beatmungsdrücken von 30-40 mmHg. Postoperativ zeigten einige der Tiere Anzeichen einer pulmonalen Hypertension, welche jedoch durch die Beatmungsintensivierung beherrschbar war. Die Heparinisierung wurde mit Protamin antagonisiert, wobei 1ml 1000 IU Heparin neutralisiert. Eine Kontrolle erfolgte mittels ACT-Messung, die unter 160 sek. liegen sollte. Dann wurden die Tiere für sechs Stunden überwacht. Nach einem standardisiertes Protokoll wurden sämtliche Vitalparameter stabil gehalten, die Tiere blieben beatmet und narkotisiert.
Nach einer sechsstündigen postoperativen Phase unter stabilen hämodynamischen und metabolischen Bedingungen wurden die Tiere in Narkose geopfert. Dabei wurde bei stabilen hämodynamischen Verhältnissen das Herz entnommen, und innerhalb von 5 Minuten der dünne Schädelknochen medial gespalten, der Liquor aus der Zysterna magna und den Seitenventrikeln, sowie das Gehirn entnommen und das Hirngewicht ermittelt.
Das Gehirn wurden dann medial gespalten und die Hemisphären kamen zur Fixation für 48 Stunden in SOMOGYI-Lösung, eine Lösung aus gesättigter Pikrinsäure mit Paraformaldehyd und 25%igem Glutaraldehyd in PBS-Puffer 154, mit einem neutralem pH-Wert. Danach wurden aus der linken und rechten Hemisphäre standardisiert die Schnitte für die einzelnen Hirnregionen angefertigt, wobei jeweils circa 3 mm transversale dünne Schnitte der beiden Hemisphären für die Hirnregionen frontaler, parietaler, occipitaler Kortex, sowie der Bereich Stammganglien, Hippocampus, Kleinhirn und Medulla angefertigt und in Paraffin eingebettet wurden (siehe Abbildung 3.4). Die Paraffin-Blöcke wurden mit 3-Aminopropyltrietoxisilan (APTS von Sigma code A/3648) aufbereitet, zugeschnitten mit dem Mikrotom in 6 µm dicke Schnitte für die histologische und immunhistochemische Färbung.
Die lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte standardisiert und blind für die jeweiligen Versuchsgruppen in der neuropathologischen Abteilung der Freien Universität Berlin. Es wurden der Hippocampus, die Stammganglien mit Ncl. caudatus, Thalamus und Pallidum, der Cortex mit Gyrus cinguli, das Kleinhirn und die Medulla ausführlich untersucht. Die Färbung erfolgte mit Hämatoxylin und Eosin (HE)-Färbung und „Luxol fast blue“ (Markscheidenfärbung). Artefakte sogenannte „Dark neurons“ wurden ausgeschlossen nach Cammermeyer et al 155. Speziell der Hippocampus als komplexes und hypoxieempfindliches Areal des Gehirns wurde detailliert analysiert und die Auswertung entsprechend seiner anatomische Unterteilung in die Regionen Cornu ammonis CA 1-4, Gyrus dentatus mit Area dentata und das Subiculum. Für die lichtmikroskopische Untersuchung wurde ein Olympus-Mikroskop eingesetzt und die photographische und digitale Dokumentation erfolgte mit einem LEICA Photomikroskop.
Die immunhistochemische Färbung des calciumbindenden Proteins S-100-B wurde durchgeführt mit Hilfe monoklonaler Antikörper und der alkalischen Phosphatase Anti-Phosphatase (APAAP-Methode) nach Cordell et al. 1984 156. Die Schnitte wurden inkubiert mit dem primären monoklonalen Mause Antikörper (IgG von DPC Immustain, CKS1S ) für 48 Stunden. Danach erfolgt die Zugabe des sogenannten Brückenantikörpers, ein Kaninchen-Anti-Mause-Antikörper im Überschuss und die Inkubation für 30 Minuten. Am Ende erfolgte dann die Zugabe des APAAP-complex 1:50 in TBS (Dakopatts, code D651), welcher an den Brückenantikörper bindet. Für die Visualisierung mittels der enzymatische Reaktion durch den Enyzm-Antikörper-Komplex wurden DPC-Immustain-Streptavidin-Biotin-Immunperoxidase (DPC Immustain-kit) angewendet. Zwischen den Schritten muss die Spülung mit phosphatfreier Pufferlösung erfolgen.
Es wurde versucht, eine mögliche inflammatorische Reaktion durch die Detektion der Mikrogliazellen mittels Lektin-Färbung nachzuweisen. Mikrogliazellen gehören zu der Familie der Monozyten/Makrophagen. Ihre Vorläufer wandern während der Embryonalphase in das ZNS ein und bilden dort das ortsständige Makrophagensystem. Die Zellen sind amöboid beweglich und mitotisch aktiv. Postnatal bilden sie Äste und Fortsätze aus und machen ca. 20% der Gliazelle im ZNS aus. Ein pathologischer Stimulus führt zu ihrer Aktivierung in eine mobile, phagozytierende und Zytokine/Proteasen sezernierende Zelle. Mikrogliazellen lassen sich mittels Immuncytochemie durch Bindung von Lektin und Metallimprägnation identifizieren. Die Mikroglia wurde in repräsentativen entparaffinierten Hirnschnitten mittels Biotinisiertes Tomato-Lektin von Lycopersicon Esculentum (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA 94010 USA, Charge Nr. M0503) in einer Verdünnung von 1:50 bis 1:200 selektiv detektiert und in einer Feuchtkammer bei 37°C für 90 Minuten inkubiert. Weiterhin wurden TBS-Puffer zum Spülen und Trypsin (Sigma T7409) zum Andauen verwendet. Die Färbung erfolgte mit DAB (Sigma D 5905) für braun und Hämatoxylin für die blaue Kerndarstellung 157.
Nekrotische Zellveränderungen wurden am mit HE-gefärbten Schnitt anhand der entsprechenden charakteristischen Veränderungen wie Eosinophilie, Verlust der Nissl-Substanz und anderer zytoplasmatischer Strukturen, sowie der Kernpyknose mit Basophilie identifiziert. Frühe Formen nekrotischer Veränderungen, wie intrazelluläre mitochondriale Schwellung und perineurales Ödem, ebenso wie späte Veränderungen in Form von Zellnekrose der Neurone konnten beobachtet und dokumentiert werden.
Insgesamt wurden die Hippocampus-Formation als ein Ort der selektiven Neuronenveränderungen 88;158 umfassend analysiert und die Neuronenveränderungen quantitativ dokumentiert. Der Hippocampus wurde unterteilt in die anatomischen Regionen Cornu ammonis 1-4, Gyrus dentatus mit Fascia dentata und das Subiculum.
Die standardisierte histologische Auswertung erfolgte blind für alle Gruppen mittels lichtmikroskopischer computergestützter Quantifizierung durch interaktive Morphometrie, wobei in einer Fläche von 10 bis 40 mm² in den einzelnen Hirnregionen die nekrotischen Neurone klassifiziert und quantitativ der prozentuale Anteil dieser Neurone an der Gesamtzahl (500 ±70) aller gezählten Neurone errechnet wurde 159. Ebenfalls quantifiziert wurden die Veränderungen im Gyrus cinguli (GC) als Repräsentant des Neokortex, da der GC mit seinem Windungstal als besonders inert gegenüber einer artifiziellen externen Neuronenverletzung gilt. Im Bereich der Stammganglien wurden Nucleus caudatus und Kerne des Thalamus, sowie
Die apoptotischen Zellveränderungen wurden mittels TDT vermittelter-dUTP-Biotin-nick-end Labeling- Methode (TUNEL) und sogenannter in situ DNA-Fragmentation dargestellt.
Diese Färbung erfolgte an den mit Xylol und Ethanol entparaffinierten Schnitten. Dabei wurden die Schnitte mit Tris-Pufferlösung gespült, anschließend mit Proteinase K für 15 Min. inkubiert und erneut mit Tris-Pufferlösung gespült. Die Inkubation erfolgte mit in-situ-Tailing-Mix, welcher aus Digoxin-DNA mit Biotin-16-dUTP (Kat-Nr.1093979), sowie ca. 20µl/cm3 terminaler Transferase vom Kälber Thymus (Kat-Nr.220582) bestand. Weitere Bestandteile sind CoCl2 25mmol und Puffer (ROCHE Diagnostics GmbH, Mannheim). Die Inkubation erfolgte für 60 Minuten im Wärmeschrank. Darauf folgte eine erneute Pufferung und die Blockierung der unspezifischen Veränderungen mittels 10%iger FCS-Lösung für 15 Min. bei Raumtemperatur. Nach Anwendung von Anti-Digoxigenin-AP für 60 Minuten erfolgte die farbliche Entwicklung unter dem Mikroskop. Anschließend wurde noch die Gegenfärbung mit Kernechtrot und Aralsulfat für ca. 10 Minuten vollzogen.
Die apoptotische Veränderungen wurden ebenfalls im HE-Schnitt anhand der morphologischen Kriterien wie Chromatinkondensation, nukleäre Blasenbildung und Bildung sogenannter apoptotischer Körperchen („apoptotic bodies“) identifiziert und mittels einer Gitterplatte (OLYMPUS) quantifiziert 106.
Für die Elektronenmikroskopie wurden aus den SOMOGYI-fixierten Gewebe würfelförmige Anteile mit einer Kantenlänge von 2 mm, standardisiert für die Regionen Hippocampus, Gyrus cinguli, Stammganglien und Kleinhirn zugeschnitten und mit Osmiumtetraoxyd nachfixiert. Nach Entwässerung wurde das Gewebe in Araldite eingebettet. Anschließend wurden Semidünnschnitte angefertigt und mit Toluidinblau angefärbt. Nach Mikroskopie der Semidünnschnitte wurden die Bereiche für die Ultradünnschnitte am Mikroskop lokalisiert und entsprechend markiert. Die Ultradünnschnitte wurden nach Kontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat im Elektronenmikroskop (ZEISS EM 10) mikroskopiert.
Die Bestimmungen des Hitze-Schock-Proteins 70 kDa (HSP 70), der Apoptose-Peptide Bak und FAS, und der anti-apototischen Peptide Bcl-xl aus der Bcl-2-Familie erfolgten mittels Real-time PCR in der molekular medizinischen Einrichtung des DHZB. Dabei wurde die RNA/DNA-Expression dieser im Zusammenhang mit der apoptotischen Kaskade stehenden Proteine ausgewählt, um einen eventuellen Effekt der Steroidintervention auf die Entstehung der Apoptose im Rahmen des KSTH von 120 Minuten molekulargenetisch zu untersuchen. Die Bestimmungen wurden am gefrorenen Hirnmaterial durchgeführt.
Aus dem Hirnmaterial folgte dann die standardisierte Aufbereitung der RNA mittels RNeasy-Kit von Quiagen. Dabei wurden nach standardisierter Aufreinigung und Bearbeitung aus den Schnitten die RNA Probe gewonnen. Die aufgereinigte RNA wurde dann für die weitere Bearbeitung bei –80°C konserviert. Danach wurde die Herstellung der komplementären DNA (c-DNA) durchgeführt, wobei aus der RNA dann mittels Reverser-Transkriptase (RT) nach Gibco Superscript II (Invitrogen) die komplementäre Einzelstrang-DNA (cDNA) hergestellt wurde. Darauf folgte die Realtime-PCR mit der cDNA (GeneAmp 5700, Perkin Elmer) mit SYBR Green, wobei die cDNA dann mit dem jeweils spezifischen Primer für 18s, GAPDH, HSP70, Bcl-xl, BAK, FAS eingesetzt wurde. Die spezifischen Primer wurden mit Primer Express hergestellt und die Spezifität der Oligonukliotidsequenzen wurde mit BLAST möglichst Intron-überspannend kontrolliert und bestätigt. Durch die spezifischen Primer wurde dann die DNA des entsprechenden Genes in der PCR hochamplifiziert.
Es erfolgte die Denaturierung und Auftrennung der DNA bei einer Temperatur > 92°C mittels “Hot start” PCR. Dann die Primer Anlagerung (Annealing), wobei über einen Zwischenschritt im 1.Zyklus aus der Einzelstrang-DNA die entsprechende Doppelstang DNA (ds-DNA) hergestellt. Darauf folgte dann pro Zyklus eine Verdopplung spezifischen Gensequenz für den jeweiligen Primer, wenn die PCR annähernd zu 100% verläuft. Insgesamt wurde in 30-40 Zyklen eine exponentielle Akkumulation des Primerzielbereichs durchgeführt, und somit pro PCR aus einer Matrize in z.B. 35 Zyklen 34x109 Kopien hergestellt wurden. Die Quantifikation der primerspezifischen DNA wurde während der PCR mittels Floureszenz-Detektion durchgeführt. Dabei wurde die Genexpressionsrate mittels SYBR Green analysiert, welches eine hohe Affinität zur Doppelstrang-DNA besitzt. Mit dem 5700 Sequenz-Detektor und dem Einsatz des SYBR Green konnte eine Echtzeit-Analyse der DNA-Vervielfältigung erhoben werden. Der 5700 Sequenz-Detektor besteht aus einer Halogen-Lichtquelle, welcher blaues Licht mit einer Wellenlänge von 485 nm durch einen optischen Filter emittiert. Das Licht wird durch eine Feldlinse auf die Probenfläche geleitet, und durch den an die DNA gebundenen Floureszenzfarbstoff wird das Licht mit der spezifischen Wellenlänge von circa 520 nm messbar. Während der gesamten Messzeit wird pro Zyklus ein Bild des emittierten grünen Lichts gespeichert, wobei die Emission des Lichts proportional zu der DNA Amplifikationsmenge ist. Da man am Anfang nicht weiß in welchem Verhältnis mit forward-Primer zu reverse-Primer das beste Primerverhältnis entsteht, wird als erstes eine Primer Matrix mit unterschiedlichen Primerverhältnissen ausgetestet. Am gängigsten sind die Verhältnisse 1:1; 1:3; und 3:1 des forward-Primers zum reverse-Primer. Dazu werden alle cDNA Proben, die untersucht werden sollen, „gepoolt“ (sogenannter Master-Pool). Nachdem das beste Primer Verhältnis für das jeweilige Gen ermittelt worden ist, macht
Am Ende wurde die jeweilige Expression des entsprechenden Apoptose-Proteins bei den Tieren ohne jeglichen Eingriff auf einen Werte von eins gesetzt, und im Vergleich dazu die Expression bei den Versuchstieren graphisch dargestellt.
Die Bearbeitung erfolgte mit MS-Office-Paket. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Mann-Whitney Test und dem Programm Statview für Windows Version 5.0.
Die 24 eingeschlossenen Tiere der drei Versuchsgruppen waren sieben bis elf Tage alt und unterschieden sich präoperativ nicht signifikant in Körpergewicht und Größe (siehe Abbildung 4.1).
Die Gehirne zeigten eine dem Alter angemessene neuronale Entwicklung. In einigen Bereichen, vor allem aber um die Hirnventrikel, waren noch Matrixzellnester vorhanden. Alle drei Versuchsgruppen wurden hinsichtlich morphologischer Veränderungen blind beurteilt. Nur bei einem Tier konnte eine intraventrikuläre Blutung beobachtet werden, welches zum Ausschluss aus der Studiengruppe geführt hat. Es zeigten sich sonst keine Anzeichen einer intra-, periventrikulären oder intraparenchymatösen Blutung.
In keiner der drei Gruppen traten entzündliche Veränderungen, wie Proliferation und Aktivierung der Mikroglia oder eine extravaskuläre Ansammlung von Leukozyten oder Lymphozyten auf. Eine perioperativ entstandene Infektion als mögliche Ursache für eine daraus resultierende Neuronenzellschädigung galt somit als nicht wahrscheinlich. Die Mikrogliafärbung beruht auf der Anfärbung von Lektinen (spezifische Zuckermoleküle), welche aber nicht nur auf den Mikrogliazellen zu finden sind, sondern auch auf den Endothelzellen. Daher färben sich die Endothelzellen ebenfalls braun an. Jedoch konnte in keinem Versuchstier eine Aktivierung der Mikrogliazellen detektiert werden. Als Vergleich ist ein Schnitt von einem Tier nach Trauma mit deutlicher Aktivierung der Mikroglia dargestellt.
Bei allen Tieren konnte neben den morphologischer Veränderungen der neuronalen Zellen auch charakteristische Veränderungen der Astrozyten in Form einer deutlichen Schwellung der perivaskulären und astrozytären Endfüsse beobachtet werden. Mikroskopisch kam es zur Ausbildung eines ausgeprägten perivaskulären Ödems (siehe Abbildung 4.3 und 4.4).
Die Beurteilung des Ödems wurde quantitativ über die prä- und postoperative Gewichtsdifferenz durchgeführt. Eine Beurteilung aufgrund der morphologischen Erscheinung im Rahmen der lichtmikroskopischen Untersuchung fand ebenfalls statt. Das perivaskuläre Ödem war vor allem bei den kleineren Gefäßen, wie Arteriolen und Venolen am ausgeprägtesten. Die Lokalisation war dabei sehr unspezifisch und das perivaskuläre Ödem war in allen Bereichen des ZNS nachweisbar.
Zusätzlich zeigte sich neben dem perivaskulären Ödem auch eine perineurale Schwellung, welche aber erst mit zunehmender Überlebenszeit deutlicher ausgeprägt und erkennbar war.
Die morphologische Auswertung wurde für den gesamten Hippocampus unter Berücksichtigung seiner anatomisch-morphologischen Strukturen durchgeführt. Es zeigte sich im Vergleich zu früheren Studien, wie z.B. bei Ye et al mit experimenteller globaler Ischämie, dass der Fokus der nekrotischen Veränderungen nicht im Sektor CA 1 des Hippocampus, sondern auch im CA 4 liegt 9899.
Die nekrotischen Neurone waren durch Eosinophilie, Kernpyknose, Zellschrumpfung sowie durch die Veränderungen der zytoplasmatischen Zellorganellen gekennzeichnet. Perineural und perivaskulär war
In der Kontrollgruppe war nach 120 min. KSTH ohne Einfluss einer Steroidbehandlung das Ausmaß der Nervenzelluntergängen in Form von Nekrose mit 77,56 ± 10,32 % im Bereich des Cornu ammonis 4 (CA 4) am größten. Ebenfalls eine ausgeprägte Nekrose konnte mit einem Anteil von 69 ± 7,3 % der Neuronen im CA 1 beobachtet werden. Die Veränderungen in den anderen Sektoren CA 2 und 3 waren nicht so ausgeprägt.
Im Gyrus dentatus zeigten sich nur vereinzelte nekrotische Neurone, es konnten zusätzlich aber auch einige vereinzelte apoptotische Veränderungen beobachtet werden.
Die neuronalen Veränderungen und das Schädigungsmuster im zerebralen Kortex, in den Stammganglien und im Kleinhirn werden im Zusammenhang Kapitel „Einfluss der Steroidintervention“ diskutiert und detailliert dargestellt. Nach KSTH zeigte sich, dass Cortex mit ca. 50 % neuronale Nekrose deutlich geringer betroffen ist. Neben der Nekrose traten auch vereinzelte Apoptosen der Gliazellen und Neurone auf. Die Stammganglien waren mit ca. 45 % Nekrose noch geringer geschädigt. Jedoch zeigte sich im Kleinhirn ein höheres Maß an neuronaler Nekrose, ca. 70 % der Purkinje-Zellen waren verändert. Eine detaillierte Darstellung der Ergebnisse erfolgt weiter unten.
Zur Quantifizierung des entstandenen perioperativen Ödems nach 120 Minuten KSTH wurde unter anderem die prä- und postoperative Gewichtsdifferenz ermittelt. Dabei wurde auch die prozentuale Gewichtszunahme berechnet. Die prä- und postoperative Gewichtsdifferenz betrug nach CPB und 120 Minuten KSTH in der Kontrollgruppe 462 Gramm, dieses entsprach einer postoperative Gewichtszunahme von knapp 23 % gegenüber dem präoperativen Gewicht.
Die Prävention eines interstitiellen Ödems und die verminderte Einlagerung von Wasser durch eine hochdosierte Steroidapplikation sollte durch den Vergleicht der prä- und postoperativen Gewichtsdifferenz ermittelt werden.
Morphologisch zeigte sich zwischen den Gruppen jedoch auch ein Unterschied in der Ausprägung des Ödems. In der Kontrollgruppe war das Ödem morphologisch am stärksten ausgeprägt, in der systemisch behandelten Steroidgruppe am schwächsten.
Das zerebrale Ödem konnte nur semiquantitativ über den Anteil des Hirngewichts vom Gesamtkörpergewicht erschlossen werden. Ein signifikanter Einfluss der Steroidgabe auf die Ödembildung war auch hier erkennbar, wenn man den prozentuale Anteil des Hirngewichtes vom Gesamtkörpergewicht errechnet hat.
Dabei zeigte sich der Anteil des Hirngewichts am Gesamtkörpergewicht von 1.6 % in der Kontrollgruppe. Die intrathekale Gruppe wies mit 1.52 % einen ähnlichen Wert auf. In der systemischen MP Gruppe zeigte sich mit 1.37 % jedoch ein signifikant niedrigerer Anteil. Eventuell ist der Unterschied im prozentualen Gewichtsanteil des Gehirns durch eine geringer Wassereinlagerung und Ödembildung bedingt.
Bei den normalen Tieren ohne CPB und KSTH lag der Anteil des Hirngewichtes bei 1.3 % bis 1.4 %, und war somit sehr ähnlich wie in der systemischen MP Gruppe.
Man kann daher folgern, dass es unter der systemischen Steroidapplikation postoperativ zu einer geringeren Gewichtszunahme kam.
Die Auswertung der hämodynamischen Parameter ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (siehe Abbildung 4.7 und 4.8). Sowohl die Kontrollgruppe, als auch die beiden Steroidgruppen zeigten vergleichbare hämodynamische Werte ohne signifikante Unterschiede vor, während und nach KSTH.
Der Arterielle Mitteldruck (MAD) lag vor, während und nach dem CPB in einem Bereich von 60 bis 80 mmHg. Es zeigten sich ZVD-Werte zwischen 5 und 10 mmHg und auch die Herzfrequenz variiert in einem Bereich von 150 bis 220 Schläge pro Minute. In der Abbildung 4.9 ist deutlich zu erkennen die normotherme Phase des CPB mit anschließender Kühlung, und das Erreichen der 15°C Marke, mit anschließendem durch den Pumpenstop resultierendem Abfall des MAD auf Werte um Null mmHg. Nach 120 Minuten KSTH erfolgte dann die Wiedererwärmung, wobei entsprechend am Anfang der Reperfusion die Erwärmung mit einem langsam steigendem HLM-Fluß und einem maximalen Temperaturgradienten von 8°C zwischen dem Oxygenator und dem Blut begonnen wurde, der langsam bis zum Erreichen von circa 25 °C gesteigert wurde. Ab 25°C konnte dann mit normal hohem Maschinenfluss wiedererwärmt werden. Nach 50 Minuten war die Phase der Reperfusion abgeschlossen. Bei normaler Körpertemperatur folgte die langsame venöse Stauung mit gleichzeitiger Flussreduktion als sogenannter „Abgang von der HLM“ und das Ende des cardiopulmonalen Bypasses war erreicht.
Der Perfusionsdruck (MAD) und die Füllungsdrücke wie ZVD und PA lagen im physiologischen Bereich und zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen:
Die Werte für das Hämoglobin verliefen in den Gruppen ebenfalls sehr ähnlich in einem Bereich von 8 g/dl bis 12 g/dl, das Hämatokrit-Werten von 25-40 % entsprach.
Die pH-Werte lagen in allen Gruppen vor KSTH im Normbereich bei 7,4 ± 0.05, nach KSTH in einem Bereich zwischen 7,21 und 7,5. Die niedrigsten Werte mit 7,21 bzw. 7,22 entstanden nach dem KSTH in der Reperfusionsphase. Diese pH-Werte erreichten weiteren Verlauf nach 1-2 Std. postoperativ wieder den Normbereich.
Die Partialdrücke für Sauerstoff (PO2) unterschieden sich zwischen den einzelnen Gruppen und lagen in einem Bereich von 180 bis 326 mmHg. Durch die intensivierte Beatmung wurde der postoperativ erhöhte Sauerstoffbedarf gewährleistet und es gab in den durchgeführten Blutgasanalysen keinen Anhalt für ein vermindertes Angebot an Sauerstoff im arteriellen Blut. Die gemessenen Werte waren vergleichbar mit denen, die auch im klinischen Einsatz beobachtet werden. Die Werte für z.B. PO2 etc. liegen insgesamt höher als der physiologische Bereich ohne eine derartige Operation.
Die präoperativen Werte waren in allen Gruppen mit ca. 0,8 mmol/l gleich. Nach KSTH lagen die Calcium-Werte nur in der intrathekalen Steroidgruppe mit 0,48 mmol/l gegenüber 0,85 mmol/l in den beiden anderen Gruppen deutlich niedriger. Postoperativ stiegen die Werte in allen Gruppen unterschiedlich an, wobei in der systemischen MP Gruppe die deutlichste Zunahme beobachtet werden konnte. In der postoperativen Phase wurde durch die systemische MP Gruppe eine Maximum von ca. 1,3 mmol/l nach 2-4 Std. erreicht. Die Calciumwerte in der intrathekale MP Gruppe blieben postoperativ jederzeit signifikant niedriger als in den beiden anderen Gruppen. Im späten postoperativen Verlauf kam es dann wieder zu einer langsamen Angleichung aller Gruppen auf Werte im Bereich von 0,8 und 1,2 mmol/l, jedoch blieben die Werte in der systemischen MP Gruppe auch nach 6 Std. weiterhin erhöht.
Der Calciumstoffwechsel ist für eine Ischämie-Reperfusion von Bedeutung. Betrachtet man die Calciumwerte, so ergaben sich bei gleichen präoperativen Werten deutliche Unterschiede in der postoperativen Phase nach KSTH, wobei die intrathekal behandelten Tiere im arteriellen und zerebralvenösen Blut signifikant niedrigere Werte (p=0.02) aufwiesen, als die Kontroll- und systemisch behandelte Steroidgruppe.
Präoperativ lagen die Werte für Natrium, Kalium und Calcium im Normbereich. Auch im weiteren Verlauf der Untersuchung zeigten die Werte keinen signifikanten Unterschied. Die Kaliumwerte zeigten einen Unterschied, so waren in der intrathekalen Steroidgruppe nach KSTH Kalium mit 3.95 mmol/l niedriger, verglichen mit >5 mmol/l in den beiden anderen Gruppen. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant.
Die Messung der Blutzuckerwerte ergaben signifikante Abweichungen zwischen den Gruppen. Nach Beginn des cardiopulmonalen Bypasses kam es zu einem Anstieg der Blutzucker-Werte in allen Gruppen von circa 100 mg/dl auf Werte um ca. 200 mg/dl. Dieser Anstieg war wahrscheinlich durch das Maschinen-Priming und die Blutkonserven bedingt.
Nach 120 Minuten KSTH zeigte sich dann aber in beiden Steroidgruppen gegenüber den präoperativen Werten eine deutlich Erhöhung der Blutzuckerwerte, wobei unter systemischen MP Gabe signifikant höhere Werte erreicht wurden als durch intrathekale MP Applikation. Die Kontrollgruppe zeigte nur geringe Änderungen der BZ-Werte. Während sich in der intrathekalen Gruppe die Glucosewerte im weiteren
Die entstandene Hyperglykämie scheint im Rahmen einer Steroidgabe abhängig von der Applikationsart zu sein, und nach KSTH nur bei einer systemischen Verabreichung des Methylprednisolons signifikant höhere Werte aufzuweisen.
Der Einfluss der systemischen Applikation des Methylprednisolons (Systemisch MP) führte nicht zu dem erwünschten neuroprotektiven Effekt. Durch die systemische MP-Gabe zeigte sich keinerlei Verbesserungen des neuronalen Schädigungsmusters. Im Gegenteil kam es zu einer Zunahme der neuronalen Nekrose im Hippocampus im CA 4 auf einen prozentualen Wert von 85,4 ± 8,48 %. Die Kontrolltiere wiesen ca. 77 % Nekrose auf. Im CA 1 kam es unter der systemischen Steroidgabe auch zu einer Zunahme der nekrotischen Neurone von ca. 40 % (Kontrollgruppe) auf 65 %.
Obwohl in der morphologischen Untersuchung das perivaskuläre Ödem subjektiv etwas milder ausfiel, kam es doch zu einem deutlichen perineuralem Ödem bei den betroffenen nekrotischen Zellen.
Somit konnte durch eine Behandlung mit intrathekalen und nicht mit systemischen Steroiden eine signifikante Verbesserung des Schädigungsmusters im Hippocampus erreicht werden. Der Fokus der Schädigung lag bei der Kontrollgruppe und der systemischen MP-Gruppe in den Sektoren CA 4 des Hippocampus.
Der Einfluss der Steroide führte neben dem oben genannten Einfluss auf die Nervenzellnekrose zusätzlich zu einer Zunahme apoptotischer Zellenveränderungen im Hippocampus. Die apoptotischen Neurone unterschieden sich von den nekrotischen N. deutlich durch ihre typischen Kernveränderungen und die Kondensation des Chromatin`s bei intaktem Zytoplasma. Zusätzlich zeigten diese Zellen eine verstärkte Eosinophilie. Der Fokus der apoptotische Nervenzellveränderungen lag im Gyrus dentatus der Hippocampus-Formation. Der Anteil apoptotischer Zellveränderungen war dort in der Kontrollgruppe ohne den Einfluss einer Steroidbehandlung mit 8.6 ± 3.4 % aller Zellen relativ niedrig.
Unter dem Einfluss der systemischen Steroidintervention kam es zu einer signifikanten Zunahme der apoptotischen Veränderungen. Wobei der Anteil apoptotischer Neuronen an der Gesamtzahl der Neurone im Gyrus dentatus nach systemischer Gabe von Methylprednisolon auf 28 ±7 % und nach intrathekaler Gabe auf 20 ±3 % zunahmen. Das Auftreten apoptotischen Zellveränderungen stellte somit eine sehr wichtige „Nebenwirkung“ der Steroidtherapie dar und wurde einer differenzierten Analyse unterzogen.
Die Apoptose wurde anhand einer spezifische TUNEL-Färbung und im Semidünnschnitt morphologisch, die Abbildungen 4.17 und 4.18 zeigen die Ergebnisse der selektiven Anfärbung im Gyrus dentatus.
Die Zunahme apoptotischer Nervenzellveränderungen im Hippocampus kann sicher nicht im Sinne eine neuroprotektiven Strategie gewertet werden. Die Form der Steroidapplikation scheint aber einen entscheidenden Einfluss auf das Schädigungsmuster nach KSTH von 120 Minuten im Hippocampus zu haben.
Stellvertretend für den parietalen Neocortex wurden die Neurone des Windungstals im Gyrus cinguli für normale, nekrotische und apoptotische Zellveränderungen quantifiziert.
Die morphologische Einteilung des GC beruht auf einer Schichtung der Neurone nach Größe und Funktion. Dabei beginnt außen die Schicht I und nach innen folgen fortlaufend die Schichten II bis V. In der Schicht II und V sind die Neurone am größten und es zeigte sich, dass in diesen Schichten mehr nekrotische Neurone vorlagen. Dabei könnte ein Zusammenhang zwischen Neuronengröße und der Empfindlichkeit gegenüber einer Hypoxie bestehen.
Das Ausmaß der Schädigung lag bei der Kontrollgruppe mit einem errechneten Mittelwert von mit 65 ± 25 % aller gezählten Neurone relativ hoch. In der systemischen Steroidgruppe bot sich ein ähnliches Ausmaß der Schädigung mit einem Mittelwert von 61 ±15 % neuronaler Nekrose. Die Intervention mit systemischen Steroiden zeigte somit keine Verbesserung der nekrotischen Schädigung im Neocortex. Im Gegensatz dazu lag in der intrathekalen Steroidgruppe der Mittelwert bei 30 ± 7 % und der Anteil nekrotischer Veränderungen fiel somit signifikant niedriger aus, als in den beiden anderen Gruppen (p=0.026).
Im Neocortex konnte ein protektiver Einfluss der Steroide bei intrathekaler Gabe und nicht bei systemischer Gabe erzielt werden. Die Kontrollgruppe und die systemische behandelte MP Gruppe zeigten einen sehr ähnlichen Anteil nekrotischer Veränderungen im Gyrus cinguli, einzig durch die intrathekale Behandlung mit MP konnte ein signifikant neuroprotektiver Effekt erzielt werden.
Vereinzelt traten nach der Steroidbehandlung auch apoptotische Veränderungen im Gyrus cinguli auf, der Anteil lag bei ca. 10 % der Neuronen. Vor allem die kleineren Neurone waren apoptotisch verändert, aber es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Steroidgruppen beobachtet werden. Eine Quantifizierung wurde nicht durchgeführt. Zusätzlich konnte im Windungstal des Gyrus einige Apoptosen der Oligendrogliazellen beobachtet werden. Da es sich um einzelne Befunde handelte, wurde auf eine ausführliche Darstellung hier verzichtet.
In den Stammganglien zeigte sich eher eine lokalisierte Schädigung in einigen Kerngebieten. Die Schädigung im Nucleus caudatus war nicht so ausgeprägt und mit 30-40 % in allen Versuchsgruppen sehr ähnlich war. Hierin bestand eine Abweichung von anderen Studien, in denen der Anteil der Schädigung im Ncl. Caudatus wesentlich höher lag 98 . Bei allen Tieren waren deutlich stärker die dem Hirnventrikelsystem zugewandten Bereich betroffen. Es zeichnete sich hier eine lokalisierte Schädigung in Nähe des Liquor cerebrospinalis ab, welche in einem Zusammenhang mit metabolischen oder perfusionsbedingten Veränderungen des Liquorraumes stehen könnte. Da zwischen den Gruppen kein signifikanter Unterschied bestand, wurden die Veränderungen in diesem Bereich nicht so ausführlich diskutiert.
Bei der Analyse des Kleinhirns wurden vor allem die Veränderungen der größten Zellen des Kleinhirns, nämlich die oberhalb der Körnerzellschicht liegenden Purkinje-Zellen, beurteilt. Dabei wurden mittels Gitterplatte jeweils 150±15 Zellen gezählt und auf nekrotische oder apoptotische Zellveränderungen hin beurteilt. Zellen mit Eosinophilie, Kernpyknose oder genereller Zellschrumpfung wurden als nekrotisch gewertet. Es zeigte sich ein sehr hoher Anteil nekrotischer Neurone mit 70 ± 17% bei den Kontrolltieren und mit 79 ± 9% ein etwas höherer Anteil in der Gruppe des systemischen MP. Die Purkinje-Zellen waren in beiden Gruppen durch Kernpyknose, Eosinophilie und Zellschrumpfung verändert. Die Nekrose der Purkinje-Zellen war in der intrathekalen Steroidgruppe mit einem mittleren Wert von 43±12 % signifikant geringer als in den anderen beiden Gruppen. Durch die intrathekale Intervention konnte somit ein neuroprotektiver Einfluss auf die Nekroseentstehung der Purkinje-Zellen im Kleinhirn erreicht werden.
Auch in den Kerngebieten des Kleinhirns zeigten sich Nekrosen der Neuronen. Es konnte aber kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden. Aufgrund der Größe der Neurone schienen sich nekrotische Veränderungen in allen Gruppen darzustellen. Die Steroidgabe scheint keinerlei Einfluss auf das Schädigungsmuster im Kleinhirn zu haben.
Die Bestimmung der Expression des Hitze-Schock-Proteins 70 im frontalen Kortex ergab einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen. Die Expression bei den Tieren ohne CPB oder KSTH (Sham) wurden auf den Wert eins gesetzt und die Abweichung der Expression von HSP 70 in den Versuchstieren in Relation dazu gesetzt. Durch KSTH kam es zu einer Erhöhung der Expression für das HSP 70 in allen Gruppen, die höchsten Werte wurden in der intrathekalen Gruppe verzeichnet. Die intrathekale Steroidintervention führte zu einer signifikanten Zunahme der Expression von HSP 70 gegenüber der Kontrollgruppe und der systemisch behandelten Steroidgruppe. Die systemische Steroidbehandlung führte auch zu einer erhöhten Expression des HSP 70, der Unterschied war jedoch nicht signifikant.
Bei der Messung der Expression der pro-apoptotischen Gene Bak und FAS konnte ein signifikanter Unterschied ermittelt werden. Gegenüber den Tieren ohne jegliche Operation mit Herz-Lungen-Maschine oder KSTH zeigte sich ein signifikante Zunahme der Expression beider Gene (p=0.01). Gegenüber der Kontrollgruppe konnte ein signifikante Zunahme der Expression nur für das intrazelluläre Gen Bak beobachtet werden. Die Expression des extrazellulären FAS-Genes war in der Kontrollgruppe nicht signifikant erhöht. Unter der Steroidintervention kam es dann sowohl zu einer vermehrten Expression für intrazelluläre Stimuli (Bak) als auch extrazelluläre Stimuli (FAS) der Apoptose. Dieses könnte eine molekulare Grundlage für die Induktion der morphologisch sichtbaren neuronalen Apoptose durch eine Steroidbehandlung zu sein. Dabei scheint auch die Applikationsart der Steroide eine Rolle zu spielen, denn die Expression von Bak und FAS war in der systemischen MP Gruppe am höchsten.
Die Expression des Bcl-xL Gens aus der Familie der anti-apoptotischen Bcl-2-Gruppe zeigte sehr ähnliche Werte für die Tiere ohne KSTH und für die Kontrollgruppe mit CPB und 120 Minuten KSTH. Zu einer Erhöhung der Genexpression für Bcl-xL kam es durch die Intervention mit Steroiden, wobei nur in der intrathekalen Gruppe ein signifikanter Unterschied gegenüber der Kontrollgruppe entstand (p=0.03). Ermittelt wurden die Werte mittels Realtime-PCR, die Expression in den Tieren ohne KSTH diente zur Ermittlung der normalen Expression und wurde auf eins festgesetzt.
In der vorliegenden experimentellen Arbeit konnte demonstriert werden, dass im Zusammenhang mit Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie und CPB eine morphologisch sichtbare Schädigung auf zerebraler Ebene reproduzierbar ist. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass es bei der chirurgischen Korrektur angeborener Herzfehler im Neugeborenen- und Kleinkindalter auch unter systemischer Hypothermie es bei einer verlängerten Kreislaufstillstandszeit zu einer Beeinträchtigung der zerebralen Funktion kommen kann, mit daraus resultierender morphologischer Schädigung. Die Inzidenz dieser zerebralen Veränderungen beeinflusst wiederum entscheidend die spätere kognitive Leistung und psychomotorische Entwicklung der operierten Kinder 1;8.
Es besteht somit die Notwendigkeit die zugrundeliegenden Pathomechanismen der zerebralen Alterationen aufzudecken und entsprechende Strategien zum Schutz des Gehirns zu entwickeln. Diese Arbeit sollte der Beschreibung der morphologischen Veränderungen im Gehirn nach verlängertem hypothermen Kreislaufstillstand von 120 Minuten dienen. Anhand des detektierten Schädigungsmusters sollte in einem zweiten Schritt der Einfluss einer Behandlung mit Methylprednisolon auf die Prävention einer neuronalen Schädigung quantitativ überprüft werden. Zu diesem Zweck wurde ein neonatales Tiermodell entworfen, welches die Gegebenheiten in der Klinik möglichst realitätsgetreu wiederspiegelt. Die Ergebnissen bei verlängertem KSTH sollten dann auch Ansätze bilden für eine zerebrale Protektion bei wesentlich kürzeren Kreislaufstillstandszeiten.
Orientiert wurde sich beim Entwurf des Studiendesigns aber auch an anderen experimentelle Studien. Kreislaufstillstandszeiten von 90 bis 120 Minuten wurden in einigen experimentellen Studien zur Erforschung der zerebralen Veränderungen angewendet 152;160;161. Aber auch im klinischen Alltag können bei sehr komplexen Operationen, wie z.B. bei der Korrektur des hypoplastischen Linksherzsyndroms, Kreislaufstillstandszeiten von 60 bis zu 80 Minuten durchaus notwendig sein. Insgesamt konnte mit diesem Modell aber erst einmal gezeigt werden, dass eine Erhebung eines organspezifischer Schädigungsmuster nach KSTH und die Evaluation einer neuroprotektiven Intervention gut möglich ist 116. Bisher haben nur Kurth und Fessatidis et al. ein neonatales Modell zur Erforschung der zerebralen Veränderungen im Zusammenhang mit CPB und KSTH mit anschließender morphologischer Analyse des ZNS etablieren können 21;87.
Steroide und speziell das Methylprednisolon werden schon seit 1966 in der Herzchirurgie eingesetzt, ursprünglich mit dem Ziel eine reaktive Vasokonstriktion und eine kardiale Dysfunktion nach CPB zu beeinflussen 124;125. Ein protektiver Einfluss von Methylprednisolon auf das Herz wurde bei anoxischem Herzstillstand beschrieben, wobei die Vorbehandlung mit MP zur Vermeidung einer pathologischen Kontraktur des Herzmuskels nach elektromechanisch ausgelöstem Herzstillstand führte 162.
Aber die Kontroverse über einen neuroprotektiven Effekt durch Reduktion der inflammatorischen Antwort durch Steroidgabe bestand weiter durch die vor allem gegensätzliche Ergebnisse aus klinischen Studien. Dabei beschrieb Andersen et al z.B. in einer klinischen Studie zwar eine Reduktion der Komplement-Aktivierung während CPB unter einmaliger intravenöser „high-dose“ Steroidtherapie, es fehlte jedoch ein signifikanter Unterschied im Outcome der Patienten 137. Boscoe et al. zeigten, dass weder Steroide noch pulsatiler HLM-Fluß die Komplement-Aktivierung unter CPB beeinflussen 138. Karlstadt et al. untersuchten den Einfluss der Steroide auf eine Endotoxin-Entstehung während CPB und stellten fest, dass Methylprednisolon die Entstehung des Plasma-Endotoxin nicht beeinflusst 139.
Ebenfalls konnte durch die Steroidbehandlung in anderen experimentellen neurologischen Studien eine Verminderung exzitatorischer Aminosäuren nach zerebraler Ischämie beobachtet werden 20;122;128;133. Zusätzlich konnte in einigen Studien auch ein antioxidaktiver Effekt durch die Steroide beschrieben werden 121;130. Und Simard et al konnten auch einen protektiven Einfluss des Methylprednisolon auf die Astrozyten nach zerebraler Ischämie nachweisen 166. Dabei scheint MP die astrozytäre Calcium-Homöostase zu stabilisieren, und damit eine astrozytäre Dysfunktion mit einem Anstieg des für die Neuronen toxischen extrazellulären Calcium’s zu verhindern 166.
In den meisten klinischen und auch experimentellen Studien fehlen jedoch vor allem ausführliche morphologische Untersuchungen, um eine neuroprotektive Wirkung durch die Applikation der Steroide wirklich beweisen zu können. Um einen neuroprotektiven Effekt der systemischen Steroidgabe wirklich nach
Die Vorbehandlung mit Steroiden mit einer „high-dose“ intravenösen MP-Gabe von 30 mg/kg vor einem ischämischen Ereignis, wie z.B. Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH), wird diskutiert 22;172;173. Nach der Vorbehandlung mit Steroiden und nach 100 Min. KSTH zeigte sich in einer Studie eine deutliche Reduktion des Körperödems, eine Verbesserung der vaskulären Funktion und eine Reduktion apoptotischer Zellveränderungen im ZNS 22. Jedoch zog diese Studie keinen Vergleich zu Tieren ohne Steroidapplikation und es fand nur eine immunhistochemische Analyse mit Anfärbung des „transforming growth factor-ß1“ (TGF-ß1) und des Apoptose-Markes Caspase-3 statt. Auf eine ausführliche quantitative regionale Analyse der neuronalen Veränderungen wurde verzichtet.
Ebenso berichtete eine Arbeitsgruppe der Duke-Universität von einer Reduktion der Immunantwort nach der Vorbehandlung mit hochdosierten Steroiden 8 Stunden vor dem CPB, verglichen mit der herkömmlichen intraoperativen Applikation in der Primeflüssigkeit des CPB 136. Die präoperative Applikation führte zur einer verbesserten Lungenfunktion durch verminderte pulmonale Wasserakkumulation: eine ähnliche Wirkung konnte auch im Gehirn durch Reduktion des perivaskulären Ödems und Verbesserung der zerebralen Hämostase aufgrund dieser Ergebnisse vermutet werden.
Auch die Ergebnisse einer Studie von Langley et al., welche den Einfluss einer Vorbehandlung mit hochdosiertem Methylprednisolon auf den zerebralen Blutfluss und die Oxygenation nach 60 Minuten KSTH untersuchten, fanden eine statistisch signifikante Erhöhung der regionalen zerebralen Perfusion nach CPB und KSTH. Auch hierbei fehlte jedoch eine histologische Evaluation post mortem, sowie weiterführende neuropsychologische Untersuchungen, die notwendig wären, um wirklich einen neuroprotektiven Effekt beschreiben und quantifizieren zu können 20. Die Veränderungen der zerebralen Perfusion und Oxygenation so kurz nach KSTH, stellen jedoch eher eine physiologische Variationen mit zugrundeliegender Kopplung aus Metabolismus und Perfusion dar, als ein Anzeichen für das Vorliegen einer signifikanten Organprotektion 17;135.
Chaney et al. stellte nach Methylprednisolongabe eine Verschlechterung der Hämodynamik und des Outcome nach während CBP fest 174. Auf eventuelle Nebenwirkungen einer Steroidtherapie vor allem im Neugeborenen– und Kleinkindesalter weisen aktuelle klinische Studien hin. Gerade durch eine postnatalen Steroidapplikation zur Behandlung einer Lungenunreife, konnten Störungen der neurologischen Entwicklung und des Verhaltens beobachtet werden 140.
Die Gruppen unterschieden sich nicht signifikant in ihren allgemeinen Parametern wie Gewicht, Alter oder Größe. Die relativ kleinen Versuchsgruppen waren bedingt durch die äußerst komplizierte Durchführung der Versuche und es wurde daher auch aufgrund strenger Kriterien eine große Anzahl von Tieren
Um einen neuroprotektiven Effekt überprüfen zu können war es notwendig, die zerebralen Veränderungen nach Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) und CPB zu beschreiben. Das Schädigungsmuster nach 120 Minuten KSTH ohne jegliche protektive Intervention bestand aus deutlichen und quantifizierbaren morphologischen Veränderungen auf astroglialer und neuronaler Ebene, mit einem regional unterschiedlichen Verteilungsmuster in den einzelnen Hirnbereichen. Die Ausprägung und die Genese von astroglialer Zellschädigung, sowie Nekrose und auch Apoptose der Neuronen ist sicherlich multifaktoriell bedingt und steht vorwiegend im Zusammenhang mit dem verlängertem Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie.
Für die Manifestation der morphologischen Veränderungen im Sinne neuronaler Nekrose und Apoptose waren bei dieser experimentellen Untersuchung das Erreichen einer postoperativen Überlebenszeit von 6 Stunden wichtig. Kurth et al. zeigte in seinen Untersuchungen ein Maximum der sichtbaren morphologischen nekrotischen und apoptotischen Veränderungen nach 6 postoperativen Stunden, wobei er nach 90 Minuten KSTH morphologische Untersuchungen mit unterschiedlichen postoperativen Zeitintervallen von 6 Stunden, 2 Tagen und 1 Woche durchführte 88.
Sicherlich wären bei noch längerem postoperativen Überlebenszeitfenster eventuell noch weitere Veränderungen zu erwarten gewesen, wie reaktive Veränderungen mit Gliose und zusätzliche immunologische Reaktionen. Wegen des komplexen Versuchsaufbaus war ein Aufwachen der Tiere und eine Entwöhnung so kurze Zeit nach dem Eingriff nicht möglich. Für ein weiteres Überleben der Tiere über 6 Stunden hinaus wäre weiterhin eine intensivmedizinische Überwachung mit Beatmung und ein komplettes intensivmedizinisches Monitoring erforderlich gewesen. Bei einer längeren postoperativen Überlebenszeit können auch zusätzliche Komplikationen unabhängig vom Versuchsaufbau, wie Blutungen, Infektionen, metabolische Störungen und hämodynamische Störungen, auftreten.
Wichtig zu erwähnen ist, dass die Dauer des KSTH einen signifikanten Einfluss auf die Entstehung und das Ausmaß der Neuronenveränderungen zu haben scheint. So stellten Fessatidis et al. schon nach 45 Minuten eine Zellschädigung in Form einer neuronale Nekrose fest, während Kin et al. diese erst nach 90 Minuten beobachteten 94;95. Einen sehr großen Einfluss scheint aber auch das Perfusionsprotokoll zu haben, wobei während eines „full-flow“-CPB eine Ischämie nicht zu erwarten ist.
Im Rahmen der Versuche konnte gezeigt werden, dass nach KSTH nicht nur die Schädigung der Neuronen im ZNS eine wesentliche Rolle spielt, sondern auch die Veränderungen der Astrogliazellen, welche einen sehr wesentlichen Bestandteil aller Zellen im ZNS darstellen.
In den von uns durchgeführten Vorversuchen am Kaninchen und am Ferkel konnten wir nach 60 Minuten KSTH kaum ischämische Veränderungen der Neuronen feststellen 17. Dagegen lag eine deutliche primäre Schädigung auf Ebene der Gliazellen. Diese Veränderungen der Gliazellen konnten aber auch nach 120 Minuten KSTH beobachtet werden, zusätzlich zeigten sich aber dann auch die neuronalen Veränderungen.
Die Veränderungen der Astrozyten sind durch eine zelluläre Schwellung gekennzeichnet. Aus dieser Schwellung resultiert sicherlich ein Funktionsverlust. Die Gliazellen zeigen topographisch eine enge Beziehung zu den kleinen Gefäßen des ZNS. Sie umgeben die Gefäße mit ihren Fortsätzen und bilden einen sehr wesentlichen Bestandteil der Blut-Hirn-Schranke 175. Darüber gewähren sie die nutritive Funktion für die Neuronen und schützen die Neuronen durch die Metabolisierung von extrazellulären Glutamat und anderen Neurotransmittern vor einer excitotoxischen Schädigung 176;177.
In vitro konnte eine astrozytäre Schwellung in Versuchen mit Zellkulturen durch Hypothermie, Hypoglykämie und Azidose hervorgerufen werden 175;178-180. Es konnten dabei komplexe Zusammenhänge zwischen der Störung des Glutamat-Metabolismus der Astrozyten während Hypothermie und einer astroglialen Schwellung nachgewiesen werden 176;180. Als Ursache der astroglialen Schwellung können somit Glutamat-Toxizität und Ionen-Imbalance angeführt werden, welche zu Veränderungen im Membranpotential der Astrozyten und einer resultierenden Schwellung führte 180-182. Die astrogliale Schwellung während
Nach 120 min. KSTH zeigte sich eine deutliche astrozytäre perivaskuläre Ödembildung, welche möglicherweise ebenfalls sekundär mit einer Verschlechterung des Neuronenstoffwechsel verbunden ist 17. Die Bestimmungen spezifischer astroglialer Proteine wie des Protein S100B in Serum und Liquor können auf morphologische und funktionale Alterationen der Astrogliazellen hinweisen 48. Die Ergebnisse der Bestimmung des astroglialen Proteins S100B bei KSTH wurden bereits publiziert 17.
Die Ergebnisse unserer experimentellen Untersuchung ergaben, dass ein verlängerter KSTH von 120 Minuten zu der Entstehung von Nekrose und auch Apoptose der Neuronen im ZNS mit einer regional unterschiedlichen Ausprägung führt. Bei der genauen Betrachtung der einzelnen Hirnregionen zeigte sich ein deutlicher Fokus der Schädigung im Bereich des Hippocampus, des Kleinhirns und des Neokortex, bei geringer ausgeprägten Veränderungen in den Stammganglien und den anderen Bereichen des ZNS. Es zeigte sich damit eine Abweichung gegenüber früheren Studien mit KSTH und einer morphologischen Analyse des ZNS 94;99. Während bei den anderen Studiengruppen der Fokus der Schädigung vorwiegend im Sektor CA 1 lokalisiert war, zeigten die neuronalen Zellveränderungen in unserer Studie eine regional unterschiedliche Ausprägung. Der Hippocampus war in unserer Studie betroffen mit den Abschnitten CA 1-4 und Gyrus dentatus. Somit konnten in unserer Studie sehr ähnliche Ergebnisse erzielt werden, wie in der Studie von Kurth et al 88. Nur wenige experimentelle Studien führten eine regionale morphologische Untersuchung des Gehirns nach KSTH durch. Die meisten Studien begnügten sich jedoch dabei auch mit nur der Erhebung eines „Scores“ und somit einer semiquantitativen Auswertung 58;183-185.
Der Hippocampus bildet als Teile des limbischen Systems die Grundlage der kognitiven Kombinationsanwendung und des Langzeitlernens. Er bietet ein gutes Beispiel dafür, wie Neuronen abhängig von ihrer funktionaler und regionaler Zugehörigkeit eine unterschiedliche Reaktion auf eine Ischämie-Reperfusion zeigen können 88;186. Die Neuronen des Gyrus dentatus zeigten nach KSTH von 120 Minuten vor allem einen Zelluntergang in Form eines programmierten Zelltodes (Apoptose), wobei ca. 10 % der Neuronen verändert waren. Die Neurone des CA 1– CA 4 wiesen eine Zellschädigung in Form von Nekrose auf mit teilweise 70 % Anteil geschädigter Neurone. Über die Ursache der unterschiedlichen regionalen Manifestationen der Schädigung im Gehirn kann nur spekuliert werden. Funktionale und auch strukturelle Unterschiede der einzelnen Neuronengruppen im Hippocampus könnten, was in der Literatur als „selektive Vulnerabilität“ angegeben wird, für die unterschiedlichen Zellveränderungen verantwortlich sein 118;186;187. Die Analyse des Hippocampus für nekrotische Neuronenveränderungen, als Ort der „selektiven Vulnerabiliät“ nach Ischämie ist sehr gängig, doch in vielen Studien wurden meist nur das CA1 und nicht auch die anderen Bereiche CA 2 – CA 4 untersucht 94;186;188. Ein nekrotischer Zelltod kommt gegenüber einem kontrollierten und morphologisch abgrenzbaren apoptotischen Zelltod durch eine fulminante Störung der
Die in unserer Untersuchung dokumentierten neuronalen Veränderungen geben einen Hinweis darüber, dass es trotz einer erwiesenen neuroprotektiven Wirkung durch die Hypothermie, bei längeren Stillstandzeiten größer 60 Minuten zu einer möglichen Limitation der protektiven Wirkung kommen kann. Daraus resultiert ein Schädigungsmuster in Form neuronaler Nekrose und Apoptose.
Im Kortexbereich gab es ebenfalls eine unterschiedliche Verteilung für die vor allem nekrotischen Neuronenveränderungen, welche sich als abhängig von der Zugehörigkeit zu den einzelnen Schichten und der Neuronengröße zeigte. Je größer die Neuronen waren, desto mehr Schädigung zeigten sie. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von anderen Studien berichtet, wobei in der Studie von Kurth et al. erstmals die apoptotischen Veränderungen im Vordergrund standen 88;192 .
Im Kleinhirn dominierten die nekrotischen Veränderungen der großen Purkinje-Zellen. Es zeigte sich eine deutliche Schädigung mit teilweise 70 – 80 % nekrotischer Zellen. Das Kleinhirn wurde in anderen Studien mit KSTH selten betrachtet. Ein so hoher Anteil der hypoxisch-ischämischen Veränderungen wurde in Studien mit normothermer Ischämie beschrieben 188. In der Studie von Kurth et al. zeigten sich ebenfalls nekrotische Veränderungen im Kleinhirn, jedoch war der Anteil der Schädigung mit ca. 25 % geringer 88.
Die Veränderungen im Bereich der Stammganglien waren durch eine moderate Schädigung geprägt und unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Gruppen. Diese Ergebnisse decken sich gut mit denen anderer Studien, in denen die Stammganglien keine wesentliche neuronale Schädigung aufwiesen 88;192.
Der Bergriff Apoptose stammt aus dem griechischen und bedeutet :„Herabfallen der Blätter im Herbst“. Er wurde durch Kerr und seine Mitarbeiter eingeführt. Sie beschrieben damit neben der Nekrose als passive Form die aktive Form des Zellunterganges 105. Im Gegensatz zur Nekrose ist die Apoptose ein energieabhängiger Prozess des Zellunterganges, welcher während der embryonalen Entwicklung und in dem sich regenerierendem Gewebe physiologisch vorkommt 193. Morphologisch zeichnet sich die Apoptose durch Kernfragmentation, Zellschrumpfung und Bildung „apoptotischen Körperchen“ bei initialem Erhalt der Zellorganellen und der Zellmembran aus 100. Der apoptotische Zelltod wird auch „programmierter“ Zelltod genannt. Er wird durch eine mitochondriale Dysfunktion und durch Freisetzung von Cytochrom C als „Apoptose-induzierendem Faktor“ aus den Mitochondrien getriggert 112;189. Sind die Mitochondrien nach einer Ischämie-Reperfusion einer Akkumulation von intrazellulären Calcium oder Sauerstoffradikalen ausgesetzt, öffnen sich in der mitochondriale Membran die „Ca++Poren“ („mitochondrial permeability
Aber im Rahmen einer Ischämie-Reperfusion können auch externe Stimuli wie TNF, lösliches Fas, toxische Produkte, Perioxide, Sauerstoffradikale oder NO via Rezeptoren in der Zellmembran zu einer Aktivierung des intrazellulären Caspase-Systems führen 59;114.
Das Auftreten apoptotischer Veränderungen im Hippocampus nach Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie wurde erst in neueren Studien von Kurth und Cooper et al. beschrieben 83;88.
Unsere Ergebnisse sind somit übereinstimmend mit den Ergebnissen von Kurth et al. 88. Die Apoptose als aktive und energieabhängige Form des Zellunterganges trat ohne Steroidbehandlung nur regionalspezifisch im Gyrus dentatus des Hippocampus auf und lag im Durchschnitt bei 9 % der Neuronen. Die Unreife der Zellen im Hippocampus könnten diese spezifische Veränderung und die regionalen Unterschiede bedingen 88.
Es wurde eine Vorbehandlung mit „high-dose“ Methylprednisolon 4-6 Std. intravenöse und intrathekal präoperativ durchgeführt, um eine mögliche molekulare Induktion spezifischer Steroide induzierter Mechanismen hervorzurufen. Die Vorbehandlung vor dem eigentlichen ischämischen Ereignis sollte eine verbesserte Zellprotektion bewirken. Nach intravenöser Gabe von MP wird die Maximalkonzentration im Organgewebe erst nach 1 bis 2 Stunden erreicht, wodurch eine Gabe während des CPB zu spät sein könnte, um eine wirksame Zellprotektion zu erzielen 22;53. Dabei ist zu beachten, dass Thompson et al. ein Absinken der Steroidkonzentration im Blut 4 Stunden nach intravenöser Applikation beschrieben hat und somit die Wirkungsdauer begrenzt zu sein scheint 136;197. Dieses könnte eine Einschränkung der Vorbehandlung bedeuten und eine weitere Gabe im Rahmen der Reperfusion könnte postuliert werden. Bisher hat jedoch keine Untersuchung zur Evaluation der Pharmakokinetik unter CPB und der unterschiedlichen Applikationsarten stattgefunden und der Einsatz der Steroide im Sinne der Neuroprotektion bleibt weiter ungeklärt.
Die intrathekale MP-Gabe wurde präoperativ ebenfalls einmalig durchgeführt, sie diente der Überprüfung einer von der Permeation über die Blut-Hirn-Schranke unabhängigen Wirkung des MP im ZNS. Bei intrathekaler Gabe gilt eine deutlich höhere Konzentration verglichen mit intravenöser Gabe als wahrscheinlich, wie Untersuchungen beim Schwein zeigen konnten 202. Die Verträglichkeit der intrathekalen Applikation wird auch in der Literatur als unbedenklich angesehen 203. Einzig durch die Nebensubstanzen wie Polyäthylenglykol wurde einmalig eine Nebenwirkung mit Arachnoiditis beschrieben 204. Die Halbwertszeit für Steroide im Liquorraum ist relativ kurz, für Dexamethason liegt sie nach Angaben bei 2,2 Std 205. Ein Übertritt des MP aus dem Liquor in das Hirngewebe wurde durch Lehrer et al. dokumentiert, wobei das MP vorwiegend in der weißen Substanz nachgewiesen werden konnte 206. Die Fähigkeit zur Passage oder Permeation von MP über die Blut-Hirn-Schranke zeigt eine entscheidende Rolle für die neuroprotektive Wirkung des Methylprednisolons (MP) zu spielen, ist aber weiter ungewiss. Chen et al. veröffentlichten eine Studie bei der sie zeigten, dass MP sich an die Gehirnkapillaren bindet und dann in einem sehr langsamen aktiven sättigbaren Transport die Blut-Hirn-Schranke (BHS) passieren kann, welcher im Zusammenhang mit dem zytoplasmatischen Glukokortikoidrezeptor steht 207.
Aufgrund der Blut-Liquor-Schranke für eiweißgebundene Substanzen, zu denen auch das MP zählt, können nach einer Studie von Uete et al. bei systemischer Applikation im Liquor nur etwa 1/10 der Serumspiegel erreicht werden 208. Die lumbale Applikation erreicht somit deutlich höhere Konzentrationen im Liquor. Die Konzentration im kranialen Anteil der Liquorräume bei lumbaler Applikation ist jedoch weiter unklar 209. Es werden jedoch höchstwahrscheinlich deutlich höhere Konzentrationen erreicht, als bei systemischer Applikation. Trotzdem werden aber lipidlösliche Steroide mit dem Ziel entworfen, eine bessere Passage in das ZNS zu erreichen. Die Permeabilität der Steroide über die BHS bleibt ungeklärt, eine zelluläre Wirkung des MP auf die Neuronen kann nicht sicher nachgewiesen werden. Vielleicht erklärt die nur geringe Permeation in das ZNS die fehlende neuroprotektive Wirkung 171;202;207.
Eine Studie von Abram et al. untersuchte den Effekt einer intrathekalen Steroidgabe und den Einfluss eines lumbalen Dauerkatheters für eine intrathekale Applikation. Dabei konnten sie keinen direkt neurotoxischen Effekt einer intrathekalen Steroidgabe feststellen 203. Auch in dieser Studie konnte kein morphologisch sichtbarer direkt neurotoxischer Effekt durch die intrathekale Steroidapplikation festgestellt werden.
Die Unterschiede in unseren Ergebnissen bei der Intervention mit intrathekalen Steroide und der daraus resultierenden signifikanten Reduktion der nekrotischen Neuronenschädigung im Vergleich zur Kontroll- und auch zur systemische behandelten Steroidgruppe, weist stark auf einen Unterschied der Wirkungsin
Als Limitation dieser Studie kann angeführt werden, dass bisher keine Bestimmungen der Steroidkonzentration durchgeführt und in Relation zu den Versuchsergebnissen gesetzt wurden. Diese Untersuchungen stehen noch aus, sind aber geplant.
Die hämodynamischen Untersuchungen ergaben keine signifikanten Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Postoperativ kam es phasenweise zu Veränderungen der Perfusion. Eine Auswertung der Perfusions- und Oxygenationsmessungen aus unserem Versuch werden folgen. Einige Aspekte sind zum Teil schon aus vorangehenden Versuchen publiziert 210. Die Intervention mit Steroiden scheint keinen signifikanten Einfluss auf die Vitalparameter zu haben und eine Wirkung der Steroide wie sie in einer Studie von Husum et al, bei der es nach einer schnellen intravenösen Bolusgabe zu einem Absinken des MAD und der SVR kam, konnte nicht beobachtet werden 211. Dass Steroide den Vasotonus und damit die Perfusion beeinflussen können, zeigte Dietzman et al. in einer Studie, wobei er eine signifikante Vasodilatation durch Steroide beobachtete 212. Ob diese Hyperperfusion im Sinne einer Neuroprotektion angesehen werden kann, oder ob es sich nur um eine temporäre reaktive Variation nach einer langen Kreislaufunterbrechung handelt, bleibt fraglich. Die Intervention mit Steroiden führte zu keiner Verbesserung der kardiorespiratorischen Parameter. Die postoperativ erhöhten ZVD-Werte waren sicherlich durch eine temporäre Herzfunktionsstörung vor allem des rechten Herzens im Rahmen einer Ischämie-Reperfusion bedingt, welches sicherlich nach einer Ischämiezeit von 120 Minuten zu erwarten ist 50213.
Einen Einfluss der Steroidgabe auf den Gesamt-Sauerstoffverbrauch konnten Thompson et al. klinisch feststellen. wobei sie keinen Unterschied in der kardialen Funktion gemessen an dem „cardiac Index“ angaben 197. Auch die Werte für die Blutgase entsprachen damit den Normalwerten in dieser Tierart und waren den physiologischen Werten beim Menschen sehr ähnlich 153;214;215. Die Hämoglobinwerte bei Ferkeln lagen ebenfalls im Normbereich, der mit 8-11 g/dl niedriger ist als beim Menschen 153. In unserer Studie kam es zu keinen signifikanten Unterschiede in den kardiorespiratorischen Parametern 41;183. Der Anstieg der PO2-Werte in der Kühlung ist bedingt durch die Aufsättigung des Blutes mit Sauerstoff und geringerem Organverbrauch bei sinkender Temperatur, wohingegen die hohen Werte in der Reperfusion und postoperativ mit PO2-Werten zwischen 200-300 mmHg sich an der oberen Grenze des Normbereiches befanden 183. Die Tiere wurden in dieser Phase optimal ventiliert.
In einigen aktuellen Studien wurde auch über einen möglichen positiven Einfluss des Methylprednisolons auf die Lunge diskutiert, wobei es in den klinischen Studien von Chaney et al. unter MP-Gabe zu einer verlängerten Intubationszeit kam, und postoperativ keine Verbesserungen der statischen und dynamischen
Die vorliegende tierexperimentelle Untersuchung konnte den Einfluss einer Vorbehandlung mit systemischen Steroiden auf die Entstehung einer persistierenden Hyperglykämie nachweisen. Zusätzlich kam es bei unterliegender Hyperglykämie auch zu einer stärkeren Ausprägung neuronaler nekrotischer und auch apoptotische Veränderungen. Die nur mit dem systemisch verabreichten Methylprednisolon (MP) verbundene Hyperglykämie scheint das Zellschädigungsmuster nach zerebraler Ischämie zu verstärken. Ob diese pathologische Stoffwechselsituation zu einer Mangel- oder Überversorgung der Nervenzellen mit Glucose führt ist unklar. Eine Hyperglykämie als Nebeneffekt einer Steroidtherapie ist vielfach auch in anderen Studien beschrieben worden 134. Einige Studien führten sogar die Verschlechterung der neuronalen Zellschädigung nach zerebraler Ischämie mit gleichzeitiger Steroidbehandlung auf die Entstehung einer Hyperglykämie und Laktatazidose zurück 170;186. Jedoch konnte eine signifikant vermehrte Azidose in unseren Versuchsgruppen nicht beobachtet werden.
Als endogene Ursache für eine Hyperglykämie kann sicherlich die im Rahmen einer stressbedingten Ausschüttung von Katecholaminen und Stresshormonen postuliert werden. Eine zusätzliche externe Glucose-Zufuhr wurde nicht durchgeführt, die Infusionstherapie war standardisiert.
Bei homogener Reduktion des Organverbrauchs unter Hypothermie, kam es auch postoperativ in der systemischen Steroidgruppe zu keiner Erholung der Stoffwechsellage. Der Verdacht liegt nahe, dass sowohl die Zunahme nekrotischer Veränderungen, als auch die zusätzliche vermehrte Entstehung apoptotischer Neuronenveränderungen im Hippocampus durch die unter der systemischen Steroidtherapie aufgetretene Hyperglykämie mitbedingt sein könnte. Denn in der Kontrollgruppe und in der intrathekal behandelten Gruppe zeigten sich bei normal hohen Blutglucose-Werten signifikant weniger apoptotische Zellveränderungen. Eine Hyperglykämie als Nebenwirkung einer intravenösen Steroidapplikation ist in der Literatur in zahlreichen klinischen und experimentellen Studien beschrieben worden 134;170;217.
Dass eine Hyperglykämie in Zusammenhang mit einer Ischämie zu einer Vermehrung der nekrotischen Zellveränderungen führt, konnte auch Cherian et al. zeigen 218. Vannuci et al. stellten zusätzlich fest, dass eine Hyperglykämie während oder nach einer Ischämie des ZNS zu einer Verstärkung des Zellschädigungsmusters führt. Er konnte aber regionalen Unterschiede aufzeigen, wobei der Nukleus Caudatus und die Stammganglien mehr betroffen waren, als z.B. der Kortex. Eine Untersuchung des Hippocampus blieb jedoch aus 219. Auch Kondo et al. beobachteten nach fokaler Ischämie bei begleitender Hyperglykämie eine Zunahme der nekrotischen Neuronenveränderung im Kortex 220. Die pathophysiologische Grundlage
Zusätzlich wurde neben einer mit Hyperglykämie assoziierter vermehrten Entstehung neuronaler Zellnekrose auch eine vermehrte Induktion neuronaler Apoptose im Kortex nach fokaler Ischämie in einem Tiermodell gefunden 186;224. Eine vermehrte Freisetzung von Cytochrom C durch einer Hyperglykämie geht mit einer Aktivierung der Caspase 3 einher, worauf die Aktivierung der Apoptose-Kaskade folgt und es zu einer Fragmentation der DNA kommt 113.
Zusätzlich konnte in klinischen Untersuchungen nachgewiesen werden, dass eine Hyperglykämie zu einem schlechteren Outcome nach CPB und KSTH führte 217.
Die Ursache für die unterschiedlich hohen Calciumspiegel in den Versuchsgruppen bleibt unklar. Ein primärer oder auch sekundärer Einfluss von Methylprednisolon auf den Calciumstoffwechsel kann postuliert werden 225;226. Aber Steroide führen via die Aktivierung des Glucocorticoidrezeptoren zu einem erhöhten Einstrom von Calcium in die Zelle 227. Eine Erhöhung des intrazellulären Calcium führt wiederum zu einer gestörten Funktion der Mitochondrien und zu einer Alteration der zellulären Energieproduktion, wodurch es zu einer Aktivierung hydrolytischer Enzyme und zu einer zytoskeletalen Degradation mit anschließender Zellnekrose kommt 189. Auch Kristian und Siesjo et al. zeigten den Zusammenhang zwischen dem Anstieg des freien Calcium in der Zelle nach Ischämie und einer reaktiven Aufnahme des Calciums in die Mitochondrien. Im Rahmen des „Calcium-Overloading“ kommt es zu einer gestörten Funktion der Mitochondrien, woraus eine Überflutung des Zytoplasmas mit Calcium folgt mit resultierender Zellschwellung und Zellnekrose 228-231. Eine geringere Calciumfreisetzung und Hypokalzämie kann somit eine Ursache sein für eine weniger ausgeprägte calcium-induzierte Glutamattoxicität und weniger nekrotischen Neuronenschaden 60.
Calcium besitzt einen direkten Effekt auf intrazelluläre Proteine und bewirkt durch Interaktion mit deren Phosphorylierungszustand eine Aktivitätsänderung von Enzymen, Rezeptoren und Genen 60;189.
Eine weitere Wirkung der Steroide wird über die Steroidrezeptoren der Astrozyten hervorgerufen, wobei hier vor allem die Ca++ Homöostase beeinflusst wird 166. Der Unterschied zwischen systemischer und intrathekaler Applikation könnte sein, dass das an Albumin gebundene MP bei systemischer Applikation mit den Steroidrezeptoren der Endothelzellen interagiert und darüber, ohne die Blut-Hirn-Schranke überwunden zu haben, in die Calcium-Homöostase der Astrozyten eingreift. Dieses könnte eine Reduktion des perivaskulären Ödems bewirken 166. Methylprednisolon führt zu einer Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration der ruhenden astrozytären Zelle, bewirkt eine Verstärkung der Calcium-getriggerten Signalantwort der Astrozyten und führt zu einer verstärkten Aufnahmefähigkeit der Astrozyten für Calcium 166. Damit sind die Astrozyten in der Lage einen interstitiellen Calciumkonzentrationsanstieg teilweise zu kompensieren, bevor er die Neuronen beeinflusst. Dieses wurde bisher als ein Teileffekt einer neuroprotektiven Wirkung interpretiert 166.
Eine Quantifizierung des zerebralen Ödems wurde in unserer Untersuchung nur indirekt über die Veränderungen des Hirngewichtes durchgeführt (siehe Abschnitt 4.3.1.). Es zeigte sich unter der systemischen Steroidbehandlung postoperativ eine signifikant geringere Gewichtszunahme und auch ein geringeres Hirngewicht (p=0.01). Die morphologische Analyse ergab auch semiquantitativ ein etwas geringer ausgeprägtes zerebrales Ödem bei den Tieren mit systemischer Steroidapplikation. Die Interaktion der Steroide mit den Astrogliazellen und auch die Prävention eines zerebralen Ödems bleiben jedoch weiter unklar. Ob z.B. Steroide durch eine Beeinflußung des Calcium-Metabolismus in den Astrozyten eventuell
Die quantitative Auswertung der neuronalen Veränderungen ergab, dass die Behandlung mit systemischen Steroiden nicht den gewünschten Effekt einer signifikanten Reduktion des neuronalen Schädigungsmusters bewirken konnte, jedoch bei der intrathekalen Gabe des MP eine deutliche Verbesserung des Schädigungsmusters erreicht werden konnte. Ein möglicher neuroprotektiver Effekt einer Behandlung mit Methylprednisolon zeigt somit eine deutliche Abhängigkeit von der Applikationsart.
Unsere Ergebnisse sprechen bei Betrachtung des morphologischen Schädigungsmusters nach Applikation des MP im Rahmen von KSTH gegen einen postulierten protektiven Effekt der Steroide vor allem im Zusammenhang mit einer Vorbehandlung 20;136. Hier lässt sich aber somit auch eine Übereinstimmung mit anderen Studien finden, die ebenfalls eine generelle Zellprotektion durch Steroidgabe im Rahmen einer zerebralen Ischämie anzweifelten und bei denen es auch zu einer deutlichen Verstärkung der ischämischen neuronalen Schädigung kam 167;170;232.
Der neuroprotektive Effekt der systemischer MP-Gabe hängt überwiegend von der Passage der Albumin-gebundenen Steroide über die BHS in das ZNS ab. Bei intrathekaler Gabe und einer vermutlich erhöhten Wirkungskonzentration des MP an den Gliazellen und Neuronen kann es zu einer Verbesserung der nekrotischen Zellveränderungen kommen. Es zeigt sich nur, dass ein neuroprotektiver Effekt der Steroide möglich ist, aber entscheidend von der Applikationsform abhängig ist.
Der Mechanismus einer neuroprotektiven Wirkung durch MP bleibt aber weiter nicht geklärt. Die Steroidwirkung im Hippocampus scheint besonders durch eine Interaktion mit spezifischen Rezeptoren bedingt zu sein. In experimentellen Studien von Pfaff et al. zeigte sich eine hohe Dichte von Steroidrezeptoren im Bereich des CA 1 und Gyrus dentatus 227;233. Dieses könnte auch die Ursache sein für eine lokal unterschiedliche und dosisabhängige Wirkung einer peripheren Steroidegabe sein. Bei einer hohen Dosis von Steroiden konnte festgestellt werden, dass es im Hippocampus zu einer Reduktion der Nervenzellpotentiale kommt. Dieses konnten durch die Veränderungen des Membranpotentials nachgewiesen werden 233.
Hall et al. vermuteten eine protektive Wirkung im Zusammenhang mit posttraumatischer Neuronendegeneration durch einen antioxidaktiven Effekt des MP’s 234;235. Einige Studien zeigten eine deutliche Hemmung der Expression der Adhäsionsmoleküle, inflammatorischer Cytokine und eine Induktion anti-inflammatorischer Cytokine wie IL-10 durch Steroide auch nach KSTH 53;54;236. Eine inflammatorisch bedingte Schädigung wird zwar auch im Zusammenhang mit KSTH vermutet, scheint jedoch eher eine untergeordnete Rolle zu spielen. Eine inflammatorischen Reaktionen der Mikroglia im Gehirn konnte im Gegensatz zu Ischämiemodellen ohne tiefe Hypothermie in unserem Modell nicht nachgewiesen werden. Die Hypothermie scheint eine reaktive Aktivierung der Microglia und somit auch eine Reaktion auf einen
Eine weitere Studie fand aber auch einen zellulärer Mechanismus für eine exzitatorisch vermittelte nekrotische Nervenzellschädigung durch Steroide heraus, wobei eine Dexamethason-Behandlung zu einer Unterdrückung des inhibitorischen serotinergen Systems mit gleichzeitiger Aktivierung des exzitatorischen dopaminergen Systems führt, woraus eine nekrotische Zellschädigung resultierte 167. Ob in unserer Untersuchung ebenfalls ein direkter Effekt der Steroide auf das komplexe System der Neurotransmitter des ZNS als Erklärung für eine durch Steroide induzierte Nervenzellschädigung in Frage kommt, bleibt unklar, da eine Untersuchung dieser Veränderungen nicht durchgeführt worden ist.
Ein wesentlicher Unterschied der neuroprotektiven Wirkung des MP bei systemischer und intrathekaler Applikation scheint mit der direkten Wirkung und einer ausreichenden Konzentration auf zerebraler Ebene zusammenzuhängen, wobei die Wirkkonzentration von der Permeation der Steroide in das ZNS abhängig zu sein scheint.
Bei den mit Methylprednisolon behandelten Tieren wurde eine Zunahme der apoptotischen Veränderungen gefunden, mit Begrenzung auf den Bereich des Gyrus dentatus und des Sektor CA 4. Nur vereinzelt kam es zu apoptotischen Veränderungen in anderen Bereichen wie Kortex oder Kleinhirn. Das Auftreten von Apoptose bei Gabe von MP wurde in einigen wenigen Studien unter anderem in Lymphozyten nachgewiesen 239;240241;242. Wenige Studien zeigten aber bisher vor allem auch den Zusammenhang zwischen einer Hyperglykämie und einer Induktion von Apoptose der Neuronen des zentralen Nervensystems 113;191;220.
Die Zunahme apoptotischer Veränderungen in dieser Untersuchung könnte mit der beobachteten Hyperglykämie im Rahmen der Steroidintervention zusammenhängen. Der genaue Mechanismus der Entstehung von Apoptose nach Steroidapplikation ist unbekannt, es können aber vor allem regionale Unterschiede in der Verteilung der Steroidrezeptoren angeführt werden, woraus eine regional unterschiedlich starke Steroidwirkung resultiert 164. Der Hippocampus verfügt gegenüber anderen Hirnregionen über eine außergewöhnlich hohe Dichte der Steroidrezeptoren 164;226;227. Es konnten bisher zwei Steroidrezeptoren nachgewiesen werden, wobei die Verteilung dieser beiden Rezeptoren unterschiedlich ist, jedoch beide Formen im Hippocampus vorkommen 143. Das Vorkommen der Steroidrezeptoren in den Mitochondrien der Nervenzellen lässt auf eine direkte Beeinflussung der mitochondrialen Atmungskette und somit der zellulären Energiegewinnung schließen 145.
Das Auftreten regionaler Apoptose im Gyrus dentatus scheint somit eher durch die systemische als durch die intrathekale Gabe von MP bedingt zu sein. Die Hyperglykämie war in der systemischen Gruppe signifikant höher, sowohl unmittelbar nach Kreislaufstillstand, als auch in der postoperativen Phase. Es ist daher anzunehmen, dass die Hyperglykämie bei der Entstehung einer regionalen Vermehrung apoptotischer Neuronenveränderungen auch nach kalter Ischämie eine relevante Rolle spielt 113;220.
Veränderungen des Calciumhaushaltes der Astrozyten oder Neuronen nach Ischämie können zur Entstehung exzitatorischer Transmitter oder freier Radikale und zur Aktivierung intrazellulärer Enzyme wie Caspase, Lipase, Protease führen, welches dann eine neuronale Apoptose mit Fragmentation der DNA zur Folge hat 60;114;189. Die signifikant niedrigeren Calciumwerte der intrathekalen Gruppe könnten somit ein wesentlicher Bestandteil einer neuroprotektiven Wirkung durch die Steroide sein.
Trotzdem stellen die apoptotischen Neuronenveränderungen eine wesentliche Nebenwirkung der Methylprednisolongabe im neugeborenem Alter und nach CPB und KSTH dar und sie können die pathophysiologische Grundlage sein, für die zerebralen Komplikationen nach Steroidgabe im Neugeborenenalter 140.
Die Bestimmung der Genexpression von den pro-apoptotischen Proteine Bak und FAS, sowie für das anti-apoptotische Protein Bcl-xl, erfolgte im frontalen Kortex. Zusätzlich wurde die Genexpression für das Hitze-Schock-Protein 70 (HSP 70) ermittelt.
Bei den Proteinen, die an der Entstehung der Apoptose beteiligt sind, unterscheidet man eine intrazelluläre (z.B. Bak) oder extrazelluläre (z.B. FAS) Lokalisation. Durch den Einfluss der hypothermen Ischämie im Rahmen des KSTH zeigte sich eine signifikante Zunahme der Expression für das intrazellulär lokalisierte Protein Bak. Die Expression von FAS war nach 120 min KSTH (i.e. Kontrollgruppe) im Vergleich zu den Tieren ohne KSTH jedoch nicht signifikant verändert.
Hitze-Schock-Proteine (HSP) sind molekulare Chaperonen und werden normalerweise kontinuierlich synthetisiert von den glialen, vaskulären und neuronalen Zellen. Zusätzlich führen eine Reihe von Stressoren des ZNS zu einer Synthesesteigerung dieser Proteine. Den verschiedenen HSP`s werden unterschiedliche
Eine verstärkte Expression des HSP 70 wird jedoch in der Literatur vielfach im Sinne einer Zellprotektion betrachtet. Dabei hemmt das HSP 70 auf der einen Seite die Entstehung der Apoptose durch Interaktion mit dem Apoptose-Protease-Aktivierungsfaktor 1 (APAF-1) und verhindert dabei die typische Chromatinkondensation durch den Apoptose-Induktionsfaktor 243. Der zelluläre Ursprung des HSP 70 ist bisher nicht ausreichend geklärt. Es wird vermutet das die Neuronen und die Gliazellen das HSP 70 nach entsprechendem Stimulus synthetisieren, und dass das Protein die Gliazellen und auch die Neuronen durch Exozytose verläßt, wie in der Zellkultur nach thermischem Stress beobachtet werden konnte 244. Foster et al. konnte das HSP 70 in den neuronalen Fortsätzen (Dendriten) nachweisen 245. Einige Studien, wie die von Liu et al. beschrieben nach zerebraler Ischämie eine Detektion des HSP 70 in den Pyramidenzellen des Hippocampus mittels Immunhistochemie 246. Zugleich wiesen sie durch die Bestimmung der spezifischen m-RNA eine frühe und eine späte Steigerung der Proteinsynthese des HSP 70 nach 246. Die frühe vermehrte Expression des HSP zeigte einen signifikant protektiveren Effekt für die Neuronen im Hippocampus 247. Eine Studie von Reshef et al. zeigte, dass die HSP 70 in den Neuronen durch Interaktion mit Kaliumkanälen und deren Öffnung zu einer Zellprotektion der Neuronen gegen Ischämie und Reperfusionsschaden führt. Wobei die neuronale sich deutlich von der kardialen Expression unterschied 248. In einer in-vitro Studie von Sato et al. an Hippocampus-Neuronen konnte bei vorhergehender Hyperthermie eine deutliche Reduzierung des durch Glutamat-Toxizität hervorgerufenem neuronalen Schadens an den CA1 Neuronen festgestellt werden 187. Dabei korrelierte die Induktion des HSP 70 mit einer morphologisch sichtbaren Zellprotektion der Hippocampus-Neurone in CA 1 und CA 4 187.
Ein signifikanter Anstieg der Expression des HSP 70 konnte nur in der intrathekalen MP-Gruppe festgestellt werden. Dabei war die Expression sowohl gegenüber der Kontrollgruppe, als auch gegenüber der systemischen Steroidgruppe signifikant erhöht. Bei gleichzeitig morphologisch sichtbarer neuronaler Protektion durch die intrathekale Steroidbehandlung kann die erhöhte Expression von HSP 70 als prädiktiver Faktor für eine neuronale Zellprotektion angesehen werden. Es kann vermutet werden , dass bei einer erhöhten Expression des HSP 70 es zu weniger neuronaler Nekrose kommt, wie es schon von Sato et al beobachtet werden konnte 187.
Für die Entstehung der Apoptose bedarf es einer aktiven Genexpression und u.a. der Aktivierung einer zytoplasmatischen Caspase-Kaskade. Diese Kaskade kann durch eine Reihe von Faktoren und Transmittern aus Mitochondrien, dem Zytoplasma und durch intrazelluläre oder extrazelluläre Proteine beeinflusst werden. Auch eine Auto-Aktivierung ist möglich 249. Für die intrazelluläre Aktivierung spielen vor allem zytoplasmatische Proteine wie z.B. Bak und Mediatoren der Mitochondrien, wie der sogenannte Apoptose-Induktions-Faktor (AIF) und Cytochrom C eine Rolle. Diese interagieren mit einem zytosolischen
Als extrazelluläre Stimuli können verschieden Mediatoren über einen trimeren Rezeptor an der Zellmembran mit einem zytoplasmatisch Teil, dem „death inducing signaling Komplex“ (DISK), die Caspase-Kaskade aktivieren. Extrazelluläre Mediatoren sind dabei die löslichen Proteine FAS (FAS-L, Apo-1L), TNF-a und andere Cytokine. Diese Proteine binden an die spezifischen Rezeptoren (CD95=FAS-R, TNF-R1) der Zellmembran, welcher dann eine Modulation des sich an der Innenseite der Zellmembran befindlichen „death inducing signaling Komplex“ (DISK) bewirkt 251. Durch diese Konformationsänderungen werden Mechanismen aktiviert, die letzten Endes zu einer Aktivierung der Caspase-Kaskade führen 251. Die vermehrte Expression extrazellulären pro-apoptotischen Proteins FAS kann somit eine Induktion des programmierten Zelltodes bewirken 252.
Aber es gibt auch Proteine, die hemmend auf die Entstehung der Apoptose wirken. Hierzu gehört Bcl-xL, aus Bcl-2-Familie. Bcl-xL ist in den Mitochondrien lokalisiert und eine erhöhte Expression kann Entstehung des programmierten Zelltodes hemmen 196;253;59. Die vermehrte Expression des Bcl-xL Proteins nach Ischämie oder Hypoxie wurde in einigen Studien im Sinne einer Neuroprotektion gewertet, da sowohl neuronale Apoptose als auch Nekrose reduziert waren 254.
Die Expression des anti-apoptotischen Bcl-xL Genes war in beiden Steroidgruppen erhöht, wobei nur der Unterschied in der intrathekalen Gruppe signifikant war (p=0.03). Für die Entstehung von Apoptose ist jedoch vor allem das Verhältnis von pro-apoptotischen Proteinen wie z.B. Bak und FAS zu den anti-apoptotischen wie z.B. Bcl-xL entscheidend 196. Betrachtet man dieses Verhältnis in den Versuchsgruppen, so zeigte sich nach systemischer Steroidbehandlung bei nur geringer Zunahme der Expression des anti-apoptotischen Genes Bcl-xL eine deutliche Zunahme der Expression der pro-apoptotischen Gene Bak und FAS. Das Verhältnis ändert sich damit zugunsten der pro-apoptotischen Gene in den systemisch behandelten Tiere. In der intrathekalen Gruppe zeigte sich ebenfalls eine Zunahme der pro-apoptotischen Gene und aber auch eine signifikante Zunahme der anti-apoptotischen Gene. Diese Ergebnisse korrelierten mit der Morphologie und dem vermehrten Auftreten von neuronaler Apoptose.
Man kann postulieren, dass eine Steroidbehandlung im Zusammenhang mit verlängertem KSTH zu einer Zunahme der pro-apoptotischen Proteine im Gehirn führt, was sich auch morphologisch beweisen läßt.
Da die Analyse bisher nur im frontalen Kortex durchgeführt wurde, ist es möglich, dass in den anderen Hirnregionen wie z.B. im Hippocampus noch deutlichere Unterschiede der Genexpression erfasst werden können.
Mit einer systemischen Steroidbehandlung lässt sich im Zusammenhang mit KSTH kein neuroprotektiver Effekt erzielen. Dieses ließ sich aus der Tatsache schließen, dass in der systemischen Steroidgruppe eine Zunahme der ischämischen Schädigung nach KSTH und eine Induktion neuronaler Apoptose beobachtet werden konnte. Ein Ausbleiben einer neuroprotektiven Wirkung ließ sich durch unterschiedliche Messungen dokumentieren, wobei es in der systemischen MP-Gruppe zu erhöhten postoperativen Werten für Calcium kam. Die morphologische Auswertung ergab ein signifikant höheres Ausmaß neuronaler Zellschädigung im Sinne neuronaler Nekrose und Apoptose. Die molekulargenetischen Untersuchungen zeigten die signifikante Zunahme pro-apoptotischer Proteine (Bak und FAS) bei nur geringer Zunahme des anti-apoptotischen Proteins Bcl-xL. Somit war das Verhältnis zugunsten der pro-apoptotischen Proteine verschoben. Eine Induktion „protektiver“ Proteine wie z.B. des HSP 70 blieb aus.
Die intrathekale Behandlung mit MP zeigte einen signifikanten neuroprotektiven Effekt mit Reduktion der neuronalen Nekrose und signifikanten Verbesserung des Schädigungsmusters nach KSTH. Zusätzlich blieben im Vergleich zu der systemischen Gruppe eine Hyperglykämie und Hyperkalzämie in dieser Gruppe aus. Intrathekales MP führt zu einer signifikanten Erhöhung der Expression des protektiven Hit
Eine wesentliche Limitation dieser durchgeführten experimentellen Studie ist die postoperative Überlebenszeit und das damit kurze Zeitfenster der morphologischen Analyse. Jedoch zeigte sich in der Studie von Kurth et al., der die Tiere mit unterschiedlich langer Überlebenszeit verglich, ein Maximum der morphologischen Veränderungen nach 6-12 Stunden 88. Zusätzlich konnte bisher noch keine Aussage über die Konzentration des Methylprednisolon`s im Gehirn gemacht werden. Ob neben der Vorbehandlung eine weitere Gabe nach Kreislaufstillstand das neuronale Schädigungsmuster hätte positiv beeinflussen können, oder ob das Ausmaß der Schädigung noch mehr zugenommen hätte, bleibt fraglich.
Weitere regionale molekulargenetische Untersuchungen an dem gefrorenem Hirnmaterial zur Evaluierung der neuronalen Apoptose werden folgen. Auch die immunhistochemische Anfärbung von HSP 70 zeigte bisher erste vielversprechende Ergebnisse. Die Steroidwirkung im Rahmen zerebraler Ischämie und Hypothermie wird auch Gegenstand weiterer Forschung sein. Obwohl mit der intrathekalen Vorbehandlung eine neuronale Protektion erzielt werden konnte, bleibt ihr klinischer Ansatz fraglich und technisch kompliziert. Eine weiterführende Evaluation des spezifischen Effektes der Steroide und der Hypothermie in Zellkulturen ist bereits angelaufen. Ebenso werden weitere Analyse bezüglich des Steroideffektes, sowie zur Entstehung apoptotischer Veränderungen durch Steroide an dem verbliebenden Hirnmaterial folgen. Diese Ergebnisse werden zusätzlich Gegenstand klinischer Forschung sein.
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S. Schubert, H. Abdul-Khaliq, M Hübler, W Böttcher, M-O.Baur, G. Stoltenburg-Didinger, D.Triotzsch, V. Alexi-Meskhishvili, M. Kopitz, H Kuppe, R. Hetzer, P.E. Lange: Der Effekt von Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie auf die intravaskuläre und intrazelluläre Oxygenation im Gehirn von Kaninchen. Norddeutsche Gesellschaft für Kinderheilkunde und Jugendmedizin 14-16 Mai 1999, Bremen, Kongreßband, ISBN: 3-931310-23-X
S. Schubert, H. Abdul-Khaliq, G. Stoltenburg-Didinger, M.Hübler, W.Böttcher, MO.Baur, D.Troitzsch, R. Hetzer, P.E. Lange: Zusammenhang zwischen erhöhten S-100 Serumwerten und immunhistochemischen Nachweis im Gehirn nach Kreislaufstillstand mit tiefer Hypothermie beim Kaninchen. Norddeutsche Gesellschaft für Kinderheilkunde und Jugendmedizin 14-16 Mai 1999, Bremen, Kongreßband, ISBN : 3-931310-23-X
S. Schubert, H. Abdul-Khaliq, G. Stoltenburg-Didinger, M. Hübler, W. Böttcher, MO. Baur, D. Troitzsch, V. Alexi-Meskischvili, R. Hetzer, P.E. Lange: Zusammenhang zwischen erhöhten S-100 Serumwerten und immunhistochemischen Expression im Gehirn nach Kreislaufstillstand mit tiefer Hypothermie beim Kaninchen. 31. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Pädiatrische Kardiologie, Wuppertal, 2-5.10.1999. Z Kardiol 1999;88:761.
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Ich danke meiner gesamten Familie für die Unterstützung und Hilfe während meiner gesamten Ausbildung.
Besonderer Dank gilt meinem Betreuer und Doktorvater Privatdozent Dr. Hashim Abdul-Khaliq, von dem ich nicht nur das wissenschaftliche Arbeiten gelernt habe, sondern der mich mit seiner Begeisterung und seinem Enthusiasmus für Forschung und Lehre stets motiviert und weitergebracht hat – unsere Zusammenarbeit war einmalig!
Besonderer Dank gilt ebenfalls meinem geschätzten Chef, Herrn Prof. Dr. Peter E. Lange, Chef der Abteilung für Kinderkardiologie und angeborene Herzfehler im Deutschen Herzzentrum Berlin, der mir die Möglichkeit dieser Promotion gegeben hat und mich kontinuierlich bei meiner Arbeit in seiner Abteilung begleitet hat. Seine Unterstützung war außerordentlich wertvoll und hat mir viel bedeutet.
Herzlicher Dank gilt weiterhin Frau Prof. Dr. med. Gisela Stoltenburg-Didinger und den Mitarbeitern in der Abteilung für Neuropathologie des Universitätsklinikums Benjamin Franklin. Ohne die Unterstützung des gesamten Teams dort hätte diese Arbeit nicht zustande kommen können.
Zusätzlich danke ich allen, die an den sehr aufwendigen Versuchen direkt oder indirekt beteiligt waren. Dabei sind namentlich zu erwähnen: Wolfgang Böttcher, meine beiden Kollegen und Mitdoktoranden Anke Wehsack und Dirk Troitzsch, Dr. med. vet. Michael Meissler und die Mitarbeiter in der tierexperimentellen Einheit der Charitè, sowie Thore Dittrich und Boris Schmidt.
Hiermit erkläre ich, dass ich diese Dissertation selbst und ohne die unzulässige Hilfe Dritter verfasst habe. Diese Arbeit stellt, auch in Teilen, keine Kopie anderer Arbeiten dar. Die benutzten Hilfsmittel und die Literatur sind vollständig angegeben.
Stephan Schubert