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II  Methodik

II.1 Versuchsplanung

Zur Überprüfung der Qualität der im Blutspendezentrum der Abteilung für Klinische Hämostaseologie und Transfusionsmedizin der Universitätskliniken des Saarlandes in Homburg/Saar hergestellten Blutderivate wird über das gesetzliche Maß hinaus, das die Kontrolle jeder 100. Spende fordert, jede 30. Spende überprüft.

Die Studie unterteilt sich in drei Abschnitte:

1. Bei 72 Spenden wird vom Ausgangsprodukt Vollblut und von den Folgeprodukten Erythrozytenkonzentrat (EK) in Additivlösung PAGGS-Mannitol, gefiltertes EK und Plasma kurz nach der Herstellung eine Probe entnommen, um Blutbilder zu erstellen und folgende zusätzliche Untersuchungen durchzuführen: Bei Vollblut und EK wird ein Blutausstrich für ein Leukozytendifferential-Blutbild hergestellt; der Erythrozytenverlust durch die Filterung wird bei den gefilterten EK berechnet, und bei den Plasmen wird Faktor V, VIII und Gesamteiweiß-Gehalt gemessen. Außerdem werden die jeweiligen Beutelvolumina durch Wiegen bestimmt.

2. Bei jeweils 12 Blutderivaten (Vollblut, Erythrozytenkonzentrat mit/ohne additive Lösung SAG-M, PAGGS-M und ADSOL, gefiltertes Erythrozytenkonzentrat, tiefkühlkonserviertes Erythrozytenkonzentrat) werden zu den oben erwähnten Untersuchungen die Hämolyserate nach Ablauf der jeweiligen Haltbarkeit bestimmt. Weiterhin werden verschiedene Parameter bei Thrombozytenhochkonzentraten (zwei Herstellungsmethoden) untersucht. Dabei wird nur das einzelne Derivat und nicht, wie oben, Ausgangsprodukt und daraus entstandene Folgeprodukte untersucht.

3. Bei 21 EK in PAGGS-M und Plasmen werden als funktionelle Parameter Hämatokrit, Plasmaviskosität, Blutviskosität, Erythrozytenrigidität und das mittlere Erythrozytenvolumen MCV am Tag 0, 7, 14, 21 und 28 nach der Herstellung bestimmt.


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II.2  Material und Meßgeräte

1. Separation

Beutelsysteme

PVC-Dreifachbeutel mit Oben/Unten-Abgang mit 63ml CPD und 100ml SAG-M, PAGGS-M (beide Biotrans GmbH (Dreieich)), oder 70ml CPD mit 110ml ADSOL (Baxter Deutschland GmbH (München))

PVC-Vierfachbeutel mit Oben/Unten-Abgang mit 63ml CPD und 100ml SAG-M, Biotrans GmbH (Dreieich)

PVC-Einfachbeutel mit 100ml CPDA1 (Biotrans GmbH (Dreieich))

Additivlösungen

100 ml PAGGS-M enthalten:

Glucose-Monohydrat

940 mg

Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat

111 mg

Dinatriumhydrogenphosphat x 12 H2O

114 mg

Adenin (Hydrochlorid)

25 mg

Guanosin

4,1 mg

Mannitol

1,0 g

Natriumchlorid

1,0 g

Aqua ad iniectabilia

ad 100 ml


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100 ml SAG-M enthalten:

Glucose-Monohydrat

900 mg

Adenin (Hydrochlorid)

21,5 mg

Mannitol

525 mg

Natriumchlorid

877 mg

Aqua ad iniectabilia

ad 100 ml

100 ml ADSOL enthalten:

Glucose-Monohydrat

2,20 g

Adenin (Hydrochlorid)

34,3 mg

Mannitol

751 mg

Natriumchlorid

90 mg

Aqua ad iniectabilia

ad 100 ml

Stabilisatorlösungen

100 ml CPD enthalten:

Citronensäure-Monohydrat

327 mg

Natriumcitrat x H2O

2,63 g

Glucose-Monohydrat

2,55 g

Natriumhydrogenphosphat x H2O

251 mg

Aqua ad iniectabilia

ad 100 ml


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100 ml CPDA1 enthalten:

Citronensäure, wasserfrei

300 mg

Natriumcitrat x H2O

2,63 g

Glucose, wasserfrei

2,9 g

Natriumhydrogenphosphat x H2O

251 mg

Adenin

27,5 mg

Aqua ad iniectabilia

ad 100 ml

Zentrifugen

Hettich Rota Silenta/RP (Tuttlingen)mit zwei verwendeten Programmen:

No. 1 (starke Zentrifugation)

 

No.3 schwache Zentrifugation

 

(Separation d. Blutspende)

 

(Thrombozytengewinnung)

 

Anlaufzeit

240 sec.

Anlaufzeit

60 sec

Laufzeit

10 min.bei 4000 g

Laufzeit

3 min bei 400 g

Bremsstufe

5

Bremsstufe

1

Temperatur

22°C

Temperatur

22°C


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Hettich Rotixa/A (Tuttlingen) (Separation d. Proben - Reagenzgläser)

Laufzeit

10 min. bei 1200 g

Bremsstufe

6

Separatoren

Optipress, Baxter Deutschland GmbH (München)

Automatische Presse, Biotrans GmbH (Dreieich)

Schweißgerät

Hematron von Travenol, Baxter (München)

“Sterile docking”

SCD 312, Haemonetics (München)

Elektronischer Zellzähler

Sysmex M-2000, Digitana (Frankfurt) zur Erstellung der Blutbilder

Photometrische Messung der Hämoglobinkonzentration

Photometer 1101 M, Eppendorf GmbH (Hamburg)

Transformationslösung aus 3,1 g Kaliumhexacyanoferrat;

5,0 g Natriumhydrogencarbonat; 0,25 g Kaliumcyanid; Wasser ad 5000 ml


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pH-Messung

pH M 64 Research pH Meter, Radiometer Copenhagen GmbH (Bonn)

Sterilitätskontrolle

70 ml BBL-Septi-Chek Blutkulturflaschen, Becton Dickinson and Company (Meylan, Frankreich).

2. Leukozytenfilterung

Leukozytenfilter

BPF 4, Pall Biomedizin GmbH (Dreieich) mit integriertem Auffangbeutel

Kammerzählverfahren

Nageotte-Zählkammer mit 50µl Volumen, Schreck Optik (Hofheim/Ts.-Lorsbach)

Unopette-Mikrocollection System mit 1980µl Ammonium-Oxalat-Vorlage, Becton-Dickinson, zu beziehen bei Döll Medizintechnik (Hofheim/Ts.)

3. Erythrozyten-Tieffrierung

Erythrozyten-Gefrierlösung

Art.Nr. 700 320, Biotrans GmbH(Dreieich)


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1 l Gefrierlösung enthält:

Glycerol

380,0 g

Sorbitol

29,0 g

Natriumchlorid

6,30 g

Aqua ad iniectabilia

ad 1000 ml

Erythrozyten-Waschlösung

Art.Nr. 700 310, Biotrans GmbH(Dreieich)

1l Waschlösung enthält:

Sorbitol

175,0 g

Natriumchlorid

8,0 g

Aqua ad iniectabilia

ad 1000 ml

Zentrifuge

Hettich Rota Silenta/RP (Tuttlingen)

zum Auftauen verwendetes Programm

Anlaufzeit

120 sec

Laufzeit

4 min. bei 2000 g.

Bremsstufe

2

Temperatur

20°C


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Tieffrierbeutel

Hemofreeze DF 700, Gambro Medizintechnik GmbH (Planegg)

aus Kapton/Teflon und Polyethylen

Transfusionsbestecke

Glycerisationsset GT1, Gambro Medizintechnik GmbH (Planegg)

Metallrahmen

Freezeenvelope E 700, Gambro Medizintechnik GmbH (Planegg)

Schweißgerät

Spezialgerät mit extralanger Schweißfläche, Gambro Medizintechnik GmbH (Planegg)

4. Faktorenbestimmung

Kugelkoagulometer KC 10, Amelung (Kerpen-Horrem)

Reagenzien der Fa. Immuno AG (Heidelberg):

5. Thrombozytengewinnung

Thrombapheresegeräte

CS-3000 Plus, Baxter GmbH (München)

AS-104, Fresenius AG (Bad Homburg)

Über-Kopf-Rotator

Platelet Rotator, Baxter GmbH (München)

Thrombozytenagitator

4010, Kottermann

6. Rheologische Messungen

Plasmaviscosimeter

KSPV-5, Fresenius (Bad Homburg)


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Hämatokrit-Zentrifuge

Micro Hematocrit Centrifuge, Hawksley (London)

SER

Selektives Erythrozytenrigidometer, Myrenne (Roettgen)


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7. Bestimmung des Glycerin-Gehaltes

Test-Kombination, Boehringer Mannheim

bestehend aus

  1. 2g Coenzym/Puffergemisch aus Glycylglycin-Puffer, pH 7,4; 7 mg NADH;
    22 mg ATP; 11 mg PEP; Magnesiumsulfat; Stabilisatoren
  2. 0,4 ml Suspension aus 240 U Pyruvat-Kinase; 220 U Lactat-Dehydrogenase
  3. 0,4 ml Suspension aus 34 U Glycerokinase
  4. Glycerin-Standard-Lösung zur Testkontrolle

8. Messung der Osmolarität

Semi-Micro-Osmometer, Knauer

9. Messung der Gesamt-Eiweiß-Konzentration

Biuret-Reagenz aus Kupfer-Sulfat, Natrium-Kalium-Tartrat, Kaliumjodid, Natronlauge

II.3 Meßmethoden

II.3.1 Hämatologische Parameter

1. Haemolysine

Definition: Substanzen, die eine Haemolyse herbeiführen, z.B. Antikörper, die bei Bindung an Erythrozyten-Antikörper Komplement aktivieren [Pschyrembel, 1989].

Haemolysintest: serologischer Nachweis haemolysierender Antikörper, die menschliche Testerythrozyten unter Aktivierung von Komplement haemolysieren.


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Vorgehen: In Teströhrchen 1 werden 2 Tropfen des zu testenden Patientenserums mit 1 Tropfen Erythrozytensuspension der Blutgruppe A, in Teströhrchen 2 werden 2 Tropfen Patientenserum mit 1 Tropfen Erythrozytensuspension der Blutgruppe B vermischt. Nach Durchmischen werden die Röhrchen 30 min bei 37°C inkubiert, anschließend anzentrifugiert und makroskopisch auf Hämolyse überprüft.

2. Freies Hämoglobin (extrazelluläres Hämoglobin)

Nach Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt; daraus kann dann photometrisch der Gehalt an freiem Hämoglobin bestimmt werden. Zu 0,1 ml Überstand werden 1 ml Transformationslösung gegeben, bei 546 nm und 591 nm die Extinktion gemessen und nach folgender Formel berechnet:

3. Hämolyserate

Die Berechnung erfolgt nach folgender Formel:

4. Erythrozyten-Verlust

Die Berechnung erfolgt über Volumen und Hämatokrit von Ausgangskonserve und Endprodukt.

Erythrozyten-Verlust (in%) = VolAus x HktAus - VolEnd x HktEnd


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5. Leukozytenzählung mit der Nageottekammer

Bei der Nageottekammer handelt es sich um eine Spezialkammer, mit der ein um ein Vielfaches größeres Volumen als mit der Neubauerkammer untersucht werden kann. Zur Zählung werden 220µl des zu untersuchenden Erythrozytenkonzentrats zu 1,98ml Ammoniumoxalat der Unopette gegeben und 10 min zur Lyse der Erythrozyten abgewartet. Dann werden ein oder zwei Nageotte-Kammern mit der verdünnten Probe befüllt und 10 min in eine feuchte Petrischale zur Sedimentation der Zellen gegeben. Anschließend können die befüllten Kammern im Phasenkontrastmikroskop ausgezählt werden.

Berechnung:

Gezählte Leukozyten in beiden Kammern = n

Leukozyten/µl = n x Verdünnungsfaktor / ausgezähltes Volumen in µl

Leukozyten/µl = n x 0,1

6. Bestimmung der Osmolalität

Messung der Gefrierpunktserniedrigung (Kryoskopie): In geeichte Glasküvetten werden 150µl des zu untersuchenden Mediums gegeben. Beim Unterschreiten des Gefrierpunktes wird ein Agitator in Gang gesetzt und die Kristallisation ausgelöst. Über einen in der Flüssigkeit befindlichen Temperaturfühler wird die dabei auftretende Gefrierpunktserniedrigung erfaßt und mit

Standardlösungen verglichen. Dazu wird das Gerät täglich mit Aqua dest. (0 mOsmol) und Eichlösung (400 mOsmol) geeicht. Die Meßskala zeigt dann die Osmolalität an [thomas, 1995].

Restgehalt an Kryoprotektivum


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1 ml Plasma oder Serum wird Aqua bidest. gemischt und 5 min. erhitzt, anschließend zentrifugiert. 0,5 ml des Überstandes werden zum Test verwendet. Dazu werden in einer Küvette Lösung 1, die zu untersuchende Probe, Aqua bidest und Suspension 2 vermischt. Ein Leerwert, der statt der Probe Aqua bidest. enthält, wird mitgeführt. Nach Stillstand der Vorreaktionen werden die Extinktionen (E1) von Probe und Leerwert bei 340 nm gemessen. Mit Suspension 3 werden weitere Reaktionen gestartet, nach Reaktionsstillstand werden die Extinktionen (E2) gemessen.

Für Leerwert und Probe werden Extinktionsdifferenzen gebildet, dann wird die Extinktionsdifferenz des Leerwertes von der Probe abgezogen.

Die Berechnung erfolgt dann nach folgender Formel

(F=Verdünnungsfaktor; e = Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm = 6,3 [l x mmol-1 x cm-1]):

8. Sterilitätskontrolle

Die entnommene Blutprobe (8-10ml) wird in eine BBL-Septi-Chek-Blutkulturflasche unter sterilen Kautelen übertragen, anschließend durch Kippen gemischt. Bei 35-37°C wird für mindestens sieben Tage inkubiert, bevor von Sterilität der Probe ausgegangen werden kann. Ein Bakterienwachstum kann meist schon innerhalb von 48 Stunden nachgewiesen werden. Dann sollte eine Gramfärbung oder eine geeignete Subkultur angelegt werden.

9. pH-Messung

Die Messung erfolgt mit Hilfe eines pH-Meters mit Glaselektrode. Diese ist an ihrem Ende zur Kugel aufgeblasen, um eine dünnwandige Membran zu formen und enthält eine Pufferlösung. [Seite 22↓]Durch den Unterschied des pH-Wertes in der zu untersuchenden Probe und der Pufferlösung entsteht ein Ionenaustausch, der elektrisch gemessen werden kann.

10. Differential-Blutbild

Die auf einem Objektträger ausgestrichene Blutprobe wird nach May-Grünwald-Giemsa gefärbt und bei 400-facher Vergrößerung ausgezählt.

11. Gesamteiweißbestimmung (Biuretmethode)

Prinzip: Anlagerung von Kupferionen im alkalischen pH-Bereich an die Peptidbindungen von Proteinen und Peptiden. Die Intensität der dabei entstehenden Violett-Färbung ist linear der Zahl der Peptidbindungen und damit der Proteinkonzentration in einem weiten Bereich. Voraussetzung für die Reaktion ist das Vorhandensein von mindestens zwei Peptidbindungen (Tripeptid). Es muß ein Standard mitgeführt werden; empfohlen wird Rinderalbumin. Zur Bestimmung wird ein Teil Plasma zu 50 Teilen Biuret-Reagenz (Verhältnis 1:51) gegeben und nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur die Absorption der Analysenprobe und des Standards gegen Biuret-Reagenz gemessen. Die Konzentration berechnet sich nach folgender Formel:

[Thomas, 1995]

II.3.2 Hämostaseologische Parameter

Faktorenanalyse

Die Analyse des Gehaltes an Gerinnungsfaktoren erfolgt mit Hilfe von Mangelplasmen, denen ein definierter Gerinnungsfaktor fehlt. Mangelplasma wird mit Patientenserum in die Vertiefung eines Kugelkoagulometers gegeben und mit einer Kugel bewegt. Gleichzeitig wird eine Zeitautomatik in [Seite 23↓]Gang gesetzt. Sobald das Gemisch gerinnt, bleibt die Kugel stehen, und die Zeit wird gestoppt. Gleichzeitig werden definierte Konzentrationen eines Referenzplasmas gemessen, um mit den Gerinnungszeiten eine Bezugskurve erstellen zu können. Auf dieser Kurve kann man die Konzentration des zu untersuchenden Faktors ablesen.

II.3.3 Hämorheologische Parameter

1. Plasmaviskositätsmessung

Die zu untersuchende Probe wird blasenfrei in eine 2 ml Spritze aufgezogen, auf eine Spezialkanüle ohne Spitze wird ein dünner Kunststoffschlauch aufgesteckt. Die Mindestfüllung beträgt 0,5 ml. Die Spritze wird nun in die vorgesehene Vertiefung des Plasmaviskosimeters gelegt, ebenso der Schlauch. Nach dem Schließen der Frontplatte wird der Spritzenkolben automatisch vorgetrieben und so der Schlauch mit Plasma gefüllt. Sobald der Plasmabolus die erste Lichtschranke erreicht, wird der Füllvorgang beendet. Schlauch und Plasma werden innerhalb von 60 Sekunden auf 37°C thermostatisiert. Anschließend wird der Schlauch durchtrennt, der Plasmabolus beginnt zu laufen. Sobald die zweite Lichtschranke erreicht wird, startet die Zeitmessung bis zum Erreichen der dritten Lichtschranke. Aus bekannter Meßstrecke und gemessener Zeit wird nach dem Hagen-Poiseuilleschen Gesetz die Plasmaviskosität berechnet [kiesewetter, 1990].

2. Blutviskosität

Es wird ebenso vorgegangen wie zur Messung der Plasmaviskosität.

3. Erythrozytenrigidität

Dem Messverfahren liegt das Prinzip der Messung der Passagezeit einzelner Erythrozyten durch eine Einzellochmembran zugrunde. Das Kernstück des Meßgerätes ist die Einzellochmembran, eine Kunststoffolie mit einer zentralen Pore (Membrandicke L=20µm, Porendurchmesser 4µm). Die Membran trennt die Meßkammer in eine Unter- und eine Oberkammer. Die Neigung der Kammer ist so gewählt, daß die sedimentierten Erythrozyten auf der Membran hinabgleiten, und sofern sie im Einzugsgebiet der Pore sind, nacheinander die Pore passieren. Die Meßkammer liegt in einem thermostatisierten Aluminiumblock. Die Messung der Passagezeit einzelner Erythrozyten durch die Einzellochmembran erfolgt elektrisch. Der Ohmsche Widerstand eines Erythrozyten ist [Seite 24↓]deutlich höher als der Widerstand des Suspensionsmediums. Dadurch kommt es beim Durchtritt eines Erythrozyten zu einer Erhöhung des Gesamtwiderstandes. Für jede Erythrozyten-Population werden 250 Erythrozytenpassagen vermessen. Die mittlere Durchtrittszeit wird berechnet und durch die mittlere Durchtrittszeit einer Kontrollpopulation anscheinend Gesunder ohne Risikofaktoren dividiert. Diesen Quotienten bezeichnet man als standardisierte Erythrozytenrigidität [kiesewetter, 1990].

4. Hämatokrit (Zentrifuge)

Das Blut wird in eine heparinisierte Mikro-Glaskapillare aufgezogen, ein Ende wird verschweißt. Die Glaskapillare wird in die Vertiefung der Mikrohämatokrit-Zentrifuge gelegt und bei 12 000 g über 3 min. zentrifugiert. Dabei werden die Erythrozyten an dem verschweißten Ende zusammengepreßt; der Hämatokrit kann dann mit Hilfe einer Schablone abgelesen werden [thomas,1995].

II.4 Durchführung der Versuche

Standard-Voraussetzungen

Spenderauswahl und Blutspende: Die Auswahl der Spender erfolgt nach den in den Richtlinien für Bluttransfusion [Wissenschaftlicher beirat der bundesärztekammer und vom Bundesgesundheitsamt, 1991] festgesetzten Kriterien.

Das mittels Venenpunktion gewonnene Vollblut wird in einen Beutel mit Konservierungsmittel CPD überführt und stellt so das Fertigarzneimittel oder den Ausgangsstoff für weitere Blutpräparationen während der anschließenden Fraktionierung dar. Als Fertigarzneimittel ist die Konserve 28 Tage bei 4°C haltbar. Alle zur Fraktionierung bestimmten Blutspenden müssen innerhalb von sechs Stunden verarbeitet werden.

II.4.1 Separation

Der Blutspendebeutel wird nach einer kurzen Ruhephase in die abnehmbare Zentrifugenhalterung eingelegt, sechs solche Halterungen werden genau austariert in die Zentrifuge eingehängt und mit Programm Nr. 1 zentrifugiert. Dann werden die Beutel sehr vorsichtig in je einen der Separatoren eingelegt, ein Restvolumen von 70ml wird entsprechend der Einstellung des Gerätes im [Seite 25↓]Spendebeutel verbleiben; während des automatischen Trennungsvorganges wird über den oberen Schlauchabgang das Plasma, über den unteren die gepackten Erythrozyten abgepreßt.

Um Erythrozytenkonzentrate ohne Additivlösung herzustellen, wird der Beutel mit dem Additiv z.B. PAGGS-M gegen einen Einfachbeutel mit dem Stabilisator (Antikoagulanz) CPDA1 ersetzt.

Die beiden Endprodukte EK und Plasma werden mittels “sterile docking” mit einem kleinen Leerbeutel verschweißt, und 10 ml Blutderivat ohne weitere Entlüftung in den Leerbeutel überführt. An dieser geringen Menge können alle notwendigen Bestimmungen, auch nach Ende der Haltbarkeit, durchgeführt werden, das restliche Blutderivat kann weiterhin für die Transfusion verwendet werden.

Bei Verwendung eines Vierfachbeutels wird wie oben beschrieben zentrifugiert. Das Restvolumen des Separators wird auf 100 ml eingestellt und wie gewohnt in Plasma und Erythrozytenkonzentrat getrennt. Bei Erreichen der vorgegebenen Restmenge wird der Separationsvorgang unterbrochen, die Beutel mit Plasma und Erythrozytenkonzentrat werden steril abgeschweißt.

Der Restbeutel mit dem Buffy-Coat wird nun nicht verworfen, sondern vorsichtig mit dem noch leeren Thrombozytenbeutel aus dem Separator entfernt und eine Stunde bei Raumtemperatur aufgehängt. Dabei sinken die im Beutel verbliebenen Zellen der Schwerkraft folgend nach unten. Danach wird eine Klemme oberhalb des Beutelinhaltes angebracht.

Danach werden die Beutel in einer speziellen Zentrifugenhalterung mit Programm Nr. 3 schwach zentrifugiert. Mit der automatischen Presse, deren Restvolumen zuvor auf 30 ml eingestellt wurde, wird das Thrombozytenkonzentrat sehr langsam in den dafür vorgesehenen Leerbeutel überführt. Dabei sollte keine sichtbare Verunreinigung des Konzentrats mit Erythrozyten erfolgen.

Nach Beendigung des Separationsvorganges wird die Schlauchverbindung zum Entnahmebeutel mit dem Thermoschweißgerät durchtrennt.

Das Thrombozytenkonzentrat kann bei Raumtemperatur (22°C) maximal fünf Tage gelagert werden und muß dabei kontinuierlich mit Hilfe eines Rotators bewegt werden.

Filterung von Erythrozyten-Konzentraten


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Nach der Separation werden der EK-Beutel und der Plasma-Beutel wie üblich vom Vollblutbeutel abgeschweißt. Nach steriler Entnahme einer kleinen Probe in einen Extrabeutel mit dem SCD wird ein Leukozyten-Filtersystem an den Erythrozyten-Beutel geschweißt. Am Filtersystem wird entsprechend der Gebrauchsinformation die Einlaß- und Auslaßklemme geschlossen. Anschließend wird der Beutel mit dem EK so hochgehängt, daß der Filter senkrecht unter dem Beutel hängt. Durch Öffnen der Einlaßklemme kann der Filterungsvorgang begonnen werden.

Sobald der EK-Beutel leergelaufen ist, wird die Verschlußkappe des Blutrückgewinnungssystems entfernt, und die Hälfte des noch im Filter befindlichen Blutes fließt in den Transferbeutel. Auch dem gefilterten EK wird wieder eine kleine Probe entnommen, um verschiedene Parameter zu bestimmen.

Das gefilterte EK ist zum Verbrauch innerhalb von 24 Stunden bestimmt.

II.4.2 Kryokonservierung

a) Einfrieren

Zum Tieffrieren ist grundsätzlich jedes frische Erythrozytenkonzentrat geeignet. Bei der Separation ist jedoch darauf zu achten, daß zum Erythrozytenkonzentrat keine Additiv- oder Anti-Koagulationslösung zugefügt wird, da diese beim Einfrieren kristallisieren und dabei die Erythrozyten verletzten können. Der Beutel, der diese Lösung enthält, wird abgeschweißt und ein Leerbeutel angeschweißt. Innerhalb einer Stunde nach Separation muß die Weiterverarbeitung erfolgen. Dazu werden Erythrozytenkonzentrat, Erythrozyten-Gefrierlösung und der Gambro-Beutel durch ein spezielles Transfusionsbesteck mit drei Dornen miteinander verbunden. Dieser Vorgang muß unter einer Sterilitätsbank durchgeführt werden. Zuerst wird etwas Gefrierlösung dem Erythrozytenkonzentrat beigefügt, damit dieses etwas fließfähiger wird. Es wird zuerst in den Gambro-Beutel überführt, der auf einem Rüttler langsam bewegt wird. Anschließend wird die Gefrierflüssigkeit zum Erythrozytenkonzentrat hinzugefügt. Es ist darauf zu achten, daß identische Volumina der Gefrierlösung und des Konzentrats verwendet werden. Nach vollständiger Befüllung des Beutels wird dieser mit einem speziellen Schweißgerät von Gambro verschlossen. Es sollten drei Nähte gesetzt werden, um die Dichtigkeit zu garantieren.


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Anschließend wird der Beutel in einen Metallrahmen gespannt und in flüssigem Stickstoff bei -196°C schockgefroren. Zur Lagerung in flüssigem Stickstoff wird der Metallrahmen wieder entfernt.

b) Auftauen

Der tiefgefrorene Gambrobeutel wird im 37°C warmen Wasserbad in horizontaler Stellung langsam aufgetaut. Sobald keine Eisklumpen mehr fühlbar sind, wird die Suspension mit dem SCD in einen Leerbeutel umgefüllt. Nachdem eine kleine Probe entnommen wurde, werden 120 bis 150 ml Waschlösung zugefügt und gut gemischt. Nach Zentrifugation wird der Überstand mit einem Separator (z.B. von Biotrans) entfernt. Dazu muß erst ein kleiner Abfallbeutel steril angeschweißt werden, in den dann vorsichtig der Überstand abgepreßt wird. Dabei wird auch die oberste Zellschicht mitentfernt, indem 10 cm des zum Abfallbeutel führenden Schlauches gefüllt werden. Das verbleibende Sediment wird mit 200 ml physiologischer NaCl-Lösung aufgefüllt, leicht durchmischt und ein zweites Mal zentrifugiert. Der Überstand wird über einen weiteren Abfallbeutel verworfen. Man verfährt dann weiter wie vorher, bis der Überstand makroskopisch nicht mehr hämolytisch erscheint, maximal aber viermal. Zum Schluß wird wiederum eine Probe entnommen, aus der der Glyzeringehalt bestimmt wird.

II.4.3 Thrombozytapherese

Die Gewinnung der Thrombozytenkonzentrate erfolgt entsprechend der Anleitung der Hersteller der Thrombapheresegeräte.

Unmittelbar nach Fertigstellung der Thrombozyten-Hochkonzentrate werden je eine Lifecell Gewebekulturbeutel (300 ml aus PTL 732 Plastic) bzw. ein “Konzentrat-Musterbeutel” (500 ml, aus Polyolefin) an das entsprechende Thrombozyten-Hochkonzentrat derselben Herstellerfirma steril angeschweißt. Dieser Beutel wird mit 20 ml Hochkonzentrat gefüllt und anschließend wieder vom Ursprungsbeutel durch Verschweißen abgetrennt. Das Thrombozytenkonzentrat wird unter standardisierten Blutbankbedingungen auf einem Agitator horizontal mit elliptischer Bewegungsrichtung (52 U/min) bei einer Raumtemperatur von 22°C maximal 120 Stunden gelagert.


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Aus dem Probebeutel, der die 20 ml Thrombozytenhochkonzentrat enthält, wird sofort die erste Probe zur Bestimmung von Thrombozyten-, Leukozyten- und Erythrozytenkonzentration entnommen.

Auch der Probebeutel wird bei Blutbankbedingungen gelagert.

II.4.4 Rheologische Messungen

Zur Bestimmung von rheologischen Parametern werden EK und FFP nach den oben beschriebenen Standardverfahren gewonnen. Dem Erykonzentrat wird als Additivlösung PAGGS-Mannitol zugefügt. Aus einem EK-Beutel, der mehr als 250 ml enthält, werden über einen mit dem SCD steril angeschweißten Beutel am Herstellungstag 50 ml entnommen und vier Wochen unter den vorgeschriebenen Bedingungen gelagert. Ebenso werden ca. 50 ml Frischplasma aus einem stark gefüllten Beutel in einen angeschweißten Satellitenbeutel überführt.

Zur Bestimmung von rheologischen Parametern von EK werden an den Meßtagen aus dem Satellitenbeutel nach vorheriger Homogenisierung der Probe 5 ml EK unter Einhaltung der Sterilität in einer 5 ml-Serum-Monovette (Fa. Sarstedt) entnommen.

Zur Bestimmung von rheologischen Parametern aus FFP werden am Herstellungstag aus dem Satellitenbeutel mit Frischplasma unter Einhaltung der Sterilität fünf 10 ml- Serum-Monovetten (Fa. Sarstedt) aufgezogen. Diese werden in den folgenden vier Wochen ebenso gelagert wie das FFP (-80°C). Zur Bestimmung wird am jeweiligen Meßtag immer nur eine Probe aufgetaut.

II.5 Statistik

Zur Bestimmung der Zeitabhängigkeit der gemessenen Variablen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse für Meßwiederholungen durchgeführt. Unterschreiten eines p-Wertes von 0,05 wurde als signifikant gewertet.

Da alle Stichproben normalverteilt waren (die Prüfung erfolgte mittels Kolmogoroff-Smirnow-Test), wurden sie mit Mittelwert und Standardabweichung beschrieben.


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II.6  Berechnung des Volumens

Da die einzelnen Stichproben nur gewogen werden konnten, die Richtlinien aber Volumenangaben fordern, mußte eine Umrechnung anhand der Dichte erfolgen.

Dabei gilt für Vollblut eine Dichte von 1,06 g/ml, für Plasma von 1,027 g/ml und für Erythrozyten von 1,096 g/ml [Ciba-Geigy AG, 1977].


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22.04.2005