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Einleitung

1.1 Krebs und PTHrP

Krebserkrankungen stellen die zweithäufigste Todesursache dar. Der Verlauf der Krebserkrankungen wird in erster Linie durch die direkten Tumorfolgen geprägt. Hierzu gehören im Rahmen der lokalen Invasion und Metastasierung die Infiltration, Destruktion und Arrosion benachbarter Strukturen und entfernter Organe. Daneben können tumor-assoziierte Krankheitserscheinungen, die weder auf Metastasierung oder Tumorinvasion zurückzuführen sind, den Krankheitsverlauf wesentlich mitbestimmen. Solche Krankheitserscheinungen werden als paraneoplastisches Syndrom bezeichnet und schließen neben seltenen Krankheiten des ZNS (Leukenzephalitis) und der Haut (Acanthosis migricans) insbesondere die endokrinen paraneoplastischen Syndrome ein. Sie können den klinisch nachweisbaren Tumoren vorangehen und somit die initiale Symptomatik einer Krebserkrankung darstellen. Häufiger stellen sie jedoch eine Komplikation im Verlauf der Krebserkrankung dar, die nicht selten den Beginn des Finalstadiums markiert.

Zu den Substanzen, die endokrine paraneoplastische Syndrome bedingen, gehört neben dem adrenokortikotropen Hormon (ACTH), dem antidiuretischen Hormon (ADH) und einigen anderen Hormonen das Parathormon-verwandte Protein, PTHrP (parathyroid hormone-related protein).

Im Zusammenhang mit der tumor-assoziierten Hyperkalzämie wurde schon früh der Einfluss des Parathormons oder eines Hormons vergleichbarer Wirkung diskutiert (Albright 1941). Nachgewiesen wurde das PTHrP 1987 von drei voneinander unabhängigen Forschungsgruppen (Burtis et al. 1987, Moseley et al. 1987, Strewler et al. 1987). In den nächsten Jahren klärten Broadus et al. (1988) und Martin et al. (1989) die Struktur des Proteins. Das PTHrP-Gen wurde 1989 auf dem Chromosom 12 lokalisiert. Es ist annähernd 15 Kilobasen lang und besteht aus sieben Exons und fünf Introns (Mangin et. al. 1989). Durch alternatives Spleißen resultieren vier mRNA-Typen (Abb. 1) (Ikeda et al. 1988, Yasuda et al. 1989). Die Untersuchung von mehr als zwanzig verschiedenen Krebszellarten zeigte, dass nahezu alle Zellinien alle vier mRNA-Typen erzeugen (Brandt et al. 1994, Nakamura et al. 1995). Ein Rezeptor, der die Wirkung des PTHrP vermittelt, konnte 1992 kloniert werden (Abou Samra et al. 1992). Er gehört zur Klasse der G‑Protein-gekoppelten Rezeptoren und bindet die N-terminalen 34 Aminosäuren des PTHrP und des PTH. Das Binden des Proteins an den PTH/PTHrP-Rezeptor kann sowohl die Adenylatzyklase (Kovacs et al. 1995) als auch die Phospholipase C und somit die Proteinkinase C (Guo et al. 1995) aktivieren. Auf Grundlage dessen ist die Störung der Kalziumhomöostase im Rahmen der tumor-assoziierten Hyperkalzämie als Wirkung des PTHrP anzusehen. Nachgewiesen werden konnte weiterhin seine Funktion als Wachstums- und [Seite 10↓]Differenzierungsfaktor bei verschiedenen Tumorzellarten (Burton et al. 1990, Turzynski et al. 1996). Auch Invasivität und Metastasierungsfähigkeit scheinen im Zusammenhang mit PTHrP zu stehen (Untersuchungen an Mammakarzinomen von Southby et al. 1990). Neben den genannten besitzt das Protein zugleich Aufgaben im physiologischen Bereich. Bereits 1989 deutete Martin et al. auf eine mögliche regulative Funktion im fetalen Kalziumhaushalt hin.

Abb. 1: Alternatives Spleißen der PTHrP-mRNA.

Neben den Exons I bis VII sind die alternativen Transkriptionsstartpunkte (T1, T2), die Stoppsequenzpunkte (STOP) und die Polyadenylierungsstellen (A1, A2, A3) dargestellt. Innerhalb der mRNA werden nichtkodierende Sequenzen (weis), die Führungssequenz (schraffiert) und kodierende Sequenzen (schwarz) unterschieden (nach Nakamura et al. 1995).

Abgesehen von anderen Funktionen des PTHrP weckt vor allem der Zusammenhang zwischen diesem Hormon und der humoral bedingten tumor-assoziierten Hyperkalzämie (HHM) Interesse für die Entwicklung therapeutischer Konzepte. Dabei erweist sich die HHM als ideales Krankheitsbild zur Testung gentherapeutischer ablativer Therapiestrategien. So entspricht die HHM, hervorgerufen durch die Überexpression eines Proteins, dem Bild einer monokausalen Erkrankung. Desweiteren lassen sich Therapieerfolge durch die Messung des Serum-Kalziums einfach und schnell aufzeigen. Als schwerwiegende Erkrankung rechtfertigt die HHM somit neue, experimentelle Therapien.

1.2 Ribozyme im Einsatz gegen Krebszellen

Für die Behandlung maligner Erkrankungen stehen derzeit verschiedene Verfahren zur Verfügung. Die hauptsächlich angewandten Therapieformen sind die operative Entfernung des Tumors, die Strahlen- und die Chemotherapie.


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Inhalt neuerer experimenteller Strategien ist es, den Stoffwechsel der Tumorzellen gezielt auf der Ebene der genetischen Informationsübertragung zu beeinflussen. Ein Beispiel hierfür ist die Hemmung der Genexpression durch die Behandlung der Tumorzellen mit geeigneten Substanzen. Zu den Stoffen, die die Translation regulieren können, zählen Antisense-Oligonukleotide (ASO). Diese kurzen DNA-Moleküle hybridisieren an spezifische mRNA-Sequenzen und hemmen so die Expression der entsprechenden Gene (Helene und Toulme 1990).

Auf der gleichen Ebene der genetischen Informationsübertragung wirken bestimmte Oligoribonukleotide. Analog zu den ASO können sie einen Antisense-Effekt hervorrufen. Darüber hinaus besitzen sie jedoch eine katalytische Funktion. Als eine Art Biokatalysatoren unterstützen sie Spaltungsreaktionen an Nukleinsäuren. Zur Bezeichnung dieser Struktur wurde aus den Begriffen Ribonukleotid und Enzym das Wort Ribozym geprägt.

Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften von Ribonukleinsäuren in den 80er Jahren waren Ausgangspunkt für die Entdeckung der Ribozyme (Cech 1986). Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die RNA neben der Rolle als Bote auch andere Aufgaben besitzt. In den folgenden Jahren wurden mehrere Ribozyme entdeckt. Darunter befanden sich das Hairpin-, das Hammerhead-Ribozym sowie das Hepatitis Delta Virus Ribozym (Forster und Symons 1987, Sharmeen 1988, Hampel und Tritz 1989). Heute gilt das Hammerhead-Ribozym als eines der am besten untersuchten Ribozyme. Entscheidende Impulse erhielt diese Entwicklung aus den Arbeiten von Uhlenbeck (1987), Haseloff und Gerlach (1988). Die Bedeutung lag vor allem im Bestimmen einer biologischen Struktur, die gezielt die Spaltung einer variablen Zielsequenz katalysiert.

Bei dem Hammerhead-Ribozym, dessen Name sich von seiner zweidimensionalen Struktur her ableitet, lassen sich aus funktioneller Sicht zwei Bereiche, die Stammschleife und die Flanken, unterscheiden (Abb. 2). Die Stammschleife wiederum teilt sich in konservierte Regionen mit konstanter und in Regionen mit variabler Basensequenz auf (Forster und Symons 1987). Werden Basen in den konservierten Regionen ausgetauscht, so führt dies zu einer verringerten kataly­ti­schen Aktivität. Die Flanken bestimmen durch ihre zur Ziel-RNA komplementären Sequenzen die Spezifität des Ribozyms.

Ein entscheidender Bereich der Zielsequenz stellt das NUH-Triplet dar. Für H steht in erster Linie C, jedoch sind auch A und U mögliche Varianten. Für N kann jedes Nukleotid eingesetzt werden (Haseloff und Gerlach 1988, Perriman 1992).


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Abb. 2: Hammerhead-Ribozym.

Im Kasten ist ein in den Positionen der Ribose beziffertes Ribonukleotid dargestellt.

Bei der Reaktion wird die Zielsequenz im Anschluss an das NUH-Triplet gespalten. Die hierbei gebildeten RNA-Produkte besitzen 5‘-Hydroxylgruppen und 2‘,3‘-zyklische Phosphatgruppen. Wesentlich für die Reaktion ist die Existenz von zweiwertigen Metallionen. Eine reaktionsfördernde Wirkung wurde sowohl für Mg2+-Ionen als auch für Mn2+- und Ca2+-Ionen nachgewiesen (Uhlenbeck 1987).

Für den Einsatz von Ribozymen zur Hemmung der Genexpression in lebenden Zellen existieren grundsätzlich zwei mögliche Varianten. Zum einen wird durch die Integration des Ribozymgens in das Genom der Wirtszelle die endogene Expression des Ribozyms erlaubt. Zum anderen kann das Ribozym direkt, etwa durch Transfektion mit kationischen Liposomen, in die Zelle eingebracht werden. Da die Handhabung der Ribozyme insbesondere durch ihre hohe Empfindlichkeit gegenüber Nukleasen erschwert wird, besteht der Vorteil der Transfektionsmethode darin, dass Stabilität und Aktivität der Ribozyme vor deren Nutzung durch Modifikationen gesteigert werden können.

In der Literatur wurden bereits verschieden Methoden, die der Stabilisierung der Ribozyme dienen, beschrieben. Eine Strategie war es, im Rahmen der chemischen Synthese der Ribozyme spezielle Nukleotide in sie einzufügen. Die in der 2‘‑Position modifizierten Nukleotide wurden an verschiedenen Positionen und in unterschiedlichem Ausmaß eingebaut. Verwendung fanden 2’‑Amino-, 2’‑Fluoro-, 2’-Desoxy-, 2’‑O-Allyl- und 2’‑O‑Methyl-ribonukleotide. Diese Modifikationen erhöhten die Stabilität der Ribozyme drastisch, während ihre katalytische Aktivität weitestgehend erhalten blieb (Pieken et al. 1991, Paolella et al. 1992, Taylor et al. 1992, Shimayama et al. 1993, Beigelman [Seite 13↓] et al. 1995). Eine zusätzliche Steigerung der Widerstandsfähigkeit gegenüber Nukleasen nach dem teil weisen Ersatz der Ribonukleotide durch Desoxyribonukleotide konnte durch eingeführte Phosphorthioatverbindungen erreicht werden (Hendry et al. 1992, Shimayama et al. 1993).

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Entwicklung eines metabolisch stabilen Ribozyms. Es sollte ausgehend von einem gegen die PTHrP-mRNA gerichteten Hammerhead-Ribozym derart modifiziert sein, dass es eine hohe katalytische Aktivität und eine ausreichende Resistenz gegenüber Nukleasen aufweist. Bei der Entwicklung und der sich anschließenden Behandlung von Tumorzellen in Monolayer-Zellkultur mit dem Ribozym waren folgende Fragen zu klären:


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01.09.2004