[Seite 38↓]

Ergebnisse

3.1 Herstellung der RNA-Ribozyme und der Substrat-RNA

Für die In-vitro-Transkription mit der T7-RNA-Polymerase sind dsDNA-Templates notwendig. Sie wurden für die Substrat-RNA und die Ribozyme RbO, RbM und Rb8/12 durch PCR amplifiziert. Die Kontrolle der PCR-Produkte erfolgte durch Elektrophorese im Agarosegel (Abb. 5 und Abb. 6). Die dsDNA-Templates der Ribozyme Rb5/10 und Rb4/8 wurden mit dem Klenow-Enzym hergestellt.

Abb. 5: DNA-Template für Substrat-RNA.

1,5 %iges Agarosegel, 1: DNA-Längenmarker VIII, 2: DNA-Template für Substrat-RNA (252 bp).

Abb. 6: DNA-Templates für Ribozyme.

2 %iges Agarosegel, 1: DNA-Längenmarker VIII, 2 ‑ 4: DNA-Templates der Ribozyme RbO (2), RbM (3) (beide 62 bp) und Rb8/12 (4) (58 bp).


[Seite 39↓]

Nach der In-vitro-Transkription wurde der gesamte Reaktionsansatz im Polyacrylamid-Gel (PAA-Gel) aufgetrennt (Abb. 7). Die Transkripte ließen sich durch Ausschneiden und Elution aus dem Gel reinigen. Das radioaktive Signal der gereinigten RNA wurde in einem Szintillationszähler gemessen. Aus den Messwerten konnte die Ausbeute an gereinigter RNA pro Transkriptionsansatz errechnet werden. Sie lag abhängig vom dsDNA-Template zwischen 20 und 200 pmol.

Abb. 7: In-vitro-Transkription.

10 %iges denaturierendes (7 M Harnstoff) PAA-Gel, 1 und 2: Substrat-RNA (232 b), 3 und 4: Ribozym RbO (42 b).

3.2 Ribozymkinetik

Die bei den kinetischen Untersuchungen erhobenen Daten basieren auf der densitometrischen Auswertung von Bildplatten an einem Phosphordensitometer. Auf den Bildern, die dabei mit Hilfe der Molecular Analyst Software erstellt wurden, sind die Banden der ungespaltenen Substrat-RNA [Seite 40↓](232 b), die Banden der Spaltprodukte (152 und 80 b) und die Banden der radioaktiv markierten Ribozyme (zwischen 42 und 30 b) zu sehen.

3.2.1 Katalytische und nicht katalytische Variante des Hammerhead-Ribozyms

Zunächst erfolgte ein Vergleich des unmodifizierten Hammerhead-Ribozyms RbO mit seinem nichtkatalytischen Pendant RbM. Sie unterscheiden sich zueinander durch den Wechsel zweier Basen in der Stammschleife. Es wurde das Guanin an Position 11 gegen ein Adenin und das Adenin an Position 30 gegen ein Guanin ausgetauscht.

Für das Ribozym RbO wurde die Bestimmung des kobs-Wert dreimal durchgeführt. Der daraus errechnete Mittelwert betrug 47,42 min-1 (x 10-3). Die mittlere Standardabweichung lag bei
8,86 min-1 (x 10-3). Das Ribozym RbM zeigte erwartungsgemäß keine katalytische Aktivität (Abb. 8 und Abb. 9).

Abb. 8: Spaltung der Substrat-RNA durch die Ribozyme RbO und RbM.

Es ist das bei der Auswertung am Phosphordensitometer erzeugte Bild eines getrockneten 10 %igen denaturierenden PAA-Gels dargestellt. Es zeigt die Substratspaltung für die Ribozyme RbO und RbM nach 0,5, 1,5, 3, 10, 30, 90 und 150 Minuten.


[Seite 41↓]

Abb. 9: Vergleich der Ribozyme RbO und RbM.

Die dargestellten Kurven entsprechen der zeitabhängigen Produktentstehung während der Reaktion.

3.2.2 Verkürzung der Stammschleife und der Flankenlängen

Als erste Modifizierungen des Hammerhead-Ribozyms RbO wurden Verkürzungen der Stammschleife und der Flanken vorgenommen. Dazu wurden die Ribozyme Rb8/12, Rb5/10 und Rb4/8 erstellt.

Durch Baseneinsparung in den Positionen 17, 18, 25 und 26 besitzt das Ribozym Rb8/12 eine kürzere Stammschleife als das Originalribozym (RbO). Die Ribozyme Rb5/10 und Rb4/8 zeichnen sich sowohl durch eine kürzere Stammschleife als auch durch kleinere Flanken (Verkürzung von 8 und 12 Basen auf 5 und 10 sowie 4 und 8 Basen) aus.

Im Vergleich der Ribozyme zeigte das Ribozym Rb8/12 eine zweimal höhere Aktivität als das Ribozym RbO. Die Ribozyme mit verkürzten Flanken wiesen hingegen eine um 25 % (Rb4/8) bis 50 % (Rb5/10) verminderte Aktivität gegenüber RbO auf (Abb. 10 und Abb. 11).


[Seite 42↓]

Abb. 10: Vergleich der Ribozyme RbO, Rb8/12, Rb5/10 und Rb4/8.

In der ersten Bahn wurde ein Kontrollwert (K) aufgetragen. Er entspricht einer Probe nach 120 Minuten aus einem ribozymfreien Reaktionsansatz. In den übrigen Bahnen ist die Substratspaltung der Ribozyme nach 2,5, 5, 10, 30, 60 und 120 Minuten dargestellt.

Abb. 11: Auswertung des Vergleichs der Ribozyme RbO, Rb8/12, Rb5/10 und Rb4/8.

Die ermittelten kobs-Werte sind im Säulendiagramm im Verhältnis zum kobs-Wert des Ribozyms RbO (entspricht 1,0) dargestellt.

3.2.3 Einfluss der Reaktionsbedingungen auf die katalytische Aktivität des Ribozyms Rb8/12

Um einschätzen zu können, wie sich veränderte Reaktionsbedingungen auf die katalytische Aktivität eines Hammerhead-Ribozyms auswirken, sind der pH-Wert, die Reaktionstemperatur und die Ma[Seite 43↓]gnesiumkonzentration bei Spaltversuchen des Ribozyms Rb8/12 variiert worden. Zudem wurde der Einfluss einer Facilitator-DNA auf die Reaktion getestet.

Die bei der Auswertung ermittelten kobs-Werte wurden mit den unter Standardbedingungen errechneten verglichen. Zur besseren Veranschaulichung sind die letzteren als 1,0 angenommen worden. Als Standardbedingungen galten ein pH-Wert von 7,5, eine Reaktionstemperatur von 37 °C und eine Magnesiumkonzentration von 10 mM. Der kobs-Wert für die Reaktion ohne Zugabe eines Facilitators wurde auf 1,0 gesetzt.

In den Versuchen zur pH-Abhängigkeit stellte sich für das Ribozym Rb8/12 ein pH-Optimum von 9,5 heraus. Bei pH-Werten unterhalb von 6,0 verlor das Ribozym seine Aktivität.

Die Reaktionen bei 25, 37 und 45 °C zeigten, dass eine Erhöhung der Reaktionstemperatur in diesem Bereich mit einer Steigerung der Aktivität des Ribozyms einhergeht.

Eine ebenso positive Abhängigkeit wies die Aktivität des Ribozyms in einem Bereich zwischen 2 und 200 mM von der Magnesiumkonzentration auf.

Durch die Zugabe eines Facilitators stieg die katalytische Aktivität um 60 % (Abb. 12).

Abb. 12: Einfluss der Reaktionsbedingungen auf die Aktivität des Ribozyms Rb8/12.

Die kobs-Werte sind im Verhältnis zu den unter Standardbedingungen (pH 7,5, 37 °C, 10 mM Magnesium, ohne Facilitatorzugabe) ermittelten kobs-Werten dargestellt.


[Seite 44↓]

3.2.4  RNA-DNA-Ribozyme

Der nächste Schritt bei der Entwicklung eines metabolisch stabilen Ribozyms bestand im teilweisen Austausch von Ribonukleotiden durch Desoxyribonukleotide. Ausgangsprodukt für diese Modifizierungen waren die reinen RNA-Ribozyme Rb5/10 und Rb8/12.

Durch eine weitere Verkürzung der Flanken und DNA-Modifizierungen zeichnet sich das Ribozym Rb4/6V1 aus. Das Ribozym Rb5/10, das im vorhergehenden Vergleich nur eine geringe Aktivität aufwies, wurde zusätzlich synthetisiert.

Zunächst erfolgte ein Vergleich des Ribozyms Rb5/10 mit seinen DNA-modifizierten Varianten. Das Ribozym Rb4/6V1 wurde in diesen Vergleich mit einbezogen (Abb. 13).

Abb. 13: Erster Vergleich DNA-modifizierter Ribozyme.

Für jedes Ribozym ist die Substratspaltung nach 10 und 120 Minuten gezeigt.

Hierbei zeigte sich, dass eine Verkürzung der Flanken auf insgesamt 10 Basen zum vollständigen Aktivitätsverlust des Ribozyms führt. Ausgehend vom Ribozym Rb5/10 wurden zunächst die Flanken DNA-modifiziert, was ohne drastische Aktivitätsverluste möglich war. Auch die Stammschleife kann weitgehend durch Desoxyribonukleotide aufgebaut werden.

Im Folgenden wurden die DNA-modifizierten Ribozyme verglichen, die in den Flanken 8 und 12 Basen aufweisen. Der Vergleich erfolgte zusammen mit den Ribozymen RbO und Rb8/12. Die Versuchsbedingungen waren mit denen im vorhergehenden Vergleich identisch (Abb. 14).


[Seite 45↓]

Abb. 14: Zweiter Vergleich DNA-modifizierter Ribozyme.

Es ist die Substratspaltung für die Ribozyme jeweils nach 10 und 120 Minuten dargestellt.


[Seite 46↓]

Abb. 15: Auswertung der Abbildung 13 und 14.

In der oberen Grafik sind die Kurven dargestellt, die die densitometrisch ermittelten Werte für die Substratspaltung nach 10 und 120 Minuten mit dem hypothetischen Nullwert (keine Spaltung bei t = 0) verbinden. Die Kurven folgen der Funktion Pt = P∞ − P∞exp(−k t). Zur besseren Übersicht sind nur die Kurven der Ribozyme RbO, Rb8/12, Rb5/10 und Rb8/12V4 gezeichnet. Die Säulengrafik stellt für jedes Ribozym den Wert k im Verhältnis zum Wert k des Ribozyms RbO dar.

3.2.5  Modifizierung mit Phosphorothioaten

Für die Modifizierung mit Phosphorothioaten empfahl sich das Ribozym Rb8/12V4. Es besteht zu 71 % aus DNA und übertrift in seiner Aktivität das Original-Ribozym RbO. Zunächst wurde das [Seite 47↓]Ribozym Rb8/12V4PT synthetisiert. Dieses weist gegenüber dem Ribozym Rb8/12V4 am 5‘-Ende eine und am 3‘-OH-Ende drei Modifizierungen mit Phosphorothioaten auf. In einem weiteren Syntheseschritt wurde Rb8/12V4PT am 3‘-OH-Ende mit Fluorescein gekoppelt. Diese Modifikation ermöglichte den intrazellularen Nachweis des transfizierten Ribozyms RbF unter dem Mikroskop.

In der folgenden kinetischen Untersuchung wurden die Ribozyme Rb8/14V4, Rb8/12V4PT und RbF verglichen (Abb. 16).

Der Einbau von Phosphorothioaten in das Ribozym Rb8/12V4PT verursachte eine Aktivitätsminderung um 30 % gegenüber Rb8/12V4. Das fluoresceingekoppelte Ribozym RbF hat im Vergleich zum Ribozym Rb8/12V4 über 85 % der Aktivität verloren (Abb. 17).

Abb. 16: Modifikationen des Ribozyms Rb8/12V4.

Dargestellt ist die Substratspaltung nach 0,5, 1,5, 3, 10, 30 und 120 Minuten.

Abb. 17: Auswertung der Abbildung 16.

Die kobs-Werte der Ribozyme sind im Säulendiagramm als relativ zum kobs-Wert des Ribozyms Rb8/12V4 dargestellt.


[Seite 48↓]

3.2.6  Modifizierung mit Phosphorothioaten und Basenaustausch

Um eine Stabilisierung zu erreichen, wurden beim Ribozym RbS gegenüber Rb8/12V4PT auch im Bereich der Stammschleife drei Phosphorothioatmodifikationen vorgenommen. Zudem erfolgte ein Austausch des Uracils an Position 13 gegen ein Adenin. Insgesamt wurde damit das Ribozym RbS gegenüber dem unmodifizierten Hammerhead-Ribozym RbO wie folgt verändert:

1.

Verkürzung der Stammschleife und der Flanken

2.

RNA-DNA-Austausch

3.

Koppelung mit Phosphorothioaten

4.

Basenaustausch in der Stammschleife

Im Vergleich zwischen dem Ribozym RbO und dem Ribozym RbS zeigte sich, dass ihre Aktivitäten trotz der umfangreichen Modifikationen nicht differierten. Mit p = 0,743 (α = 0,5) ergab sich im t‑Test für die kobs-Werte der Ribozyme kein signifikanter Unterschied (Abb. 18 und Abb. 19).

Abb. 18: Vergleich der Ribozyme RbO und RbS.

Die Abbildung zeigt die Substratspaltung der Ribozyme nach 0,5, 1,5, 3, 10, 30, 90 und 150 Minuten.


[Seite 49↓]

Abb. 19: Auswertung der Abbildung 18.

In der Säulengrafik sind die gemittelten kobs-Werte für die Ribozyme RbO und RbS verzeichnet.

3.2.7 Kationisches Lipid

Die Transfektion der Zellen mit dem stabilisierten Ribozym sollte mit Hilfe eines kationischen Lipids erfolgen. In einer kinetischen Untersuchung wurde zuvor dessen Einfluss auf die katalytische [Seite 49↓]Aktivität überprüft. Dabei stellte sich heraus, dass sich die Aktivität des Ribozyms RbS nach Zugabe eines Lipids zum Reaktionsansatz um 20 % verringerte (Abb. 20).

Abb. 20: Einfluss eines kationischen Lipids auf die Aktivität des Ribozyms RbS.


[Seite 50↓]

3.2.8  Kontrollribozym RbSSc

Die Behandlung der Zellen mit dem stabilisierten Ribozym kann durch unspezifische Effekte eine Verringerung der PTHrP-Sekretion hervorrufen. Um diese von der erwünschten Wirkung des Ribozyms unterscheiden zu können, wurde ein weiteres Ribozym (RbSSc) erstellt. Es besitzt im Gegensatz zum Ribozym RbS Flanken, deren Sequenzen nicht komplementär zur Substrat-RNA sind. Die Flanken verfügen rechnerisch über die gleichen Basen, sind jedoch durch das Vertauschen der Basen in ihrer Sequenz verändert. Im Test zeigte dieses Ribozym keine Aktivität (Abb. 21).

Abb. 21: Vergleich des Kontrollribozyms RbSSc mit dem stabilisierten Ribozym.

Es ist die Substratspaltung nach 0,5, 1,5, 3, 10, 30, 90 und 150 Minuten dargestellt.

3.3 Stabilitätstest

Die metabolische Stabilität des Ribozyms RbS gegenüber dem unmodifizierten Ribozym RbO wurde in 1 %igem Kälberserum (FCS) getestet. In der FCS-Lösung lagen die Ribozyme in einer Konzentration von 1 µM vor. Die Auswertung des Stabilitätstests ergab für das Ribozym RbS eine Halbwertzeit von mehr als 10 Stunden. Sie war gegenüber der für das Ribozym RbO ermittelten Halbwertzeit (ca. eine Stunde) über das Zehnfache erhöht.


[Seite 51↓]

Abb. 22: Stabilität von RbO und RbS im Serum.

Es ist der Abbau der Ribozyme nach einer Minute sowie nach 0,5, 1, 2, 4, 6 und 10 Stunden abgebildet. Um das Ribozym RbS und dessen Abbauprodukte autoradiografisch darstellen zu können, erfolgte vor dem Versuch eine radioaktive 5‘-End-Markierung des Ribozyms.

Abb. 23: Auswertung der Abbildung 22.

3.4 Transfektion

Vor der Behandlung der Tumorzellen in Monolayer-Zellkultur durch lipidvermittelte Transfektion mit dem stabilisierten Ribozym, wurden in Transfektionsversuchen acht verschiedene kationische Lipide des PerFect Lipid Transfection Kit (Invitrogen) zusammen mit dem Ribozym RbF getestet. [Seite 52↓]Der Nachweis des fluoresceinmarkierten Ribozyms RbF in den Zellen erfolgte an einem konfokalen Mikroskop. Für die Zellbehandlung wurde das Lipid 6 des PerFect Lipid Transfection Kit ausgewählt, da es die stärkste diffus zytoplasmatische Verteilung des Ribozyms bedingte (Abb. 24).

Abb. 24: Transfektion.

Die Abbildung zeigt Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 nach lipidvermittelter Transfektion mit dem Ribozym RbF. Das Ribozym stellt sich im Zytoplasma als diffuse Färbung dar (dicke Pfeile). Darüber hinaus existiert es im Zytoplasma innerhalb liposomaler Einschlüsse (gepunktete Pfeile) und außerhalb der Zellen in größeren Lipid-Ribozym-Komplexen (dünne Pfeile).

3.5 Behandlung der Zellen

3.5.1 Ribozym RbS und RbSSc

Um die Wirksamkeit des stabilisierten Ribozyms RbS in vivo zu überprüfen, wurden mit diesem Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 in Monolayer-Zellkultur behandelt. Parallel dazu erfolgte eine Kontrollbehandlung der Zellen mit dem Ribozym RbSSc. Das ebenfalls stabilisierte Ribozym RbSSc kann sich auf Grund inkomplementärer Flanken nicht an die PTHrP-mRNA binden. Es besitzt somit gegenüber der PTHrP-mRNA keine katalytische Aktivität.

Die Ribozyme lagen in dem Transfektionsmedium in einer Konzentration von 166 nM vor. In Bezug auf das Kontrollribozym RbSSc ließ sich für das Ribozym RbS kein Effekt nachweisen. Die in den 60 Minuten nach der Behandlung (2. Wert) gemessenen PTHrP-Sekretionen waren mit p = 0,706 (α = 0,5) nicht signifikant verschieden (Abb. 25).


[Seite 53↓]

In einem weiteren Versuch wurden die Zellen nochmals zum einen in der vorher genannten und zu anderen in der fünffach höheren Konzentration mit Ribozymen und Lipid behandelt. Es zeigte sich nach der Behandlung mit den höheren Ribozym- und Lipidkonzentrationen eine Verringerung der PTHrP-Sekretion. Jedoch konnte auch in diesem Fall kein signifikanter Unterschied (2. Wert: p = 0,365 (α = 0,5)) hinsichtlich der Sekretion von PTHrP zwischen der Behandlung mit dem Ribozym RbS und dem Kontrollribozym RbSSc festgestellt werden.

Abb. 25: Behandlung mit dem Ribozym RbS und dem Kontrollribozym.

Dargestellt sind die nach 60 und 120 Minuten gemessenen Extinktionen bei 450 nm. Der 60 Minuten-Wert entspricht der Sekretion während der einstündigen Behandlung mit den Ribozymen und der 120 Minuten-Wert der Sekretion in den 60 Minuten nach der Behandlung.

Abb. 26: Behandlung mit erhöhten Ribozym- und Lipidkonzentrationen.

Das Prinzip der Darstellung entspricht dem in Abbildung 25.


[Seite 54↓]

3.5.2  Antisense-Oligonukleotid

Antisense-Oligonukleotide können in Zellen durch Bindung an mRNA zur Verringerung der Expression des entsprechenden Gens führen. Die Behandlung der Zellen mit dem Antisense-Oligonukleotid ASO8/12 sollte diesen möglichen Effekt für die PTHrP-Sekretion nachweisen.

In einem Versuch wurden die Zellen mit dem Ribozym RbS oder dem ASO8/12 behandelt. Beide lagen in Konzentrationen von 1 µM vor. Auf die Zugabe von einem Lipid im Behandlungsmedium wurde verzichtet.

Gegenüber der Kontrollsekretion (K) sind für die Behandlung mit dem Ribozym und dem Antisense-Oligonukleotid keine signifikanten Unterschiede gemessen worden (Abb. 27).

Eine Erhöhung der Konzentration des Antisense-Oligonukleotid (bis 10 µM) führte zu keiner Verringerung der PTHrP-Sekretion (Abb. 28).

Abb. 27: Behandlung mit dem Ribozym RbS und dem Antisense-Oligonukleotid.

Das Prinzip der Darstellung entspricht dem in Abbildung 25.


[Seite 55↓]

Abb. 28: Behandlung mit hohen Antisense-Oligonukleotid-Konzentrationen.

Das Prinzip der Darstellung entspricht dem in Abbildung 25.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
01.09.2004