[Seite 56↓]

Diskussion

In dieser Arbeit sollte schrittweise ein Ribozym gegen die PTHrP-mRNA entwickelt werden. Um es für die Behandlung von Tumorzellen in Monolayer-Zellkultur einsetzen zu können, waren verschieden Modifikationen am Ribozym notwendig. Die strukturellen und chemischen Abänderungen des Ausgangsribozyms sollten bei gewahrter katalytischer Aktivität zu einer erhöhten Nukleasenstabilität führen.

Die Laborarbeit gliederte sich methodisch in folgende Schwerpunkte:

 

  • Substrat- und Ribozymherstellung
  • Kinetik-Tests
  • Stabilitätstest
  • Behandlung der Zellen.

Am Anfang standen vorbereitende Arbeiten, die dem Herstellen der Ribozyme und der Substrat-RNA dienten. Dabei erwies es sich als problematisch, die radioaktiv markierten RNA-Stränge in für die Ribozymkinetik ausreichender Menge und Reinheit zu erzeugen.

Als der entscheidende Abschnitt dieser Arbeit sind die kinetischen Untersuchungen anzusehen. Mit ihrer Hilfe war es möglich, die unterschiedlich modifizierten Ribozyme zu differenzieren und die Einflüsse der verschiedenen Modifikationen auf die katalytische Aktivität zu untersuchen.

Vor den Zellversuchen wurde das Ribozym RbS - es stellte das Ergebnis der Entwicklung dar - auf seine metabolische Stabilität getestet.

Die Behandlung der Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 mit dem Ribozym RbS beendete die experimentelle Phase der Arbeit.

4.1 Substrat-RNA und RNA-Ribozyme

Da die kinetischen Untersuchungen unter single-turnover-Bedingungen im Bereich von 1 µM erfolgten, wurde eine beträchtliche Menge der 232 Basen langen Substrat-RNA benötigt. Diese Synthesemenge war durch die In-vitro-Transkription nur zu erreichen, wenn bei dieser Reaktion mindestens 20 µg Template-DNA eingesetzt wurden.


[Seite 57↓]

Im Folgenden sind die Syntheseschritte der Substrat-RNA zusammengefasst:

Amplifikation der Template-DNA durch PCR

Reinigen der Template-DNA

In-vitro-Transkription

Reinigen und Vermessen des Transkriptionsprodukts

Um die Menge an amplifizierter DNA bei der PCR zu erhöhen, wurde die Reaktion optimiert. Das gelang zum einen durch Verkürzen des PCR-Templates von 413 auf 252 Basen. Die zu diesem Zweck erforderliche Primer-DNA wurde mit der Oligo-Software ermittelt. Neben der höheren PCR-Ausbeute führte die Verkürzung später zusätzlich zu einer höheren Transkriptionseffizienz.

Zum anderen wurden die Annealing-Temperatur und die Zyklenzahl angepasst. Hilfreich war hierfür neben durchgeführten Testreihen die Oligo-Software, mit der sich eine Richttemperatur ermitteln ließ. Die optimierte PCR zeigte im Kontrollgel nur geringe Degradationsprodukte und keine Fehlbanden (Abb. 5).

Die Reinigung des PCR-Produkts von Proteinen (DNA-Polymerase) und Nukleotiden hatte einen maßgeblichen Einfluss auf das Gelingen der In-vitro-Transkription. Es konnte festgestellt werden, dass ein zweimaliges Ausschütteln des PCR-Ansatzes mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol gegenüber einem einmaligen zu einer deutlich höheren Transkriptionseffizienz führt. Bei einem Einsatz von ungereinigter Template-DNA in der In-vitro-Transkription war das Reaktionsprodukt im PAA-Gel nicht klar von degradierten oder nicht vollständig synthetisierten Produkten abzugrenzen.

Für die weitere Verwendung der Substrat-RNA und der Ribozyme in den Kinetikuntersuchungen war es notwendig, sie im Anschluss an die Transkription von zusätzlich transkribierten Fehlbanden, von Template-DNA, Proteinen und Degradationen zu selektieren. Dabei kam es insbesondere darauf an, die entsprechenden Banden der Transkriptionsprodukte aus dem PAA-Gel präzise herauszuschneiden. Nur so konnte gewährleistet werden, dass die spätere Mengenbestimmung und die kinetischen Tests nicht durch Doppelbanden verfälscht wurden.


[Seite 58↓]

4.2  Ribozymkinetik

Die Reaktionsgeschwindigkeit von chemischen Prozessen lässt sich in vielen Fällen durch spezielle Substanzen regulieren. Dabei bleiben die Katalysatoren - so werden diese Substanzen bezeichnet - während der Reaktion in ihrer Struktur und Menge erhalten. Für die Katalysatoren in biologischen Systemen wurden die Begriffe Biokatalysator bzw. Enzym geprägt. Sie werden in der Mehrzahl durch intrazelluläre Proteine verkörpert, die monomer, oligomer, einfach oder komplex strukturiert sind. Aber auch für einige Ribonukleinsäuren, Ribozyme genannt, wurde enzymatische Aktivität nachgewiesen (Cech 1986).

Die Reaktionskinetik der von Ribozymen katalysierten Reaktionen gleicht der anderer Enzymsysteme. So lässt sich die enzymatische Reaktion allgemein durch folgende Gleichung wiedergeben (Hendry et al. 1992):

Die Gleichgewichtskonstante K des ersten Reaktionsschritts ergibt sich aus dem Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten für Substratassoziation und -dissoziation (K = k1 / k-1). Im zweiten Schritt, auch als chemischer Schritt bezeichnet, findet die eigentliche Substratspaltung statt. Ihre Geschwindigkeit wird mit der Konstante k2 beschrieben. Sie ist von der Konzentration der Reaktionskomponenten (Substrat [S], Ribozym [R]) unabhängig. Die entsprechende Rückreaktion ist zu vernachlässigen.

Der letzte Schritt umfasst die Produktdissoziation. Er könnte auch in zwei weitere, parallel verlaufende Zwischenschritte untergliedert werden (RP1 + P2 oder RP2 + P1). Als eine Besonderheit der ribozymkatalysierten Reaktionen ist dabei die starke Bindung zwischen komplementären RNA-Strängen herauszustellen. Sie kann den letzten Reaktionsschritt zu einem die Gesamtreaktion limitierenden Schritt werden lassen (McConnell 1997).

Entsprechend anderen Enzymen können Ribozyme durch die katalytische Konstanten Km, kcat und kcat/Km näher charakterisiert werden. Die Werte ergeben sich aus der klassischen Michaelis-Menten-Kinetik. Diese geht davon aus, dass bei konstanter Enzymmenge die Substratkonzentration schrittweise angehoben wird. Mit dem Anstieg des Enzym-Substrat-Komplexes (ES) nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit (initialer Substratumsatz) zu. Wird die Reaktionsgeschwindigkeit im Koordinatensystem als Funktion der Substratkonzentration aufgetragen, erhält man eine hyperbolische Kurve, die sich asymptotisch der Maximalgeschwindigkeit Vmax nähert. Bei maximalem initialen Substratumsatz liegt die gesamte Enzymmenge als Enzym-Substrat-Komplex vor. Die dann bestehende [Seite 59↓]Substratsättigung bedingt, dass die Geschwindigkeit nur durch eine Erhöhung der Enzymkonzentration zu steigern ist.

Abb. 29: Michaelis-Menten-Kinetik.

Die Konzentration des Substrats, die zur Sättigung führt, ist für jedes Enzym verschieden. Da sich jedoch die experimentelle Bestimmung der Sättigungskonzentration als schwierig erwies, führten Michaelis und Menten (1913) den standardisierten Wert Km ein. Der auch als Michaeliskonstante bezeichnete Km-Wert entspricht der Substratkonzentration bei halbmaximaler Geschwindigkeit. Er stellt somit die Substratkonzentration dar, bei der die Hälfte des vorhandenen Enzyms mit Substrat gesättigt ist (Abb. 29).

Mit Hilfe des Km-Werts lassen sich Aussagen über die Substrataffinität des Enzyms treffen. Ist der Km-Wert hoch, bedeutet es, dass eine große Substratmenge zur Sättigung des Enzyms erforderlich ist. Das Enzym besitzt eine geringe Affinität zum Substrat. Analog ergibt sich für ein starkes Bindungsbestreben zwischen Enzym und Substrat ein geringer Km-Wert.

Der kcat-Wert, in älterer Literatur auch als Wechselzahl (turnover number) bezeichnet, gibt die molare katalytische Aktivität des Enzyms an. Er entspricht dem Quotienten aus gemessener Maximalgeschwindigkeit Vmax und der eingesetzten Enzymmenge. Dieser für jedes Enzym spezifische Wert besitzt die Dimensionen s-1 oder min-1. Er gibt an, wie viel Substratmoleküle in der Zeiteinheit von einem Enzymmolekül bzw. einem katalytischen Zentrum bei Substratsättigung umgesetzt werden. In der Michaelis-Menten-Kinetik entspricht der kcat-Wert der Geschwindigkeitskonstante für den chemischen Schritt.


[Seite 60↓]

Aus dem Km und kcat-Wert errechnet sich die katalytische Effizienz eines Enzyms. Der auch als Spezifitätskonstante bezeichnete Term kcat/Km ist besonders für den Vergleich von verschiedenen Substraten eines Enzyms oder von mehreren Enzymen, die dasselbe Substrat umsetzen, geeignet.

Je nachdem, welche Reaktionskomponente - Substrat oder Ribozym - im Vergleich zur jeweils anderen im Überschuss vorliegt, wird zwischen Reaktionen unter multiple- oder single-turnover Bedingungen unterschieden. Multiple-turnover Reaktionen erfolgen unter Substratüberschuss. Dabei wird festgestellt, ob ein Ribozym in der Lage ist, mehrere Substratmoleküle zu spalten. Unter diesen Reaktionsbedingungen können alle Reaktionsschritte, insbesondere die Produktdissoziation, den Reaktionsumsatz limitieren. Durch eine Balance zwischen Bildung und Zerfall des Ribozym-Substrat-Komplexes (RS) wird über einen längeren Zeitraum der Reaktion sowohl die RS-Konzentration als auch die freie Ribozympopulation konstant gehalten (steady state).

Bei single-turnover-Reaktionen liegt das Ribozym im Überschuss vor. Dies macht es wahrscheinlich, das ein Ribozym die Spaltung von nicht mehr als einem Substratmolekül katalysiert. Die Produktdissoziation spielt deshalb als reaktionslimitierender Faktor keine Rolle. Vielmehr sind nur die ersten beiden Reaktionsschritte, nämlich die Bildung des RS-Komplexes und die Spaltungsreaktion, für den Reaktions­umsatz entscheidend.

Die Entscheidung für eine der beiden genannten Formen der Reaktionskinetik ist in erster Linie von den Strukturen der Reaktionspartner abhängig. Um die Effektivität verschiedener Ribozyme bei der Spaltung einer kurzen Substrat-RNA zu vergleichen, sind Reaktionen unter multiple-turnover-Bedingungen gut geeignet. Dazu werden mit Hilfe der Michaelis-Menten-Kinetik die katalytischen Konstanten kcat,Km und kcat/Km ermittelt.

Für die Spaltung längerer Substrate spielen Sekundärstrukturen der RNA-Stränge eine wichtige Rolle. Sie können zu einer erheblichen Verminderung der katalytischen Effizienz führen. So ergaben sich für die Spaltung der LTR 1 RNA des HIV Typ1 (ca. 1.000 Basen) im Vergleich zur Spaltung kurzer synthetischer Substrate (19 Basen) um mindestens drei Größenordnungen niedrigere kcat/Km-Werte (Heidenreich und Eckstein 1992). Der Grund für den geringen Umsatz unter Substratüberschuss könnten starke Sekundärstrukturen, insbesondere doppelsträngige und haarnadelförmige, im Bereich und in der Nähe der Zielsequenz sein. Ebenfalls wäre es denkbar, dass die Erreichbarkeit der Zielsequenz für das Ribozym durch Sekundärstrukturen eingeschränkt wird. Ein herabgesetztes Bindungsvermögen eines Ribozyms an ein langes Substrat konnte durch ein Absinken des Km-Wertes nachgewiesen werden. Die chemische Umsetzung des Substrats - durch den kcat-Wert charakterisiert - wurde dabei nicht beeinflusst (Fedor und Uhlenbeck 1990). Neben den Sekundärstrukturen würde auch die Bildung von irregulären Ribozym-Substrat-Komplexen zu einem vermin[Seite 61↓]derten Substratumsatz führen. Um trotz langer Substrate einen ausreichenden Umsatz zu gewährleisten, ist es erforderlich, die Ribozymkonzentration im Verhältnis zur Substratkonzentration anzuheben. Single-turnover-Reaktionen, in denen das Ribozym im Überschuss vorliegt, gelten daher als Mittel der Wahl für die Spaltung längerer Substrate.

In dieser Arbeit wurden verschiedene Ribozyme hinsichtlich ihrer Aktivität in zellfreien Versuchen untersucht. Die In-vitro-Spaltung eines 232 Basen umfassenden Abschnitts des Exon III und IV der PTHrP mRNA erfolgte dabei unter single-turnover-Bedingungen. Anfängliche Tests, die unter Überschuss des Substrats zum Ribozym stattfanden, ergaben nur einen geringen Umsatz. Der Versuchsaufbau, der den Arbeiten von Hendry und McCall (1992, 1995a und b) entlehnt wurde, gestattete es hingegen, dass für die meisten der untersuchten Ribozyme ein gut messbarer Umsatz nachgewiesen werden konnte. Für den Vergleich der Ribozyme wurde der kobs-Wert, eine kinetische Konstante erster Ordnung, ermittelt. Dieser Wert entspricht der Geschwindigkeitskonstante k2, da durch die Vorinkubation des gesamten Reaktionsansatzes in Abwesenheit von Magnesium der reaktionslimitierende Schritt nicht die Bildung des Ribozym-Substrat-Komplexes (k1), sondern die Spaltung des Substrats ist. Sehr einflussreich auf die ermittelten kobs-Werte waren die Zeitpunkte der Probenentnahmen (2.2.4.1). Es ergaben sich systematisch höhere Werte, je näher die erste Entnahme am Zeitpunkt t0 (t = 0) lag, bzw. systematisch zu niedrige Werte, je weiter die erste Probenentnahme herausgezögert wurde. Die Entnahme einer Probe zum Zeitpunkt t0 war technisch nicht möglich, so dass die ermittelten kobs-Werte nur Näherungswerte an den absoluten Wert sein können.

Die katalytischen Konstanten der Michaelis-Menten-Kinetik kcat, Km und kcat/Km ließen sich unter single-turnover-Bedingungen nicht bestimmen.

4.2.1 Das Hammerhead-Ribozym RbO

Zu Beginn der kinetischen Untersuchungen wurde der kobs-Wert für das Hammerhead-Ribozym RbO, das der Entwicklung weiterer Ribozyme zu Grunde lag, bestimmt. Der gemittelte Wert für die Spaltung der 232 Basen langen Substrat-RNA betrug 0,047 min-1. Hendry und McCall ermittelten in ihrer Arbeit (1992) für die Ribozyme 1 und 2 mit 1,6 min-1 (± 0,6) und 5,0 min-1 (± 1,0) um bis zu 100 mal höhere k2-Werte 2 . Ein mit 0,24 min-1 (± 0,05) lediglich fünffach höherer kobs-Wert wurde von ihnen in einer weiteren Arbeit (1995a) für das Ribozym TAT RA angegeben. Der direkte Vergleich der Werte ist jedoch nur bedingt zulässig, da in den Untersuchungen von Hendry und McCall vergleichsweise kurze Substrate (13 Basen) gespalten wurden.


[Seite 62↓]

Eine Spaltung längerer Substrate wurde von Jankowsky und Schwenzer (1996) durchgeführt. Das Ziel ihrer Untersuchungen war es, die Spaltung von Substraten unterschiedlicher Länge im Beisein von Facilitatoren-RNA und -DNA zu untersuchen. Als Substrat-RNA wurden drei Domäne der HTF 3 mRNA mit 39, 452 und 942 Basen eingesetzt. Die Reaktionen wurden durch ein 32 Basen langes Hammerhead-Ribozym katalysiert. Im Folgenden sind die von Jankowsky und Schwenzer ermittelten k2-Werte (entsprechen kobs) aufgeführt, die ohne Anwendung von Facilitatoren ermittelt wurden.

k2 S

39

=

2,3

min-1

(± 0,3)

k2 S

452

=

0,057

min-1

(± 0,003)

k2 S

942

=

0,0185

min-1

(± 0,002)

Es ist ersichtlich, dass das kurze Substrat S 39 nahezu 125 mal schneller gespalten wird als das Substrat S 942. Diese Werte verdeutlichen, welchen Einfluss die Länge des Substrats auf die Spaltung hat. Mit 0,057 min-1 liegt die Geschwindigkeitskonstante k2 für die Spaltung des Substrats S 452 im Bereich des kobs-Werts des Ribozyms RbO. Jedoch ist auch hier ein direkter Ver[Seite 62↓]gleich der Werte nur eingeschränkt möglich, da zum einen die Größe der Substrate nicht identisch ist und zum anderen die Substratlänge nur ein Hinweis auf mögliche Sekundärstrukturen sein kann.

Parallel zum Ribozym RbO wurde das Ribozym RbM getestet. Beide Ribozyme sind bis auf zwei Abweichungen im Bereich der Stammschleife des Ribozyms RbM identisch. Der Austausch von zwei Basen in der konservierten Region der Stammschleife von RbM bedingte den vollständigen Verlust der katalytischen Aktivität. Diese Tatsache untermauert die Feststellung, dass die konservierte Region eine wichtige Rolle für die Ribozymaktivität spielt. Manipulationen in diesem Bereich, sei es durch Basenaustausch, Phosphorthionatsubstitutionen oder andere Modifikationen, führen daher zu einer Abnahme oder dem Verlust der Aktivität (Ruffner et al. 1990).

4.2.2 Verkleinerung des Hammerhead-Ribozyms

In den voranstehenden Abschnitten wurde bereits darauf hingewiesen, dass die Länge der Substrat-RNA und die damit verbundenen mehr oder minder ausgeprägten Sekundärstrukturen erheblichen[Seite 63↓] Einfluss auf die Spaltungsreaktion haben. Zweifellos ist aber auch die Struktur des Ribozyms für die Effizienz der Katalyse von Bedeutung. Obgleich die Struktur des Hammerhead-Ribozyms in gewissem Maß festgelegt ist, sind Variationen in bestimmten Abschnitten ohne Verlust der katalytischen Aktivität möglich.

In mehreren Arbeiten untersuchten Lange et al. (1994), Tuschl und Eckstein (1993), Hendry und McCall (1995 und 1996), inwiefern Größenänderungen der Ribozyme die Katalyse beeinflussen. Auf den Erkenntnissen basierend und ausgehend vom Hammerhead-Ribozym RbO wurden in dieser Arbeit weitere Ribozyme, die in Flanken und Stammschleife verkleinert wurden, erstellt (Abb. 30).

Abb. 30: Ribozymübersicht I.

Das Ribozym Rb8/12, das mit dem Ribozym RbO identische Flanken besitzt, wies bei der Spaltung der Substrat-RNA die höchste Aktivität auf. Die Tatsache, dass die kürzeren Flanken der Ribozyme Rb5/10 und Rb4/8 geringere Substratumsätze bewirkten, lässt vermuten, dass es für die Länge der Flanken ein Optimum bezüglich der Ribozymaktivität gibt. So ermittelten auch Lange et al. (1994) bei der Spaltung einer 501 Basen umfassenden Substrat-RNA durch Ribozyme mit unterschiedlichen Flanken (3‘/5‘-Flanken: 5/9, 7/9, 8/10 und 14/13) die höchste Effizienz für das Ribozym mit einer Flankenlänge von 7 und 9 Basen. Eine Bindungsschwäche der 3‘‑Flanke mit sich anschließender frühzeitiger Dissoziation vom Substrat wurde als Grund für die geringe Effizienz des 5/9er Ribozyms angenommen. Hendry und McCall (1995 und 1996) untersuchten den Einfluss der Flankenlänge auf die Katalyse anhand von Spaltungen kurzer Substrate (13 nt). Der Vergleich eines 10/10er mit einem 6/6er Ribozyms ergab deutliche Unterschiede hinsichtlich der ermittelten kinetischen Konstanten. Das kleinere Ribozym, bezeichnet als TAT RA 6X2, wies einen annähernd 20fach höheren kcat-Wert und einen um zwei Drittel niedrigeren Km-Wert auf. Die sich daraus ergebende katalytische Effizienz (kcat/Km) zeigt, dass das Ribozym mit den kürzeren Flanken das Substrat unter multiple-turnover-Bedingungen ca. 60 mal effektiver umsetzt. In gleicher Weise zeigte [Seite 64↓]sich das kleinere Ribozym in den Reaktionen, in denen es im Überschuss zum Substrat vorlag, als das aktivere. Der 40fach höhere kobs-Wert demonstriert eine deutliche Zunahme der Spaltungsrate bei einer Verkürzung beider Flanken von 10 auf 6 Basen (Hendry und McCall 1995).

In einer weiteren Arbeit wiesen Hendry und McCall (1996) nach, dass die katalytische Aktivität von Ribozymen mit asymmetrischen Flanken größer ist, wenn sich die kürzere der beiden Flanken am 5‘‑Ende befindet. So wurde bei der Spaltung eines 21mer Substrats durch ein 5/10er und ein 10/5er Ribozym für das Verhältnis der ermittelten kobs-Werte ein Faktor, der größer als 100 ist, errechnet. Um die Flankenlängen zu optimieren, variierten Hendry und McCall diese in weiteren Untersuchungen. Hierbei erkannten sie, dass eine Längenveränderung der 5‘-Flanke einen größeren Effekt hervorruft als eine Änderung der Länge der 3‘-Flanke.

Eine weitere Verkleinerung der Ribozyme ist durch die Einsparung von Basen im Bereich der Stammschleife möglich. In mehreren Arbeiten wurden Ribozyme erstellt, bei denen die Basen der Stammschleife, abgesehen von denen in den konservierten Regionen, teilweise oder vollständig entfernt wurden. Diese Ribozyme, von McCall et al. (1992) als Minizyme bezeichnet, verfügten bei der Spaltung kleiner Substrate unter multiple-turnover Bedingungen über eine geringere Aktivität als die Ribozyme mit kompletter Stammschleife. Dabei war die Aktivitätseinschränkung vom Ausmaß der Baseneinsparung abhängig (Tuschl und Eckstein 1993). Die Ribozyme, bei denen die Doppelhelix der Stammschleife lediglich von vier auf zwei Basenpaare verkleinert wurde, wiesen im Vergleich zum Ausgangsribozym ähnliche katalytische Werte auf. Bei einem vollständigen Verzicht auf die Doppelhelix sank die katalytische Effizienz der Ribozyme drastisch. Aber auch für die Basensequenz der Doppelhelix und der sich anschließenden Schleife wurde ein Einfluss auf die Ribozymaktivität nachgewiesen. So zeigte ein Ribozym mit kompletter, jedoch in der Sequenz der Doppelhelix veränderter Stammschleife eine 225fach geringere katalytische Effizienz gegenüber dem Ursprungsribozym. Das starke Absinken des kcat-Werts ließ dabei auf die Bedeutung der Doppelhelix bei der Substratspaltung schließen. Für sie wurde eine stabilisierende Funktion von Übergangszuständen bei der Spaltung angenommen. Der unveränderte Km-Wert deutete an, dass die Sequenzänderung die Bildung des Ribozym-Substrat-Komplexes nicht berührt (Tuschl und Eckstein 1993).

In Bezug auf die Stammschleifengröße konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Verkleinerung nicht zwangsläufig mit einer geringeren Ribozymaktivität einhergehen muss. Das Ribozym Rb8/12 erwies sich gegenüber RbO trotz kleinerer Stammschleife bei der Spaltung der Substrat-RNA als das aktivere. Allerdings wurde hier im Unterschied zu der Arbeit von Tuschl und Eckstein (1993) ein langes Substrat (232 gegenüber 12 Basen) unter single-turnover-Bedingungen gespalten.

Insgesamt lassen sich aus der Verkleinerung von Hammerhead-Ribozymen folgende Vorteile ableiten. Bei der Spaltung von längeren Substraten können Ribozyme mit kürzeren Flanken und einer[Seite 65↓] verkleinerten Stammschleife einen höheren Umsatz bewirken als die entsprechenden „vollständigen“ Ribozyme. Dabei ist anzunehmen, dass dem Effekt das bessere Erreichen der Zielsequenzen selbst bei ausgeprägten Sekundärstrukturen zu Grunde liegt. Der Effekt lässt sich jedoch nicht vorhersagen und muss daher durch Austesten herausgestellt werden. Ein weiterer Vorteil besteht in der erleichterten Handhabung verkleinerter Ribozyme. Sie weisen weniger Angriffspunkte für Nukleasen auf und lassen sich besser in Zellen transfizieren. Ein nicht zu unterschätzender Vorteil sind ferner die geringeren Synthesekosten.

4.2.3 Einfluss der Reaktionsbedingungen auf die katalytische Aktivität des Ribozyms Rb8/12

Aus den Versuchen mit in Stammschleife und Flanken verkleinerten Ribozymen resultierte das Ribozym Rb8/12. Vor einer weiteren Modifizierung des Ribozyms wurde seine katalytische Aktivität bei veränderten Reaktionsbedingungen untersucht.

Wie die Katalysen anderer Enzymsysteme lassen sich ribozymkatalysierte Reaktionen durch Modulation von pH-Wert und Reaktionstemperatur beeinflussen. Des Weiteren wirken sich Konzentrationsänderungen von Metallionen, die sowohl viele Enzyme als auch Ribozyme als Cofaktoren für die optimale Katalyse benötigen, auf die Reaktion aus. Für den Reaktions-pH, die Temperatur und die Metallionenkonzentration existieren Optima, unter denen die Enzyme am effektivsten arbeiten. Diese liegen für die meisten Proteinenzyme im physiologischen Bereich. Bei extremeren Bedingungen, wie zu starker Hitze oder allzu niedriger bzw. zu hoher Wasserstoffionenkonzentration, können die Enzyme auf Grund der Denaturierung ihre Aktivität verlieren.

4.2.3.1 pH-Wert

Bereits Uhlenbeck (1987) untersuchte für seine katalytische RNA die Abhängigkeit der Spaltung eines Oligoribonukleotids von den Reaktionsbedingungen. Die dabei getroffenen Aussagen ließen sich in dieser Arbeit weitestgehend bestätigen. In der von Uhlenbeck dargestellten Abhängigkeit der Substrathalbwertzeit von dem pH-Wert wurde deutlich, dass der größte Effekt hinsichtlich des Umsatzes bei Änderungen des Reaktions-pHs im Bereich zwischen 6 und 8 zu erwarten ist. In diesem Sinne konnte auch in der vorliegenden Arbeit für das Ribozym Rb8/12 gezeigt werden, dass bei der Verminderung der Wasserstoffionenkonzentration von pH 7,5 auf 8,5 der kobs-Wert um 200 % steigt, hingegen ein weitere Absenkung auf ein Zehntel nur noch einen Anstieg des kobs-Werts um 10 % zur Folge hat. Insgesamt erhöhte sich damit bei einer Steigerung des pH von 6 auf 8 die Reak[Seite 66↓]tionskonstante kobs um den Faktor 3. Daraus lässt sich in Übereinstimmung mit Uhlenbeck schließen, dass der Reaktions-pH den reaktionslimitierenden Schritt nur indirekt beeinflusst, dass jedoch die stärkste Abhängigkeit im physiologischen pH-Bereich besteht.

4.2.3.2 Temperatur

Uhlenbeck (1989) untersuchte in weiteren Tests den Zusammenhang zwischen der Reaktionstemperatur und dem Reaktionsumsatz. Dabei erkannte er in der Arrhenius-Auftragung eine lineare Beziehung zwischen der Substrathalbwertzeit und der Reaktionstemperatur in einem Bereich von 10 °C bis 37 °C. Die zugehörige Aktivierungsenergie gab er mit E = 13,1 kcal mol-1 an. Für die Aktivität des Ribozyms Rb8/12 ist eine ähnliche Temperaturabhängigkeit anzunehmen. Die bei Temperaturen von 25 °C, 37 °C und 45 °C gemessenen kobs-Werte lassen hier vermuten, dass das Temperatur­optimum oberhalb des physiologischen Bereichs liegt und es demzufolge für den praktischen Einsatz von Ribozymen in Zellen nur geringe Bedeutung hat.

4.2.3.3 Magnesiumkonzentration

Neben den Tests zum Reaktions-pH und der Reaktionstemperatur überprüfte Uhlenbeck in der Arbeit von 1989 den Einfluss verschiedene zweiwertige Metallionen auf den Reaktionsumsatz. Hierzu wurden getrennten Reaktionsansätzen Chlorsalze der Metalle Magnesium, Mangan, Kalzium und Zink zugegeben, so dass die Endkonzentration 10 mM betrug. Weitere Ansätze wurden mit Natriumchlorid, EDTA bzw. Spermidin in verschiedenen Konzentrationen versetzt. In diesen konnten jedoch keine Umsätze gemessen werden. Die höchste Effizienz zeigte die Katalyse bei der Zugabe von Manganchlorid. Sie unterschied sich von der Effizienz für den Ansatz mit Magnesiumchlorid um den Faktor 8 und für den Ansatz mit Kalziumchlorid um den Faktor 25. Bei Zugabe von Zinkchlorid erfolgte keine Substratspaltung. Eine detaillierte Untersuchung der Beziehung zwischen der Mg2+-Konzentration und der Substrathalbwertzeit ergab eine Kurve mit zunächst starkem Abfall im Bereich zwischen 1 mM und 5 mM und einer folgenden asymptotischen Annäherung an einen Minimalwert bei Konzentrationen oberhalb von 20 mM. Danach schien die Aktivität des Ribozyms unabhängig von der Mg2+-Konzentration zu sein.

Für das Ribozym Rb8/12 wurde der Einfluss der Mg2+-Konzentration auf die Ribozymaktivität in einem ausgedehnteren Bereich untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass selbst bei Konzentrationen von bis zu 200 mM durchaus eine Abhängigkeit zwischen dem kobs-Wert und dem Magnesiumgehalt besteht. Ebenfalls mit diesem Gegenstand beschäftigten sich Sawata et al. (1993). Dabei wurden von ihnen zwei mögliche Formen der Magnesiumabhängigkeit diskutiert. Zum einen für [Seite 67↓]reine RNA-Ribozyme die Abhängigkeit, bei der eine Sättigung erreicht wird, sobald die Mg2+-Konzentration 100 mM überschreitet. Zum anderen für chimäre RNA-DNA-Ribozyme die Abhängigkeit, bei der der Reaktionsumsatz durch Zugabe von Magnesium auch noch im hochmolaren Bereich (1 M) zu steigern ist. Hendry und McCall (1995) hingegen vermuteten, dass für die meisten Ribozyme eine zweiphasige Abhängigkeit von der Mg2+-Konzentration besteht. So könnte eine zunächst exponentielle Abhängigkeit von einer linearen abgelöst werden.

In welcher Form die Aktivität des Ribozyms Rb8/12 von der Mg2+-Konzentration abhängt, kann mit Hilfe der vorliegenden Daten nicht eindeutig bestimmt werden. Hierfür wären weitere Versuche notwendig, in denen die Mg2+-Konzentration in einem größeren Bereich zu variieren wäre. Deutlich ist jedoch, dass innerhalb physiologischer Konzentrationen eine positive Korrelation besteht.

4.2.3.4 Facilitator

Neben der Modifizierung von pH-Wert, Reaktionstemperatur und Metallionenkonzentration kann die Aktivität eines Ribozyms auch durch die Zugabe von Oligonukleotiden beeinflusst werden. Goodchild stellte 1992 erste Untersuchungen zu diesen als Facilitatoren bezeichneten Strukturen an. Dabei erkannte er hinsichtlich ihrer Funktionsweise Ähnlichkeiten mit Coenzymen konventioneller Enzyme. Er fand heraus, dass Facilitatoren weder den chemischen Schritt der Substratspaltung beeinflussen noch die Produktdissoziation beschleunigen. Vielmehr erklärte Goodchild die Wirkung der Facilitatoren mit ihrem Einfluss aud die Bildung des Ribozym-Substrat-Komplexes. In diesem ersten Reaktionsschritt ist es den Facilitatoren möglich, die aus Ribozymflanken und Zielsequenz gebildete Helix zu stabilisieren. Unmittelbar dem 3‘-Ende des Ribozyms benachbart lagern sie sich der Ziel-RNA auf Grund ihrer komplementären Sequenz an. Die erzeugte Stabilität ermöglicht es auch Ribozymen mit kurzen Flanken sich besser an das Substrat zu binden. Da kurze Flanken eine stärkere Produktdissoziation als längere bedingen, ist es verständlich, warum gerade bei kleinen Ribozymen der Einsatz eines Facilitators den Reaktionsumsatz verbessert. So zeigten Nesbitt et al. (1994), dass die Aktivität eines 5/5er Ribozyms durch die Zugabe einer 13 Basen umfassenden Facilitator-DNA um den Faktor 556 gesteigert werden konnte, der Facilitator hingegen bei einem 10/10er Ribozym keine Aktivitätssteigerung hervorrief.

Für die Wirkung des Facilitators sind neben den Ribozymflanken auch die Reaktionsbedingungen und die Struktur der Substrat-RNA entscheidend. Die erhebliche Aktivitätssteigerung für das 5/5er Ribozym nach Zugabe eines Facilitators waren von Nesbitt et al. (1994) bei der Spaltung einer 37 Basen langen Substrat-RNA unter multiple-turnover-Bedingungen (20facher Überschuss) gemessen worden. Für den Einsatz von Ribozymen in Zellen ist jedoch vor allem ihre Fähigkeit zur Spalt[Seite 68↓]ung längerer mRNA-Sequenzen von Bedeutung. In dieser Arbeit wurde eine Facilitator-DNA (13mer) bei der Spaltung eines langen Substrats unter single-turnover-Bedingungen eingesetzt. Wie bereits erwähnt, spielt die Bildung des Ribozym-Substrat-Komplexes unter Ribozymüberschuss für den Reaktionsumsatz nur eine geringe Rolle. Dies könnte die lediglich 60 %ige Steigerung der Aktivität des Ribozyms Rb8/12 bei Facilitator-Zugabe erklären. Es wurden jedoch für die Spaltung von größeren Substrat-mRNA auch stärkere Effekte der Facilitatoren nachgewiesen (Denman 1993, Nesbitt et al. 1994, Jankowsky und Schwenzer 1996 und 1998). Bei bis zu fünffachem Ribozymüberschuss und zum Teil geringen Magnesiumkonzentrationen (1mM) steigerte sich bei einigen Ribozymen die Aktivität um mehr als das Zehnfache. Jankowsky und Schwenzer benutzten dabei in ihren Arbeiten (1996 und 1998) DNA- und RNA-Facilitatoren. Diese wendeten sie sowohl als 5‘- als auch 3‘‑Variante erfolgreich an. Zudem zeigten Jankowsky und Schwenzer (1998), dass auch unter zehnfachen multiple-turnover-Bedingungen, die in der Regel für den Umsatz langer Substrate ungeeignet schienen, die Aktivität der Ribozyme durch den Einsatz von Facilitatoren zu steigern ist.

In künftigen Untersuchungen wäre zu klären, inwieweit Facilitatoren in der Lage sind, Ribozyme bei der Hemmung der Genexpression in Zellen zu unterstützen.

4.2.4 RNA-DNA-Ribozyme

Der nächste Schritt in der Entwicklung des metabolisch stabilen Ribozyms bestand in dem teilweisen Austausch der Ribonukleotide durch Desoxyribonukleotide. Dabei war es das Ziel, eine größtmögliche Menge an DNA in ein Hammerhead-Ribozym einzubringen, ohne dass es seine Aktivität verliert.

Für die Effekte, die durch die Substitution von RNA durch DNA hervorgerufen wurden, lassen sich in der Literatur zahlreiche Quellen finden, jedoch wurden in der Mehrzahl der kinetischen Untersuchungen kurze Substrate verwandt (Perreault et al. 1990, Yang et al. 1992, Hendry et al. 1992, Taylor et al. 1992, Shimayama et al. 1993, Hendry und McCall 1995). Diese Arbeit hingegen verglich RNA-DNA-Ribozyme (s.Abb. 31) bei der Spaltung einer langen Substrat-RNA. Dabei wurde untersucht, in welchem Maß sich der Basenwechsel in den verschiedenen Regionen der Ribozymstruktur auf die katalytische Aktivität auswirkt. Eine der Feststellungen, die die meisten Forschungsgruppen trafen, konnte auch in dieser Arbeit bestätigt werden. Sie besagt, dass ein Austausch von RNA durch DNA in den konservierten Regionen der Stammschleife mit erheblichen Aktivitätseinschränkungen der Ribozyme einhergeht. Demgemäß zeigten die Ribozyme Rb5/10V3 und Rb8/12V3a keine oder eine deutlich geringere Aktivität als die vergleichbaren Ribozyme Rb5/10V4 und Rb8/12V4.


[Seite 69↓]

Abb. 31: Ribozymübersicht II.

Erste Untersuchungen zum Basenaustausch im konservierten Bereich der Stammschleife nahmen Perreault et al. (1990) vor. Sie wiesen die große Bedeutung der 2‘-OH-Gruppen der konservierten Ribonukleotide für die Katalyse nach. Verschiedene Ribozyme, in deren Stammschleifen im unterschiedlichen Maß DNA eingebracht wurde, zeigten gegenüber dem Voll-RNA-Ribozym bis 200fach geringere kcat-Werte. Unbeeinflusst von dem Austausch war die Substrataffinität. So besaßen alle Ribozyme annähernd gleiche Km-Werte. Daher ist eine Funktion der Stammschleife bei der Bildung des Ribozym-Substrat-Komplexes nicht anzunehmen.

Für den Austausch von RNA durch DNA in den Ribozymflanken wurden in den Arbeiten von Hendry et al. (1992), Shimayama et al. (1993) und Hendry und McCall (1995) andere katalytische [Seite 70↓]Werte ermittelt. Entsprechend modifizierte Ribozyme zeigten gegenüber den Voll-RNA-Ribozymen überwiegend Steigerungen des kcat-Werts (22fach bei Hendry et al. 1992). Starke Unterschiede hingegen wiesen die ermittelten Km-Werte auf. Mit einer 65fachen Steigerung der Konstanten für das RNA-DNA-Ribozym gegenüber dem Voll-RNA-Ribozym wich der von Shimayama et al. (1993) erhaltene Wert deutlich von Hendrys ab. Hendry (1995) begründete diesen Unterschied mit der Zusammensetzung der von ihm benutzten Substrat-RNA TAT S13, die zu 67 % aus Purinbasen bestand. Shimayamas Substrat hingegen wies lediglich ein Gehalt von 30 % Purinen auf.

Vergleicht man die katalytischen Effizienzen (kcat/Km) für die chimären Ribozyme aus den Arbeiten von Hendry und Shimayama mit denen der Voll-RNA-Ribozyme, wird erkennbar, welchen Einfluss die Flankenlänge und der DNA-Gehalt der Flanken auf die Katalyse besitzen (s.Tabelle 9). So kann bei Ribozymen mit kurzen Flanken (von weniger als 6 Basen) der Austausch von RNA durch DNA zu einer verminderten katalytischen Effizienz führen.

Tabelle 9: Einfluss von Flankenlänge und DNA-Gehalt auf die kinetischen Parameter.

 

Hendry (1992)a)

Shimayama (1993)b)

Hendry (1995)a)

Hendry (1995)a)

Ribozymflanken

10/10

5/5

10/10

6/6

k cat RD / k cat R c)

22

3,6

5,1

0,83

K m RD / K m R c)

1,6

65

1,2

2,8

k cat /K m RD /
k
cat /K m R c)

14

0,05

4,3

0,29

k obs RD / k obs R d)

-

-

19

< 0,99

Angegeben sind die Verhältnisse zwischen den katalytischen Konstanten der RNA-DNA-Ribozyme (RD) und der Voll-RNA-Ribozyme (R).
a) Spaltung eines 13mer Substrats
b) Spaltung eines 11mer Substrats
c) unter multiple-turnover-Bedingungen
d) unter single-turnover-Bedingungen

Wie die katalytische Effizienz scheint auch der kobs-Wert von der Flankenlänge und dem DNA-Gehalt beeinflusst zu werden. Ein RNA-DNA-Basenaustausch führte unter single-turnover-Bedingungen bei dem Ribozym mit kurzen Flanken (TAT RB 6X2) zur Minderung und bei dem Ribozym mit langen Flanken (TAT RB) zu einer Erhöhung des kobs-Werts (Hendry et al. 1995).

In der vorliegenden Arbeit erbrachte die Substratspaltung mit den allein in den Flanken DNA-modifizierten Ribozymen ein vergleichbares Ergebnis. Der Basenaustausch in den Flanken der Ribozyme R5/10 und Rb8/12 ergab die Ribozyme Rb5/10V1 bzw. Rb8/12V1. Für die beiden chimären Ribozyme wurden geringere k-Werte ermittelt als für die entsprechenden reinen RNA-[Seite 71↓]Ribozyme. Auffällig ist wiederum, dass die Minderung des k-Werts umso größer ist, je kleiner die Ribozymflanken sind. Das zusätzlich erstellte Ribozym Rb4/6V1, das sich gegenüber dem Ribozym Rb5/10V1 durch eine weitere Verkürzung der Flanken auszeichnet, zeigte keine Aktivität mehr.

Sowohl in den Flanken als auch im Bereich der nichtkonservierten Region der Stammschleife wurden die Varianten V4, V5 und V6 der Ribozyme Rb5/10 und Rb8/12 mit DNA modifiziert. Dabei scheint die DNA-Modifikation der Stammschleife keinen negativen Einfluss auf die Ribozymaktivität auszuüben. Wie bei Shimayama et al. (1993) führte der zusätzliche Basenaustausch in diesem Bereich eher zu einer leichten Erhöhung der Ribozymaktivität (vergleiche Ribozymvarianten V4 mit V1).

Gegenüber den reinen RNA-Ribozymen RbO und Rb8/12 weisen die in Flanken und Stammschleife DNA-modifizierten Ribozyme Rb8/12V6 und Rb8/12V4 nahezu identische k-Werte auf. Nomenklatorisch ist zu bemerken, dass die V6-Varianten keine echten Abkömmlinge der Ribozyme Rb5/10 und Rb8/12 sind, da sie keine verkürzte Stammschleife besitzen.

Aus den Untersuchungen zur DNA-Modifikation der Hammerhead-Ribozyme resultiert das Ribozym Rb8/12V4, das bei hoher Aktivität zum überwiegenden Teil (71 %) aus DNA besteht. Der hohe Anteil an Desoxyribonukleinsäure im Ribozym hat mehrere Vorteile. Erstens kann die Aktivität eines Hammerhead-Ribozyms mit langen Flanken durch DNA-Modifikationen im Bereich der Flanken und der nichtkonservierten Region der Stammschleife gesteigert werden. Zweitens erhöht sich bei diesen Ribozymen die Widerstandsfähigkeit gegenüber Ribonukleasen, insbesondere gegenüber 3‘-Exonukleasen (Hendry et al. 1992). Und drittens lassen sich durch den DNA-Einbau die Synthesekosten der Ribozyme erheblich senken.

4.2.5 Modifizierung mit Phosphorothioaten

Aus den Untersuchungen zum RNA-DNA-Basenaustausch ging mit Rb8/12V4 ein DNA-reiches und zugleich aktives Ribozym hervor. Um die Stabilität des Ribozyms zu erhöhen, wurden im nächsten Schritt Phoshorothioat-Modifikationen vorgenommen. In früheren Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass die Einführung von Phosphorothioaten in Oligonukleotide zur Steigerung ihrer Nukleasenstabilität beitragen kann (Eckstein 1985, Goodchild 1990). Allerdings führte die Einbindung von Phosphorothioaten (PT) in konservierte Regionen der Ribozyme zu einer Verminderung der katalytischen Aktivität (Buzayan et al. 1990, Ruffner und Uhlenbeck 1990).

Eine Modifizierung der Ribozymflankenenden leitete diesen Abschnitt der Untersuchungen ein. Dazu wurde ausgehend von Rb8/12V4 das Ribozym Rb8/12V4PT erstellt. Dieses unterschied sich von dem Ausgangsribozym durch eine PT-Modifikation am 5‘- und drei PT-Modifikationen am [Seite 72↓]3‘-Ende. Im Vergleich der beiden Ribozyme ergab sich für das PT‑modifizierte eine Verringerung des kobs-Werts um 30 %. Ein Minderung der katalytischen Effizienz um denselben Betrag wurde von Heidenreich und Eckstein (1992) für ein Ribozym ermittelt, nachdem es in gleicher Weise modifiziert worden war. Eine erhöhte Nukleasenstabilität konnte jedoch für dieses reine RNA-Ribozym nicht festgestellt werden. Erst der Austausch der Pyrimidinbasen durch die entsprechenden Desoxyribonukleoside führte zu einer gesteigerten Widerstandskraft. Auch Shimayama et al. (1993) konnten für ein nur in den Flanken und im nichtkonservierten Teil der Stammschleife PT- und DNA-modifiziertes Hammerhead-Ribozym keine deutlich höhere Nukleasenstabilität als für das Voll-RNA-Ribozym ermitteln. Hingegen steigerte die Einführung von drei PT-Modifikationen in den konservierten Sequenzbereichen des Ribozyms die Stabilität merklich. Die höchste Stabilität jedoch erreichten Shimayama et al. mit zwei Ribozymen, die zwar nur zwei Phosphorothioatverbindungen in der konservierten Region aufwiesen, bei denen aber dafür ein Uracil gegen ein Adenin bzw. Guanin ausgetauscht wurde. Von beiden Ribozymen stellte sich das Adenin-Ribozym als das aktivere heraus. Seine katalytische Effizienz jedoch war 15 mal geringer als die des Voll-RNA-Ribozyms.

Basierend auf den Ergebnissen von Shimayama et al. wurde in dieser Arbeit das Ribozym Rb8/12V4PT weiter modifiziert, wodurch das das Ribozym RbS entstand. In der folgenden Abbildung wird illustriert, welche Modifikationen diese Ribozym gegenüber dem Ausgangsribozym RbO aufweist.

Abb. 32: Ribozymübersicht III.

Im Unterschied zu den Ergebnissen von Shimayama et al. (1993) wies das Ribozym RbS trotz aller Modifikationen die gleiche Aktivität wie das reine RNA-Ribozym RbO auf. Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass die Aktivitäten der Ribozyme nur bedingt miteinander verglichen werden [Seite 73↓]können, da im Unterschied zum RbS-Ribozym in Shimayamas stabilisierten Ribozymen sämtliche Desoxyribonukleotide PT-modifiziert sind.

Abschließend wurde geprüft, welchen Einfluss ein kationisches Lipid in vitro auf die Substratspaltung hat. Für eine Hemmung der Ribozymaktivität durch die Lipide, die zur Transfektion benötigt werden, wären mehrere Ursachen denkbar. So könnte zum Beispiel die Sekundärstruktur des Ribozyms oder des Substrats durch die geladenen Lipide verändert werden. Des Weiteren wäre bedingt durch die Bildung von Lipid-Ribozym- bzw. Lipid-Substrat-Komplexen die räumliche Trennung von Ribozymen und Substrat möglich. Eine starke Verringerung oder gar die Aufhebung der Ribozymaktivität konnte jedoch nach Zugabe des Lipids nicht nachgewiesen werden (Abb. 20).

4.3 Stabilitätstest

Im Stabilitätstest wurde die Widerstandsfähigkeit für die Ribozyme RbO und RbS gegenüber Nukleasen untersucht. Dabei erwies sich das Ribozym RbS mit einer mindestens 10fach höheren Halbwertzeit in einer 1 %igen FCS-Lösung als das deutlich stabilere Ribozym. Shimayama et al. (1993) testeten die Stabilität ihrer Ribozyme sowohl in 0,1 %iger FCS-Lösung als auch in 20 %igem Humanserum. In dem vergleichsweise gering konzentrierten Kälberserum konnten für das Adenin- bzw. das Guanin-Ribozym höhere Halbwertzeiten als für das RbS-Ribozym ermittelt werden.

Eine deutlich höhere Aggressivität des Kälberserums gegenüber den Ribozymen ergab der Vergleich der Seren in Shimayamas Arbeit. Der Umstand, dass Modifizierungen in den verschiedenen Bereichen der Ribozymstruktur eine ungleiche Zunahme der Stabilität in den Seren bedingten, lässt Abweichungen in der Nukleasenzusammensetzung der Seren vermuten. So ist für das Humanserum ein höherer Gehalt an Exoribonukleasen anzunehmen, da hier die Stabilität eines Ribozyms nach einer DNA-Modifizierung der Flanken merklich zunahm. Im Kälberserum hingegen scheinen die Endoribonukleasen die Aggressivität gegenüber den Ribozymen zu bedingen. In diesem Fall steigerte die PT-Modifizierung der Basen im katalytischen Teil der Stammschleife und der Pyrimidinbasenaustausch die Ribozymstabilität.

Weitaus größere Steigerungen der Stabilität der Ribozyme lassen sich dadurch erreichen, dass in der 2’-Position chemisch modifizierte Ribonukleotide eingebaut werden. Für entsprechende Ribozyme mit C-Allyl- bzw. O-Methyl-modifizierten Nukleotiden konnten Halbwertzeiten nachgewiesen werden, die das 50.000fache der des reinen RNA-Ribozyms überschritten (Beigelman et al. 1995). Jedoch stehen der großen Stabilität hohe Synthesekosten gegenüber.


[Seite 74↓]

4.4  Transfektion

Für den Einsatz von Ribozymen als Expressionshemmer ist es notwendig, sie an ihren Wirkungsort, das Zytoplasma, zu transportieren. Hierfür existieren grundsätzlich zwei Wege. Zum einen ist es möglich, die Ribozymsequenz in DNA zu kodieren. In ein Plasmid eingebunden wird diese in die Zellen transfiziert, so dass die Zellen selbst die Ribozyme direkt an ihrem Wirkungsort herstellen. Um jedoch die Ribozymwirkung nachzuweisen, ist es erforderlich, die Zellen stabil zu transfizieren. Mehreren Arbeitsgruppen gelang es, mit Hilfe dieser Methode die Expression bestimmter Gene zu hemmen (Cotten und Birnstiel 1989, Scanlon et al. 1991, L'Huillier et al. 1992, Cantor et al. 1993, Potter et al. 1993, Denman et al. 1994, Kobayashi et al. 1994).

Zum anderen können vorgefertigte Ribozyme direkt in die Zellen eingebracht werden. Für den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen steht neben Elektroporation, Mikroinjektion und weiteren Methoden die Transfektion mittels kationischer Lipide zur Verfügung (Überblick von Cotten 1990). In einigen Arbeiten wurde bereits die Wirkung transfizierter Ribozyme untersucht (Sioud et al. 1992, Snyder et al. 1993). Dabei ließ sich für bestimmte Gene die Unterdrückung ihrer Expression nachweisen.

Untersuchungen zur lipidvermittelten Transfizierung von Zellen mit Nukleinsäuren ergaben, dass verschiedene Zellinien hinsichtlich der Transfektionsparameter, wie das Massenverhältnis von Lipid und Nukleinsäure, unterschiedliche Optima besitzen (Felgner et al. 1987, Malone et al. 1989). Um diesen Umstand zu berücksichtigen und um ein optimales Transfektionsergebnis zu erzielen, wurden in der vorliegenden Arbeit die Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 mit acht verschiedenen Lipid-Lösungen des PerFect Lipid Transfection Kits (Invitrogen) transfiziert. Dabei wurden für das Lipid 6 und 8 unterschiedliche Lipid-Ribozym-Massenverhältnisse getestet. Für eine optimale Wirkung der Ribozyme sollten diese mittels der Transfektion eine möglichst diffuse zytoplasmatische Verteilung in den Zellen erreichen. Das beste Transfektionsresultat konnte mit dem Lipid 6 in einem Massenverhältnis von 6 zu 1 gegenüber dem fluoresceinmarkierten Ribozym RbF erzielt werden. Im konfokalen Lasermikroskop war in diesem Fall neben dem punktförmigen Leuchten liposomaler Einschlüsse die diffuse Färbung des Zytoplamas am ausgeprägtesten. Die katalytische Aktivität des Ribozyms RbF spielte in dem Transfektionsversuch keine Rolle. In den kinetischen Untersuchungen wurde jedoch deutlich, dass die Fluorescein-Markierung die Aktivität des Ribozyms einschränkte. Es zeigte gegenüber dem nichtmarkierten - ansonsten identischen - Ribozym Rb8/12V4PT einen über 75 % geringeren kobs-Wert.


[Seite 75↓]

4.5  Behandlung der Zellen

Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die In-vivo-Wirksamkeit des entwickelten Ribozyms RbS getestet. Dabei zeigte das Ribozym gegenüber den Kontrollen, einem Antisense-Oligonukleotid und einem Ribozym mit zur PTHrP-mRNA inkomplementären Flanken, keine signifikante Wirkung. Darüber hinaus konnte im Vergleich zur Kontrollsekretion nach der Transfizierung der Zellen mit dem Ribozym keine geringere PTHrP-Konzentration im Zellüberstand gemessen werden. Wird die vergleichsweise starke Aktivität des Ribozyms RbS im zellfreien System betrachtet, lassen sich für die ausbleibende Wirkung in vivo verschiedene Gründe annehmen.

Beispielsweise besteht die Möglichkeit, dass die Zielsequenz innerhalb der PTHrP-mRNA auf Grund von Sekundärstrukturen für das Ribozym nicht erreichbar ist. Dabei könnten Abweichungen in der Sekundärstruktur der PTHrP-mRNA zwischen dem zellfreien System und den zellulären Bedingungen durch den Längenunterschied der Sequenzen bedingt sein. Unterstützt wird diese Vermutung durch die Tests mit einem Antisense-Oligonukleotid, das der Flankensequenz entspricht. Dieses hybridisiert an die gleiche Zielsequenz wie das Ribozym. Jedoch auch bei der Behandlung der Zellen mit dem ASO in Konzentrationen bis 10 µM war keine Wirkung nachzuweisen. Im Gegensatz dazu verursachte - in den Untersuchungen von Bunge (1997) - die Behandlung der selben Zellinie mit einem Antisense-Oligonukleotid in einer Konzentration von 2,5 µM eine deutliche Hemmung der Translation. Diese Diskrepanz lässt sich am ehesten auf die unterschiedlichen Zielsequenzen der verwendeten Antisense-Oligonukleotide zurückführen:

 

Zielsequenz kodiert

für Aminosäuren

  

ASO in der vorliegenden Arbeit

10 - 16

ASO von Bunge (1997)

4 - 9

Des Weiteren besaß das Ribozym mit 166 nM und 1 µM im Transfektionsmedium eine vergleichsweise niedrige Konzentration. In anderen Arbeiten wurden für die Transfektion von Zellen mit zwischen 4 µM und 50 µM weitaus höhere Ribozymkonzentrationen genutzt (Sioud et al. 1992, Snyder et al. 1993). In dieser Arbeit konnte jedoch aus technischen Gründen die Ribozymkonzentration nur begrenzt angehoben werden. Ebenfalls erscheint die 60minütige Behandlungszeit der Zellen gegenüber den Zeiten in anderen Arbeiten kurz (Sioud et al. 1992, Snyder et al. 1993). Hier wurden die Zellen über Zeiträume von 20 bis 72 Stunden behandelt. Eine lange Behandlungsdauer mit einer hohen Transfektionseffizienz kann aber noch keine Ribozymwirkung garantieren, solange das Ribo[Seite 76↓]zym nicht frei im Zytoplasma vorliegt. In den Transfektionsversuchen mit dem fluoresceinmarkierten Ribozym konnte nachgewiesen werden, dass auch bei einer Behandlungszeit von nur einer Stunde und der verwendeten Ribozymkonzentration eine gute zelluläre Aufnahme und eine zytoplasmatische Verteilung des Ribozym erfolgte.

Zweifelsohne wird die Wirkung von expressionshemmenden Mitteln, wie Ribozymen und Antisense-Oligonukleotiden, auch von der Stärke der Genexpression beeinflusst. Sie bestimmt im Zusammenhang mit der absoluten Ribozymmenge in der Zelle die Ribozym-Substrat-Relation. So ist die Wirkung von Expressionshemmern in solchen Zellen geringer, die das entsprechende Gen stark regulieren und daher eine große Menge an mRNA herstellen.

Letztendlich ist zu diskutieren, ob das Ribozym RbS über eine ausreichende Stabilität für einen Einsatz in vivo verfügte. Eine direkte Kontrolle der Ribozymstabilität in der Zelle gestaltet sich schwierig. So können lediglich Stabilitätstests mit Zellüberständen oder lysierten Zellen einen Hinweis auf die Widerstandskraft gegenüber Nukleasen geben. In Anbetracht dessen, dass selbst ein „nur“ DNA-modifiziertes Ribozym (Snyder et al. 1993) stabil genug war, um in transfizierten Zellen zu wirken, macht eine ausreichend hohe Stabilität des Ribozyms RbS wahrscheinlich.

4.6 Aussagen

Das in der vorliegenden Arbeit entwickelte Hammerhead-Ribozym RbS konnte in den Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 trotz hoher Aktivität in vitro und gesteigerter metabolischer Stabilität keine nachweisbare Wirkung hervorrufen. Aus den hier vorliegenden Ergebnissen und Literaturangaben lassen sich zusammenfassend für die Entwicklung von metabolisch stabilen Ribozymen zur direkten Behandlung von Zellen in Monolayer-Zellkultur folgende Aussagen treffen:


Fußnoten und Endnoten

1 LTR = long terminal repeats, Steuersequenz

2 In folgenden Arbeiten von Hendry wurden die k2-Werte als kobs-Werte bezeichnet.

3 HTF = human tissue factor



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
01.09.2004