Mit der Entdeckung der katalytischen Aktivität von Ribonukleinsäuren wurde begonnen, darauf basierende therapeutische Strategien zu entwickeln, die auf genetischer Ebene den Stoffwechsel oder virale Infektionen von Zellen beeinflussen. Entsprechende Oligoribonukleotide waren befähigt, spezifisch RNA-Stränge zu erkennen und zu spalten. In Analogie zu Enzymen wurden sie als Ribozyme bezeichnet.
Aufgabe der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines metabolisch stabilen Hammerhead-Ribozyms. Dieses sollte lipidvermittelt in die Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 transfiziert werden und dort die Genexpression des dem Parathormon verwandten Proteins (PTHrP) durch die Spaltung der PTHrP-mRNA unterdrücken. Ausgangspunkt der Entwicklung war das Hammerhead-Ribozym RbO. Es wies in zellfreien Versuchen bei der Spaltung einer 232 Basen langen Substrat-RNA mit einem k(obs)-Wert von 47,42 E-3 /min eine zur Literatur vergleichbar hohe Aktivität auf, jedoch zeigte es sich als reiner RNA-Strang gegenüber Nukleasen sehr fragil. Das Endprodukt der in mehreren Schritten abgelaufenen Weiterentwicklung des Ribozyms RbO stellte das Ribozym RbS dar. Im Vergleich zum Ausgangsribozym bestand das in der Stammschleife verkürzte Ribozym zu 71 % aus DNA. Es besaß Phosphorothioatmodifikationen in den Flanken und in den konservierten Sequenzbereichen. Zudem war durch einen Basenwechsel im katalytischen Teil der Stammschleife eine Pyrimidinbase durch eine Purinbase ausgetauscht worden. Zusammen bedingten die genannten Veränderungen eine Steigerung der Ribozymstabilität um mehr als das Zehnfache. Dabei war die katalytische Aktivität des Ribozyms RbS mit einem k(obs)-Wert von 45,76 min E-3 /min gegenüber RbO annähernd identisch.
Das schrittweise Vorgehen bei der Ribozymentwicklung mit dem Erstellen von 20 unterschiedlich modifizierten Ribozymen ermöglichte es, den Einfluss einzelner Modifikationen auf die Ribozymaktivität zu prüfen. Mehrfach konnten dabei die Ergebnisse anderer Forschungsgruppen bestätigt werden. So wurde erkannt, dass für viele Modifikationen, wie Ribozymverkleinerung, RNA-DNA-Basenaustausch und Phosphorothioateinbindung, die Auswirkung auf die katalytische Aktivität nur begrenzt vorherzusagen ist und optimale Ergebnisse nur durch Testreihen zu erlangen sind.
Bei der Behandlung der Tumorzellen in Monolayer-Zellkultur ließ sich für das Ribozym RbS keine signifikante Wirkung nachweisen. Als Ursache dafür ist am ehesten die auf Grund von Sekundärstrukturen fehlende Erkennung der Zielsequenz innerhalb der PTHrP-mRNA anzunehmen.
The development of therapeutic strategies affecting cellular metabolism and viral infections of cells was introduced after the discovery of the catalytic activity of ribonucleic acid. Appropriate oligoribonucletides were able to specificly recognize and cleave RNA strands. They were called ribozymes by analogy with enzymes.
The main task of our research was the development of a metabolic stable hammerhead ribozym. The ribozym should be transfected by lipid mediated transport into renal carcinoma cells RCC 95/96 where it should suppress the gene expression of parathormone-related peptide (PTHrP) by means of cleavage of the PTHrP mRNA. The hammerhead ribozyme RbO was the starting point of the development. Its activity in cleavage of 232 base long subsrats in cell-free tests was comparable to the literature (k(obs) value 47,42 E-3 /min). However it was very fragile regarding nucleases. The end product of the gradual further development of the ribozyme RbO was the ribozyme RbS. This ribozyme which was shortened in helix 2 consisted of 71 percent DNA in comparison to the original one. It was modified with phosphorothioates in helix 1 and 3 and in the conserved sequence regions. Furthermore a pyrimidine base was exchanged for a purine base in the catalytic part of helix 2. Altogether the named alterations increased the stability of the ribozyme more than 10 times. The catalytic activity of the ribozyme RbS compared to RbO was approximately identical (k(obs) value 45,76 E-3 /min).
The step-by-step development of the ribozymes with the creation of 20 different modified ribozyms made it possible to study the impact of individual modifications on the ribozyme activity. Often the results of other research groups were confirmed. Thus it was detected that the effects of some modifications like ribozyme reduction, RNA-DNA base exchange and phosphorothioates integration are only partly predictable. Therefore optimal results are only obtained by a number of tests.
Finally we could not demonstrate a significant effect of the ribozyme RbS in the treatment of tumor cells in monolayer. The most likely explanation for this seems to be that the target sequence inside of the PTHrP-mRNA wasn't recognized due to secondary structures.
Krebserkrankungen stellen die zweithäufigste Todesursache dar. Der Verlauf der Krebserkrankungen wird in erster Linie durch die direkten Tumorfolgen geprägt. Hierzu gehören im Rahmen der lokalen Invasion und Metastasierung die Infiltration, Destruktion und Arrosion benachbarter Strukturen und entfernter Organe. Daneben können tumor-assoziierte Krankheitserscheinungen, die weder auf Metastasierung oder Tumorinvasion zurückzuführen sind, den Krankheitsverlauf wesentlich mitbestimmen. Solche Krankheitserscheinungen werden als paraneoplastisches Syndrom bezeichnet und schließen neben seltenen Krankheiten des ZNS (Leukenzephalitis) und der Haut (Acanthosis migricans) insbesondere die endokrinen paraneoplastischen Syndrome ein. Sie können den klinisch nachweisbaren Tumoren vorangehen und somit die initiale Symptomatik einer Krebserkrankung darstellen. Häufiger stellen sie jedoch eine Komplikation im Verlauf der Krebserkrankung dar, die nicht selten den Beginn des Finalstadiums markiert.
Zu den Substanzen, die endokrine paraneoplastische Syndrome bedingen, gehört neben dem adrenokortikotropen Hormon (ACTH), dem antidiuretischen Hormon (ADH) und einigen anderen Hormonen das Parathormon-verwandte Protein, PTHrP (parathyroid hormone-related protein).
Im Zusammenhang mit der tumor-assoziierten Hyperkalzämie wurde schon früh der Einfluss des Parathormons oder eines Hormons vergleichbarer Wirkung diskutiert (Albright 1941). Nachgewiesen wurde das PTHrP 1987 von drei voneinander unabhängigen Forschungsgruppen (Burtis et al. 1987, Moseley et al. 1987, Strewler et al. 1987). In den nächsten Jahren klärten Broadus et al. (1988) und Martin et al. (1989) die Struktur des Proteins. Das PTHrP-Gen wurde 1989 auf dem Chromosom 12 lokalisiert. Es ist annähernd 15 Kilobasen lang und besteht aus sieben Exons und fünf Introns (Mangin et. al. 1989). Durch alternatives Spleißen resultieren vier mRNA-Typen (Abb. 1) (Ikeda et al. 1988, Yasuda et al. 1989). Die Untersuchung von mehr als zwanzig verschiedenen Krebszellarten zeigte, dass nahezu alle Zellinien alle vier mRNA-Typen erzeugen (Brandt et al. 1994, Nakamura et al. 1995). Ein Rezeptor, der die Wirkung des PTHrP vermittelt, konnte 1992 kloniert werden (Abou Samra et al. 1992). Er gehört zur Klasse der G‑Protein-gekoppelten Rezeptoren und bindet die N-terminalen 34 Aminosäuren des PTHrP und des PTH. Das Binden des Proteins an den PTH/PTHrP-Rezeptor kann sowohl die Adenylatzyklase (Kovacs et al. 1995) als auch die Phospholipase C und somit die Proteinkinase C (Guo et al. 1995) aktivieren. Auf Grundlage dessen ist die Störung der Kalziumhomöostase im Rahmen der tumor-assoziierten Hyperkalzämie als Wirkung des PTHrP anzusehen. Nachgewiesen werden konnte weiterhin seine Funktion als Wachstums- und
Abgesehen von anderen Funktionen des PTHrP weckt vor allem der Zusammenhang zwischen diesem Hormon und der humoral bedingten tumor-assoziierten Hyperkalzämie (HHM) Interesse für die Entwicklung therapeutischer Konzepte. Dabei erweist sich die HHM als ideales Krankheitsbild zur Testung gentherapeutischer ablativer Therapiestrategien. So entspricht die HHM, hervorgerufen durch die Überexpression eines Proteins, dem Bild einer monokausalen Erkrankung. Desweiteren lassen sich Therapieerfolge durch die Messung des Serum-Kalziums einfach und schnell aufzeigen. Als schwerwiegende Erkrankung rechtfertigt die HHM somit neue, experimentelle Therapien.
Für die Behandlung maligner Erkrankungen stehen derzeit verschiedene Verfahren zur Verfügung. Die hauptsächlich angewandten Therapieformen sind die operative Entfernung des Tumors, die Strahlen- und die Chemotherapie.
Auf der gleichen Ebene der genetischen Informationsübertragung wirken bestimmte Oligoribonukleotide. Analog zu den ASO können sie einen Antisense-Effekt hervorrufen. Darüber hinaus besitzen sie jedoch eine katalytische Funktion. Als eine Art Biokatalysatoren unterstützen sie Spaltungsreaktionen an Nukleinsäuren. Zur Bezeichnung dieser Struktur wurde aus den Begriffen Ribonukleotid und Enzym das Wort Ribozym geprägt.
Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften von Ribonukleinsäuren in den 80er Jahren waren Ausgangspunkt für die Entdeckung der Ribozyme (Cech 1986). Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die RNA neben der Rolle als Bote auch andere Aufgaben besitzt. In den folgenden Jahren wurden mehrere Ribozyme entdeckt. Darunter befanden sich das Hairpin-, das Hammerhead-Ribozym sowie das Hepatitis Delta Virus Ribozym (Forster und Symons 1987, Sharmeen 1988, Hampel und Tritz 1989). Heute gilt das Hammerhead-Ribozym als eines der am besten untersuchten Ribozyme. Entscheidende Impulse erhielt diese Entwicklung aus den Arbeiten von Uhlenbeck (1987), Haseloff und Gerlach (1988). Die Bedeutung lag vor allem im Bestimmen einer biologischen Struktur, die gezielt die Spaltung einer variablen Zielsequenz katalysiert.
Bei dem Hammerhead-Ribozym, dessen Name sich von seiner zweidimensionalen Struktur her ableitet, lassen sich aus funktioneller Sicht zwei Bereiche, die Stammschleife und die Flanken, unterscheiden (Abb. 2). Die Stammschleife wiederum teilt sich in konservierte Regionen mit konstanter und in Regionen mit variabler Basensequenz auf (Forster und Symons 1987). Werden Basen in den konservierten Regionen ausgetauscht, so führt dies zu einer verringerten katalytischen Aktivität. Die Flanken bestimmen durch ihre zur Ziel-RNA komplementären Sequenzen die Spezifität des Ribozyms.
Ein entscheidender Bereich der Zielsequenz stellt das NUH-Triplet dar. Für H steht in erster Linie C, jedoch sind auch A und U mögliche Varianten. Für N kann jedes Nukleotid eingesetzt werden (Haseloff und Gerlach 1988, Perriman 1992).
Bei der Reaktion wird die Zielsequenz im Anschluss an das NUH-Triplet gespalten. Die hierbei gebildeten RNA-Produkte besitzen 5‘-Hydroxylgruppen und 2‘,3‘-zyklische Phosphatgruppen. Wesentlich für die Reaktion ist die Existenz von zweiwertigen Metallionen. Eine reaktionsfördernde Wirkung wurde sowohl für Mg2+-Ionen als auch für Mn2+- und Ca2+-Ionen nachgewiesen (Uhlenbeck 1987).
Für den Einsatz von Ribozymen zur Hemmung der Genexpression in lebenden Zellen existieren grundsätzlich zwei mögliche Varianten. Zum einen wird durch die Integration des Ribozymgens in das Genom der Wirtszelle die endogene Expression des Ribozyms erlaubt. Zum anderen kann das Ribozym direkt, etwa durch Transfektion mit kationischen Liposomen, in die Zelle eingebracht werden. Da die Handhabung der Ribozyme insbesondere durch ihre hohe Empfindlichkeit gegenüber Nukleasen erschwert wird, besteht der Vorteil der Transfektionsmethode darin, dass Stabilität und Aktivität der Ribozyme vor deren Nutzung durch Modifikationen gesteigert werden können.
In der Literatur wurden bereits verschieden Methoden, die der Stabilisierung der Ribozyme dienen, beschrieben. Eine Strategie war es, im Rahmen der chemischen Synthese der Ribozyme spezielle Nukleotide in sie einzufügen. Die in der 2‘‑Position modifizierten Nukleotide wurden an verschiedenen Positionen und in unterschiedlichem Ausmaß eingebaut. Verwendung fanden 2’‑Amino-, 2’‑Fluoro-, 2’-Desoxy-, 2’‑O-Allyl- und 2’‑O‑Methyl-ribonukleotide. Diese Modifikationen erhöhten die Stabilität der Ribozyme drastisch, während ihre katalytische Aktivität weitestgehend erhalten blieb (Pieken et al. 1991, Paolella et al. 1992, Taylor et al. 1992, Shimayama et al. 1993, Beigelman
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Entwicklung eines metabolisch stabilen Ribozyms. Es sollte ausgehend von einem gegen die PTHrP-mRNA gerichteten Hammerhead-Ribozym derart modifiziert sein, dass es eine hohe katalytische Aktivität und eine ausreichende Resistenz gegenüber Nukleasen aufweist. Bei der Entwicklung und der sich anschließenden Behandlung von Tumorzellen in Monolayer-Zellkultur mit dem Ribozym waren folgende Fragen zu klären:
Welchen Einfluss haben die verschiedenen Modifikationen des Ribozyms auf seine katalytische Aktivität?
Welche Bedingungen beeinflussen die Aktivität zusätzlich?
Lassen sich allgemeine Regeln für die Entwicklung eines metabolisch stabilen Ribozyms aufstellen?
Die benutzten Chemikalien wurden in dem Reinheitsgrad pro analysis verwandt.
Agarose, GibcoBRL, Karlsruhe
Ammoniumacetat, Merck, Darmstadt
APS (Ammoniumperoxodisulfat), Merck, Darmstadt
[ γ -P 32 ] ATP, Amersham, Braunschweig
biotinyl. anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Ziege), Dako, Hamburg
biotinyl. anti-Maus-IgG-Antikörper (Kaninchen), Dako, Hamburg
Bis-Tris-Propan, Merck, Darmstadt
Borsäure, Merck, Darmstadt
Bromphenolblau (3‘,3‘‘,5‘,5‘‘-Tetrabromophenolsulfonphtalein), Sigma, Deisenhofen
BSA (bovine serum albumin, Fraction V), Serva, Heidelberg
Calciumchlorid-Dihydrat, Merck, Darmstadt
Chloroform, Merck, Darmstadt
Citronensäure, Merck, Darmstadt
Dinatriumhydrogenphosphat, Merck, Darmstadt
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz), Boehringer, Mannheim
Eisessig, Merck, Darmstadt
Ethanol, J. T. Baker, Deventer, Holland
Ethidiumbromid, Sigma, Deisenhofen
FCS (fetal calf serum), PAA Laboratories GmbH, Linz, Österreich
Formaldehyd, Merck, Darmstadt
Formamid, Merck, Darmstadt
L-Glutamin, Bio Whittaker, Verviers, Belgien
Glycerol, Merck, Darmstadt
Glycogen, Boehringer, Mannheim
Harnstoff, Serva, Heidelberg
Ham`s F-10 Medium, Sigma, Deisenhofen
Hep2-Mounting Medium, The binding site, Birmingham, GB
Isoamylalkohol, Roth, Karlsruhe
Isopropanol, Merck, Darmstadt
Kaliumchlorid, Merck, Darmstadt
Kaliumdihydrogenphosphat, Merck, Darmstadt
Klenow-Enzym, Boehringer, Mannheim
Leibovitz´s L-15 Medium, Life Technologies, Eggenstein
Loading-Dye, Promega, Mannheim
Magnesiumchlorid, Fluka-Chemie, Buchs, Schweiz
MEM-Vitamine, Seromed, Berlin
Molecular Weight Marker VIII, Boehringer, Mannheim
monoklonaler anti-PTHrP-IgG-Antikörper (Maus), Dianova, Hamburg
Natriumacetat, Merck, Darmstadt
Natriumazid, Merck, Darmstadt
Natriumcarbonat, Merck, Darmstadt
Natriumchlorid, Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid, Merck, Darmstadt
PerFect-Transfection-Kit, Invitrogen, NV Leek, Holland
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1), Sigma, Deisenhofen
Polyacrylamid, Appligene, Heidelberg
Propidiumjodid, Sigma, Deisenhofen
PTHrP (1-86), Bachem, Heidelberg
Salzsäure, Merck, Darmstadt
Schwefelsäure, Merck, Darmstadt
SDS (n-Dodecylhydrogensulfat), Merck, Darmstadt
SA-Pox Konjugat, HRP, Dako, Hamburg
T4-Polynucleotid-Kinase, Promega, Mannheim
T7-RNA-Polymerase, Boehringer, Mannheim
Taq-DNA-Polymerase, Boehringer, Mannheim
TEMED (N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylen-Diamin), Sigma, Deisenhofen
Transferrin, Boehringer, Mannheim
Trasylol, Bayer, Leverkusen
Tris-Base (Trisaminomethan), Merck, Darmstadt
Trypsin, Seromed, Biochrom, Berlin
[ α -P 32 ] UTP, Amersham, Braunschweig
Wasserstoffperoxid 30 %, Merck, Darmstadt
8-Kammer-Objektträger, Nunc, Wiesbaden-Biebrich
96-Loch-Platten, Nunc, Wiesbaden-Biebrich
24-Loch-Platten, Nunc, Wiesbaden-Biebrich
Röntgenfilme, Amersham, Braunschweig
Zellkulturflaschen, Falcon, Becton und Dickinson, Heidelberg
Für die Verarbeitung des Daten- und Bildmaterials wurde institutseigene Software verwandt. Im Folgenden sind neben den Programmbezeichnungen die Softwarehersteller, der Verwendungszweck und die entsprechenden Dateiformate aufgeführt.
Molecular Analyst, BioRad, München
Origin, Microcal Software, Inc., Northampton, USA
Kinetic Calc
Microsoft Powerpoint, Microsoft Corporation
Oligo, National Biosciences, Inc., Plymouth, USA
DNASIS, Hitachi Software Engineering Co. Ltd., Yokohama, Japan
EMBL, Datenbank (DKFZ Karlsruhe)
Für die Behandlung von Tumorzellen in Monolayer-Zellkultur mit dem stabilisierten Ribozym wurde die Zellinie RCC 95/96, ein Nierenzellkarzinom, ausgewählt. Diese Zellinie ist im eigenen Labor etabliert worden. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Leibovitz`s L-15 und Ham`s F-10 Medium.
Das Hammerhead-Ribozym RbO (Abb. 3) ist eines von drei im eigenen Labor entwickelten Ribozymen. Es katalysiert die Spaltung der PTHrP-mRNA.
Das Ribozym RbO stellte den Ursprung für die Entwicklung eines metabolisch stabilen Ribozyms dar. Es wurde, wie auch die anderen reinen RNA-Ribozyme (RbM, Rb8/12, Rb5/10 und Rb4/8), durch In-vitro-Transkription hergestellt.
Sämtliche Ribozyme mit DNA-Modifikationen synthetisierte Dr. Sabine Müller vom Institut für Chemie / Fachinstitut für Organische und Bioorganische Chemie der Humboldt-Universität zu Berlin. Die Synthese erfolgte am Syntheseapparat „Gene Assembler Special“ (Pharmacia, Freiburg).
Um Fehler bei der In-vitro-Transkription des Ribozyms Rb5/10 auszuschließen, wurde dieses zusätzlich am Syntheseapparat synthetisiert.
In der folgenden Tabelle 1 sind alle in dieser Arbeit verwendeten Ribozyme aufgeführt.
Zusätzlich zu den stabilisierten Ribozymen wurden die Zellen mit einem DNA-Antisense-Oligonukleotid (ASO8/12) behandelt. Mit dessen Hilfe sollte überprüft werden, ob durch die alleinige Bindung des Oligonukleotids an die Zielsequenz der PTHrP-mRNA eine Verminderung der Genexpression des PTHrP bewirkt wird. Das ASO8/12 umfasst 21 Basen und entspricht in seiner Sequenz den Flanken des Ribozyms RbO.
Zwischen die beiden Sequenzen der Ribozymflanken wurde ein Guanin eingeschoben, da sich die Flanken des Ribozyms mit dem Abstand einer Base an die PTHrP-mRNA anlagern. Für die metabolische Stabilität sorgen am 5‘- und 3‘- Ende je zwei Phosphorothioatmodifizierungen.
Die Kultivierung der Zellen als Monolayer erfolgte in 75 cm2-Kulturflaschen in 15 ml Leibovitz´s L‑15 Medium bei 5 % CO2, 37 °C und 98 % Luftfeuchtigkeit. Die Zellen wurden je nach Konfluenz bis zu zweimal pro Woche passagiert. Hierfür wurde das Medium abgesaugt um die Zellen dann mit 3 ml PBS zu waschen. Nach dem Abziehen des PBS erfolgte die Trypsinierung der Zellen. Dazu wurden diese ca. 10 Minuten mit 3 ml einer trypsinhaltigen Lösung (2.1.2.5) bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Nachdem sich die Zellen von der Oberfläche der Kulturflasche abgelöst hatten, wurde die enzymatische Aktivität des Trypsins durch die Zugabe von 3 ml Medium inhibiert. Mittels steriler Pipetten unterschiedlicher Größe fand daraufhin eine Vereinzelung der Zellen in der Zellsuspension statt. Schließlich wurde die Zellsuspension bis auf ein Zehntel abgesaugt. Für die weitere Inkubation der Zellen wurde die Zellkulturflasche mit 15 ml L-15 Medium gefüllt.
Sowohl die Substrat-RNA als auch die reinen RNA-Ribozyme wurden mittels der T7-RNA-Polymerase (Boehringer, Mannheim) durch In-vitro-Transkription hergestellt.
Für eine In-vitro-Transkription mit der T7-RNA-Polymerase sind dsDNA-Templates notwendig, die am 5'-Ende eine T7-Promotorsequenz aufweisen.
Die dsDNA-Templates für die Substrat-RNA und die Ribozyme RbO, RbM und Rb8/12 wurden durch PCR amplifiziert. Die dafür benötigten upstream und downstream Primer lieferte ROTH (Karlsruhe) und TIB-MOLBIOL (Berlin). Im Falle der Ribozyme dienten as-ss-DNA-Templates, die ebenfalls von ROTH hergestellt wurden, als Vorlage für die PCR.
Ausgangsprodukt für das 252 Basenpaare umfassende ds-DNA-Template der Substrat-RNA bildete eine 413 Basenpaare lange Sequenz, die einem Ausschnitt des Exon III und IV der PTHrP-mRNA entspricht. Sowohl Exon III als auch Exon IV sind in allen mRNA-Typen des alternativen Spleißens enthalten. Die verwendete Sequenz war ein PCR-Produkt, das aus RT-PCR-Untersuchungen von A. Bunge (1997) im eigenen Labor hervorging.
Die PCR wurde in einem Trio-Thermoblock (Biometra, Göttingen) durchgeführt. In Tabelle 3 ist der einfache Reaktionsansatz aufgeführt.
Da alle DNA-Templates am 3‘-OH-Ende die 20 Basenpaare lange T7-Promotor-Sequenz besaßen, konnte in allen PCR-Ansätzen der gleiche upstream Primer verwendet werden.
Die PCR-Programme umfassten 30 Zyklen und unterschieden sich lediglich durch die Annealing-Temperatur. Sie betrug für die Substrat-RNA 55 °C und für die Ribozyme 52 °C. In einem ersten Schritt wurde der Ansatz vier Minuten lang bei 94 °C denaturiert. Die folgenden 30 Zyklen enthielten einen 45 Sekunden dauernden Denaturierungsschritt bei 94 °C, einen eine Minute dauernden Schritt mit der Annealing-Temperatur und einen eine Minute langen Extensionsschritt bei 72 °C.
Proben aus jedem PCR-Ansatz wurden zur Kontrolle des entstandenen PCR-Produkts zu gleichen Teilen mit einem DNA-Auftragspuffer (2.1.2.6) versetzt und in einem 1,5 %igen bzw. 2,5 %igem Agarosegel aufgetragen. Die Banden des entstandenen PCR-Produkts ließen sich im Gel auf einem UV-Transluminator sichtbar machen.
Zur Vorbereitung der PCR-Produkte auf ihre Verwendung in der In-vitro-Transkription war ein zweimaliges Ausschütteln des Ansatzes mit einem Volumen Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) und eines mit einem Volumen Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) notwendig. Die in der abgezogenen wässrigen Oberphase enthaltene DNA wurde mit einem Zehntel Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 und mit zwei Volumen eiskaltem 100 %igem Ethanol innerhalb von 30 Minuten bei -70 °C gefällt. Im Folgenden wurde die Fällung 15 Minuten lang in einer Kühlzentrifuge bei maximaler Drehzahl zentrifugiert. Nach dem Waschen des entstandenen Pellets mit eiskaltem 70 %igem Ethanol wurde dieses bei Raumtemperatur getrocknet und in RNase-freiem Aqua bidest. aufgenommen.
Die Herstellung der dsDNA-Templates der Ribozyme Rb4/8 und Rb5/10 aus ssDNA-Templates und einer Primersequenz erfolgte mit Hilfe des Klenow-Enzyms. Das Enzym katalysiert die Anlagerung von Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTP) an das 3‘-OH-Ende einer Primer/Template-DNA. Die notwendigen ssDNA-Templates und der Primer wurden von ROTH bezogen
(Tabelle 4).
Der einfache Reaktionsansatz enthielt ein Volumen von 20 µl (Tabelle 5):
Er inkubierte über 60 Minuten bei 37 °C im Trio Thermoblock (Biometra, Göttingen). Zur Reinigung wurde der Ansatz nach der Reaktion wie die PCR-Ansätze behandelt (s. 2.2.2.2).
Die In-vitro-Transkription fand in einem Reaktionsansatz mit einem Volumen von 40 µl statt. Die enthaltenen Reagenzen sind in der Tabelle 6 aufgeführt.
Der Ansatz inkubierte drei Stunden lang bei 37 °C. Gestoppt wurde die Reaktion durch die Zugabe von einem Volumen eines RNA-Auftragspuffers (2.1.2.7). Dann erfolgte die Denaturierung der transkribierten RNA durch Erhitzung der Lösung über 90 Sekunden bei 90 °C. Nach dem raschen Abkühlen der Reaktionsgefäße auf Eis wurde der komplette Ansatz in einem 10 %igen denaturierenden Polyacrylamid-Gel (PAA-Gel) aufgetrennt. Durch die Exposition und die Schwärzung eines Röntgenfilms auf dem Gel ließen sich die Banden des Transkriptionsprodukts lokalisieren. Diese wurden mit einem sterilen Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und in 1,5 ml Eppendorfgefäßen mit 375 µl eines RNA-Elutionspuffers (2.1.2.4) versetzt. Die Gefäße inkubierten bei 37 °C über Nacht schüttelnd in einem Thermoblock. Nach viertelstündigem Zentrifugieren mit Maximaldrehzahl in einer Eppendorf-Tischzentrifuge wurde der Überstand abgezogen und mit einem halben Volumen 7 M Ammoniumacetat und 2,5 Volumen eiskaltem 100 %igen Ethanol bei -70 °C innerhalb von 30 Minuten gefällt. Dem Zentrifugieren der Fällung folgte die Messung der Aktivität des mit 70 %igem Ethanol gewaschenen und getrockneten Pellets einem Szintillationszähler. Aus der Aktivität ließ sich die Stoffmenge der gefällten RNA wie folgt errechnen:
Mit RNase-freiem Aqua bidest. wurde die Konzentration der Ribozyme auf ca. 8 µM und die der Substrat-RNA auf ca. 3 µM eingestellt. Nach dem vollständigen Lösen der Pellets und kurzer Zentrifugation wurde ein definiertes Volumen abgenommen, erneut am Szintillationszähler gemessen und die Konzentrationen der Ribozymlösungen auf 4 µM und die der Substratlösung auf 1,5 µM verdünnt.
Zur radioaktiven Markierung des modifizierten Ribozyms RbS wurde das DNA 5‘-End Labeling System (Promega, Mannheim) benutzt. Die darin enthaltene T4 Polynukleotidkinase (PNK) katalysiert die Übertragung der γ-Phosphatgruppe des ATP auf das dephosphorylierte 5‘-Hydroxy-Ende eines RNA- oder DNA-Templates.
Die im einfachen Reaktionsansatz enthaltenen Reagenzen sind in Tabelle 7 aufgeführt.
Der Ansatz inkubierte 20 Minuten lang bei 37 °C. Die folgende Kontrolle der Markierung und Reinigung des markierten Ribozyms über Gelelektrophorese im PAA-Gel erfolgte wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben.
Für die Stabilisierung des Hammerhead-Ribozyms waren verschiedene Modifikationen geplant. Diese Veränderungen wurden schrittweise durchgeführt, um ihren Einfluss auf die katalytische Aktivität des Ribozyms besser bestimmen zu können.
Die unterschiedlichen Modifikationen des Ribozyms RbO wurden in zellfreien Kinetik-Versuchen miteinander verglichen. In Anlehnung an Arbeiten von Hendry und McCall (1992, 1995a und b) erfolgten diese Versuche unter single-turnover Bedingungen. Hierbei katalysierte das Ribozym, das im eineinhalbfachem Überschuss zum Substrat vorlag, die Spaltung der Substrat-RNA.
Die Substratspaltung fand in einem Volumen von 24 µl statt (Tabelle 8).
Für das Ribozym Rb8/12 wurde die Beeinflussbarkeit der katalytischen Aktivität durch den pH‑Wert, die Reaktionstemperatur, die Magnesiumkonzentration und durch den Zusatz eines Facilitator-DNA-Oligonukleotids untersucht.
Zunächst wurden in den Reaktionsansätzen einer Versuchsreihe pH-Werte von 6,0, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 und 9,5 durch ein Puffergemisch aus Bis-Tris-Propan und Tris-HCl eingestellt.
In weiteren Versuchen ließ sich durch die Inkubation bei verschiedenen Temperaturen (25°, 37°, 45 °C) die Abhängigkeit der katalytischen Aktivität von der Reaktionstemperatur analysieren.
Um den Einfluss der Magnesiumkonzentration auf die Reaktion zu ermitteln, wurden die Konzentration in vier Versuchen auf Werte von 2, 10, 50 und 200 mM angepasst.
Eine Facilitator-DNA ist ein ssDNA-Oligonukleotid, dessen Sequenz es ihm ermöglicht, sich direkt benachbart zum 3‘-OH-Ende des Ribozyms an die Substrat-RNA anzulagern. Dies bewirkt eine
Im Reaktionsansatz lag die Facilitator-DNA in einer Konzentration von 1 µM vor.
Des Weiteren wurde für das stabilisierte Ribozym RbS die Beeinflussung der Aktivität durch ein kationisches Lipid getestet. Das Lipid 6 aus dem PerFect Transfection Kit (Invitrogen) war in einem Reaktionsansatz in einer Konzentration von 170 µg/ml enthalten.
Zur Auswertung der Versuche wurden die getrockneten, radioaktiven Gele in den Belichtungskassetten des Phosphordensitometers fixiert. Darin exponierten sie Bildplatten. Die Expositionszeit
Für jeden Zeitwert (ein Zeitwert entspricht im Gel einer Bahn) wurde die prozentuale Produktentstehung errechnet. Sie ergibt sich aus dem Verhältnis zwischen dem bis dahin entstanden Produkt (Summe der Produktbanden) und dem insgesamt eingesetzten Substrat (Summe aus beiden Produktbanden und verbleibender Substratbande). In einem Koordinatensystem gegenüber der Reaktionszeit aufgetragen, ergab sich für die Produktentstehung eine Wachstumskurve. Diese ließ sich mit Hilfe der Software Origin anpassen. Grundlage für die Kurvenanpassung bildete die folgende exponentielle Funktion (Hendry et al. 1992):
Die Variable P t entspricht dem prozentualen Anteil des entstandenen Produkts zum Zeitpunkt t. P ∞ gleicht der maximalen Produktentstehung im Unendlichen. P Δ ist die Differenz aus der maximalen Produktentstehung und der Produktbildung zum Zeitpunkt Null. Alle drei Werte sind prozentuale Anteile in Bezug auf das gesamte Substrat. Die Reaktionszeit wird mit t dargestellt.
Der k obs -Wert [min -1] ist eine Konstante erster Ordnung für diese Reaktion. Er beschreibt die initiale und somit maximale Spaltungsrate in dieser Reaktion. In dieser Arbeit bildete er die Grundlage für die Einschätzung der Aktivität der Ribozyme.
Im Anschluss an die Auswertung der Versuche am Phosphordensitometer wurden zur direkten, nicht digitalen Dokumentation mit Hilfe der getrockneten Gele in Röntgenkassetten Röntgenfilme geschwärzt.
Für einen Vergleich der Ribozyme mit DNA-Modifizierungen wurden Änderungen in der Versuchsdurchführung und -auswertung vorgenommen. Die Reaktionsansätze besaßen ein Volumen von 15 µl. In diesen waren das Ribozym in einer Konzentration von 500 nM und das Substrat von 300 nM enthalten. Die Entnahme von Aliquots erfolgte jeweils nach 10 und 120 Minuten. Abgesehen von diesen Änderungen folgte die Versuchsdurchführung den oben genannten Schritten. Bei der Auswertung der densitometrisch ermittelten Werte für die Produktentstehung wurde eine vereinfachte Form der exponentiellen Wachstumsfunktion benutzt.
Die Funktion
verläuft durch den Ursprung des Koordinatensystems. Sie geht damit von der Annahme aus, dass zum Zeitpunkt P0 (t = 0) keine Produktbildung vorliegt. Der so ermittelte Wert k weicht von dem kobs-Wert ab, genügt jedoch für einen Vergleich der Ribozyme. Zudem lässt sich die maximale Produktbildung P∞ bestimmen.
Um die metabolische Stabilität gegenüber Exo- und Endonukleasen zu untersuchen, wurden das unmodifizierte Ribozym RbO und das Ribozym RbS 1 %igem Kälberserum (FCS) ausgesetzt.
Die Konzentration der Ribozyme in den Versuchsansätzen betrug 1 µM. Im Gesamtvolumen von 20 µl wurden 2 %ige FCS- und 2 µM Ribozymstammlösung zu gleichen Teilen gemischt und bei 37 °C inkubiert. Während des Versuchs wurden zu definierten Zeiten Proben a 2 µl entnommen. Diese wurden mit 5 Volumen Stopppuffer (2.1.2) versetzt und lagerten zunächst bei ‑20 °C, um den weiteren Abbau der Ribozyme zu stoppen. Die Proben wurden in einem 20%igen denaturierenden PAA-Gel aufgetrennt. Nach der Exposition eines Röntgenfilms auf dem Gel erfolgte dessen Auswertung an einem Densitometer. Dabei wurde der Ribozymabbau mit Hilfe der Molecular Analyst Software (BioRad) quantifiziert und die Halbwertzeit der Ribozyme berechnet.
Für die Wirkung des stabilisierten Ribozyms in vivo ist dessen erfolgreiche Transfizierung in die Zellen notwendig. Die Transfektion sollte mit Hilfe eines kationischen Lipids erfolgen. Es wurden in Transfektionsversuchen acht verschiedene Lipide des PerFect Transfection Kit (Invitrogen) zusammen mit dem Ribozym RbF getestet.
Das Ribozym RbF ist am 3‘-OH-Ende mit Fluorescein markiert. Nach Anregung mit kurzwelligem Licht (490 nm) emittierte Fluorescein Licht einer Wellenlänge von 515 nm und ist somit unter dem Mikroskop sichtbar.
In Vorbereitung der Transfektion wurden die Zellen der Zellinie RCC 95/96 nach der Passage in den Kulturflaschen in einer Fuchs-Rosenthal-Kammer gezählt. Dann erfolgte die Aussaat der Zellen in 8-Kammer-Objektträger. In jede Kammer wurden ca. 20.000 Zellen in 300 µl Leibovitz´s L-15 Medium gegeben. Nach Inkubation der Zellen über Nacht waren die Objektträger subkonfluent bewachsen. Um die Zellen unter serumfreien Bedingungen zu transfizieren, wurden die Kammern dreimal mit 300 µl serumfreiem Ham`s F-10 gewaschen. Danach inkubierten die Zellen mit 300 µl modifizierten Ham`s F-10.
Die Herstellung des modifizierten Ham`s F10 erfolgte eine halbe Stunde vor Beginn der Transfektion. Zunächst wurden Lipid und Ribozym getrennt in je 150 µl Ham`s F-10 aufgenommen. Die Lipidkonzentration im Medium betrug 24 µg/ml. Das Ribozym wurde im Massenverhältnis 1 : 6 zum Lipid im Medium gelöst und lag somit in einer Konzentration von 4 µg/ml vor. Nach viertelstündiger Inkubation der beiden Teillösungen bei Raumtemperatur wurden diese vereinigt und inkubierten eine weitere Viertelstunde. Das Ribozym besaß nun in diesem Medium eine Konzentration von 166 nM. Vor der Behandlung der Zellen mit dem modifizierten Medium wurde es auf 37 °C erwärmt.
Die Transfektionszeit betrug 60 Minuten. Danach wurden die Objektträger fünf Minuten lang in 1x PBS gewaschen. Die Fixierung der Zellen erfolgte durch 10minütige Inkubation der Objektträger in einer Lösung aus 3,7 % Formaldehyd in 1x PBS. Um die Zellen unter dem Mikroskop besser lokalisieren zu können, wurden die Zellkerne mit 100 µl verdünnter Propidiumjodidlösung gefärbt (10 µl 95 %ige Propidiumjodidlösung in 10 ml 1x PBS). Anschließend waren die Objektträger wiederholt in 1x PBS zu waschen. Dann konnten die Kammerwände entfernt werden. Schließlich wurden die Objektträger mit Hilfe von Hep2-Mounting Medium und einem Deckgläschen eingedeckelt. Die Begutachtung der Zellen erfolgte an einem konfokalen Mikroskop.
Die Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 wurden in Zellkultur mit den stabilisierten Ribozymen RbS, RbSSc und dem Antisense-Oligonukleotid (ASO8/12) behandelt. Für diese Behandlung war folgende Vorbereitung der Zellen notwendig: Nach der Passage in der Kulturflasche wurden die Zellen in einer Fuchs-Rosenthal-Kammer gezählt und in 24-Loch-Platten (Nunc) ausgesät. Die Aussaat von 200.000 Zellen in 2 ml Leibovitz´s L-15 Medium je Loch erwies sich dabei als optimal, da so nach der Inkubation über Nacht bei 37 °C eine konfluente Bewachsung vorlag. Am nächsten Tag wurde das L-15 Medium abgesaugt und jedes Loch dreimal mit 2 ml Ham`s F-10 gewaschen. Dann erfolgte die Inkubation der Zellen bei 37 °C mit 250 µl modifizierten Ham`s F-10. Dabei wurden die Zellen in jeweils drei Löchern gleich behandelt. Die Herstellung des mit den Ribozymen modifizierten Ham`s F-10 ist im Abschnitt 2.2.6 beschrieben.
Das Antisense-Oligonukleotid ist für die Behandlung der Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen (1 bis 10 µM) im Ham`s F-10 verdünnt worden. Das mit dem ASO8/12 modifizierte Medium enthielt kein kationisches Lipid.
Nach 60minütiger Inkubation wurden aus jedem Loch zwei Proben von 100 µl des Behandlungsmediums entnommen und in eine vorbehandelte (s. 2.2.8) 96-Loch-Platte (Nunc) aufgetragen. Um ein Antrocknen der Zellen zu verhindern, erfolgte sofort das Auffüllen der Löcher mit 2 ml unmodifiziertem Ham`s F10. Nach dem Absaugen der Löcher fand eine erneute Inkubation der Zellen mit 250 µl unmodifiziertem Ham`s F-10 statt. Wiederum nach 60 Minuten wurden zwei 100 µl‑Proben je Loch entnommen und in die 96-Loch-Platte pipettiert.
Insgesamt ergaben sich für beide Entnahmezeiten und für jede unterschiedliche Behandlung jeweils sechs Proben aus den Zellüberständen. Die in den sechs Proben durch ELISA ermittelten Werte für die PTHrP-Sekretion wurden in der Auswertung gemittelt. Somit resultierten für jede Behandlung zwei Werte. Der erste Wert entsprach der PTHrP-Menge, die während der 60minütigen Behandlung durch die Zellen sezerniert wurde und der zweite Wert der Menge an PTHrP, die in den 60 Minuten nach der Behandlung sezerniert wurde.
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Der Prüfstein für die Wirksamkeit des stabilisierten Ribozyms bei der Behandlung von Zellen in Zellkultur war die Sekretion des PTHrP in das Kultivierungsmedium. Diese sollte sich durch erfolgreiche Spaltung der PTHrP-mRNA mittels Ribozym messbar vermindern. Für den quantitativen Nachweis des PTHrP in den Zellkulturüberständen wurde ein one-site-ELISA genutzt.
Beim one-site-ELISA wird ein über unspezifische Bindungen an eine Mikrotiterplatte gebundenes Antigen durch einen monoklonalen Primärantikörper detektiert. An diesen wird ein biotinylierter Sekundärantikörper gekoppelt. Die Biotin-Streptavidin-Bindung koppelt den zweiten Antikörper mit einem Streptavidin-Peroxydase-Konjugat. Eine Erhöhung der Sensitivität des ELISA lässt sich durch das Einfügen eines weiteren biotinylierten Antikörpers (Tertiärantikörper) erzielen (Abb. 4).
In Vorbereitung des one-site-ELISA wurden verschiedene Lösungen hergestellt.
Bevor die Zellüberstände in die 96-Loch-Platte (ELISA-Platte) gegeben wurden, erfolgte eine Vorbehandlung der Löcher mit 20 µl Carbonatpuffer. Das so entstandene alkalische Milieu ermöglichte dem Peptid PTHrP eine bessere Bindung an die Gefäßwand.
Zusätzlich zu den Zellüberständen wurde auf jeder ELISA-Platte eine Eichreihe aufgetragen. Das PTHrP 1-86 (BACHEM, Heidelberg) nahm darin Konzentrationen von 5 nM bis 50 pM an. Die mit den Zellüberständen und der Eichreihe beschickten Platten inkubierten über Nacht bei 4 °C.
Am folgenden Tag wurden die Platten abgesaugt und auf saugfähigen und fusselfreien Papiertü-chern ausgeklopft. In jedes Loch wurden 200 µl der Blocklösung gegeben. Um die Immunreaktion zu beschleunigen, wurden alle Lösungen auf 37 °C vorgewärmt. Mit der Blocklösung inkubierten die Platten schwimmend in einem Wasserbad bei 37 °C. Zwischen allen Inkubationsschritten, die eben-
Nach der 45minütigen Inkubation der Platten mit der Blocklösung und dem anschließenden Waschen fand eine Beladung der Löcher mit der ersten Antikörperlösung statt. Es wurden pro Loch 100 µl Lösung pipettiert. Die Inkubationszeit betrug zwei Stunden. Die sich anschließenden Inkubationen mit je 100 µl der zweiten und dritten Antikörperlösung sowie der SA-POX-Lösung dauerten jeweils eine Stunde. Nach dem dreimaligen Waschen wurden die Platten mit Citrat-Phosphatpuffer behandelt. Ein weiterer Waschschritt folgte nicht. Die Citrat-Phosphat-pufferlösung wurde durch Ausklopfen entfernt und die einzelnen Löcher mit 100 µl Substratlösung beschickt.
Die entstehende Farbreaktion ließ sich durch Zugabe von 1 %iger Schwefelsäure stoppen. Es folgte die Messung der Extinktion der ELISA-Platten am Mikrotiterplattenphotometer. Mit Hilfe der Kinetic Calc Software wurden die Messwerte ausgewertet.
Die Mittelwerte und die Standardabweichungen für die kobs-Werte der Ribozyme RbO und RbS wurden aus mindestens drei Versuchen errechnet. Aussagen über die signifikante Verschiedenheit der Werte konnten mittels Student´s t-Test für unabhängige Stichproben getroffen werden.
Die Extinktionswerte, die nach der Behandlung der Zellen in den Überständen gemessenen wurden, sind für mindestens vier gleiche Behandlungen nach Abzug eines Leerwertes gemittelt worden. Mit dem Student´s t-Test für unabhängige Stichproben wurde analysiert, ob die Ergebnisse zur Kontrollbehandlung signifikant verschieden sind.
Für die In-vitro-Transkription mit der T7-RNA-Polymerase sind dsDNA-Templates notwendig. Sie wurden für die Substrat-RNA und die Ribozyme RbO, RbM und Rb8/12 durch PCR amplifiziert. Die Kontrolle der PCR-Produkte erfolgte durch Elektrophorese im Agarosegel (Abb. 5 und Abb. 6). Die dsDNA-Templates der Ribozyme Rb5/10 und Rb4/8 wurden mit dem Klenow-Enzym hergestellt.
Die bei den kinetischen Untersuchungen erhobenen Daten basieren auf der densitometrischen Auswertung von Bildplatten an einem Phosphordensitometer. Auf den Bildern, die dabei mit Hilfe der Molecular Analyst Software erstellt wurden, sind die Banden der ungespaltenen Substrat-RNA
Zunächst erfolgte ein Vergleich des unmodifizierten Hammerhead-Ribozyms RbO mit seinem nichtkatalytischen Pendant RbM. Sie unterscheiden sich zueinander durch den Wechsel zweier Basen in der Stammschleife. Es wurde das Guanin an Position 11 gegen ein Adenin und das Adenin an Position 30 gegen ein Guanin ausgetauscht.
Für das Ribozym RbO wurde die Bestimmung des kobs-Wert dreimal durchgeführt. Der daraus errechnete Mittelwert betrug 47,42 min-1 (x 10-3). Die mittlere Standardabweichung lag bei
8,86 min-1 (x 10-3). Das Ribozym RbM zeigte erwartungsgemäß keine katalytische Aktivität (Abb. 8 und Abb. 9).
Als erste Modifizierungen des Hammerhead-Ribozyms RbO wurden Verkürzungen der Stammschleife und der Flanken vorgenommen. Dazu wurden die Ribozyme Rb8/12, Rb5/10 und Rb4/8 erstellt.
Durch Baseneinsparung in den Positionen 17, 18, 25 und 26 besitzt das Ribozym Rb8/12 eine kürzere Stammschleife als das Originalribozym (RbO). Die Ribozyme Rb5/10 und Rb4/8 zeichnen sich sowohl durch eine kürzere Stammschleife als auch durch kleinere Flanken (Verkürzung von 8 und 12 Basen auf 5 und 10 sowie 4 und 8 Basen) aus.
Im Vergleich der Ribozyme zeigte das Ribozym Rb8/12 eine zweimal höhere Aktivität als das Ribozym RbO. Die Ribozyme mit verkürzten Flanken wiesen hingegen eine um 25 % (Rb4/8) bis 50 % (Rb5/10) verminderte Aktivität gegenüber RbO auf (Abb. 10 und Abb. 11).
Um einschätzen zu können, wie sich veränderte Reaktionsbedingungen auf die katalytische Aktivität eines Hammerhead-Ribozyms auswirken, sind der pH-Wert, die Reaktionstemperatur und die Ma
Die bei der Auswertung ermittelten kobs-Werte wurden mit den unter Standardbedingungen errechneten verglichen. Zur besseren Veranschaulichung sind die letzteren als 1,0 angenommen worden. Als Standardbedingungen galten ein pH-Wert von 7,5, eine Reaktionstemperatur von 37 °C und eine Magnesiumkonzentration von 10 mM. Der kobs-Wert für die Reaktion ohne Zugabe eines Facilitators wurde auf 1,0 gesetzt.
In den Versuchen zur pH-Abhängigkeit stellte sich für das Ribozym Rb8/12 ein pH-Optimum von 9,5 heraus. Bei pH-Werten unterhalb von 6,0 verlor das Ribozym seine Aktivität.
Die Reaktionen bei 25, 37 und 45 °C zeigten, dass eine Erhöhung der Reaktionstemperatur in diesem Bereich mit einer Steigerung der Aktivität des Ribozyms einhergeht.
Eine ebenso positive Abhängigkeit wies die Aktivität des Ribozyms in einem Bereich zwischen 2 und 200 mM von der Magnesiumkonzentration auf.
Durch die Zugabe eines Facilitators stieg die katalytische Aktivität um 60 % (Abb. 12).
Der nächste Schritt bei der Entwicklung eines metabolisch stabilen Ribozyms bestand im teilweisen Austausch von Ribonukleotiden durch Desoxyribonukleotide. Ausgangsprodukt für diese Modifizierungen waren die reinen RNA-Ribozyme Rb5/10 und Rb8/12.
Durch eine weitere Verkürzung der Flanken und DNA-Modifizierungen zeichnet sich das Ribozym Rb4/6V1 aus. Das Ribozym Rb5/10, das im vorhergehenden Vergleich nur eine geringe Aktivität aufwies, wurde zusätzlich synthetisiert.
Zunächst erfolgte ein Vergleich des Ribozyms Rb5/10 mit seinen DNA-modifizierten Varianten. Das Ribozym Rb4/6V1 wurde in diesen Vergleich mit einbezogen (Abb. 13).
Hierbei zeigte sich, dass eine Verkürzung der Flanken auf insgesamt 10 Basen zum vollständigen Aktivitätsverlust des Ribozyms führt. Ausgehend vom Ribozym Rb5/10 wurden zunächst die Flanken DNA-modifiziert, was ohne drastische Aktivitätsverluste möglich war. Auch die Stammschleife kann weitgehend durch Desoxyribonukleotide aufgebaut werden.
Im Folgenden wurden die DNA-modifizierten Ribozyme verglichen, die in den Flanken 8 und 12 Basen aufweisen. Der Vergleich erfolgte zusammen mit den Ribozymen RbO und Rb8/12. Die Versuchsbedingungen waren mit denen im vorhergehenden Vergleich identisch (Abb. 14).
Für die Modifizierung mit Phosphorothioaten empfahl sich das Ribozym Rb8/12V4. Es besteht zu 71 % aus DNA und übertrift in seiner Aktivität das Original-Ribozym RbO. Zunächst wurde das
In der folgenden kinetischen Untersuchung wurden die Ribozyme Rb8/14V4, Rb8/12V4PT und RbF verglichen (Abb. 16).
Der Einbau von Phosphorothioaten in das Ribozym Rb8/12V4PT verursachte eine Aktivitätsminderung um 30 % gegenüber Rb8/12V4. Das fluoresceingekoppelte Ribozym RbF hat im Vergleich zum Ribozym Rb8/12V4 über 85 % der Aktivität verloren (Abb. 17).
Um eine Stabilisierung zu erreichen, wurden beim Ribozym RbS gegenüber Rb8/12V4PT auch im Bereich der Stammschleife drei Phosphorothioatmodifikationen vorgenommen. Zudem erfolgte ein Austausch des Uracils an Position 13 gegen ein Adenin. Insgesamt wurde damit das Ribozym RbS gegenüber dem unmodifizierten Hammerhead-Ribozym RbO wie folgt verändert:
Im Vergleich zwischen dem Ribozym RbO und dem Ribozym RbS zeigte sich, dass ihre Aktivitäten trotz der umfangreichen Modifikationen nicht differierten. Mit p = 0,743 (α = 0,5) ergab sich im t‑Test für die kobs-Werte der Ribozyme kein signifikanter Unterschied (Abb. 18 und Abb. 19).
Die Transfektion der Zellen mit dem stabilisierten Ribozym sollte mit Hilfe eines kationischen Lipids erfolgen. In einer kinetischen Untersuchung wurde zuvor dessen Einfluss auf die katalytische
Die Behandlung der Zellen mit dem stabilisierten Ribozym kann durch unspezifische Effekte eine Verringerung der PTHrP-Sekretion hervorrufen. Um diese von der erwünschten Wirkung des Ribozyms unterscheiden zu können, wurde ein weiteres Ribozym (RbSSc) erstellt. Es besitzt im Gegensatz zum Ribozym RbS Flanken, deren Sequenzen nicht komplementär zur Substrat-RNA sind. Die Flanken verfügen rechnerisch über die gleichen Basen, sind jedoch durch das Vertauschen der Basen in ihrer Sequenz verändert. Im Test zeigte dieses Ribozym keine Aktivität (Abb. 21).
Die metabolische Stabilität des Ribozyms RbS gegenüber dem unmodifizierten Ribozym RbO wurde in 1 %igem Kälberserum (FCS) getestet. In der FCS-Lösung lagen die Ribozyme in einer Konzentration von 1 µM vor. Die Auswertung des Stabilitätstests ergab für das Ribozym RbS eine Halbwertzeit von mehr als 10 Stunden. Sie war gegenüber der für das Ribozym RbO ermittelten Halbwertzeit (ca. eine Stunde) über das Zehnfache erhöht.
Vor der Behandlung der Tumorzellen in Monolayer-Zellkultur durch lipidvermittelte Transfektion mit dem stabilisierten Ribozym, wurden in Transfektionsversuchen acht verschiedene kationische Lipide des PerFect Lipid Transfection Kit (Invitrogen) zusammen mit dem Ribozym RbF getestet.
Um die Wirksamkeit des stabilisierten Ribozyms RbS in vivo zu überprüfen, wurden mit diesem Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 in Monolayer-Zellkultur behandelt. Parallel dazu erfolgte eine Kontrollbehandlung der Zellen mit dem Ribozym RbSSc. Das ebenfalls stabilisierte Ribozym RbSSc kann sich auf Grund inkomplementärer Flanken nicht an die PTHrP-mRNA binden. Es besitzt somit gegenüber der PTHrP-mRNA keine katalytische Aktivität.
Die Ribozyme lagen in dem Transfektionsmedium in einer Konzentration von 166 nM vor. In Bezug auf das Kontrollribozym RbSSc ließ sich für das Ribozym RbS kein Effekt nachweisen. Die in den 60 Minuten nach der Behandlung (2. Wert) gemessenen PTHrP-Sekretionen waren mit p = 0,706 (α = 0,5) nicht signifikant verschieden (Abb. 25).
Antisense-Oligonukleotide können in Zellen durch Bindung an mRNA zur Verringerung der Expression des entsprechenden Gens führen. Die Behandlung der Zellen mit dem Antisense-Oligonukleotid ASO8/12 sollte diesen möglichen Effekt für die PTHrP-Sekretion nachweisen.
In einem Versuch wurden die Zellen mit dem Ribozym RbS oder dem ASO8/12 behandelt. Beide lagen in Konzentrationen von 1 µM vor. Auf die Zugabe von einem Lipid im Behandlungsmedium wurde verzichtet.
Gegenüber der Kontrollsekretion (K) sind für die Behandlung mit dem Ribozym und dem Antisense-Oligonukleotid keine signifikanten Unterschiede gemessen worden (Abb. 27).
Eine Erhöhung der Konzentration des Antisense-Oligonukleotid (bis 10 µM) führte zu keiner Verringerung der PTHrP-Sekretion (Abb. 28).
In dieser Arbeit sollte schrittweise ein Ribozym gegen die PTHrP-mRNA entwickelt werden. Um es für die Behandlung von Tumorzellen in Monolayer-Zellkultur einsetzen zu können, waren verschieden Modifikationen am Ribozym notwendig. Die strukturellen und chemischen Abänderungen des Ausgangsribozyms sollten bei gewahrter katalytischer Aktivität zu einer erhöhten Nukleasenstabilität führen.
Die Laborarbeit gliederte sich methodisch in folgende Schwerpunkte:
Am Anfang standen vorbereitende Arbeiten, die dem Herstellen der Ribozyme und der Substrat-RNA dienten. Dabei erwies es sich als problematisch, die radioaktiv markierten RNA-Stränge in für die Ribozymkinetik ausreichender Menge und Reinheit zu erzeugen.
Als der entscheidende Abschnitt dieser Arbeit sind die kinetischen Untersuchungen anzusehen. Mit ihrer Hilfe war es möglich, die unterschiedlich modifizierten Ribozyme zu differenzieren und die Einflüsse der verschiedenen Modifikationen auf die katalytische Aktivität zu untersuchen.
Vor den Zellversuchen wurde das Ribozym RbS - es stellte das Ergebnis der Entwicklung dar - auf seine metabolische Stabilität getestet.
Die Behandlung der Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 mit dem Ribozym RbS beendete die experimentelle Phase der Arbeit.
Da die kinetischen Untersuchungen unter single-turnover-Bedingungen im Bereich von 1 µM erfolgten, wurde eine beträchtliche Menge der 232 Basen langen Substrat-RNA benötigt. Diese Synthesemenge war durch die In-vitro-Transkription nur zu erreichen, wenn bei dieser Reaktion mindestens 20 µg Template-DNA eingesetzt wurden.
Amplifikation der Template-DNA durch PCR
Reinigen der Template-DNA
In-vitro-Transkription
Reinigen und Vermessen des Transkriptionsprodukts
Um die Menge an amplifizierter DNA bei der PCR zu erhöhen, wurde die Reaktion optimiert. Das gelang zum einen durch Verkürzen des PCR-Templates von 413 auf 252 Basen. Die zu diesem Zweck erforderliche Primer-DNA wurde mit der Oligo-Software ermittelt. Neben der höheren PCR-Ausbeute führte die Verkürzung später zusätzlich zu einer höheren Transkriptionseffizienz.
Zum anderen wurden die Annealing-Temperatur und die Zyklenzahl angepasst. Hilfreich war hierfür neben durchgeführten Testreihen die Oligo-Software, mit der sich eine Richttemperatur ermitteln ließ. Die optimierte PCR zeigte im Kontrollgel nur geringe Degradationsprodukte und keine Fehlbanden (Abb. 5).
Die Reinigung des PCR-Produkts von Proteinen (DNA-Polymerase) und Nukleotiden hatte einen maßgeblichen Einfluss auf das Gelingen der In-vitro-Transkription. Es konnte festgestellt werden, dass ein zweimaliges Ausschütteln des PCR-Ansatzes mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol gegenüber einem einmaligen zu einer deutlich höheren Transkriptionseffizienz führt. Bei einem Einsatz von ungereinigter Template-DNA in der In-vitro-Transkription war das Reaktionsprodukt im PAA-Gel nicht klar von degradierten oder nicht vollständig synthetisierten Produkten abzugrenzen.
Für die weitere Verwendung der Substrat-RNA und der Ribozyme in den Kinetikuntersuchungen war es notwendig, sie im Anschluss an die Transkription von zusätzlich transkribierten Fehlbanden, von Template-DNA, Proteinen und Degradationen zu selektieren. Dabei kam es insbesondere darauf an, die entsprechenden Banden der Transkriptionsprodukte aus dem PAA-Gel präzise herauszuschneiden. Nur so konnte gewährleistet werden, dass die spätere Mengenbestimmung und die kinetischen Tests nicht durch Doppelbanden verfälscht wurden.
Die Reaktionsgeschwindigkeit von chemischen Prozessen lässt sich in vielen Fällen durch spezielle Substanzen regulieren. Dabei bleiben die Katalysatoren - so werden diese Substanzen bezeichnet - während der Reaktion in ihrer Struktur und Menge erhalten. Für die Katalysatoren in biologischen Systemen wurden die Begriffe Biokatalysator bzw. Enzym geprägt. Sie werden in der Mehrzahl durch intrazelluläre Proteine verkörpert, die monomer, oligomer, einfach oder komplex strukturiert sind. Aber auch für einige Ribonukleinsäuren, Ribozyme genannt, wurde enzymatische Aktivität nachgewiesen (Cech 1986).
Die Reaktionskinetik der von Ribozymen katalysierten Reaktionen gleicht der anderer Enzymsysteme. So lässt sich die enzymatische Reaktion allgemein durch folgende Gleichung wiedergeben (Hendry et al. 1992):
Die Gleichgewichtskonstante K des ersten Reaktionsschritts ergibt sich aus dem Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten für Substratassoziation und -dissoziation (K = k1 / k-1). Im zweiten Schritt, auch als chemischer Schritt bezeichnet, findet die eigentliche Substratspaltung statt. Ihre Geschwindigkeit wird mit der Konstante k2 beschrieben. Sie ist von der Konzentration der Reaktionskomponenten (Substrat [S], Ribozym [R]) unabhängig. Die entsprechende Rückreaktion ist zu vernachlässigen.
Der letzte Schritt umfasst die Produktdissoziation. Er könnte auch in zwei weitere, parallel verlaufende Zwischenschritte untergliedert werden (RP1 + P2 oder RP2 + P1). Als eine Besonderheit der ribozymkatalysierten Reaktionen ist dabei die starke Bindung zwischen komplementären RNA-Strängen herauszustellen. Sie kann den letzten Reaktionsschritt zu einem die Gesamtreaktion limitierenden Schritt werden lassen (McConnell 1997).
Entsprechend anderen Enzymen können Ribozyme durch die katalytische Konstanten Km, kcat und kcat/Km näher charakterisiert werden. Die Werte ergeben sich aus der klassischen Michaelis-Menten-Kinetik. Diese geht davon aus, dass bei konstanter Enzymmenge die Substratkonzentration schrittweise angehoben wird. Mit dem Anstieg des Enzym-Substrat-Komplexes (ES) nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit (initialer Substratumsatz) zu. Wird die Reaktionsgeschwindigkeit im Koordinatensystem als Funktion der Substratkonzentration aufgetragen, erhält man eine hyperbolische Kurve, die sich asymptotisch der Maximalgeschwindigkeit Vmax nähert. Bei maximalem initialen Substratumsatz liegt die gesamte Enzymmenge als Enzym-Substrat-Komplex vor. Die dann bestehende
Die Konzentration des Substrats, die zur Sättigung führt, ist für jedes Enzym verschieden. Da sich jedoch die experimentelle Bestimmung der Sättigungskonzentration als schwierig erwies, führten Michaelis und Menten (1913) den standardisierten Wert Km ein. Der auch als Michaeliskonstante bezeichnete Km-Wert entspricht der Substratkonzentration bei halbmaximaler Geschwindigkeit. Er stellt somit die Substratkonzentration dar, bei der die Hälfte des vorhandenen Enzyms mit Substrat gesättigt ist (Abb. 29).
Mit Hilfe des Km-Werts lassen sich Aussagen über die Substrataffinität des Enzyms treffen. Ist der Km-Wert hoch, bedeutet es, dass eine große Substratmenge zur Sättigung des Enzyms erforderlich ist. Das Enzym besitzt eine geringe Affinität zum Substrat. Analog ergibt sich für ein starkes Bindungsbestreben zwischen Enzym und Substrat ein geringer Km-Wert.
Der kcat-Wert, in älterer Literatur auch als Wechselzahl (turnover number) bezeichnet, gibt die molare katalytische Aktivität des Enzyms an. Er entspricht dem Quotienten aus gemessener Maximalgeschwindigkeit Vmax und der eingesetzten Enzymmenge. Dieser für jedes Enzym spezifische Wert besitzt die Dimensionen s-1 oder min-1. Er gibt an, wie viel Substratmoleküle in der Zeiteinheit von einem Enzymmolekül bzw. einem katalytischen Zentrum bei Substratsättigung umgesetzt werden. In der Michaelis-Menten-Kinetik entspricht der kcat-Wert der Geschwindigkeitskonstante für den chemischen Schritt.
Je nachdem, welche Reaktionskomponente - Substrat oder Ribozym - im Vergleich zur jeweils anderen im Überschuss vorliegt, wird zwischen Reaktionen unter multiple- oder single-turnover Bedingungen unterschieden. Multiple-turnover Reaktionen erfolgen unter Substratüberschuss. Dabei wird festgestellt, ob ein Ribozym in der Lage ist, mehrere Substratmoleküle zu spalten. Unter diesen Reaktionsbedingungen können alle Reaktionsschritte, insbesondere die Produktdissoziation, den Reaktionsumsatz limitieren. Durch eine Balance zwischen Bildung und Zerfall des Ribozym-Substrat-Komplexes (RS) wird über einen längeren Zeitraum der Reaktion sowohl die RS-Konzentration als auch die freie Ribozympopulation konstant gehalten (steady state).
Bei single-turnover-Reaktionen liegt das Ribozym im Überschuss vor. Dies macht es wahrscheinlich, das ein Ribozym die Spaltung von nicht mehr als einem Substratmolekül katalysiert. Die Produktdissoziation spielt deshalb als reaktionslimitierender Faktor keine Rolle. Vielmehr sind nur die ersten beiden Reaktionsschritte, nämlich die Bildung des RS-Komplexes und die Spaltungsreaktion, für den Reaktionsumsatz entscheidend.
Die Entscheidung für eine der beiden genannten Formen der Reaktionskinetik ist in erster Linie von den Strukturen der Reaktionspartner abhängig. Um die Effektivität verschiedener Ribozyme bei der Spaltung einer kurzen Substrat-RNA zu vergleichen, sind Reaktionen unter multiple-turnover-Bedingungen gut geeignet. Dazu werden mit Hilfe der Michaelis-Menten-Kinetik die katalytischen Konstanten kcat,Km und kcat/Km ermittelt.
Für die Spaltung längerer Substrate spielen Sekundärstrukturen der RNA-Stränge eine wichtige Rolle. Sie können zu einer erheblichen Verminderung der katalytischen Effizienz führen. So ergaben sich für die Spaltung der LTR
LTR = long terminal repeats, Steuersequenz
In dieser Arbeit wurden verschiedene Ribozyme hinsichtlich ihrer Aktivität in zellfreien Versuchen untersucht. Die In-vitro-Spaltung eines 232 Basen umfassenden Abschnitts des Exon III und IV der PTHrP mRNA erfolgte dabei unter single-turnover-Bedingungen. Anfängliche Tests, die unter Überschuss des Substrats zum Ribozym stattfanden, ergaben nur einen geringen Umsatz. Der Versuchsaufbau, der den Arbeiten von Hendry und McCall (1992, 1995a und b) entlehnt wurde, gestattete es hingegen, dass für die meisten der untersuchten Ribozyme ein gut messbarer Umsatz nachgewiesen werden konnte. Für den Vergleich der Ribozyme wurde der kobs-Wert, eine kinetische Konstante erster Ordnung, ermittelt. Dieser Wert entspricht der Geschwindigkeitskonstante k2, da durch die Vorinkubation des gesamten Reaktionsansatzes in Abwesenheit von Magnesium der reaktionslimitierende Schritt nicht die Bildung des Ribozym-Substrat-Komplexes (k1), sondern die Spaltung des Substrats ist. Sehr einflussreich auf die ermittelten kobs-Werte waren die Zeitpunkte der Probenentnahmen (2.2.4.1). Es ergaben sich systematisch höhere Werte, je näher die erste Entnahme am Zeitpunkt t0 (t = 0) lag, bzw. systematisch zu niedrige Werte, je weiter die erste Probenentnahme herausgezögert wurde. Die Entnahme einer Probe zum Zeitpunkt t0 war technisch nicht möglich, so dass die ermittelten kobs-Werte nur Näherungswerte an den absoluten Wert sein können.
Die katalytischen Konstanten der Michaelis-Menten-Kinetik kcat, Km und kcat/Km ließen sich unter single-turnover-Bedingungen nicht bestimmen.
Zu Beginn der kinetischen Untersuchungen wurde der kobs-Wert für das Hammerhead-Ribozym RbO, das der Entwicklung weiterer Ribozyme zu Grunde lag, bestimmt. Der gemittelte Wert für die Spaltung der 232 Basen langen Substrat-RNA betrug 0,047 min-1. Hendry und McCall ermittelten in ihrer Arbeit (1992) für die Ribozyme 1 und 2 mit 1,6 min-1 (± 0,6) und 5,0 min-1 (± 1,0) um bis zu 100 mal höhere k2-Werte
In folgenden Arbeiten von Hendry wurden die k2-Werte als kobs-Werte bezeichnet.
HTF = human tissue factor
Es ist ersichtlich, dass das kurze Substrat S 39 nahezu 125 mal schneller gespalten wird als das Substrat S 942. Diese Werte verdeutlichen, welchen Einfluss die Länge des Substrats auf die Spaltung hat. Mit 0,057 min-1 liegt die Geschwindigkeitskonstante k2 für die Spaltung des Substrats S 452 im Bereich des kobs-Werts des Ribozyms RbO. Jedoch ist auch hier ein direkter Ver
Parallel zum Ribozym RbO wurde das Ribozym RbM getestet. Beide Ribozyme sind bis auf zwei Abweichungen im Bereich der Stammschleife des Ribozyms RbM identisch. Der Austausch von zwei Basen in der konservierten Region der Stammschleife von RbM bedingte den vollständigen Verlust der katalytischen Aktivität. Diese Tatsache untermauert die Feststellung, dass die konservierte Region eine wichtige Rolle für die Ribozymaktivität spielt. Manipulationen in diesem Bereich, sei es durch Basenaustausch, Phosphorthionatsubstitutionen oder andere Modifikationen, führen daher zu einer Abnahme oder dem Verlust der Aktivität (Ruffner et al. 1990).
In den voranstehenden Abschnitten wurde bereits darauf hingewiesen, dass die Länge der Substrat-RNA und die damit verbundenen mehr oder minder ausgeprägten Sekundärstrukturen erheblichen
In mehreren Arbeiten untersuchten Lange et al. (1994), Tuschl und Eckstein (1993), Hendry und McCall (1995 und 1996), inwiefern Größenänderungen der Ribozyme die Katalyse beeinflussen. Auf den Erkenntnissen basierend und ausgehend vom Hammerhead-Ribozym RbO wurden in dieser Arbeit weitere Ribozyme, die in Flanken und Stammschleife verkleinert wurden, erstellt (Abb. 30).
Das Ribozym Rb8/12, das mit dem Ribozym RbO identische Flanken besitzt, wies bei der Spaltung der Substrat-RNA die höchste Aktivität auf. Die Tatsache, dass die kürzeren Flanken der Ribozyme Rb5/10 und Rb4/8 geringere Substratumsätze bewirkten, lässt vermuten, dass es für die Länge der Flanken ein Optimum bezüglich der Ribozymaktivität gibt. So ermittelten auch Lange et al. (1994) bei der Spaltung einer 501 Basen umfassenden Substrat-RNA durch Ribozyme mit unterschiedlichen Flanken (3‘/5‘-Flanken: 5/9, 7/9, 8/10 und 14/13) die höchste Effizienz für das Ribozym mit einer Flankenlänge von 7 und 9 Basen. Eine Bindungsschwäche der 3‘‑Flanke mit sich anschließender frühzeitiger Dissoziation vom Substrat wurde als Grund für die geringe Effizienz des 5/9er Ribozyms angenommen. Hendry und McCall (1995 und 1996) untersuchten den Einfluss der Flankenlänge auf die Katalyse anhand von Spaltungen kurzer Substrate (13 nt). Der Vergleich eines 10/10er mit einem 6/6er Ribozyms ergab deutliche Unterschiede hinsichtlich der ermittelten kinetischen Konstanten. Das kleinere Ribozym, bezeichnet als TAT RA 6X2, wies einen annähernd 20fach höheren kcat-Wert und einen um zwei Drittel niedrigeren Km-Wert auf. Die sich daraus ergebende katalytische Effizienz (kcat/Km) zeigt, dass das Ribozym mit den kürzeren Flanken das Substrat unter multiple-turnover-Bedingungen ca. 60 mal effektiver umsetzt. In gleicher Weise zeigte
In einer weiteren Arbeit wiesen Hendry und McCall (1996) nach, dass die katalytische Aktivität von Ribozymen mit asymmetrischen Flanken größer ist, wenn sich die kürzere der beiden Flanken am 5‘‑Ende befindet. So wurde bei der Spaltung eines 21mer Substrats durch ein 5/10er und ein 10/5er Ribozym für das Verhältnis der ermittelten kobs-Werte ein Faktor, der größer als 100 ist, errechnet. Um die Flankenlängen zu optimieren, variierten Hendry und McCall diese in weiteren Untersuchungen. Hierbei erkannten sie, dass eine Längenveränderung der 5‘-Flanke einen größeren Effekt hervorruft als eine Änderung der Länge der 3‘-Flanke.
Eine weitere Verkleinerung der Ribozyme ist durch die Einsparung von Basen im Bereich der Stammschleife möglich. In mehreren Arbeiten wurden Ribozyme erstellt, bei denen die Basen der Stammschleife, abgesehen von denen in den konservierten Regionen, teilweise oder vollständig entfernt wurden. Diese Ribozyme, von McCall et al. (1992) als Minizyme bezeichnet, verfügten bei der Spaltung kleiner Substrate unter multiple-turnover Bedingungen über eine geringere Aktivität als die Ribozyme mit kompletter Stammschleife. Dabei war die Aktivitätseinschränkung vom Ausmaß der Baseneinsparung abhängig (Tuschl und Eckstein 1993). Die Ribozyme, bei denen die Doppelhelix der Stammschleife lediglich von vier auf zwei Basenpaare verkleinert wurde, wiesen im Vergleich zum Ausgangsribozym ähnliche katalytische Werte auf. Bei einem vollständigen Verzicht auf die Doppelhelix sank die katalytische Effizienz der Ribozyme drastisch. Aber auch für die Basensequenz der Doppelhelix und der sich anschließenden Schleife wurde ein Einfluss auf die Ribozymaktivität nachgewiesen. So zeigte ein Ribozym mit kompletter, jedoch in der Sequenz der Doppelhelix veränderter Stammschleife eine 225fach geringere katalytische Effizienz gegenüber dem Ursprungsribozym. Das starke Absinken des kcat-Werts ließ dabei auf die Bedeutung der Doppelhelix bei der Substratspaltung schließen. Für sie wurde eine stabilisierende Funktion von Übergangszuständen bei der Spaltung angenommen. Der unveränderte Km-Wert deutete an, dass die Sequenzänderung die Bildung des Ribozym-Substrat-Komplexes nicht berührt (Tuschl und Eckstein 1993).
In Bezug auf die Stammschleifengröße konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Verkleinerung nicht zwangsläufig mit einer geringeren Ribozymaktivität einhergehen muss. Das Ribozym Rb8/12 erwies sich gegenüber RbO trotz kleinerer Stammschleife bei der Spaltung der Substrat-RNA als das aktivere. Allerdings wurde hier im Unterschied zu der Arbeit von Tuschl und Eckstein (1993) ein langes Substrat (232 gegenüber 12 Basen) unter single-turnover-Bedingungen gespalten.
Insgesamt lassen sich aus der Verkleinerung von Hammerhead-Ribozymen folgende Vorteile ableiten. Bei der Spaltung von längeren Substraten können Ribozyme mit kürzeren Flanken und einer
Aus den Versuchen mit in Stammschleife und Flanken verkleinerten Ribozymen resultierte das Ribozym Rb8/12. Vor einer weiteren Modifizierung des Ribozyms wurde seine katalytische Aktivität bei veränderten Reaktionsbedingungen untersucht.
Wie die Katalysen anderer Enzymsysteme lassen sich ribozymkatalysierte Reaktionen durch Modulation von pH-Wert und Reaktionstemperatur beeinflussen. Des Weiteren wirken sich Konzentrationsänderungen von Metallionen, die sowohl viele Enzyme als auch Ribozyme als Cofaktoren für die optimale Katalyse benötigen, auf die Reaktion aus. Für den Reaktions-pH, die Temperatur und die Metallionenkonzentration existieren Optima, unter denen die Enzyme am effektivsten arbeiten. Diese liegen für die meisten Proteinenzyme im physiologischen Bereich. Bei extremeren Bedingungen, wie zu starker Hitze oder allzu niedriger bzw. zu hoher Wasserstoffionenkonzentration, können die Enzyme auf Grund der Denaturierung ihre Aktivität verlieren.
Bereits Uhlenbeck (1987) untersuchte für seine katalytische RNA die Abhängigkeit der Spaltung eines Oligoribonukleotids von den Reaktionsbedingungen. Die dabei getroffenen Aussagen ließen sich in dieser Arbeit weitestgehend bestätigen. In der von Uhlenbeck dargestellten Abhängigkeit der Substrathalbwertzeit von dem pH-Wert wurde deutlich, dass der größte Effekt hinsichtlich des Umsatzes bei Änderungen des Reaktions-pHs im Bereich zwischen 6 und 8 zu erwarten ist. In diesem Sinne konnte auch in der vorliegenden Arbeit für das Ribozym Rb8/12 gezeigt werden, dass bei der Verminderung der Wasserstoffionenkonzentration von pH 7,5 auf 8,5 der kobs-Wert um 200 % steigt, hingegen ein weitere Absenkung auf ein Zehntel nur noch einen Anstieg des kobs-Werts um 10 % zur Folge hat. Insgesamt erhöhte sich damit bei einer Steigerung des pH von 6 auf 8 die Reak
Uhlenbeck (1989) untersuchte in weiteren Tests den Zusammenhang zwischen der Reaktionstemperatur und dem Reaktionsumsatz. Dabei erkannte er in der Arrhenius-Auftragung eine lineare Beziehung zwischen der Substrathalbwertzeit und der Reaktionstemperatur in einem Bereich von 10 °C bis 37 °C. Die zugehörige Aktivierungsenergie gab er mit E = 13,1 kcal mol-1 an. Für die Aktivität des Ribozyms Rb8/12 ist eine ähnliche Temperaturabhängigkeit anzunehmen. Die bei Temperaturen von 25 °C, 37 °C und 45 °C gemessenen kobs-Werte lassen hier vermuten, dass das Temperaturoptimum oberhalb des physiologischen Bereichs liegt und es demzufolge für den praktischen Einsatz von Ribozymen in Zellen nur geringe Bedeutung hat.
Neben den Tests zum Reaktions-pH und der Reaktionstemperatur überprüfte Uhlenbeck in der Arbeit von 1989 den Einfluss verschiedene zweiwertige Metallionen auf den Reaktionsumsatz. Hierzu wurden getrennten Reaktionsansätzen Chlorsalze der Metalle Magnesium, Mangan, Kalzium und Zink zugegeben, so dass die Endkonzentration 10 mM betrug. Weitere Ansätze wurden mit Natriumchlorid, EDTA bzw. Spermidin in verschiedenen Konzentrationen versetzt. In diesen konnten jedoch keine Umsätze gemessen werden. Die höchste Effizienz zeigte die Katalyse bei der Zugabe von Manganchlorid. Sie unterschied sich von der Effizienz für den Ansatz mit Magnesiumchlorid um den Faktor 8 und für den Ansatz mit Kalziumchlorid um den Faktor 25. Bei Zugabe von Zinkchlorid erfolgte keine Substratspaltung. Eine detaillierte Untersuchung der Beziehung zwischen der Mg2+-Konzentration und der Substrathalbwertzeit ergab eine Kurve mit zunächst starkem Abfall im Bereich zwischen 1 mM und 5 mM und einer folgenden asymptotischen Annäherung an einen Minimalwert bei Konzentrationen oberhalb von 20 mM. Danach schien die Aktivität des Ribozyms unabhängig von der Mg2+-Konzentration zu sein.
Für das Ribozym Rb8/12 wurde der Einfluss der Mg2+-Konzentration auf die Ribozymaktivität in einem ausgedehnteren Bereich untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass selbst bei Konzentrationen von bis zu 200 mM durchaus eine Abhängigkeit zwischen dem kobs-Wert und dem Magnesiumgehalt besteht. Ebenfalls mit diesem Gegenstand beschäftigten sich Sawata et al. (1993). Dabei wurden von ihnen zwei mögliche Formen der Magnesiumabhängigkeit diskutiert. Zum einen für
In welcher Form die Aktivität des Ribozyms Rb8/12 von der Mg2+-Konzentration abhängt, kann mit Hilfe der vorliegenden Daten nicht eindeutig bestimmt werden. Hierfür wären weitere Versuche notwendig, in denen die Mg2+-Konzentration in einem größeren Bereich zu variieren wäre. Deutlich ist jedoch, dass innerhalb physiologischer Konzentrationen eine positive Korrelation besteht.
Neben der Modifizierung von pH-Wert, Reaktionstemperatur und Metallionenkonzentration kann die Aktivität eines Ribozyms auch durch die Zugabe von Oligonukleotiden beeinflusst werden. Goodchild stellte 1992 erste Untersuchungen zu diesen als Facilitatoren bezeichneten Strukturen an. Dabei erkannte er hinsichtlich ihrer Funktionsweise Ähnlichkeiten mit Coenzymen konventioneller Enzyme. Er fand heraus, dass Facilitatoren weder den chemischen Schritt der Substratspaltung beeinflussen noch die Produktdissoziation beschleunigen. Vielmehr erklärte Goodchild die Wirkung der Facilitatoren mit ihrem Einfluss aud die Bildung des Ribozym-Substrat-Komplexes. In diesem ersten Reaktionsschritt ist es den Facilitatoren möglich, die aus Ribozymflanken und Zielsequenz gebildete Helix zu stabilisieren. Unmittelbar dem 3‘-Ende des Ribozyms benachbart lagern sie sich der Ziel-RNA auf Grund ihrer komplementären Sequenz an. Die erzeugte Stabilität ermöglicht es auch Ribozymen mit kurzen Flanken sich besser an das Substrat zu binden. Da kurze Flanken eine stärkere Produktdissoziation als längere bedingen, ist es verständlich, warum gerade bei kleinen Ribozymen der Einsatz eines Facilitators den Reaktionsumsatz verbessert. So zeigten Nesbitt et al. (1994), dass die Aktivität eines 5/5er Ribozyms durch die Zugabe einer 13 Basen umfassenden Facilitator-DNA um den Faktor 556 gesteigert werden konnte, der Facilitator hingegen bei einem 10/10er Ribozym keine Aktivitätssteigerung hervorrief.
Für die Wirkung des Facilitators sind neben den Ribozymflanken auch die Reaktionsbedingungen und die Struktur der Substrat-RNA entscheidend. Die erhebliche Aktivitätssteigerung für das 5/5er Ribozym nach Zugabe eines Facilitators waren von Nesbitt et al. (1994) bei der Spaltung einer 37 Basen langen Substrat-RNA unter multiple-turnover-Bedingungen (20facher Überschuss) gemessen worden. Für den Einsatz von Ribozymen in Zellen ist jedoch vor allem ihre Fähigkeit zur Spalt
In künftigen Untersuchungen wäre zu klären, inwieweit Facilitatoren in der Lage sind, Ribozyme bei der Hemmung der Genexpression in Zellen zu unterstützen.
Der nächste Schritt in der Entwicklung des metabolisch stabilen Ribozyms bestand in dem teilweisen Austausch der Ribonukleotide durch Desoxyribonukleotide. Dabei war es das Ziel, eine größtmögliche Menge an DNA in ein Hammerhead-Ribozym einzubringen, ohne dass es seine Aktivität verliert.
Für die Effekte, die durch die Substitution von RNA durch DNA hervorgerufen wurden, lassen sich in der Literatur zahlreiche Quellen finden, jedoch wurden in der Mehrzahl der kinetischen Untersuchungen kurze Substrate verwandt (Perreault et al. 1990, Yang et al. 1992, Hendry et al. 1992, Taylor et al. 1992, Shimayama et al. 1993, Hendry und McCall 1995). Diese Arbeit hingegen verglich RNA-DNA-Ribozyme (s.Abb. 31) bei der Spaltung einer langen Substrat-RNA. Dabei wurde untersucht, in welchem Maß sich der Basenwechsel in den verschiedenen Regionen der Ribozymstruktur auf die katalytische Aktivität auswirkt. Eine der Feststellungen, die die meisten Forschungsgruppen trafen, konnte auch in dieser Arbeit bestätigt werden. Sie besagt, dass ein Austausch von RNA durch DNA in den konservierten Regionen der Stammschleife mit erheblichen Aktivitätseinschränkungen der Ribozyme einhergeht. Demgemäß zeigten die Ribozyme Rb5/10V3 und Rb8/12V3a keine oder eine deutlich geringere Aktivität als die vergleichbaren Ribozyme Rb5/10V4 und Rb8/12V4.
Erste Untersuchungen zum Basenaustausch im konservierten Bereich der Stammschleife nahmen Perreault et al. (1990) vor. Sie wiesen die große Bedeutung der 2‘-OH-Gruppen der konservierten Ribonukleotide für die Katalyse nach. Verschiedene Ribozyme, in deren Stammschleifen im unterschiedlichen Maß DNA eingebracht wurde, zeigten gegenüber dem Voll-RNA-Ribozym bis 200fach geringere kcat-Werte. Unbeeinflusst von dem Austausch war die Substrataffinität. So besaßen alle Ribozyme annähernd gleiche Km-Werte. Daher ist eine Funktion der Stammschleife bei der Bildung des Ribozym-Substrat-Komplexes nicht anzunehmen.
Für den Austausch von RNA durch DNA in den Ribozymflanken wurden in den Arbeiten von Hendry et al. (1992), Shimayama et al. (1993) und Hendry und McCall (1995) andere katalytische
Vergleicht man die katalytischen Effizienzen (kcat/Km) für die chimären Ribozyme aus den Arbeiten von Hendry und Shimayama mit denen der Voll-RNA-Ribozyme, wird erkennbar, welchen Einfluss die Flankenlänge und der DNA-Gehalt der Flanken auf die Katalyse besitzen (s.Tabelle 9). So kann bei Ribozymen mit kurzen Flanken (von weniger als 6 Basen) der Austausch von RNA durch DNA zu einer verminderten katalytischen Effizienz führen.
Wie die katalytische Effizienz scheint auch der kobs-Wert von der Flankenlänge und dem DNA-Gehalt beeinflusst zu werden. Ein RNA-DNA-Basenaustausch führte unter single-turnover-Bedingungen bei dem Ribozym mit kurzen Flanken (TAT RB 6X2) zur Minderung und bei dem Ribozym mit langen Flanken (TAT RB) zu einer Erhöhung des kobs-Werts (Hendry et al. 1995).
In der vorliegenden Arbeit erbrachte die Substratspaltung mit den allein in den Flanken DNA-modifizierten Ribozymen ein vergleichbares Ergebnis. Der Basenaustausch in den Flanken der Ribozyme R5/10 und Rb8/12 ergab die Ribozyme Rb5/10V1 bzw. Rb8/12V1. Für die beiden chimären Ribozyme wurden geringere k-Werte ermittelt als für die entsprechenden reinen RNA-
Sowohl in den Flanken als auch im Bereich der nichtkonservierten Region der Stammschleife wurden die Varianten V4, V5 und V6 der Ribozyme Rb5/10 und Rb8/12 mit DNA modifiziert. Dabei scheint die DNA-Modifikation der Stammschleife keinen negativen Einfluss auf die Ribozymaktivität auszuüben. Wie bei Shimayama et al. (1993) führte der zusätzliche Basenaustausch in diesem Bereich eher zu einer leichten Erhöhung der Ribozymaktivität (vergleiche Ribozymvarianten V4 mit V1).
Gegenüber den reinen RNA-Ribozymen RbO und Rb8/12 weisen die in Flanken und Stammschleife DNA-modifizierten Ribozyme Rb8/12V6 und Rb8/12V4 nahezu identische k-Werte auf. Nomenklatorisch ist zu bemerken, dass die V6-Varianten keine echten Abkömmlinge der Ribozyme Rb5/10 und Rb8/12 sind, da sie keine verkürzte Stammschleife besitzen.
Aus den Untersuchungen zur DNA-Modifikation der Hammerhead-Ribozyme resultiert das Ribozym Rb8/12V4, das bei hoher Aktivität zum überwiegenden Teil (71 %) aus DNA besteht. Der hohe Anteil an Desoxyribonukleinsäure im Ribozym hat mehrere Vorteile. Erstens kann die Aktivität eines Hammerhead-Ribozyms mit langen Flanken durch DNA-Modifikationen im Bereich der Flanken und der nichtkonservierten Region der Stammschleife gesteigert werden. Zweitens erhöht sich bei diesen Ribozymen die Widerstandsfähigkeit gegenüber Ribonukleasen, insbesondere gegenüber 3‘-Exonukleasen (Hendry et al. 1992). Und drittens lassen sich durch den DNA-Einbau die Synthesekosten der Ribozyme erheblich senken.
Aus den Untersuchungen zum RNA-DNA-Basenaustausch ging mit Rb8/12V4 ein DNA-reiches und zugleich aktives Ribozym hervor. Um die Stabilität des Ribozyms zu erhöhen, wurden im nächsten Schritt Phoshorothioat-Modifikationen vorgenommen. In früheren Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass die Einführung von Phosphorothioaten in Oligonukleotide zur Steigerung ihrer Nukleasenstabilität beitragen kann (Eckstein 1985, Goodchild 1990). Allerdings führte die Einbindung von Phosphorothioaten (PT) in konservierte Regionen der Ribozyme zu einer Verminderung der katalytischen Aktivität (Buzayan et al. 1990, Ruffner und Uhlenbeck 1990).
Eine Modifizierung der Ribozymflankenenden leitete diesen Abschnitt der Untersuchungen ein. Dazu wurde ausgehend von Rb8/12V4 das Ribozym Rb8/12V4PT erstellt. Dieses unterschied sich von dem Ausgangsribozym durch eine PT-Modifikation am 5‘- und drei PT-Modifikationen am
Basierend auf den Ergebnissen von Shimayama et al. wurde in dieser Arbeit das Ribozym Rb8/12V4PT weiter modifiziert, wodurch das das Ribozym RbS entstand. In der folgenden Abbildung wird illustriert, welche Modifikationen diese Ribozym gegenüber dem Ausgangsribozym RbO aufweist.
Im Unterschied zu den Ergebnissen von Shimayama et al. (1993) wies das Ribozym RbS trotz aller Modifikationen die gleiche Aktivität wie das reine RNA-Ribozym RbO auf. Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass die Aktivitäten der Ribozyme nur bedingt miteinander verglichen werden
Abschließend wurde geprüft, welchen Einfluss ein kationisches Lipid in vitro auf die Substratspaltung hat. Für eine Hemmung der Ribozymaktivität durch die Lipide, die zur Transfektion benötigt werden, wären mehrere Ursachen denkbar. So könnte zum Beispiel die Sekundärstruktur des Ribozyms oder des Substrats durch die geladenen Lipide verändert werden. Des Weiteren wäre bedingt durch die Bildung von Lipid-Ribozym- bzw. Lipid-Substrat-Komplexen die räumliche Trennung von Ribozymen und Substrat möglich. Eine starke Verringerung oder gar die Aufhebung der Ribozymaktivität konnte jedoch nach Zugabe des Lipids nicht nachgewiesen werden (Abb. 20).
Im Stabilitätstest wurde die Widerstandsfähigkeit für die Ribozyme RbO und RbS gegenüber Nukleasen untersucht. Dabei erwies sich das Ribozym RbS mit einer mindestens 10fach höheren Halbwertzeit in einer 1 %igen FCS-Lösung als das deutlich stabilere Ribozym. Shimayama et al. (1993) testeten die Stabilität ihrer Ribozyme sowohl in 0,1 %iger FCS-Lösung als auch in 20 %igem Humanserum. In dem vergleichsweise gering konzentrierten Kälberserum konnten für das Adenin- bzw. das Guanin-Ribozym höhere Halbwertzeiten als für das RbS-Ribozym ermittelt werden.
Eine deutlich höhere Aggressivität des Kälberserums gegenüber den Ribozymen ergab der Vergleich der Seren in Shimayamas Arbeit. Der Umstand, dass Modifizierungen in den verschiedenen Bereichen der Ribozymstruktur eine ungleiche Zunahme der Stabilität in den Seren bedingten, lässt Abweichungen in der Nukleasenzusammensetzung der Seren vermuten. So ist für das Humanserum ein höherer Gehalt an Exoribonukleasen anzunehmen, da hier die Stabilität eines Ribozyms nach einer DNA-Modifizierung der Flanken merklich zunahm. Im Kälberserum hingegen scheinen die Endoribonukleasen die Aggressivität gegenüber den Ribozymen zu bedingen. In diesem Fall steigerte die PT-Modifizierung der Basen im katalytischen Teil der Stammschleife und der Pyrimidinbasenaustausch die Ribozymstabilität.
Weitaus größere Steigerungen der Stabilität der Ribozyme lassen sich dadurch erreichen, dass in der 2’-Position chemisch modifizierte Ribonukleotide eingebaut werden. Für entsprechende Ribozyme mit C-Allyl- bzw. O-Methyl-modifizierten Nukleotiden konnten Halbwertzeiten nachgewiesen werden, die das 50.000fache der des reinen RNA-Ribozyms überschritten (Beigelman et al. 1995). Jedoch stehen der großen Stabilität hohe Synthesekosten gegenüber.
Für den Einsatz von Ribozymen als Expressionshemmer ist es notwendig, sie an ihren Wirkungsort, das Zytoplasma, zu transportieren. Hierfür existieren grundsätzlich zwei Wege. Zum einen ist es möglich, die Ribozymsequenz in DNA zu kodieren. In ein Plasmid eingebunden wird diese in die Zellen transfiziert, so dass die Zellen selbst die Ribozyme direkt an ihrem Wirkungsort herstellen. Um jedoch die Ribozymwirkung nachzuweisen, ist es erforderlich, die Zellen stabil zu transfizieren. Mehreren Arbeitsgruppen gelang es, mit Hilfe dieser Methode die Expression bestimmter Gene zu hemmen (Cotten und Birnstiel 1989, Scanlon et al. 1991, L'Huillier et al. 1992, Cantor et al. 1993, Potter et al. 1993, Denman et al. 1994, Kobayashi et al. 1994).
Zum anderen können vorgefertigte Ribozyme direkt in die Zellen eingebracht werden. Für den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen steht neben Elektroporation, Mikroinjektion und weiteren Methoden die Transfektion mittels kationischer Lipide zur Verfügung (Überblick von Cotten 1990). In einigen Arbeiten wurde bereits die Wirkung transfizierter Ribozyme untersucht (Sioud et al. 1992, Snyder et al. 1993). Dabei ließ sich für bestimmte Gene die Unterdrückung ihrer Expression nachweisen.
Untersuchungen zur lipidvermittelten Transfizierung von Zellen mit Nukleinsäuren ergaben, dass verschiedene Zellinien hinsichtlich der Transfektionsparameter, wie das Massenverhältnis von Lipid und Nukleinsäure, unterschiedliche Optima besitzen (Felgner et al. 1987, Malone et al. 1989). Um diesen Umstand zu berücksichtigen und um ein optimales Transfektionsergebnis zu erzielen, wurden in der vorliegenden Arbeit die Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 mit acht verschiedenen Lipid-Lösungen des PerFect Lipid Transfection Kits (Invitrogen) transfiziert. Dabei wurden für das Lipid 6 und 8 unterschiedliche Lipid-Ribozym-Massenverhältnisse getestet. Für eine optimale Wirkung der Ribozyme sollten diese mittels der Transfektion eine möglichst diffuse zytoplasmatische Verteilung in den Zellen erreichen. Das beste Transfektionsresultat konnte mit dem Lipid 6 in einem Massenverhältnis von 6 zu 1 gegenüber dem fluoresceinmarkierten Ribozym RbF erzielt werden. Im konfokalen Lasermikroskop war in diesem Fall neben dem punktförmigen Leuchten liposomaler Einschlüsse die diffuse Färbung des Zytoplamas am ausgeprägtesten. Die katalytische Aktivität des Ribozyms RbF spielte in dem Transfektionsversuch keine Rolle. In den kinetischen Untersuchungen wurde jedoch deutlich, dass die Fluorescein-Markierung die Aktivität des Ribozyms einschränkte. Es zeigte gegenüber dem nichtmarkierten - ansonsten identischen - Ribozym Rb8/12V4PT einen über 75 % geringeren kobs-Wert.
Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die In-vivo-Wirksamkeit des entwickelten Ribozyms RbS getestet. Dabei zeigte das Ribozym gegenüber den Kontrollen, einem Antisense-Oligonukleotid und einem Ribozym mit zur PTHrP-mRNA inkomplementären Flanken, keine signifikante Wirkung. Darüber hinaus konnte im Vergleich zur Kontrollsekretion nach der Transfizierung der Zellen mit dem Ribozym keine geringere PTHrP-Konzentration im Zellüberstand gemessen werden. Wird die vergleichsweise starke Aktivität des Ribozyms RbS im zellfreien System betrachtet, lassen sich für die ausbleibende Wirkung in vivo verschiedene Gründe annehmen.
Beispielsweise besteht die Möglichkeit, dass die Zielsequenz innerhalb der PTHrP-mRNA auf Grund von Sekundärstrukturen für das Ribozym nicht erreichbar ist. Dabei könnten Abweichungen in der Sekundärstruktur der PTHrP-mRNA zwischen dem zellfreien System und den zellulären Bedingungen durch den Längenunterschied der Sequenzen bedingt sein. Unterstützt wird diese Vermutung durch die Tests mit einem Antisense-Oligonukleotid, das der Flankensequenz entspricht. Dieses hybridisiert an die gleiche Zielsequenz wie das Ribozym. Jedoch auch bei der Behandlung der Zellen mit dem ASO in Konzentrationen bis 10 µM war keine Wirkung nachzuweisen. Im Gegensatz dazu verursachte - in den Untersuchungen von Bunge (1997) - die Behandlung der selben Zellinie mit einem Antisense-Oligonukleotid in einer Konzentration von 2,5 µM eine deutliche Hemmung der Translation. Diese Diskrepanz lässt sich am ehesten auf die unterschiedlichen Zielsequenzen der verwendeten Antisense-Oligonukleotide zurückführen:
Des Weiteren besaß das Ribozym mit 166 nM und 1 µM im Transfektionsmedium eine vergleichsweise niedrige Konzentration. In anderen Arbeiten wurden für die Transfektion von Zellen mit zwischen 4 µM und 50 µM weitaus höhere Ribozymkonzentrationen genutzt (Sioud et al. 1992, Snyder et al. 1993). In dieser Arbeit konnte jedoch aus technischen Gründen die Ribozymkonzentration nur begrenzt angehoben werden. Ebenfalls erscheint die 60minütige Behandlungszeit der Zellen gegenüber den Zeiten in anderen Arbeiten kurz (Sioud et al. 1992, Snyder et al. 1993). Hier wurden die Zellen über Zeiträume von 20 bis 72 Stunden behandelt. Eine lange Behandlungsdauer mit einer hohen Transfektionseffizienz kann aber noch keine Ribozymwirkung garantieren, solange das Ribo
Zweifelsohne wird die Wirkung von expressionshemmenden Mitteln, wie Ribozymen und Antisense-Oligonukleotiden, auch von der Stärke der Genexpression beeinflusst. Sie bestimmt im Zusammenhang mit der absoluten Ribozymmenge in der Zelle die Ribozym-Substrat-Relation. So ist die Wirkung von Expressionshemmern in solchen Zellen geringer, die das entsprechende Gen stark regulieren und daher eine große Menge an mRNA herstellen.
Letztendlich ist zu diskutieren, ob das Ribozym RbS über eine ausreichende Stabilität für einen Einsatz in vivo verfügte. Eine direkte Kontrolle der Ribozymstabilität in der Zelle gestaltet sich schwierig. So können lediglich Stabilitätstests mit Zellüberständen oder lysierten Zellen einen Hinweis auf die Widerstandskraft gegenüber Nukleasen geben. In Anbetracht dessen, dass selbst ein „nur“ DNA-modifiziertes Ribozym (Snyder et al. 1993) stabil genug war, um in transfizierten Zellen zu wirken, macht eine ausreichend hohe Stabilität des Ribozyms RbS wahrscheinlich.
Das in der vorliegenden Arbeit entwickelte Hammerhead-Ribozym RbS konnte in den Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 trotz hoher Aktivität in vitro und gesteigerter metabolischer Stabilität keine nachweisbare Wirkung hervorrufen. Aus den hier vorliegenden Ergebnissen und Literaturangaben lassen sich zusammenfassend für die Entwicklung von metabolisch stabilen Ribozymen zur direkten Behandlung von Zellen in Monolayer-Zellkultur folgende Aussagen treffen:
Die Aktivität eines Hammerhead-Ribozyms kann durch Optimierung der Flankenlänge und durch Baseneinsparungen in der Stammschleife erhöht werden. Dabei sind, um eine spätere Aktivität in den Zellen zu gewährleisten, in den zellfreien Versuchen möglichst große Ziel-RNA zu spalten.
Der Austausch von Ribonukleotide durch Desoxyribonukleotide ist innerhalb der Ribozymstruktur umfangreich möglich. Neben der gesteigerten Widerstandskraft gegenüber Ribonukleasen und geringeren Synthesekosten kann er eine erhöhte Ribozymaktivität bedingen.
In fast allen Bereichen des Ribozyms können eingeführte Phosphorothioatverbindungen die Ribozymstabilität vergrößern. Bei der Modifizierung der konservierten Region der Stammschlei
Die Fluorescein-Markierung des Ribozym ermöglicht eine direkte Transfektionskontrolle unter dem Mikroskop. Im Idealfall ist nach erfolgter Transfektion eine diffuse zytoplasmatische Verteilung des Ribozyms in der Zelle zu erkennen. Eine Optimierung der Transfektion ist nur durch Testreihen mit verschiedenen Lipiden und mit unterschiedlichen Lipid-Ribozym-Massenverhältnissen zu erreichen.
Mit der Entdeckung der katalytischen Aktivität von Ribonukleinsäuren wurde begonnen, darauf basierende therapeutische Strategien zu entwickeln, die auf genetischer Ebene den Stoffwechsel oder virale Infektionen von Zellen beeinflussen. Entsprechende Oligoribonukleotide waren befähigt, spezifisch RNA-Stränge zu erkennen und zu spalten. In Analogie zu Enzymen wurden sie als Ribozyme bezeichnet.
Aufgabe der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines metabolisch stabilen Hammerhead-Ribozyms. Dieses sollte lipidvermittelt in die Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 transfiziert werden und dort die Genexpression des dem Parathormon verwandten Proteins (PTHrP) durch die Spaltung der PTHrP-mRNA unterdrücken. Ausgangspunkt der Entwicklung war das Hammerhead-Ribozym RbO. Es wies in zellfreien Versuchen bei der Spaltung einer 232 Basen langen Substrat-RNA mit einem kobs-Wert von 47,42 min-1 (x 10-3) eine zur Literatur vergleichbar hohe Aktivität auf, jedoch zeigte es sich als reiner RNA-Strang gegenüber Nukleasen sehr fragil. Das Endprodukt der in mehreren Schritten abgelaufenen Weiterentwicklung des Ribozyms RbO stellte das Ribozym RbS dar. Im Vergleich zum Ausgangsribozym bestand das in der Stammschleife verkürzte Ribozym zu 71 % aus DNA. Es besaß Phosphorothioatmodifikationen in den Flanken und in den konservierten Sequenzbereichen. Zudem war durch einen Basenwechsel im katalytischen Teil der Stammschleife eine Pyrimidinbase durch eine Purinbase ausgetauscht worden. Zusammen bedingten die genannten Veränderungen eine Steigerung der Ribozymstabilität um mehr als das Zehnfache. Dabei war die katalytische Aktivität des Ribozyms RbS mit einem kobs-Wert von 45,76 min-1 (x 10-3) gegenüber RbO annähernd identisch.
Das schrittweise Vorgehen bei der Ribozymentwicklung mit dem Erstellen von 20 unterschiedlich modifizierten Ribozymen ermöglichte es, den Einfluss einzelner Modifikationen auf die Ribozymaktivität zu prüfen. Mehrfach konnten dabei die Ergebnisse anderer Forschungsgruppen bestätigt werden. So wurde erkannt, dass für viele Modifikationen, wie Ribozymverkleinerung, RNA-DNA-Basenaustausch und Phosphorothioateinbindung, die Auswirkung auf die katalytische Aktivität nur begrenzt vorherzusagen ist und optimale Ergebnisse nur durch Testreihen zu erlangen sind.
Bei der Behandlung der Tumorzellen in Monolayer-Zellkultur ließ sich für das Ribozym RbS keine signifikante Wirkung nachweisen. Als Ursache dafür ist am ehesten die auf Grund von Sekundärstrukturen fehlende Erkennung der Zielsequenz innerhalb der PTHrP-mRNA anzunehmen.
Belehrt über die Strafbarkeit einer auch nur fahrlässig falschen Versicherung an Eides Statt versichere ich an Eides Statt:
Ich versichere hiermit, dass ich die der Medizinischen Fakultät Charité vorgelegte Dissertationsschrift:
„Entwicklung eines metabolisch stabilen Ribozyms gegen die mRNA des Parathormon-verwandten Proteins (PTHrP)“
selbstständig angefertigt habe, die Arbeit auch in Teilen keine Kopie anderer oder eigener Arbeiten darstellt und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt wurden.
Ich habe und hatte bisher kein Promotionsverfahren an anderen Stellen beantragt.
Mir ist bewusst, dass eine nicht wahrheitsgemäße eidesstattliche Versicherung erhebliche strafrechtliche Konsequenzen für mich haben kann.
von
Martin Schultz
geboren am 27. September 1970 in Neubrandenburg
An erster Stelle danke ich meinen Eltern, die mir das Medizinstudium ermöglichten.
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dietel und Dr. Andreas Turzynski für die Überlassung des interessanten Themas sowie für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und der Sachmittel.
Besonders herzlich danke ich Dr. Andreas Turzynski für die intensive Betreuung, die ständige Diskussionsbereitschaft und für die Einführung in die molekularbiologischen Arbeitstechniken.
Ebenfalls großen Dank zolle ich Dr. Sabine Müller, die mich mit gutem Rat und vor allem mit der Herstellung der Ribozyme unterstützte.
Des Weiteren danke ich meinem Kommilitonen Timm Schulz für die gute Zusammenarbeit und den regen Gedankenaustausch.
Ferner gilt mein Dank den Mitarbeitern des Pathologischen Instituts für ihre Unterstützung. Gesondert nennen möchte ich hier Stefanie Wurr, Imad Kajjal, Dr. Gabriele Saretzki, Dr. Andreas Bunge, Dr. Kai Wiechen und Dr. Ursula Anderer.
Zuletzt, aber um so herzlicher danke ich meiner Frau Ulrike, die mich in allen Phasen der Arbeit unterstützt hat.