Zunächst erfolgte ein Vergleich des unmodifizierten Hammerhead-Ribozyms RbO mit seinem nichtkatalytischen Pendant RbM. Sie unterscheiden sich zueinander durch den Wechsel zweier Basen in der Stammschleife. Es wurde das Guanin an Position 11 gegen ein Adenin und das Adenin an Position 30 gegen ein Guanin ausgetauscht.

Für das Ribozym RbO wurde die Bestimmung des k_obs-Wert dreimal durchgeführt. Der daraus errechnete Mittelwert betrug 47,42 min^-1 (x 10^-3). Die mittlere Standardabweichung lag bei
8,86 min^-1 (x 10^-3). Das Ribozym RbM zeigte erwartungsgemäß keine katalytische Aktivität (Abb. 8 und Abb. 9).

Abb. 8: Spaltung der Substrat-RNA durch die Ribozyme RbO und RbM.

Es ist das bei der Auswertung am Phosphordensitometer erzeugte Bild eines getrockneten 10 %igen denaturierenden PAA-Gels dargestellt. Es zeigt die Substratspaltung für die Ribozyme RbO und RbM nach 0,5, 1,5, 3, 10, 30, 90 und 150 Minuten.

Abb. 9: Vergleich der Ribozyme RbO und RbM.

Die dargestellten Kurven entsprechen der zeitabhängigen Produktentstehung während der Reaktion.

Als erste Modifizierungen des Hammerhead-Ribozyms RbO wurden Verkürzungen der Stammschleife und der Flanken vorgenommen. Dazu wurden die Ribozyme Rb8/12, Rb5/10 und Rb4/8 erstellt.

Durch Baseneinsparung in den Positionen 17, 18, 25 und 26 besitzt das Ribozym Rb8/12 eine kürzere Stammschleife als das Originalribozym (RbO). Die Ribozyme Rb5/10 und Rb4/8 zeichnen sich sowohl durch eine kürzere Stammschleife als auch durch kleinere Flanken (Verkürzung von 8 und 12 Basen auf 5 und 10 sowie 4 und 8 Basen) aus.

Im Vergleich der Ribozyme zeigte das Ribozym Rb8/12 eine zweimal höhere Aktivität als das Ribozym RbO. Die Ribozyme mit verkürzten Flanken wiesen hingegen eine um 25 % (Rb4/8) bis 50 % (Rb5/10) verminderte Aktivität gegenüber RbO auf (Abb. 10 und Abb. 11).

Abb. 10: Vergleich der Ribozyme RbO, Rb8/12, Rb5/10 und Rb4/8.

In der ersten Bahn wurde ein Kontrollwert (K) aufgetragen. Er entspricht einer Probe nach 120 Minuten aus einem ribozymfreien Reaktionsansatz. In den übrigen Bahnen ist die Substratspaltung der Ribozyme nach 2,5, 5, 10, 30, 60 und 120 Minuten dargestellt.

Abb. 11: Auswertung des Vergleichs der Ribozyme RbO, Rb8/12, Rb5/10 und Rb4/8.

Die ermittelten k_obs-Werte sind im Säulendiagramm im Verhältnis zum k_obs-Wert des Ribozyms RbO (entspricht 1,0) dargestellt.

Um einschätzen zu können, wie sich veränderte Reaktionsbedingungen auf die katalytische Aktivität eines Hammerhead-Ribozyms auswirken, sind der pH-Wert, die Reaktionstemperatur und die Magnesiumkonzentration bei Spaltversuchen des Ribozyms Rb8/12 variiert worden. Zudem wurde der Einfluss einer Facilitator-DNA auf die Reaktion getestet.

Die bei der Auswertung ermittelten k_obs-Werte wurden mit den unter Standardbedingungen errechneten verglichen. Zur besseren Veranschaulichung sind die letzteren als 1,0 angenommen worden. Als Standardbedingungen galten ein pH-Wert von 7,5, eine Reaktionstemperatur von 37 °C und eine Magnesiumkonzentration von 10 mM. Der k_obs-Wert für die Reaktion ohne Zugabe eines Facilitators wurde auf 1,0 gesetzt.

In den Versuchen zur pH-Abhängigkeit stellte sich für das Ribozym Rb8/12 ein pH-Optimum von 9,5 heraus. Bei pH-Werten unterhalb von 6,0 verlor das Ribozym seine Aktivität.

Die Reaktionen bei 25, 37 und 45 °C zeigten, dass eine Erhöhung der Reaktionstemperatur in diesem Bereich mit einer Steigerung der Aktivität des Ribozyms einhergeht.

Eine ebenso positive Abhängigkeit wies die Aktivität des Ribozyms in einem Bereich zwischen 2 und 200 mM von der Magnesiumkonzentration auf.

Durch die Zugabe eines Facilitators stieg die katalytische Aktivität um 60 % (Abb. 12).

Abb. 12: Einfluss der Reaktionsbedingungen auf die Aktivität des Ribozyms Rb8/12.

Die k_obs-Werte sind im Verhältnis zu den unter Standardbedingungen (pH 7,5, 37 °C, 10 mM Magnesium, ohne Facilitatorzugabe) ermittelten k_obs-Werten dargestellt.

Für die Modifizierung mit Phosphorothioaten empfahl sich das Ribozym Rb8/12V4. Es besteht zu 71 % aus DNA und übertrift in seiner Aktivität das Original-Ribozym RbO. Zunächst wurde das Ribozym Rb8/12V4PT synthetisiert. Dieses weist gegenüber dem Ribozym Rb8/12V4 am 5‘-Ende eine und am 3‘-OH-Ende drei Modifizierungen mit Phosphorothioaten auf. In einem weiteren Syntheseschritt wurde Rb8/12V4PT am 3‘-OH-Ende mit Fluorescein gekoppelt. Diese Modifikation ermöglichte den intrazellularen Nachweis des transfizierten Ribozyms RbF unter dem Mikroskop.

In der folgenden kinetischen Untersuchung wurden die Ribozyme Rb8/14V4, Rb8/12V4PT und RbF verglichen (Abb. 16).

Der Einbau von Phosphorothioaten in das Ribozym Rb8/12V4PT verursachte eine Aktivitätsminderung um 30 % gegenüber Rb8/12V4. Das fluoresceingekoppelte Ribozym RbF hat im Vergleich zum Ribozym Rb8/12V4 über 85 % der Aktivität verloren (Abb. 17).

Abb. 16: Modifikationen des Ribozyms Rb8/12V4.

Dargestellt ist die Substratspaltung nach 0,5, 1,5, 3, 10, 30 und 120 Minuten.

Abb. 17: Auswertung der Abbildung 16.

Die k_obs-Werte der Ribozyme sind im Säulendiagramm als relativ zum k_obs-Wert des Ribozyms Rb8/12V4 dargestellt.

Die Transfektion der Zellen mit dem stabilisierten Ribozym sollte mit Hilfe eines kationischen Lipids erfolgen. In einer kinetischen Untersuchung wurde zuvor dessen Einfluss auf die katalytische Aktivität überprüft. Dabei stellte sich heraus, dass sich die Aktivität des Ribozyms RbS nach Zugabe eines Lipids zum Reaktionsansatz um 20 % verringerte (Abb. 20).

Abb. 20: Einfluss eines kationischen Lipids auf die Aktivität des Ribozyms RbS.

Um die Wirksamkeit des stabilisierten Ribozyms RbS in vivo zu überprüfen, wurden mit diesem Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 in Monolayer-Zellkultur behandelt. Parallel dazu erfolgte eine Kontrollbehandlung der Zellen mit dem Ribozym RbSSc. Das ebenfalls stabilisierte Ribozym RbSSc kann sich auf Grund inkomplementärer Flanken nicht an die PTHrP-mRNA binden. Es besitzt somit gegenüber der PTHrP-mRNA keine katalytische Aktivität.

Die Ribozyme lagen in dem Transfektionsmedium in einer Konzentration von 166 nM vor. In Bezug auf das Kontrollribozym RbSSc ließ sich für das Ribozym RbS kein Effekt nachweisen. Die in den 60 Minuten nach der Behandlung (2. Wert) gemessenen PTHrP-Sekretionen waren mit p = 0,706 (α = 0,5) nicht signifikant verschieden (Abb. 25).

In einem weiteren Versuch wurden die Zellen nochmals zum einen in der vorher genannten und zu anderen in der fünffach höheren Konzentration mit Ribozymen und Lipid behandelt. Es zeigte sich nach der Behandlung mit den höheren Ribozym- und Lipidkonzentrationen eine Verringerung der PTHrP-Sekretion. Jedoch konnte auch in diesem Fall kein signifikanter Unterschied (2. Wert: p = 0,365 (α = 0,5)) hinsichtlich der Sekretion von PTHrP zwischen der Behandlung mit dem Ribozym RbS und dem Kontrollribozym RbSSc festgestellt werden.

Abb. 25: Behandlung mit dem Ribozym RbS und dem Kontrollribozym.

Dargestellt sind die nach 60 und 120 Minuten gemessenen Extinktionen bei 450 nm. Der 60 Minuten-Wert entspricht der Sekretion während der einstündigen Behandlung mit den Ribozymen und der 120 Minuten-Wert der Sekretion in den 60 Minuten nach der Behandlung.

Abb. 26: Behandlung mit erhöhten Ribozym- und Lipidkonzentrationen.

Das Prinzip der Darstellung entspricht dem in Abbildung 25.