[Seite 18↓]

3  Material und Methoden

3.1 Tiermodell

Alle Experimente wurden gemäß den Bestimmungen für Pflege und Handhabung von Laborversuchstieren des „US National Institutes of Health“ (NIH Publication No. 85-23, revised 1985) durchgeführt. Es wurden 335 männliche Albino-WISTAR-Ratten ausgewählt, welche zu Versuchsbeginn 15 Wochen alt waren und 250-280 g wogen.

Der Myokardinfarkt wurde unter Anästhesie durch Ligatur der linken Koronararterie erzeugt. Die Anästhesie erfolgte durch eine intraperitoneale Injektion von 75 mg/kg KG Ketamin­hydrochlorid (Ketanest ®, Sanovi-Ceva, Germany) in Kombination mit 7,5 mg/kg KG Xylanzin­hydrochlorid (Rompun ®, Bayer, Germany). Danach wurden die Tiere intubiert und mit Luft beatmet. Nach Inzision der Haut und Freilegung des darunterliegenden Muskelgewebes wurde parallel zum Sternum der linke M. pectoralis durchtrennt. Nach Eröffnen des Perikards wurde das Herz luxiert und die linke Koronararterie in Höhe des linken Vorhofs unterbunden. Der erfolgreiche Gefäßverschluss wurde durch eine regionale Zyanose des Myokards in Kombination mit dem Auftreten charakteristischer ST-Hebungen im Elektrokardiogramm bei 318 Tieren nachgewiesen. Nach Reposition des Herzens wurde der Brustkorb verschlossen. Zur anti­biotischen Begleittherapie wurden subcutan 20 mg/kg Gentamycinsulfat (Refobacin ®, Merck, Darmstadt, Germany) injiziert. Als Kontrollgruppe (K) dienten 25 „scheinoperierte“ Tiere. Diese wurden analog operiert, jedoch ohne die Koronararterie zu ligieren.

Fortan erhielten die Tiere 6 Wochen entweder den ACE-Hemmer Ramipril (Gruppe R), den selektiven β-1-Blocker Metoprolol (Gruppe M), eine Kombination beider Medikamente (Gruppe MR) oder Placebo (Gruppe P). Die Tiere der Medikamentengruppe R erhielten vom ersten postoperativen Tag an Ramipril (Astra Hässle, Mölndal, Sweden) in einer Dosierung von 1 mg/kg pro Tag, gelöst im Trinkwasser der Tiere. Die Gruppe M erhielt Metoprolol (Astra Hässle, Mölndal, Sweden) in einer Dosierung von 350 mg/kg KG pro Tag als Zugabe zum Standardpelletfutter. Die Gruppe MR wurde mit 350 mg/kg KG Metoprolol plus 1 mg/kg KG Ramipril behandelt. Um in dieser Gruppe einen exzessiven Blutdruckabfall unmittelbar nach der Infarzierung zu vermeiden, erhielten die Tiere in Dosissteigerung postoperativ 350 mg/kg KG Metoprolol (Tag 1-3), 350 mg/kg KG Metoprolol plus 0,1 mg/kg KG Ramipril (Tag 4-7) sowie die gleiche Metoprololdosis plus 0,3 mg/kg KG Ramipril (Tag 8-11).


[Seite 19↓]

Während des Versuches wurden die Tiere bei Raumtemperatur gehalten, wobei möglichst ein 12-stündiger circadianer Rhythmus beachtet wurde.

Nach 6 Wochen wurden die Tiere erneut narkotisiert, anschließend wurden hämodynamische Parameter gemessen und nachfolgend Herzgewebe zur Bestimmung des Hypertrophiegrades, der Infarktgröße, der kontraktilen Funktion sowie zur Charakterisierung des Sauerstoffradikal-Stoffwechsels gewonnen.

3.2 Hämodynamische Messung (LVEDP)

Für die Messung des linksventrikulären enddiastolischen Druckes wurde ein 2F-Mikrotip-Druckaufnahme-Katheter (Millar, AD Krauth, Hamburg) in die rechte Arteria carotis communis eingebracht und sodann im linken Ventrikel platziert.

3.3 Bestimmung des Hypertrophiegrades und der Infarktgröße

Nach Messung des LVEDP wurden die Herzen umgehend entnommen, abgetupft und sofort mit eisgekühlter physiologischer Kochsalzlösung gespült. Anschließend wurden die Vorhöfe, der rechte und linke Ventrikel sowie der posteriore linksventrikuläre Papillarmuskel präpariert. Jeder Herzanteil wurde gewogen. Danach wurde visuell zwischen Infarktgewebe und funktionstüchtigem Myokard des linken Ventrikels differenziert. Für die biochemische Analyse wurden etwa 15 mg Gewebe aus einem relativ weit vom Infarktbereich entfernten Gebiet des linken Ventrikels entnommen, unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Analyse bei -80° C gelagert. Anschließend wurde zur Bestimmung der Infarktgröße durch Inkubation mit 0,1 %-igem Nitro-Blau-Tetrazoliumsalz (NBT) zwischen infarziertem Areal und intaktem linken Ventrikel unterschieden. Das Infarktgebiet (Narbe) wurde nach Separierung aus dem linken Ventrikel planimetrisch vermessen. Die Infarktgröße (IG) wurde als prozentualer narbiger Anteil an der Oberfläche des linken Ventrikels angegeben. Zur Analyse der akuten Infarktphase wurde zusätzlich Gewebe aus dem rechten Ventrikel gewonnen.

3.4 Bestimmung der kontraktilen Funktion an isolierten Papillarmuskeln

Der linksventrikuläre posteriore Papillarmuskel wurde unmittelbar nach Entnahme in einer Messkammer zwischen einem fixierten Haken und einem isometrischen Kraftwandler eingehängt. Hierbei wurde das Präparat bei einem ph 7,43 und 31° C von einer mit 100 %igem Sauerstoff oxygenierten Blutersatzlösung umspült, bestehend aus (Angaben in mM) 140 NaCl, 5,0 KCl, 1,5 CaCl2, 1,1 MgCl2, 10,0 Tris/HCl und 11,1 Glucose. Die Applikation von Reizstärke, [Seite 20↓]-dauer und -frequenz erfolgte über Plugsys System 603 (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Germany). Bei einer durchschnittlichen Frequenz von 0,5 Hz und einer biphasischen Impulsdauer von 7 ms konnten maximale Kraftentwicklung (peak force, /PF), Latenzzeit bis zum Kraftmaximum (TPF) und Relaxationszeit (entspricht 50 % PF) ermittelt werden.

3.5 Biochemische Untersuchungen

3.5.1 Bestimmung der Lipidperoxidkonzentration (LPO)

Die quantitative Messung der Lipidperoxidkonzentration (LPO) im Gewebe wurde nach der Methode nach Ohakawa et al. (36) durchgeführt. Genutzt wurde die Eigenschaft von Lipidperoxiden, mit Thiobarbitursäure in saurer Lösung (ph 3,5) zu einem roten Farbkomplex (thiobarbitursäure­reaktive Substanzen, TBARS) zu reagieren, welcher flourimetrisch bei 515/553 nm gemessen werden kann.

Testzusammensetzung, Reagenzien: Natriumdodecylsulfat (SDS) 8,1 % 0,28 mol/l; 2‑Thiobarbitursäure 0,8 % 0,049 mol/l; 1,1,3,3‑Tetraethoxypropan (TBA) 10 nmol/ml Eisessig; Acetatpuffer (20 %-ig mit NaOH auf ph 3,5 titriert) Pyridin; n‑Butanol

Arbeitsvorschrift: Nach Homogenisierung (3 x 15 s mittels Ultra-Thurax) des Gewebes (50 mg/ml) wurde das Gewebehomogenat dem nachfolgenden Messansatz entsprechend analysiert (Angaben in ml):

Messansatz

Leerwert

Eichkurve

Probe

Acetatpuffer ph 3,5

0,3

0,3

0,3

Na-Dodecylsulfat

0,04

0,04

0,04

TBA

0,3

0,3

0,3

dest. H2O2

0,15

  

Homogenat

  

0,15

Das Reaktionsgemisch wurde 60 min bei 90° C inkubiert. Nach Abkühlung im Eisbad wurden 0,2 ml dest. H2O und 1,0 ml Butanol/Pyridin (Verhältnis 15:1) zugegeben. Nach 20-minütigem Schütteln und folgender Zentrifugation (10 min bei 1000 U/min) wurde die Lipidkonzentration nach Überführung der Butanolphase in die Meßküvette flourimetrisch auf LAB-QUANT SHIMADZU RF-5001 PC bei 515 nm Extinction/553 nm Emission gemessen. Die Konzentration der TBARS wird nach Subtraktion des Leerwertes auf der Basis der Eichkurve bestimmt. Als Standard diente Tetraethoxypropan.


[Seite 21↓]

3.5.2  Proteinbestimmung

Benutzt wurde die Methode nach Lowry (37). Die Konzentrationsberechnung erfolgte mittels eines mitgeführten Humanalbumin-Standards über eine Eichkurve. Die Probe wurde als Doppel­wert auf SHIMADZU-UV-PC 2001 bei 750 nm bestimmt.

3.5.3 Aktivitätsmessung der Gesamt-Superoxiddismutase (t-SOD)

Die SOD-Aktivitätsbestimmung basiert auf der Methode nach Beauchamp und Fridovich (38) Nach diesem Testprinzip werden mittels Xanthin und Xanthinoxidase (XOD) Sauerstoffradikale produziert, welche I.N.T. (2-4-Iodophenyl-3-nitrophenol-5-phenyltetrazolium-chlorid) zu einem roten Farbstoff reduzieren, dessen Bildung bei einer Wellenlänge von 550 nm verfolgt werden kann. In Anwesenheit der SOD wird diese Indikatorreaktion gehemmt. Hierbei erfolgt die Farbstoffhemmung (im Bereich einer 30- bis 60 %-igen Hemmung) proportional der SOD- Enzymaktivität.

(11)

(12)

Genutzt wurde der kommerzielle Testkit „Ransod“, der nachfolgende Zusammensetzung besitzt (Randox Laboratories Ltd., North Ireland):

Mixed Substrate: Xanthin (0,05 mmol/l), I.N.T. (0,025 mmol/l), CAPS pH 10,2 (50 mmol/l), EDTA (0,94 mmol/l), Xanthin-Oxidase XOD (80 U/l), 2 mmol/l Natriumcyanid (für selektive Bestimmung der Mangan-SOD)

Messansätze (Angaben in μl), Messtemperatur 37° C:

 

Leerwert Total-SOD

Total-SOD

Leerwert Mn-SOD

Mn-SOD

Dest. H2O

10

 

10

 

Homogenat (1:10)

 

10

  

Homogenat pur

   

10

Mixed Substrat

340

340

340

340

0,2 M NaCN

  

50

50

 

Durchmischen

Durchmischen

Durchmischen

Durchmischen

XOD

50

50

50

50

Gesamtvolumen

400

400

450

450

Eine 50%-ige Hemmung der Farbstoffbildung wurde als 1 Unit/l SOD-Aktivität definiert. Wie unten dargestellt, ergibt sich eine optimale Probenkonzentration im Test, wenn das Homogenat [Seite 22↓]1:10 verdünnt wird. Bei dieser Probenkonzentration wird eine Hemmung im Bereich des für diesen Test ausgewiesenen Linearitätsbereiches (30-60 % Hemmung) erzielt.

 

X

Prozentuale Hemmung

Leerwert

30,2

 

Verdünnung 1:10

17,84

40,91

Verdünnung 1:25

24,59

18,58

Verdünnung 1:50

27,91

7,59

Verdünnung 1:100

29,07

3,75

Der Variationskoeffizient in der Serie betrug 5,25 %. Für die „Von-Tag-zu-Tag-Streuung“ wurde ein Variationskoeffizient von < 10 % akzeptiert.

3.5.4 Bestimmung der Superoxiddismutase-Isoenzyme Mangan-SOD und Kupfer-Zink-SOD

Die Aktivität der Mn-SOD kann mit demselben Testverfahren wie für die Total-SOD erfolgen, nachdem durch die Anwesenheit von Na-Cyanid die Aktivität des Isoenzyms Cu-Zn-SOD gehemmt worden ist. Die nun gemessene Aktivität entspricht der Mn-SOD (39). Durch Subtraktion der Mn-SOD von der SOD-Gesamtaktivität erhält man den Anteil der Cu-Zn-SOD. In der Gegenwart von 2 mmol/l NaCN wird die Cu-Zn-SOD vollständig gehemmt. Da die Mn-SOD-Aktivität circa 10-15 % der t-SOD-Aktivität beträgt, muss das Probenmaterial unverdünnt eingesetzt werden.

3.5.5 Bestimmung der Glutathionperoxidase-Aktivität (GSH-Px)

Die Messung der Glutathionperoxidase-Aktivität erfolgte nach der von Paglia und Valentine (40) beschriebenen Methode. Die in der Testprobe enthaltene Glutathionperoxidase katalysiert die Oxidation von 2 Glutathionmolekülen (GSH) durch Cumenhydroperoxid (ROOH). In der anschließenden Folgereaktion wird das entstandene GSSG mittels NADPH2 bei einem Überschuss an Glutathionreduktase kontinuierlich zu NADP+ reduziert. Dies kann bei 340 nm verfolgt werden (Gleichung 13).

(13)

Dieses Testprinzip nutzt das Testkit „RANSEL“ der Firma Randox Laboratories Ltd., North Ireland, das in dieser Arbeit verwendet wurde. Die Reagenzienkonzentrationen im Test sind nachfolgend aufgeführt:


[Seite innerhalb Tabelle 23↓]

Glutathion

4 mmol/ l

Glutathion- Reduktase

> 0,5 U/ l

NADPH

0,28 mmol/ l

Phosphatpuffer ph 7,2

0, 05 mol/ l

ETDA

4,3 mmol/ l

Cumenhydroperoxid

0,18 mmol/ l

Messansätze (Angaben in μl):

 

Leerwert

mitgeführte Kontrolle

Probe

dest. H2O

10

  

Homogenat

  

10

Randox Kontrolle

 

10

 

Reagenzgemisch

500

500

500

Cumenhydroperoxid

20

20

20

 

Durchmischen

Durchmischen

Durchmischen

Gesamtvolumen

530

530

530

Die Berechnung der GSH-Px-Aktivität erfolgte nach der Formel:

(14)

dE = Extinktion (Probe) - Extinktion Leerwert, e = molarer Extinktionskoeffizient (l/μmol x cm ),
KV = Küvettenvolumen (0,53 ml), PV = Probenvolumen (0,01), d = Schichtdicke, f = Verdünnungsfaktor (1),
t = Messzeitintervall

Laut Messvorschrift sollte die Extinktion der Messprobe mehr als die doppelte Extinktion des Leerwertes betragen. Dies konnte bei Einsatz von unverdünntem Myokardhomogenat erreicht werden. Ein Variationskoeffizient < 10 % in der „Von-Tag-zu-Tag“-Streuung wurde akzeptiert.

3.5.6 Statistisch-methodische Vorbereitung

30-36 Stunden nach Myokardinfarkt (MI) wurden die Tiere (n = 6) getötet; das Myokardgewebe aus dem rechten und linken Ventrikel wurde im Vergleich zu „scheinoperierten“ Kontrollen (K) (n = 6) analysiert. Aus versuchstechnischen Gründen wurde der Mittelwert der Konzentration bzw. Aktivität im rechten Ventrikel mit jeweils 100 % angenommen. Die Konzentration bzw. Aktivität des linken Ventrikels wurde in prozentualer Relation dazu dargestellt. Alle im Nachfolgenden als signifikant ausgewiesenen Ergebnisse entsprechen dem Signifikanzniveau p ≤ 0,05. Als Tendenz ausgewiesene Ergebnisse basieren auf p ≤ 0,1.

Bei 318 von 335 Tieren wurde nach 6 Wochen ein erfolgreicher Gefäßverschluss (nachweisbar an regionaler Zyanose des Myokards in Kombination mit dem Auftreten charakteristischer ST-Hebungen im Elektrokardiogramm) erzielt. Innerhalb der ersten 24 Stunden nach Gefäßverschluss verstarben von diesen Tieren 44 % (178 überlebende Tiere). Bis 6 Wochen [Seite 24↓]nach Gefäßverschluss verstarben ohne signifikante Unterschiede in den Gruppen mit Myokardinfarkt weitere 7-12 % der Tiere. Von den 25 scheinoperierten Kontrolltieren starben im Versuchszeitraum 3 Tiere. Die überlebenden 156 Tiere mit Myokardinfarkt (R: 39, M: 38, MR: 38, P: 41) und die 22 Kontrolltiere wurden gewogen und narkotisiert und es erfolgte nach oben beschriebenem Vorgehen die Messung des LVEDP. Anschließend wurden die Tiere getötet, nach unverzüglicher Herzentnahme wurden die Vorhöfe abgetrennt, das Gesamtventrikelgewicht sowie die Infarktgröße bestimmt und Myokardgewebe aus dem rechten und linken Ventrikel für die biochemische Analyse sowie Papillarmuskeln zur Charakterisierung der Kontraktilität gewonnen.

3.5.7 Anzahl der in die Studie eingeschlossenen Tiere

Eingeschlossen in die Analyse wurden Tiere mit einem Transmuralinfarkt und einer Infarktgröße > 20 % des linken Ventrikels. Entsprechend wurden danach in der placebo-behandelten Gruppe mit Myokardinfarkt (P) 29 (71 %) von 41 Tieren und in der Kontrollgruppe (K) 22 Tiere berücksichtigt (Abb. 6a). Von den Tieren, die mit Ramipril (R), Metoprolol (M) bzw. mit der Kombination von Metoprolol und Ramipril (MR) behandelt wurden, sind(R)30 (77 %) von 39, (M) 29 (76 %) von 38 und (MR) 21 (55 %) von 38 Tieren eingeschlossen worden (Abb. 6a). Die im Vergleich zu den Gruppen R, M und P prozentual geringere Anzahl von Infarkten > 20 Prozent in der Gruppe MR ließ sich nicht als statistisch signifikanter Unterschied sichern. Alle im Nachfolgenden als signifikant ausgewiesenen Ergebnisse entsprechen dem Signifikanzniveau p ≤ 0,05. Als Tendenz ausgewiesene Ergebnisse basieren auf p ≤ 0,1.

3.5.8 Statistik

Alle Werte sind als Mittelwert ± SEM angegeben. Die statistische Auswertung wurde mit dem U-Test von Mann und Whitney bzw. dem Kruskal-Wallis-Test unter der Bonferoni-Held-Signifikanzangleichung mit den Programmen SPSS ® und EXEL ® durchgeführt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
13.01.2005