2 Patienten und Methoden

2.1 Datenmaterial

↓6

Die Daten stammen aus den Patientenakten des Transplantationszentrums und des HLA-Labors des Krankenhauses im Friedrichshain Berlin, jetzt Charité Campus Virchow-Klinikum und aus dem Transplantations-Informations-System der Deutschen Stiftung Organtransplantation. Von jedem Patienten waren folgende Informationen verfügbar: Datum der Transplantation, HLA-Typisierung des Spenders und Empfängers, HLA-Antikörperverhalten, Angaben zu Graviditäten, Transfusionen, zur Transplantatfunktion und Transplantatüberlebenszeit.

Die Empfänger-Typisierungen wurden im HLA-Labor für HLA-A,B,C serologisch und für die Loci HLA-DR,DQ molekulargenetisch durchgeführt. Die Spender-Typisierung erfolgte hier bzw. in Laboratorien des Eurotransplant-Verbundes. Die Kreuzteste wurden im HLA-Labor im Krankenhaus im Friedrichshain durchgeführt. Die Antikörperbefunde stammen aus regelmäßigen Screening-Untersuchungen der auf der Warteliste stehenden Patienten und aus Verlaufskontrollen nach Nierentransplantation. Zur langfristigen Beurteilung der Transplantatfunktion wurden Serum-Kreatininwerte aus der Spätphase nach Transplantation herangezogen.

Zum HLA-Matching auf Ebene von Aminosäure-Triplets diente das Computerprogramm HLAMatchmaker Version SER1.2 von Rene J. Duquesnoy PhD, Pittsburgh, USA (53, 54, 55).

2.2 Patienten

↓7

In den Jahren 1991-1996 erhielten im Nierentransplantationszentrum im Krankenhaus im Friedrichshain insgesamt 519 Patienten allogene Nierentransplantate von postmortalen Spendern. Von 327 Transplantierten lagen vollständige Angaben zum HLA-Antikörperverhalten vor, von 295 vollständige Angaben zu Transfusionen.

Befunde über HLA-Antikörper wurden von jedem Patienten vor und nach der Nierentransplantation erhoben. Entsprechend den HLA-Antikörperbefunden AK positiv oder AK negativ vor und nach Transplantation resultierten fünf verschiedene Patientengruppen:

AK-Gruppe 1 :

AK vor TX neg. / AK nach TX neg.

AK-Gruppe 2 :

AK vor TX pos. / AK nach TX neg.

AK-Gruppe 3 :

AK vor TX neg. / AK nach TX pos.

AK-Gruppe 4 :

AK vor TX pos. / AK nach TX pos.

AK-Gruppe 5 :

DRA pos.

↓8

Bei den Antikörper-positiven Patienten der Gruppen 3 und 4 handelt es sich meistens um HLA-Antikörper, die im Routine-Lymphozytotoxtest (LCT) nachgewiesen wurden und nicht gegen das Transplantat gerichtet waren. Einige Patienten entwickelten spezifische, gegen Spenderantigene gerichtete HLA-Antikörper, sogenannte donorreaktive Antikörper (DRA). Diese waren nachweisbar im Lymphozytotoxtest gegen ein Panel typisierter Blutspender sowie in postoperativ durchgeführten Crossmatchen mit den Spenderzellen. Patienten mit spezifischen donorreaktiven Antikörpern bildeten die Antikörpergruppe 5.

Beim statistischen Vergleich der Patientenverteilung (Tabelle 1) konnte für einige Merkmale eine Gleichverteilung in den einzelnen Antikörpergruppen nachgewiesen werden. Dazu gehören das Alter bei Transplantation und die Grundkrankheit.

Andere Merkmale häuften sich in bestimmten Gruppen. In der AK-Gruppe 1 sind viele Patienten mit wenig Transfusionen, kurzer Dialysedauer vor Transplantation und Patienten mit Ersttransplantation. Patienten mit vielen Transfusionen, langer Dialysedauer vor Transplantation und mit Mehrfachtransplantationen sind vermehrt in den AK-Gruppen 4 und 5 anzutreffen.

↓9

Tabelle 1: Übersicht und statistischer Vergleich der Patientendaten

 

Pat.

AK-Gr.1

AK-Gr.2

AK-Gr.3

AK-Gr.4

AK-Gr.5

  
 

n=327

n=202

n=29

n=29

n=48

n=19

Statistik

 
         
         

Alter bei TX

        

<30 Jahre

(n)

44

21

5

5

8

5

nicht

30-60 Jahre

(n)

256

157

24

22

40

13

signifikant ¹

>60 Jahre

(n)

27

24

0

2

0

1

 
         
         

Geschlecht

        

weiblich

(n)

140

80

14

9

30

7

signifikant ¹

männlich

(n)

187

122

15

20

18

12

 
         
         

Grundkrankheit

        

Pyelonephritis

(n)

65

42

4

6

9

4

 

Glomerulonephr.

(n)

159

94

18

12

27

8

nicht

vererbt

(n)

44

28

4

2

6

4

signifikant ¹

autoimmun

(n)

10

5

1

3

1

0

 

sonstiges

(n)

49

33

2

6

5

3

 
         
         

Dialysedauer vor TX

        

<1 Jahr

(n)

29

23

4

0

2

0

 

1-10 Jahre

(n)

269

172

16

28

37

16

signifikant ¹

>10 Jahre

(n)

26

6

8

1

8

3

 
         
         

Transfusionen vor TX

        

0-10

(n)

219

157

19

16

20

7

signifikant ¹

>10

(n)

76

20

9

9

27

11

 
         
         

Transplantation

        

Erst-

(n)

273

193

20

25

24

11

signifikant ¹

Mehrfach-

(n)

54

9

9

4

24

8

 
         
         

Anzahl MM- broad

        

0

(n)

72

44

8

7

13

0

 

1

(n)

42

24

3

5

7

3

nicht

2

(n)

112

69

12

5

18

8

signifikant ²

3

(n)

83

53

4

12

9

5

 

4

(n)

17

12

2

0

1

2

 

5

(n)

1

0

0

0

0

1

 
         

2.3 Methoden

2.3.1 HLA-Antikörperscreening

Die HLA-Antikörperbestimmung erfolgte serologisch mit dem Lymphozytotoxtestfür HLA-Antikörper Klasse I (HLA-A- und -B-Loci) und mittels ELISA für HLA-Antikörper Klasse I + II (einschließlich HLA-DR-Loci) (56).

2.3.1.1  Lymphozytotoxtest

Der Mikrolymphozytotoxtest ist die Standardtechnik zum Nachweis von HLA-Antikörpern (57). Alle Patienten auf der Warteliste wurden regelmäßig alle drei Monate auf HLA-Antikörper untersucht. Bei neuaufgenommenen prospektiven Transplantatempfängern (Rezipienten), bei Patienten, die Transfusionen erhielten, sowie bei Patienten nach Transplantatektomie erfolgte zusätzlich ein HLA-Antikörpernachweis. Um das HLA-Antikörperverhalten nach der Nierentransplantation zu beurteilen, wurden im hier betrachteten Patientenkollektiv Tests durchgeführt zu festgelegten Terminen am 3., 7., 10. und 20. postoperativen Tag sowie zusätzlich bei klinischem Verdacht auf Rejektion und zur Entlassung. Immunsuppressive Therapien sind in der Auswertung des LCT zu beachten, da einige Medikamente durch ihre Zytotoxizität zu falsch positiven Reaktionen führen können (58).

↓10

Beim LCT wurden Patientenseren inkubiert mit Lymphozytenpanels von 30 bis 50 ausgewählten Blutspendern mit bekanntem HLA-Typ. Besitzt der Patient Antikörper zum bekannten Antigen auf dem Spenderlymphozyten, kommt es zur Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes. An diesen Komplex kann Komplement anlagern und den Lymphozyten lysieren. Zerstörte Zellen können nach Zugabe von Farbstoff unter einem Fluoreszensmikroskop von intakten Lymphozyten unterschieden werden. Der prozentuale Anteil lysierter Zellen wird bewertet nach einem Scoresystem. Dieses definiert die Reaktionsstärke des Serums. Der Anteil positiver Reaktionen an der Gesamtzahl der Lymphozytenpanels wurde als Panelreaktivität (Panel-reaktive Antikörper= PRA) bezeichnet und in Prozent angegeben. Seren mit einer PRA > 5% wurden als positiv bewertet und aufgrund ihres Reaktionsmusters mit allen Testlymphozyten hinsichtlich der HLA-Antikörperspezifität differenziert. Das Ergebnis der letzten Antikörperuntersuchung vor Transplantation wurde als aktuelle Panelreaktivität in Prozent bezeichnet, das Serum eines Patienten mit der höchsten Panelreaktivität wurde als maximale Panelreaktivität mitgeführt.

Zur Unterscheidung der Immunglobuline (Ig) in IgG-und IgM-Antikörper erfolgte die Untersuchung parallel in zwei Ansätzen mit und ohne Dithiothreitol. Diese Substanz reduziert Disulfidbrücken und inaktiviert damit IgM-Antikörper. Entscheidend für Abstoßungsreaktionen sind HLA-IgG-Antikörper. IgM-Antikörper sind oft Auto-Antikörper und besitzen keine Relevanz für das Transplantat (59).

2.3.1.2  ELISA

Neben dem LCT kann ein Enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) zum HLA-Antikörpernachweis durchgeführt werden. Die kommerziellen Tests sind als Festphasen-ELISA konzipiert:

↓11

In den Vertiefungen der Testplatten befindet sich ein Panel von HLA-Antigenen der Klasse I und II. Darauf wird Patientenserum geschichtet und zwei Stunden inkubiert. Befinden sich im zugegebenen Serum spezifische HLA-Antikörper, so binden sich diese an die korrespondierenden Antigene. Danach wird ein sekundärer Antikörper hinzugegeben. Er bindet am Antigen-Antikörper-Komplex und kann durch eine enzymvermittelte Farbstoffreaktion sichtbar gemacht werden. Der Farbumschlag wird im Photometer gemessen und über eine entsprechende Software ausgewertet.

Die Vorteile des ELISA im Vergleich zum LCT liegen in der deutlich höheren Sensitivität und Objektivität. Das ELISA-Verfahren ist nicht abhängig von der Komplement-Reaktion oder von lebenden Zellen. Lymphozytotoxische Pharmaka, wie z.B. Antithymozytenglobulin, verursachen keine falsch-positive Reaktion.

Im HLA-Labor wird als ELISA-gestützte Methode der PRA-STAT® der Firma SangStat eingesetzt. Auf der klassischen 96-well Zellkulturplatte können Seren von insgesamt zwei Patienten getestet werden. 44 Reaktionsvertiefungen sind beschichtet mit Antigenpräparationen. Alle Antigenpräparationen enthalten HLA-Klasse I- und II-Spezifitäten entsprechend einem Lymphozytenpanel im LCT. Vier wells werden für positive und negative Kontrollen verwendet.

↓12

Eine HLA-Antikörper-Diagnostik mittels ELISA erfolgte generell bei allen Patienten bei Aufnahme auf die Warteliste zur Nierentransplantation, weiterhin bei Patienten mit auffälligem LCT-Befund und bei Patienten nach Bluttransfusionen. Nach einer Organtransplantation wurde ein ELISA durchgeführt zur Rejektionsdiagnostik vor allem bei Therapie mit lymphozytotoxischen Antikörperpräparaten.

2.3.2 Kreuztest

Der Kreuztest wurde mit dem LCT durchgeführt. Aktuelles Serum des Empfängers wurde zu Lymphozyten aus Blut, Milz oder Lymphknoten des Spenders gegeben. Bei HLA-Antikörper-positiven Patienten wurde zusätzlich mit historischen Seren gekreuzt (Seren mit maximaler PRA und wenn vorhanden nach vorangegangener Transplantation). Die Voraussetzungen für eine Transplantation waren sowohl ein negatives Ergebnis mit aktuellem Serum als auch eine negative Reaktion mit historisch maximalem bzw. Ektomie-Serum. Postoperativ erfolgte ein Kreuztest mit aktuellem Serum am 3., 7., 10. und 20. Tag. Dabei konnten eventuell neu gebildete, gegen Spenderantigene gerichtete donorreaktive Antikörper nachgewiesen werden. Bei Rejektionstherapie mit bestimmten Immunsuppressiva, wie z.B. ATG oder Muronomab-CD3, kann der Kreuztest nach Transplantation nicht zum Monitoring eingesetzt werden. Diese Medikamente führen durch ihre Zytotoxizität zu falsch positiven Reaktionen.

2.4 Immunsuppressive Therapie

Zur Vermeidung von Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantation wurden verschiedene immunsuppressiv wirkende Medikamente eingesetzt. (60, 61, 62) Im Zeitraum der Studie wurden vorwiegend verwendet: Methylprednisolon, Azathioprin,Ciclosporin A, polyklonale Antikörper wie Antihuman-T-Lymphozyten-Globulin (ATG), sowie monoklonale T-Lymphozyten-Antikörper, wie z.B. Muromonab-CD3 (OKT3). Diese Pharmaka greifen an verschiedenen Punkten im Immunsystem ein. Eine gezielt dosierte Kombination dieser Medikamente ist sinnvoll, weil dadurch einerseits sich das Wirkspektrum erhöht und andererseits sich die Nebenwirkungen verringern.

↓13

Die meisten Patienten, die in dieser Arbeit besprochen werden, erhielten eine klassische Basisimmunsuppression. Diese bestand aus Methylprednisolon (40mg/d), Azathioprin (1mg/kg KG/d) und Ciclosporin A (gewünschter Blutspiegel 100-150 ng/ml). Eine intensivierte Therapie war erforderlich bei hochsensibilisierten Patienten, Mehrfachtransplantierten, alten Patienten und Patienten mit Nieren- und Leberfunktionsstörungen. Hier kam primär eine Quadrupeltherapie zum Einsatz: Methylprednisolon, Azathioprin, Ciclosporin A und ATG (3mg/kg KG/d)(63). Die Immunsuppression muß insgesamt variabel bleiben und dem klinischen Verlauf angepaßt werden. Dabei gilt der Grundsatz: „so viel wie notwendig - so wenig wie nötig“.

Bei etwa 30 – 40% der Patienten kam es zu Abstoßungsreaktionen. Die meisten dieser Rejektionen konnten mit 500 mg Methylprednisolon an fünf aufeinanderfolgenden Tagen unterdrückt werden. Gelang dies nicht, sollte vor einer weiteren Therapie die Abstoßungsreaktion durch eine Biopsie gesichert werden (64). Dann erfolgte primär eine 7tägige Gabe von ATG (3mg/kg KG/d), bei Therapieversagen eine 10tägige Behandlung mit Muromonab-CD3 (5 mg/d) (65).

2.5 Statistik und Dokumentation

Zur Abschätzung der Transplantatüberlebenszeit wurde die Methode von KAPLAN und MEIER verwendet, die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen wurde mit dem Log-Rang-Test und dem Breslow-Test geprüft. Zum Ausschluß unterschiedlicher Transplantationsergebnisse zwischen Erst- und Mehrfachtransplantierten wurde die Transplantatüberlebenszeit über Schichten berechnet. Beim Vergleich von beobachteten Häufigkeiten wurde der Chi-Quadrat-Test mit beobachteten und erwarteten Häufigkeiten und korrigiert standardisierten Residuen angewandt. Zur Berechnung des relativen Risikos bei der multivariablen Analyse kam die Cox-Regression mit Likelihood-Ratio-Test zum Einsatz.

↓14

Zur Nierenfunktionsbeurteilung wurden aus dem zentralen Datenregister des Transplantationsdispensairs des Krankenhauses im Friedrichshain und des Rudolf VirchowKlinikums Kreatininwerte herangezogen, die 3, 6 und 12 Monate nach Transplantation und danach jährlich bestimmt wurden.

Als Funktionsverlust wurde der Zeitpunkt der Wiederaufnahme in die Dauerdialysebehandlung in Monaten nach Transplantation angegeben, ebenso galt als Funktionsverlust die Ektomie des Transplantats. Verstorbene Patienten mit funktionierendem Transplantat wurden in die Gruppe der Transplantatverluste eingeordnet.

Patienten galten als sensibilisiert, wenn bei ihnen lymphozytotoxische Antikörper mit einer Panelreaktivität > 5% nachweisbar waren. Bei grenzwertigen Befunden erfolgte eine Kontrolluntersuchung mit dem sensitiveren ELISA.

↓15

Als donorreaktive Antikörper wurden gegen Spenderantigene gerichtete lymphozytotoxische Antikörper bezeichnet, die sich nach Transplantation inkompatibler Organe beim Empfänger nachweisen ließen.


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27.05.2005