Aus der Klinik für Neurologie
der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Einfluss von „Calcitonin Gene-Related Peptide” und „Substance P” auf die
mRNA-Expression und Freisetzung von Zytokinen aus zerebralen Endothelzellen bei Kostimulation mit Pneumokokkenzellwänden

Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Frau Ute-Stephani Sehmsdorf
aus Bad Langensalza

Dekan:
Prof. Dr. med. J.W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Herr Prof. Dr. J. Weber
2. Herr PD. Dr. med. Dipl-Psych. H. Mönnikes
3. Herr Prof. Dr. med. habil. P. Oehme

eingereicht:27.April 2001

Datum der Promotion:22.Oktober 2001

Widmung

In großer Dankbarkeit
meinen Eltern
Johanna und Christoph Sehmsdorf
gewidmet

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Bakterielle Meningitis
    • 1.1.1 Epidemiologie
    • 1.1.2  Klinik und Komplikationen der bakteriellen Meningitis
  • 1.2  Die Erreger
    • 1.2.1 Pneumokokken und ihre Zellwände (PCW)
  • 1.3 Pathologie und Pathogenese der Pneumokokken-Meningitis
  • 1.4 Die Rolle der zerebralen Endothelzellen bei der Inflammation
  • 1.5 Zytokine bei Meningitis
  • 1.6 Das Trigeminovaskuläre System (TVS)
    • 1.6.1 Aktivierung des Trigeminus
    • 1.6.2  Die physiologische Rolle und klinische Bedeutung des TVS
    • 1.6.3 Die Rolle des TVS bei der Neuroinflammation
  • 1.7 Neuropeptide
    • 1.7.1 Tachykinin - Substanz P (SP)
    • 1.7.2  Calcitonin gene-related peptide (CGRP)
    • 1.7.3 Adrenomedullin (AM)
  • 1.8  Hypothesen
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Zellkulturen
    • 2.1.1 Primärkulturen der zerebralen Kapillarendothelzellen
    • 2.1.2 Die Zell-Linie L929
  • 2.2 Die Stimulation der Zellkulturen
    • 2.2.1 Materialien
    • 2.2.2  Durchführung der Stimulation
  • 2.3 RNA Isolation
    • 2.3.1 Materialien
    • 2.3.2 Durchführung der RNA-Isolation
  • 2.4  Reverse Transkription der mRNA in cDNA
    • 2.4.1 Materialien
    • 2.4.2 Durchführung
  • 2.5 Reverse Transkriptase (RT)-PCR
    • 2.5.1  Materialien
    • 2.5.2 Semiquantitative β–Actin PCR
    • 2.5.3 Semiquantitative Zytokin PCR
    • 2.5.4 PCR ohne kompetitives Kontrollfragment
  • 2.6 Auswertung der PCR Produkte
    • 2.6.1 Material und Methode
  • 2.7 Die Bestimmung von TNF-α mit TNF-α-Bioassay
  • 2.8 Quantitative Bestimmungen der Zytokine mit dem ELISA
  • 2.9 Quantitative Bestimmung von SP und SP_1-7 mit dem RIA
    • 2.9.1 Materialien und Methodik
  • 2.10  Bestimmung von Adrenomedullin(1-50) Enzym immunoabsorbet assay (EIA)
  • 2.11 Angewendete statistische Verfahren
  • 2.12 Darstellung der Ergebnisse
    • 2.12.1 Darstellung der Ergebnisse über den Einfluss von CGRP/CGRP_8-37 und SP/ SR140 333 auf die Zytokin mRNA-Expression und Freisetzung
    • 2.12.2 Darstellung der Ergebnisse der CRLR- und AM mRNA Expression
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Charakterisierung der β-Actin mRNA-Expression
  • 3.2  Einfluss von CGRP und CGRP_8-37 sowie SP und SR140333 auf die  mRNA-Expression und Freisetzung von TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2
    • 3.2.1 Einfluss von CGRP und CGRP_8-37 auf die mRNA-Expression und Freisetzung der Zytokine
    • 3.2.2  Einfluss von SP und SR140333 auf die mRNA-Expression und - Freisetzung
    • 3.2.3 SP 1-4 N-terminales Fragment
  • 3.3  CRLR (A-CGRP1) mRNA-Expression
    • 3.3.1 Einfluss von PCW auf die CRLR-mRNA-Expression im Zeitverlauf
    • 3.3.2  Regulation der CRLR mRNA-Expression bei PCW-Stimulation unter Zugabe von CGRP und CGRP_8-37 nach 4 h und 6 h
  • 3.4  Adrenomedullin (AM)-mRNA-Expression
    • 3.4.1 Einfluss von PCW auf die AM-mRNA-Expression im Zeitverlauf
    • 3.4.2  Regulation der AM-mRNA-Expression bei PCW-Stimulation und Zugabe von CGRP und CGRP_8-37 nach 4 h und 6 h
  • 3.5  Einfluss von PCW und CGRP auf die Adrenomedullin (1-50) Protein-Freisetzung aus zerebralen Endothelzellen
  • 3.6  Vergleich der SP_1-11 und SP_1-7 (Fragment) Konzentrationen in den Zellkulturüberständen
• 4  Diskussion
  • 4.1 Einfluss von CGRP auf die mRNA-Expression und Proteinfreisetzung der Zytokine TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2
  • 4.2  Einfluss von SP und SR140333 auf die mRNA-Expression und Proteinfreisetzung der Zytokine TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2
  • 4.3 Regulation des „Calcitonin Related-Like Receptor“ (CRLR)
  • 4.4 Adrenomedullin (AM)-mRNA-Expression und Freisetzung
    • 4.4.1 AM (1-50) - TNF-α
  • 4.5 SP_1-11 und SP_1-7 Konzentrationen in Zellkulturüberständen
• 5  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Publikationen
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Gesamtmix für cDNA-Synthese
• Tab. 2: Mastermix für 25µl PCR Ansatz
• Tab.3: Primersequenzen und PCR-Bedingungen
• Tab. 4: Primersequenzen und PCR-Bedingungen für PCR ohne KF
• Tab. 5:RIA-Ansatz-Protokoll
• Tab. 7: Ergebnisse des Vergleichs zwischen TNF-α- und AM(1-50) Freisetzung
• Tab. 8: SP_1-11 und SP_1-7 Protein (fmol/100µl) in Zellkulturüberständen
• Tab. 9: Zusammenfassende Übersicht der Daten über den Einfluss von CGRP und SP auf die Bildung der Zytokine

Bilder

• Abb. 1: mögliche Rolle des Trigeminovaskulären Systems bei bakterieller Meningitis
• Abb. 2: Bildbeispiel für β-Actin Auswertung mit Hilfe der ALF-express™ Software
• Abb. 3: β-Actin-mRNA-Expression zwischen PCW(n=8) und Kontrollen (n=8) ist nicht signifikant verschieden p>0,05
• Abb. 4A-C: Wirkung von CGRP auf die TNF-α mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und TNF-α-Freisetzung nach 4 h (B) bzw. 8 h (C). n ≥ 4 bzw. 3 für (PCW+CGRP100nM) aus mindestens 3 unabhängigen Einzelexperimenten,*** p<0,001, ** p<0,01, *p< 0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 5A-F: Wirkung von CGRP_8-37 1 µM auf die TNF-α-mRNA-Expression (A, B) und TNF-α-Freisetzung nach 4 h (C, D) und 8 h (E, F), n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, ***p<0,001, *p<0,05 gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM bzw. PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 6A-B: Wirkung von CGRP auf die IL-1β-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-1β-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, ***p<0,001, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 7A-D: Wirkung von CGRP_8-37 1 µM auf die IL-1β-mRNA-Expression (A; B) und  IL-1β Proteinfreisetzung (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM bzw. PCW-stimulierten Gruppe.
• Abb. 8A-B: Wirkung von CGRP auf die IL-6 mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-6-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten,  **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 9A-D: Wirkung von CGRP_8-37 1 µM auf die IL-6-mRNA-Expression (A, B) und  IL-6-Proteinfreisetzung (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, ***p<0,001, **p<0,01,*p<0,05 gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM bzw. PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 10A-B: Wirkung von CGRP auf die IL-10-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-10-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten,  **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 11A-D: Wirkung von CGRP8-37 1 µM auf die IL-10-mRNA-Expression (A, B) und  IL-10-Proteinfreisetzung (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM- bzw.  PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 12A-B: Wirkung von CGRP auf die MIP-2-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und MIP-2-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten, **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 13A-D: Wirkung von CGRP_8-37 1 µM auf die MIP-2-mRNA-Expression (A, B) und MIP-2-Proteinfreisetzung (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, ***p<0,001, *p<0,05 gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM - bzw. PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 14A-C: Wirkung von SP auf die TNF-α mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und TNF-α-Freisetzung nach 4 h (B) bzw. 8 h (C), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten, ***p<0,001 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 15A-F: Wirkung von SR140333 auf die TNF-α mRNA-Expression (A, B) und  TNF-α Freisetzungnach 4 h (C, D) und 8h (E, F), n=4 aus 4 unabhängigen Experimenten, ***P<0,001, **p<0,01,*p<0,05 gegenüber der PCW- bzw. PCW+SP10nM-Gruppe.
• Abb. 16A-B: Wirkung von SP auf die IL-1β-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-1β-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten, *p<0,05 gegenüber der mit PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 17A-B: Wirkung von SP auf die IL-6-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-6-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten, #p<0,05 gegenüber der Kontrolle, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 18A-D: Wirkung von SR140333 auf die IL-6-mRNA-Expression (A, B) und  IL-6-Proteinfreisetzung nach 8 h (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Experimenten, ***p<0,001, **p<0,01 gegenüber der mit PCW- bzw. PCW+SP 10 nM- stimulierten Gruppe
• Abb. 19A-B: keine Wirkung von SP auf die IL-10-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-10-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 von unabhängigen 4 Experimenten, p>0,05 gegenüber der mit PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 20A-D: Wirkung von SR140333 auf die IL-10-mRNA-Expression (A, B) und  IL-10-Proteinfreisetzung nach 8 h (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Experimenten, ***p<0,001; **p<0,01 gegenüber der mit PCW- bzw. PCW+SP 10 nM-stimulierten Gruppe
• Abb. 21A-B: Wirkung von SP auf die MIP-2-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und MIP-2-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 von 4 unabhängigen Experimenten, **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe
• Abb. 22A: Zeitverlauf der CRLR mRNA-Expression bei PCW-Stimulation im Vergleich zur Kontrolle nach 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, (n=4), aus unabhängigen 4 Einzelexperimenten, ***p<0,001, **p<0,01,*p<0,05 gegenüber der Kontrolle
• Abb. 22B: Zeitverlauf der AM-mRNA-Expression bei PCW-Stimulation im Vergleich zur Kontrolle nach 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, (n=4) aus unabhängigen 4 Einzelexperimenten,  *p<0,05, ***p<0,001 gegenüber Kontrolle
• Abb. 23A-C: Wirkung von CGRP 10nM (A) und CGRP_8-37 1 µM (B, C) auf die  AM-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation, n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, *p<0,05 gegenüber der mit PCW- bzw. PCW+CGRP 10 nM-stimuliertenGruppe
• Abb. 24A-B: Zeitverlauf der Freisetzung von TNF-α (A) und AM 1-50 (B) aus zerebralen Endothelzellen nach Stimulation mit PCW, PCW+CGRP 10 nM, CGRP 10 nM und Kontrolle. Um die Übersichtlichkeit zu erhalten wurden der Standardabweichungen nicht dargestellt (siehe Tab 7); n ≥ 2 aus 2 unabhängigen Experimenten
• Abb. 25A-B: SP1-11 (A) und SP1-7 (B)-Peptid in Überständen der stimulierten Proben (s.o.) mit dem RIA gemessen, n=3 (Ausnahme Zahlen in Klammern über den Säulen) aus 3 unabhängigen Einzelexperimenten A: **p<0,01 gegenüber 100% PCW+SP10nM; #p<0,05 gegenüber SP10nM; B: *p<0,05 gegenüber 100% PCW+SP10nM bzw. PCW+SP10nM+SR140333 1µM; # p<0,05 gegenüber SP100nM; ***p<0,001 gegenüber 100% PCW+SP100nM