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3  Ergebnisse

3.1 Charakterisierung der β-Actin mRNA-Expression

Bevor die Experimente zur Untersuchung des Einflusses von CGRP und SP bei stimulierten zerebralen Endothelzellen durchgeführt worden sind, wurde die β-Actin mRNA-Expression der Endothelzellen bei Stimulation mit Zellwänden von S. pneum. (PCW) überprüft, da die Expression des β-Actin-Gens als ein unerlässliches Maß zur Einstellung gleicher cDNA-Probenmengen bei den Experimenten dienen sollte.

Für diesen Zweck wurde die RNA von kultivierten zerebralen Endothelzellen sowie von Endothelzellen die mit PCW 5x105 cfu/ml 4 h stimuliert worden sind isoliert. Die Proben wurden auf einen RNA-Gehalt von 0,5 µg/µl eingestellt und in cDNA durch Reverse Transkription umgeschrieben. Anschließend wurde die kompetitive β-Actin-PCR mit dem Kontrollfragment (KF 10-5)(siehe auch Kapitel Material und Methoden) durchgeführt.

Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den mit PCW-stimulierten Proben (p>0,05) und den Kontrollproben gefunden werden (Abb. 3).

Abb. 3: β-Actin-mRNA-Expression zwischen PCW(n=8) und Kontrollen (n=8) ist nicht signifikant verschieden p>0,05


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3.2  Einfluss von CGRP und CGRP8-37 sowie SP und SR140333 auf die
mRNA-Expression und Freisetzung von TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2

3.2.1 Einfluss von CGRP und CGRP8-37 auf die mRNA-Expression und Freisetzung der Zytokine

Der Einfluss von CGRP und CGRP8-37 auf die mRNA-Expression und Freisetzung der Zytokine TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 sowie MIP-2 wurde wie folgt analysiert:

Die alleinige Zugabe von CGRP in den Konzentrationen von 1, 10 und 100 nM, führte zu keiner Veränderung der mRNA-Expression der untersuchten Zytokine gegenüber der nur mit RPMI-Medium inkubierten Kontrollgruppe (Abb. 4A; 6A; 8A; 10A; 12A) und auch die nach 8 h gemessene Freisetzung der Zytokine zeigte unter Zugabe von 1 nM CGRP keine signifikanten Unterschiede zur Kontrollgruppe. Die Freisetzung von TNF-α wurde zusätzlich bereits nach 4 h gemessen, wobei keine der getesteten CGRP-Konzentrationen (1, 10, 100 nM) zu einer signifikanten Veränderung führte (Abb. 4C; 6B; 8B; 10B; 12B u. 4B).

Regulation der PCW-induzierten mRNA-Expression

Für alle Zytokine wurde die Zugabe von 1, 10 und 100 nM CGRP zur Stimulation mit PCW untersucht (Abb. 4A; 6A; 8A; 10A; 12A). Dabei erwies sich die Zugabe von 10 nM CGRP als die Konzentration, die zu einer maximalen Erhöhung der mRNA-Expression aller untersuchter Zytokine und MIP-2 führte. 1 nM CGRP erhöhte nur bei TNF-α, IL-6, IL-10 und MIP-2 (Abb. 4A; 8A; 10A; 12A) und 100 nM CGRP nur bei TNF-α, IL-6 und MIP-2 die mRNA-Expression signifikant (Abb.4A; 8A; 12A).

Um festzustellen, ob dieser Effekt der erhöhten mRNA-Expression über den
CRLR-(CGRP-1)-Rezeptor vermittelt ist, wurde zusätzlich zu den 10 nM CGRP
1µM CGRP8-37 zugegeben. Dies bewirkte eine signifikante Inhibition der erhöhten
mRNA-Expression aller Zytokine und MIP-2 auf das Niveau der Zytokin-Expression der nur mit PCW-stimulierten Zellen (Abb. 5A; 7A; 9A; 11A u. 13A).

Des Weiteren wurde untersucht, ob bereits 1 µM CGRP8-37 allein eine Inhibition der
PCW-induzierten Zytokin-mRNA-Expression bewirkt. Es konnte hierbei jedoch für kein Zytokin ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen gefunden werden
(Abb. 5B; 7B; 9B; 11B u. 13B).


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Freisetzung von bioaktiven TNF- α und IL-1 β , IL-6, IL-10 und MIP-2 Protein

Im wesentlichen korrelieren die Ergebnisse der Zytokin-Freisetzung mit denen für die mRNA-Expression. So bewirkte die Zugabe von 10 nM CGRP ebenfalls eine signifikante Erhöhung von IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2 in den Zellkulturüberständen nach 8 h als auch von freiem TNF-α nach 4 h (Abb. 4B; 6B; 8B; 10B; 12B). Allerdings bewirkte die Zugabe von 1 nM CGRP nur die Erhöhung von freiem TNF-α nach 4h, während es nach 8h, wie auch die Zugabe von 10 nM CGRP, zu einer signifikanten Verringerung der TNF-α-Freisetzung gegenüber den nur mit PCW-stimulierten Zellen führte (Abb. 4B,C). Die Stimulation mit
100 nM CGRP führte zu einer signifikanten Erhöhung der freigesetzten IL-1β und IL-10 Konzentration (Abb. 6B u. 10B).

Wie schon auf der Ebene der mRNA-Expression gezeigt worden ist, hemmte die zusätzliche Gabe von 1 µM CGRP8-37 zur Stimulation mit 10 nM CGRP signifikant die Freisetzung von IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2 nach 8 h sowie die Freisetzung von freiem TNF-α nach 4 h (Abb. 7C; 9C; 11C; 13C u. 5C).

Im Gegensatz zur mRNA-Expression bewirkte die Gabe von 1 µM CGRP8-37 eine hoch signifikante Verringerung der PCW-induzierten Freisetzung von TNF-α nach 4 h und 8 h sowie von IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2 (Abb. 5D,F; 7D; 9D; 11D; 13D).


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Abb. 4A-C: Wirkung von CGRP auf die TNF-α mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und TNF-α-Freisetzung nach 4 h (B) bzw. 8 h (C). n ≥ 4 bzw. 3 für (PCW+CGRP100nM) aus mindestens 3 unabhängigen Einzelexperimenten,*** p<0,001, ** p<0,01, *p< 0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 5A-F: Wirkung von CGRP8-37 1 µM auf die TNF-α-mRNA-Expression (A, B) und
TNF-α-Freisetzung nach 4 h (C, D) und 8 h (E, F), n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, ***p<0,001, *p<0,05 gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM bzw. PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 6A-B: Wirkung von CGRP auf die IL-1β-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-1β-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, ***p<0,001, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 7A-D: Wirkung von CGRP8-37 1 µM auf die IL-1β-mRNA-Expression (A; B) und
IL-1β Proteinfreisetzung (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM bzw. PCW-stimulierten Gruppe.


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Abb. 8A-B: Wirkung von CGRP auf die IL-6 mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-6-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten,
**p<0,01, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 9A-D: Wirkung von CGRP8-37 1 µM auf die IL-6-mRNA-Expression (A, B) und
IL-6-Proteinfreisetzung (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, ***p<0,001, **p<0,01,*p<0,05 gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM bzw. PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 10A-B: Wirkung von CGRP auf die IL-10-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-10-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten,
**p<0,01, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 11A-D: Wirkung von CGRP8-37 1 µM auf die IL-10-mRNA-Expression (A, B) und
IL-10-Proteinfreisetzung (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM- bzw.
PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 12A-B: Wirkung von CGRP auf die MIP-2-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und MIP-2-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten, **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 13A-D: Wirkung von CGRP8-37 1 µM auf die MIP-2-mRNA-Expression (A, B) und MIP-2-Proteinfreisetzung (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, ***p<0,001, *p<0,05 gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM - bzw. PCW-stimulierten Gruppe


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3.2.2  Einfluss von SP und SR140333 auf die mRNA-Expression und - Freisetzung

Insgesamt gesehen ist der Einfluss von SP weniger eindrucksvoll, dafür aber differenzierter. Wiederum bewirkte die alleinige Gabe von SP in den Konzentrationen von 10 und 100 nM keine Veränderung der mRNA-Expression und der Freisetzung von TNF-α, IL-1β, IL-10 und MIP-2 gegenüber der nur mit RPMI-Medium inkubierten Kontrollgruppe (Abb. 14A, B, C; 16A, B;19A, B; 21A, B). Ausnahmsweise führte die Stimulation mit 10 nM SP zu einer um
5 % erhöhten IL-6-mRNA-Expression sowie zu einer um 2 % gesteigerten Freisetzung von
IL-6 gegenüber der Kontrolle (Abb. 17A, B).

Regulation der mRNA-Expression

Es wurde untersucht, ob SP in den Konzentrationen von 10 und 100 nM die durch die
PCW-induzierte mRNA-Expression der Zytokine beeinflusst (Abb. 14A; 16A; 17A; 19A; 21A). Dabei bewirkte nur 10 nM SP eine signifikante Erhöhung der mRNA-Expression von IL-1β, IL-6 und MIP-2 gegenüber der PCW stimulierten Gruppe.

Die Zugabe von 100 nM SP bewirkte bei allen untersuchten Zytokinen und MIP-2 keine signifikante Änderung der mRNA-Expression (Abb. 14A; 16A; 17A; 19A; 21A).

Die zusätzliche Gabe von 1 µM des NK-1-Antagonisten SR140333 zu 10 nM SP bewirkte nur eine signifikante Hemmung der IL-10-mRNA-Expression gegenüber der PCW-stimulierten Gruppe (Abb. 20A). Die Zugabe von 10 µM SR140333 dagegen wirkte differenzierter. So führten 10 µM SR140333 zu einer signifikanten Erhöhung der TNF-α-mRNA-Expression und zu einer signifikanten Hemmung von IL-6 und IL-10 gegenüber der PCW-Gruppe
(Abb. 15B; 18B; 20B). Keine Wirkung zeigte der NK-1-Antagonist sowohl auf die IL-1β- und MIP-2-mRNA-Expression als auch auf deren Freisetzung.

Freisetzung von bioaktiven TNF- α und IL-1 β , IL-6, IL-10 und MIP-2 Protein

Die Zugabe von 10 nM SP wirkte sich verschieden auf die Freisetzung der Zytokine aus. Einmal führte die Zugabe von 10 nM SP nach 4 h zu einer signifikant geringeren TNF-α-Konzentration im Zellkulturüberstand, während es nach 8 h zu einem signifikant erhöhten MIP-2-Proteingehalt kam (Abb. 14B; 21B). Dagegen hatte die Zugabe von 100 nM SP keinen Effekt auf die mRNA-Expression, führte aber zu signifikant erhöhten Konzentrationen von IL-1β und MIP-2 im Kulturüberstand (Abb. 16B; 21B). Keine Wirkung zeigte SP auf die Freisetzung von TNF-α, IL-6 und IL-10 nach 8 h.


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Die zusätzliche Gabe von 1 µM SR140333 zur Gabe von 10 nM SP bewirkte nur eine signifikante Hemmung der TNF-α Freisetzung nach 8 h gegenüber der Gruppe mit alleiniger Zugabe von 10 nM SP zu PCW (Abb. 15F).

Die durch PCW-stimulierte Freisetzung von IL-6, IL-10 und TNF-α nach 4 h und 8 h wurde durch Gabe von 10 µM SR140333 signifikant gehemmt (Abb. 15C,E; 18C; 20C).


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Abb. 14A-C: Wirkung von SP auf die TNF-α mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und TNF-α-Freisetzung nach 4 h (B) bzw. 8 h (C), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten, ***p<0,001 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 15A-F: Wirkung von SR140333 auf die TNF-α mRNA-Expression (A, B) und
TNF-α Freisetzungnach 4 h (C, D) und 8h (E, F), n=4 aus 4 unabhängigen Experimenten, ***P<0,001, **p<0,01,*p<0,05 gegenüber der PCW- bzw. PCW+SP10nM-Gruppe.


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Abb. 16A-B: Wirkung von SP auf die IL-1β-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-1β-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten,
*p<0,05 gegenüber der mit PCW-stimulierten Gruppe

Abb. 17A-B: Wirkung von SP auf die IL-6-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-6-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 aus 4 unabhängigen Experimenten,
#p<0,05 gegenüber der Kontrolle, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 18A-D: Wirkung von SR140333 auf die IL-6-mRNA-Expression (A, B) und
IL-6-Proteinfreisetzung nach 8 h (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Experimenten,
***p<0,001, **p<0,01 gegenüber der mit PCW- bzw. PCW+SP 10 nM- stimulierten Gruppe

Abb. 19A-B: keine Wirkung von SP auf die IL-10-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und IL-10-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 von unabhängigen 4 Experimenten, p>0,05 gegenüber der mit PCW-stimulierten Gruppe


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Abb. 20A-D: Wirkung von SR140333 auf die IL-10-mRNA-Expression (A, B) und
IL-10-Proteinfreisetzung nach 8 h (C, D), n=4 aus 4 unabhängigen Experimenten, ***p<0,001; **p<0,01 gegenüber der mit PCW- bzw. PCW+SP 10 nM-stimulierten Gruppe

Abb. 21A-B: Wirkung von SP auf die MIP-2-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation (A) und MIP-2-Proteinfreisetzung nach 8 h (B), n≥4 von 4 unabhängigen Experimenten, **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der nur mit PCW-stimulierten Gruppe

3.2.3 SP 1-4 N-terminales Fragment

Bei allen untersuchten Zytokinen wurde geprüft, ob SP1-4 in den Konzentrationen 200 nM und 2000 nM einen Einfluss auf die Zytokin-mRNA-Expression sowie auf deren Freisetzung hat.

Es konnte kein signifikanter Unterschied zu der PCW-induzierten Zytokin-Bildung gefunden werden.


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3.3  CRLR (A-CGRP1) mRNA-Expression

Die Calcitonin Related-Like Receptor (CRLR)-mRNA entspricht der mRNA des CGRP-1 Rezeptors (siehe Einleitung).

Die CRLR-mRNA konnte sowohl bei den unstimulierten als auch bei den PCW-stimulierten zerebralen Kapillarendothelzellen nachgewiesen werden.

3.3.1 Einfluss von PCW auf die CRLR-mRNA-Expression im Zeitverlauf

Die mRNA-Expression des CRLR-Rezeptors wurde im zeitlichen Verlauf untersucht. So zeigte sich zum Zeitpunkt 0 h kein signifikanter Unterschied zwischen der PCW-Gruppe und der Kontrollgruppe, während sich nach 2 h die CRLR-Expression bei PCW-Stimulation gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöhte. Das Verhältnis der mRNA-Expression kehrte sich nach 4 h und 6 h um, dabei war die CRLR-mRNA-Expression stetig abgefallen und gegenüber der Kontrollgruppe signifikant verringert (Abb.22A).

Abb. 22A: Zeitverlauf der CRLR mRNA-Expression bei PCW-Stimulation im Vergleich zur Kontrolle nach 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, (n=4), aus unabhängigen 4 Einzelexperimenten,
***p<0,001, **p<0,01,*p<0,05 gegenüber der Kontrolle


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3.3.2  Regulation der CRLR mRNA-Expression bei PCW-Stimulation unter Zugabe von CGRP und CGRP8-37 nach 4 h und 6 h

Nach 4 h war die CRLR-mRNA-Expression bei Zugabe von 10 nM CGRP gegenüber der PCW-Gruppe erhöht. Zusätzlich zu den 10 nM CGRP wurde 1 µM CGRP8-37 zugegeben, dies bewirkte aber keine Inhibition der erhöhten mRNA-Expression.

Dagegen führte die alleinige Gabe von 1 µM CGRP8-37 zu einer signifikanten Inhibition der PCW-induzierten CRLR mRNA-Expression.

Während die zusätzlichen Gaben von 1 nM und 10 nM CGRP zu PCW nach 6 h zu signifikant erhöhten CRLR-mRNA-Expressionen gegenüber der PCW Gruppe führten, bewirkte 100 nM CGRP keine signifikante Änderung. Insgesamt gesehen aber war die erhöhte mRNA-Expression gegenüber der Kontrollgruppe reduziert.

Die alleinige Stimulation mit 10 nM und 1 nM CGRP bewirkte nach 4 h und 6 h eine signifikante Reduktion der Expression gegenüber der Kontrollgruppe.

RDC-1 (K-CGRP1) Rezeptor

In den gleichen cDNA-Proben in denen die CRLR-Rezeptor-mRNA gemessen wurde, ist auch die RDC-1-Rezeptor mRNA nachgewiesen worden. Im Gegensatz zur CRLR-Rezeptor Transkription konnte hier keine Veränderung der Transkription unter Einfluss von PCW und CGRP gefunden werden.

L1-(Adrenomedullin)-Rezeptor

Ebenfalls konnte bei den gleichen Proben der L1-Rezeptor nachgewiesen werden. Allerdings ist die mRNA-Expression nur sehr schwach ausgeprägt und zeigte keinerlei Änderung der Transkription unter Einwirkung von PCW oder CGRP.


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3.4  Adrenomedullin (AM)-mRNA-Expression

Die AM-mRNA konnte in allen untersuchten Proben, sowohl bei den unstimulierten- als auch bei den PCW-stimulierten Zellen nachgewiesen werden.

3.4.1 Einfluss von PCW auf die AM-mRNA-Expression im Zeitverlauf

Die AM-mRNA-Expression wurde im zeitlichen Verlauf untersucht. Während sich zum Zeitpunkt 0 h kein signifikanter Unterschied zwischen der PCW-Gruppe und der Kontrollgruppe fand, zeigte sich eine signifikant erhöhte AM mRNA-Expression nach 2 h,
4 h und 6 h (Abb.22B).

Abb. 22B: Zeitverlauf der AM-mRNA-Expression bei PCW-Stimulation im Vergleich zur Kontrolle nach 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, (n=4) aus unabhängigen 4 Einzelexperimenten,
*p<0,05, ***p<0,001 gegenüber Kontrolle


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3.4.2  Regulation der AM-mRNA-Expression bei PCW-Stimulation und Zugabe von CGRP und CGRP8-37 nach 4 h und 6 h

Die Zugabe von 10 nM CGRP führte nach 4 h und 6 h zu einer signifikanten Erhöhung der AM-mRNA-Expression, während die Zugabe von 1 und 100 nM CGRP keine signifikante Änderung der Transkription gegenüber dem PCW-Stimulus nach 6 h bewirkte (Abb. 23A).

Zusätzlich zu den 10 nM CGRP wurde 1 µM CGRP8-37 zugegeben, dies bewirkte eine signifikante Inhibition der erhöhten mRNA-Expression. Auch die alleinige Gabe von 1 µM CGRP8-37 führte zu einer signifikanten Inhibition der PCW-induzierten
AM-mRNA-Expression nach 4 h (Abb. 23B,C).

Die alleinige Stimulation der Zellen mit 10 nM CGRP und 1 nM CGRP nach 4 h bzw. 6 h bewirkte im Trend eine erhöhte AM-mRNA-Expression im Vergleich zur Kontrollgruppe. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant (Abb. 23A).


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Abb. 23A-C: Wirkung von CGRP 10nM (A) und CGRP8-37 1 µM (B, C) auf die
AM-mRNA-Expression nach 4 h Stimulation, n=4 aus 4 unabhängigen Einzelexperimenten, *p<0,05 gegenüber der mit PCW- bzw. PCW+CGRP 10 nM-stimuliertenGruppe


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Tab. 6: Übersicht der CRLR- und AM-mRNA-Expression Ergebnisse

RNA %

PCW 0 h

KO 0 h

PCW 2 h

KO 2 h

PCW 4 h

KO 4 h

PCW 6 h

KO 6 h

CRLR

85

100

180,5 ± 24,4 *

100,0 ± 36,6

55,5 ± 12,5 **

100,0 ± 13,6

24,0 ± 4,7 ***

100,0 ± 13,8

AM

103,1

100

175,5 ± 25,1 *

100,0 ± 42,9

141,0 ± 11,1*

100,0 ± 13,4

150,4 ± 2,6 ***

100 ± 24,2

***p<0,001, **p<0,01, *p<0,5 gegenüber der 100% Kontrolle (Ko)

Stimulanzien

CRLR 4 h %

CRLR 6 h %

AM 4 h %

AM 6 h %

PCW

100 ± 24,5

100 ± 29,7

100,0 ± 18,0

100,0 ± 24,8

Kontrolle

163,8 ± 13,0 ***

487,8 ± 43,2 ***

61,1 ± 11,4

66,7 ± 1,2 ***

CGRP 1 nM

n. b.

279,3 ± 8,2 # ***

n. b.

120,0 ± 35,5

CGRP 10 nM

70, 0 ± 18,4 #

n. b.

81,0 ± 13,4

n.b.

PCW + CGRP 1 nM

n b.

364,2 ± 82,7

n. b.

209,0 ± 48,4

PCW + CGRP10 nM

137,0 ± 9,1 *

174,0 ± 28,2

185,3 ± 34,9 *

131,7 ± 3,8 **

PCW + CGRP 100 nM

n. b.

194,5 ± 48,2

n. b.

108,0 ± 6,7

PCW + CGRP10nM + CGRP 8-37 1 µM

170,3 ± 30,0

n. b.

53,0 ± 6,6 *

n. b.

PCW + CGRP 8-37 1 µM

78, 0 ± 6,4 *

n. b.

71,3 ± 7,1*

n b.

***p<0,001, **p<0,01, *p<0,5 gegenüber der 100% Kontrolle (Ko) #< 0,05 gegenüber der 100% Kontrolle, ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,5 gegenüber
100% PCW-Stimulation
n.b. = nicht bestimmt


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3.5  Einfluss von PCW und CGRP auf die Adrenomedullin (1-50) Protein-Freisetzung aus zerebralen Endothelzellen

Mit Hilfe des EIA wurde Adrenomedullin (1-50) zu den Zeitpunkten 0 h, 4 h, 8 h und 12 h gemessen.

Nach 0 h, 4 h ,8 h konnte kein Adrenomedullin(AM)-(1-50) gemessen werden. Erst nach 12 h konnte in den Gruppen, die mit 10 nM CGRP, PCW oder mit PCW und zusätzlich 10 nM CGRP stimuliert worden sind, AM (1-50) gemessen werden. Dabei bewirkte die zusätzliche Gabe von 10 nM CGRP zu PCW eine signifikante Erhöhung der AM-Konzentration gegenüber der mit PCW-Gruppe (Abb. 24A). Kein AM(1-50) war über den ganzen Zeitraum in den Überständen der Mediumkontrollen messbar.

Weiterhin wurde in den gleichen Proben in denen AM gemessen worden ist, auch der TNF-α Proteingehalt in pg/ml bestimmt. Dabei zeigte sich eine negative Korrelation zwischen der TNF-α-Konzentration und der AM-Konzentration nach 12 h. Bei der mit PCW-stimulierte Gruppe zeigte sich, dass eine erhöhte Konzentration an AM mit einer niedrigeren Konzentration an TNF-α korrelierte. Die verglichenen TNF-α-Konzentrationen waren dabei signifikant voneinander verschieden (Tab.7, Abb. 24A, B).

Tab. 7: Ergebnisse des Vergleichs zwischen TNF-α- und AM(1-50) Freisetzung

 

TNF- α pg/ml

AM (1-50) ng/ml

 

0 h

4 h

8 h

12 h

0 h

4 h

8 h

12 h

PCW

0 ± 0

30,3 ± 20,6

122,8 ± 12,6

195,5 ± 19,0

0 ± 0

0 ± 0

0 ± 0

7,4 ± 0

PCW + CGRP 10 nM

0 ± 0

39,0 ± 23,6

66,1 ± 15,3 **

157,9 ± 14,7 *

0 ± 0

0 ± 0

0 ± 0

25,1 ± 1,0 ***

CGRP 10 nM

0 ± 0

0 ± 0

0 ± 0

0 ±0

0 ± 0

0 ± 0

0 ± 0

2,8 ± 0,0

Kontrolle

0 ± 0

0 ± 0

0 ± 0

0 ± 0

0 ± 0

0 ± 0

0 ± 0

0 ± 0

***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05 gegenüber der Stimulation mit PCW


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Abb. 24A-B: Zeitverlauf der Freisetzung von TNF-α (A) und AM 1-50 (B) aus zerebralen Endothelzellen nach Stimulation mit PCW, PCW+CGRP 10 nM, CGRP 10 nM und Kontrolle. Um die Übersichtlichkeit zu erhalten wurden der Standardabweichungen nicht dargestellt (siehe Tab 7); n ≥ 2 aus 2 unabhängigen Experimenten


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3.6  Vergleich der SP1-11 und SP1-7 (Fragment) Konzentrationen in den Zellkulturüberständen

In den Zellkulturüberständen wurde SP1-11 und SP1-7 mittels RIA gemessen. SP konnte nur in den mit SP stimulierten Proben gemessen werden. Die SP1-11 Konzentrationen sind um das 2,3-fache höher als die SP1-7 –Peptidkonzentrationen, wenn die Zellen mit 10 nM SP bzw. PCW und 10 nM SP stimuliert worden sind. Dabei blieb der prozentuale Anteil an SP1-7 in den genannten Gruppen aber gleich. Bei einer zusätzlichen Gabe von 1 µM SR140333 zu der Stimulation mit nur 10 nM SP, zeigte sich nur ein geringer, 1,4-facher Unterschied zwischen der SP1-11 und der SP1-7 zu Gunsten von SP1-11. Zusätzliche Gabe von 1 µM SR140333 zur Stimulation mit PCW und 10 nM SP bewirkte dagegen eine 3,1-fach höhere Konzentration an SP1-11 im Vergleich zu der Konzentration an SP1-7 (Tab. 8).

Tab. 8: SP1-11 und SP1-7 Protein (fmol/100µl) in Zellkulturüberständen

SP-Fragment

PCW

Ko

SP 10 nM

PCW+SP 10 nM

SP 10 nM +

SR140333 1 µM

PCW+SP 10nM+
SR140333 1µM

SP 100 nM

PCW+SP 100nM

SP1-11 (fmol/100µl)

0 ± 0

0 ± 0

159,2 ± 27,3

279,0 ± 55,8

194,7 ± 27,5

197,5 ± 56,2

~308x103± ~131x103

~355x103 ± ~162x103

SP1-7 (fmol/100µl)

0 ± 0

0 ± 0

71,0 ± 5,3

118,0 ± 45,4

136,5 ± 22,4

63,0 ± 20,1

403,0 ± 132,3

797,0 ± 214,6

Obwohl immer mit der gleichen Menge an SP1-11 stimuliert worden ist, war die Konzentration von SP1-11 in den Überstanden, die mit PCW und 10 nM SP stimuliert worden sind, gegenüber den Proben, denen nur 10 nM SP zugegeben worden ist, signifikant erhöht. Das Verhältnis der SP1-7 Konzentrationen in den oben genannten Proben zueinander entsprach in der Tendenz dem Konzentrationsverhältnis von SP1-11, war jedoch nicht signifikant verschieden. Die SP1-7- Konzentration in den Überständen, denen PCW und 100 nM SP zugegeben worden sind, war gegenüber den Überständen denen nur 100 nM SP zugegeben sind signifikant erhöht. In den Proben mit zusätzlicher Gabe von 1 µM SR140333 waren die SP1-11 und SP1-7 Konzentrationen in den Überständen gegenüber den Proben die ohne Zugabe von SR140333 zu PCW und 10 nM SP stimuliert worden sind, signifikant verringert. (Abb.25A, B).


[Seite 81↓]

Der Vergleich zwischen den einzelnen Konzentrationen von SP1-11 und SP1-7 der stimulierten Proben erfolgt in Prozent. Dabei werden die Werte auf die Gruppe der Stimulation mit PCW+SP10nM = 100% bzw. PCW+SP100nM =100% (nur SP1-7) bezogen (Abb. 25 A, B).

Abb. 25A-B: SP1-11 (A) und SP1-7 (B)-Peptid in Überständen der stimulierten Proben (s.o.) mit dem RIA gemessen, n=3 (Ausnahme Zahlen in Klammern über den Säulen) aus 3 unabhängigen Einzelexperimenten A: **p<0,01 gegenüber 100% PCW+SP10nM; #p<0,05 gegenüber SP10nM; B: *p<0,05 gegenüber 100% PCW+SP10nM bzw. PCW+SP10nM+SR140333 1µM; # p<0,05 gegenüber SP100nM; ***p<0,001 gegenüber 100% PCW+SP100nM


[Seiten 82 - 83↓]

Tab. 9: Zusammenfassende Übersicht der Daten über den Einfluss von CGRP und SP auf die Bildung der Zytokine

RNA in %

TNF- α %

IL-1 β %

IL-6%

IL-10%

MIP-2%

PCW

100,0 ± 26,9

100,0 ± 21,8

100,0 ± 14,4

100,0 ± 24,2

100,0 ± 24,3

Kontrolle

3,6 ± 0,9

1,2 ± 0,7

0,6 ± 0,3

7,4 ± 2,4

3,8 ± 1,3

CGRP1nM

3,3 ± 1,4

2,3 ± 1,6

0,5 ± 0,1

7,3 ± 1,6

1,7 ± 0,3

CGRP10nM

0,5 ± 0,3#

1,8 ± 1,1

0,1 ± 0,0

2,1 ± 1,5

3,8 ± 0,9

CGRP100nM

3,0 ± 1,1

1,3 ± 0,4

0,3 ± 0,1

2,5 ± 1,1

2,1 ± 0,6

PCW+CGRP1nM

199,6 ± 30,3**

134,0 ± 15,8 *

123,0 ± 8,7 *

127,0 ± 6,7 **

252,6 ± 49,6 *

PCW+CGRP10nM

207,9 ± 28,1***

135,8 ± 6,5 ***

153,7 ± 12,6 **

161,5 ± 21,8 *

356,2 ± 90,5 *

PCW+CGRP100nM

183,3 ± 35,2*

112,5 ± 8,6

133,2 ± 8,6 **

130,8 ± 13,5

355,2 ± 105,1 *

PCW+CGRP10nM+ CGRP8-37 1µM

62,5 ± 4,7 ***(a)

74,0 ± 5,9 **(a)

66,9 ± 8,7 **(a)

61,0 ± 5,6 ***(a)

59,6 ± 6,1 ***(a)

PCW+CGRP8-37 1µM

106,1 ± 22,6

106,4 ± 8,7

98,2 ± 26,1

63,2 ± 16,2

89,8 ± 12,3

Protein in %

TNF- α 4 h %

TNF- α 8 h %

IL-1 β %

IL-6%

IL-10%

MIP-2%

PCW

100,0 ± 18,0

100,0 ± 33,0

100,0 ± 33,0

100,0 ± 11,4

100,0 ± 36,3

100,0 ± 26,7

Kontrolle

0,8 ± 0,2

1,5 ± 0,5

4,0 ± 2,4

4,0 ± 2,4

0,3 ± 0,3

2,7 ± 0,7

CGRP1nM

0,6 ± 0,1

1,0 ± 0,2

1,7 ± 0,9

1,7 ± 0,9

2,5 ± 2,2

1,6 ± 0,7

CGRP10nM

0,6 ± 0,1

n. b.

n. b.

n. b.

n. b.

n. b.

CGRP100nM

0,7 ± 0,1

n. b.

n. b.

n. b.

n. b.

n. b.

PCW+CGRP1nM

154,5 ± 13,9 ***

60,4 ± 6,9 ***

109,0 ± 27,2

111,0 ± 6,4

123,0 ± 18,8

105,0 ± 15,5

PCW+CGRP10nM

145,8 ± 13,7 *

63,4 ± 10,3 **

158,0 ± 16,7*

134,0 ± 14,7 *

165,0 ± 16,4 **

143,0 ± 10,3 **

PCW+CGRP100nM

135,3 ± 20,6

82,7 ± 9,3

112,4 ± 27,9

110,0 ± 7,7

146,0 ± 6,0 *

105,0 ± 30,8

PCW+CGRP10nM +

CGRP8-37 1µM

74,2 ± 9,2 *(a)

122,7 ± 22,9

68,0 ± 7,2 **(a)

80,0 ± 8,0 * (a)

77,6 ± 5,1 **(a)

78,2 ± 3,9 ***(a)

PCW+CGRP8-37 1µM

34,1 ± 7,0 ***

38,2 ± 9,5 ***

86,0 ± 4,4 *

62,9 ± 5,2 ***

70,5 ± 8,0 **

85,2 ± 6,0 *

RNA

TNF- α

IL-1 β

IL-6

IL-10

MIP-2

 

Units

Units

Units

Units

Units

PCW

252,9 ± 68,1

515,3 ± 112,7

1252,2 ± 180,3

1282,8 ± 310,3

394,3 ± 95,7

Kontrolle

4,7 ± 0,8

    

CGRP1nM

4,7 ± 1,6

    

CGRP10nM

0,8 ± 0,3

    

CGRP100nM

3,5 ± 1,2

    

PCW+CGRP1nM

455,5 ± 150,7

670,6 ± 194,3

1546,2 ± 251,0

1629,6 ± 387,0

875,3 ± 187,5

PCW+CGRP10nM

494,6 ± 157,8

691,8 ± 160,2

1929,0 ± 325,4

2060,8 ± 489,1

1244,2 ± 314,0

PCW+CGRP100nM

485,3 ± 212,5

589,0 ± 307,9

1578,6 ± 218,5

1575,5 ± 492,9

1231,5 ± 370,0

PCW+CGRP10nM +

CGRP8-37 1µM

183,3 ± 35,3

421,0 ± 162,0

1256,0 ± 101,6

1325,0 ± 564,8

419,0 ± 150,2

PCW+CGRP8-37 1µM

572,0 ± 368,2

708,5 ± 111,3

990,5 ± 327,8

1754,0 ± 438,1

277,6 ± 86,0

Protein

TNF- α 4 h

TNF- α 8 h

IL-1 β

IL-6

IL-10

MIP-2

 

pg/ml

pg/ml

pg/ml

pg/ml

pg/ml

ng/ml

PCW

1116,3 ± 209,0

1830,0 ± 600,8

234,0 ± 77,3

3972,0 ±452,8

1010,0 ± 367,0

86,0 ± 23,0

Kontrolle

      

CGRP1nM

      

CGRP10nM

  

n .b.

n .b.

n. b.

n. b.

CGRP100nM

  

n. b.

n. b.

n. b.

n. b.

PCW+CGRP1nM

1801,5 ± 468,2

1024,0 ± 283,4

178,0 ± 29,5

4110,0 ± 470,1

1253,0 ± 519,9

84,0 ± 19,7

PCW+CGRP10nM

1706,0 ± 477,3

1161,4 ± 472,3

388,0 ± 85,8

5111,0 ± 387,9

1591,0 ± 599,9

121,0 ± 30,3

PCW+CGRP100nM

1681,7 ± 528,8

782,0 ± 219,5

156,0 ± 28,5

3738,0 ± 410,2

584,0 ± 316,5

61,0 ± 13,3

PCW+CGRP10nM + CGRP8-37 1µM

1165,8 ± 340,0

1247,7 ± 484,7

318,0 ± 42,9

3866,4 ± 1215,0

1351,0 ± 407,4

71,8 ± 14,5

PCW+CGRP8-37 1µM

137,0 ±. 53,2

169,0 ± 20,2

232,0 ± 12,0

4577,8 ±1135,0

460,8 ± 56,0

84,9 ± 7,3


[Seite 84↓]

RNA in %

TNF- α %

IL-1 β %

IL-6%

IL-10%

MIP-2%

PCW

100,0 ± 24,0

100,0 ± 20,1

100,0 ± 12,0

100,0 ± 18,3

100,0 ± 13,0

Kontrolle

9,4 ± 1,0

10,5 ± 4,5

5,2 ± 2,0

7,0 ± 1,2

0,8 ± 0,4

SP10nM

10,5 ± 2,0

12,1 ±4,5

10,6 ± 3,0 #

4,0 ± 1,4

4,3 ± 3,1

SP100nM

10,7 ± 3,0

15,1 ± 6,8

12,5 ± 5,0

6,0 ± 1,8

3,3 ± 1,8

SP10nM+SR140333 1µM

16,7 ± 7,0

5,4 ± 2,0

5,7 ± 3,0

2,0 ± 0,8

2,1 ± 1,1

PCW+SP10nM

116,7 ± 14,0

117,2 ±5,5 *

130,5 ± 12,2 *

123,0 ± 33,4

138,7 ± 16,7*

PCW+SP100nM

115,0 ± 7,0

99,8 ± 5,8

139,0 ± 19,0

125,0 ± 42,6

98,4 ± 13,5

PCW+SP10nM +

SR140333 1µM

135,4 ± 17,0

91,4 ± 5,6

98,7 ± 12,6

52,0 ± 5,1***(b)

77,3 ± 9,7

PCW +SR140333 10µM

178,8 ± 24,0*

92,4 ± 9,7

54,3 ± 10,1 **

36,0 ± 8,9 ***

74,3 ± 12,7

Protein in %

TNF- α 4 h %

TNF- α 8 h %

IL-1 β %

IL-6%

IL-10%

MIP-2%

PCW

100,0 ± 19,6

100,0 ± 20,3

100,0 ± 19,3

100,0 ± 13,5

100,0 ± 32,5

100,0 ± 17,6

Kontrolle

1,0 ± 0,2

1,0 ± 0,2

2,0 ± 2,4

0,0 ± 0,0

0,3 ± 0,3

2,0 ± 0,7

SP10nM

0,5 ± 0,1

1,0 ± 0,2

4,0 ± 3,6

2,0 ± 1,0 #

0,8 ± 0,6

2,0 ± 0,7

SP100nM

2,0 ± 1,4

2,0 ± 0,5

1,0 ± 0,9

5,0 ± 4,9

0,0 ± 0,0

2,0 ± 0,9

SP10nM+SR140333 1µM

1,0 ± 0,3

1,0 ± 0,5

0,0

0,2 ± 0,2

0,0 ± 0,0

0,0 ± 0,2

PCW+SP10nM

62,0 ± 7,8 ***

117,0 ± 14,4

120,0 ± 10,7

106,0 ± 5,6

118,5 ± 8,3

122,0 ± 5,5 ***

PCW+SP100nM

105,0 ± 22,8

123,0 ± 25,1

119,0 ± 2,5 *

97,0 ± 6,7

125,5 ± 22,9

112,0 ± 3,6 **

PCW+SP10nM+ SR140333 1µM

91,0 ± 17,4

70,0 ± 5,7**(b)

105,0

103,0 ± 6,9

93,3 ± 9,9

107,0 ± 9,0

PCW+SR140333 10µM

18,0 ± 6,2 ***

36,0 ± 10,0***

193,0

46,0 ± 7,1 ***

35,7 ± 11,5**

99,0 ± 17,1


[Seite 85↓]

RNA in Units

TNF- α

IL-1 β

IL-6

IL-10

MIP-2

 

Units

Units

Units

Units

Units

PCW

684,1 ± 162,0

672,0 ± 135,6

971,0 ± 114,0

1936,0 ± 354,0

255,1 ± 33,3

Kontrolle

65,9 ± 20,0

52,0 ± 17,0

48,4 ± 14,0

92,0 ± 34,8

2,4 ± 1,5

SP 10 nM

71,6 ± 22,0

63,0 ± 18,0

102,6 ± 28,0

72,0 ± 29,4

4,3 ± 3,1

SP 100 nM

100,3 ± 34,0

78,0 ± 27,0

115,3 ± 42,0

110,0 ± 34,7

10,3 ± 7,4

SP10nM+SR140333 1µM

146,5 ± 50,0

50,0 ± 28,7

44,7 ± 19,0

26,0 ± 12,7

3,7 ± 1,3

PCW+SP 10 nM

806,5 ± 183,0

681,0 ± 113,1

1289,0 ± 234,0

2113,0 ± 532,1

345,8 ± 83,7

PCW+SP 100 nM

780,2 ± 204,0

684,8 ± 176,3

1408,2 ± 407,0

2257,0 ± 685,9

250,4 ± 45,5

PCW+SP 10nM +

SR140333 1µM

1096,8 ± 357,0

702,3 ± 103,9

979,0 ± 126,0

1087,0 ± 358,1

182,3 ± 33,3

PCW +SR140333 10µM

1048,6 ± 331,0

673,0 ± 88,3

434,6 ± 62,0

452,0 ± 115,9

149,8 ± 22,0

Protein

TNF- α 4h

TNF- α 8h

IL-1 β

IL-6

IL-10

MIP-2

 

pg/ml

pg/ml

pg/ml

pg/ml

pg/ml

ng/ml

PCW

1369,0 ± 268,3

605,0 ± 122,6

126,0 ± 24,0

4053,0 ± 547,7

517,7 ± 168,7

103,0 ± 18,1

Kontrolle

6,0 ± 1,4

7,0 ± 1,4

6,0 ± 6,3

0,0 ± 0,0

1,3 ± 1,3

2,0 ± 0,5

SP 10 nM

5,0 ± 1,0

6,0 ± 0,8

7,0 ± 7,0

67,0 ± 33,9

0,8 ± 0,6

2,0 ±0,4

SP 100 nM

16,0 ± 10,7

5,0 ± 0,3

5,0

139,0 ± 116,4

0,0 ± 0,0

1,0 ± 0,4

SP10nM+SR140333 1µM

4,0 ± 1,1

5,0 ± 0,3

0,0

15,0 ± 15,0

0,0 ± 0,0

1,0 ± 0,3

PCW+SP 10 nM

842,0 ± 7,8

711,0 ± 155,4

153,0 ± 35,5

4514,0 ± 5,6

576,6 ± 164,5

125,0 ± 24,9

PCW+SP 100 nM

1484,0 ± 372,1

494,0 ± 180,8

180,0 ± 46,0

4118,0 ± 971,8

544,8 ± 200,1

123,0 ± 30,7

PCW+SP10 nM +

SR140333 1 µM

971,0 ± 409,3

393,0 ± 170,6

236,0

5120,0 ± 958,2

548,4 ± 194,4

173,0 ± 34,9

PCW+SR140333 10 µM

104,0 ± 25,0

161,0 ± 82,0

378,0

2572,0 ± 848,1

256,6 ± 189,1

146,0 ± 38,8

Anmerkungen: ***p<0,001,**p<0,01,*p<0,05 signifikant gegenüber der mit PCW stimulierten Gruppe, (a) signifikant gegenüber der mit PCW+CGRP 10 nM-stimulierten Gruppe, (b) signifikant gegenüber der mit PCW+SP 10 nM-stimulierten Gruppe, #p<0,05 signifikant gegenüber der Kontrolle


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02.09.2004