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4  Diskussion

Schwerpunkt dieser Arbeit war es, an primären zerebralen Kapillarendothelzellen, einem wesentlichen zellulären Bestandteil der BHS, den Einfluss der Neuropeptide CGRP und SP auf die mRNA-Expression und Freisetzung der Zytokine TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2 zu untersuchen. Des Weiteren wurde der Effekt von Zellwänden von S. pneumoniae auf die Regulation der mRNA-Expression des Calcitonin Related-Like Receptor (CRLR), der als CGRP- und AM-Rezeptor funktioniert, untersucht.

In eigenen von mir hier nicht weiter ausgeführten Untersuchungen konnten ich zeigen, dass zerebrale Endothelzellen nicht in der Lage sind, CGRP zu exprimieren. Deshalb untersuchten wir, ob zerebrale Endothelzellen AM sezernieren können. Wir untersuchten auch, wie sich die Dichte an NK-Rezeptoren auf die zerebralen Endothelzellen unter dem Einfluss von PCW verändert und ob die Stimulation der Zellen mit PCW sich auf die Fragmentierung von SP1-11 zu SP1-7 auswirkt.

Dabei ergaben sich folgende wesentliche Resultate:

  1. CGRP führte zu einer Erhöhung der PCW-induzierten TNF-α-, IL-1β-, IL-6-, IL10- und MIP-2-mRNA-Expression und führte zu einer erhöhten Freisetzung der Zytokine mit Ausnahme von TNF-α. Hierbei war die Freisetzung aus den zerebralen Endothelzellen nach 8 h reduziert. Die Wirkung von CGRP ist Rezeptor-vermittelt, da eine erhöhte Expression der Zytokine durch Zugabe des Antagonisten h-CGRP8-37 kompetitiv gehemmt werden konnte.
  2. Der Einfluss von SP auf die Expression der Zytokine war insgesamt schwächer, eine erhöhte mRNA-Expression war nur für IL-1β, IL-6 und MIP-2 statistisch signifikant. SP führte zu einer erhöhten Freisetzung von IL-1β und MIP-2 nach 8 h, während die Freisetzung von TNF-α gegenüber den PCW-stimulierten Proben nach 4 h signifikant reduziert war. Die Proteinfreisetzung von TNF-α, IL-6 und IL-10 konnte zudem durch den „Non-Peptide“ NK-1-Antagonisten SR140333 gehemmt werden, nicht aber die Freisetzung von IL-1β und MIP-2.
  3. Das N-terminale SP-Fragment SP1-4 war nicht in der Lage die Zytokin-mRNA-Expression und -Freisetzung aller untersuchter Zytokine und MIP-2 zu beeinflussen.[Seite 87↓]
  4. Eine konstitutive mRNA-Expression von CRLR und AM war in den zerebralen Endothelzellen nachweisbar. Zellwände von S. pneumoniae regulierten die mRNA-Expression von CRLR und AM im zeitlichen Verlauf.
  5. CGRP führte allein zu einer Reduzierung der CRLR-mRNA-Expression und zu einer Erhöhung der AM-mRNA-Expression und AM(1-50)-Freisetzung. In Anwesenheit von PCW führte CGRP zu einer weiteren Erhöhung der CRLR- und AM- Expression gegenüber der alleinigen PCW-Stimulation.
  6. Mittels Enzym-Immuno-Assay (EIA) war AM(1-50) Protein nur in Überständen von CGRP- bzw. PCW-stimulierten Proben messbar. In Gegenwart von CGRP war bei den PCW-stimulierten Proben die AM(1-50) Proteinkonzentration signifikant erhöht.
  7. Ein Vergleich zeigte, dass mit verstärkter Freisetzung von AM(1-50) die
    TNF-α- Freisetzung signifikant vermindert war.
  8. Die Detektion von SP war mittels RIA in den Zellkulturüberständen der Kontrollen und in den PCW-Proben nicht möglich. Bei Zugabe von SP1-11 konnten erhöhte Konzentrationen an SP1-7 bei den PCW-Proben gemessen werden, jedoch führte die PCW-Stimulation nicht zu einer vermehrten SP-Spaltung.

In den folgenden Abschnitten sollen die Ergebnisse im Einzelnen diskutiert werden.

4.1 Einfluss von CGRP auf die mRNA-Expression und Proteinfreisetzung der Zytokine TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2

In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass durch CGRP die
PCW-induzierte TNF-α-, IL-1β-, IL-6-, IL-10- und MIP-2-mRNA-Expression in zerebralen Endothelzellen verstärkt wird. Die durch CGRP-verstärkte mRNA-Expression konnte komplett durch den CGRP-1-Rezeptor-Antagonist hCGRP8-37 auf das Niveau der
PCW-induzierten mRNA-Expression reduziert werden. Dagegen konnte die gleichzeitige Gabe von hCGRP8-37 zu PCW die induzierte Zytokin-Expression nicht hemmen. CGRP hingegen hatte allein keinen Einfluss auf die basale Expression und Freisetzung der untersuchten Zytokine und MIP-2.

Im wesentlichen korrelierten die Effekte von CGRP auf die Freisetzung der Zytokine mit den Effekten auf die mRNA-Expression. So zeigte sich eine ca. 50 % höhere Proteinfreisetzung der Zytokine IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2 nach 8 h bzw. von TNF-α nach 4 h Inkubation. [Seite 88↓]Der wohl auffälligste Effekt von CGRP war aber die Inhibition der Freisetzung des bioaktiven TNF-α nach 8 h Inkubation. So waren die gemessenen TNF-α-Konzentrationen in den Zellkulturüberständen um ca. 40 % im Vergleich zu den Proben, die nur mit PCW stimuliert worden sind, reduziert.

Während für IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2 sowie TNF-α nach 4 h die erhöhte Freisetzung durch die Gabe von hCGRP8-37 gehemmt werden konnte, war dies bei der Freisetzung von bioaktiven TNF-α nach 8 h nicht der Fall. Im Gegenteil, es zeigte sich im Trend sogar ein umgekehrter Effekt: der Gehalt an TNF-α lag um ca. 20 % höher als bei Stimulation mit
10 nM CGRP.

Die alleinige Gabe von hCGRP8-37 zu PCW hemmte die induzierte Freisetzung von Zytokinen. Am stärksten war der Gehalt an freiem bioaktiven TNF-α, um ca. 70 %, reduziert.

Interessanterweise gelang es nicht, die mRNA von CGRP in den zerebralen Endothelzellen nachzuweisen. Demzufolge bleibt die Frage offen, warum die direkte Zugabe von h-CGRP8-37 zu PCW die Freisetzung der Zytokine derartig stark hemmt, wenn kein CGRP von den Zellen gebildet wird und auch kein CGRP zugegeben wurde. Vermutet werden kann eine Inhibition des AM-Signals am CRLR-Rezeptor. Mehr dazu soll unter Abschnitt 4.4. diskutiert werden.

Die Aktivierung der zerebralen Kapillarendothelzellen ist ein wesentlicher Schritt in der inflammatorischen Kaskade der Meningitis. Eine wichtige Rolle dabei spielt TNF-α, da es in den zerebralen Endothelzellen gebildet wird und über autokrine Aktivierung u.a. zur Hochregulierung der ICAM-1-Adhäsionsmoleküle führt. Die TNF-α-Produktion der zerebralen Endothelzellen und die daraus folgende entzündliche Aktivierung der Zellen ist die Voraussetzung für die vom PAF-Rezeptor vermittelte Transzytose von Pneumokokken. Später wiederum spielen Adhäsionsmoleküle eine zentrale Rolle bei der Invasion von aktivierten Leukozyten in das ZNS [Springer et al., 1990]. Diese aktivierten Leukozyten tragen wesentlich zum Schaden bei der bakteriellen Meningitis bei [Tuomanen et al., 1989; Weber et al., 1995; Braun et al., 1999]. Auch die Höhe der Leukozytenzahl im Liquor von Patienten im akuten Stadium der bakteriellen Meningitis korrelierte mit der Schwere der chronischen Folgen der Erkrankung [Bohr et al., 1984].

Wie bereits erwähnt, konnte von uns gezeigt werden, dass mit PCW-stimulierte zerebrale Endothelzellen im Vergleich zur Kontrolle einen deutlichen Anstieg der
TNF-α-mRNA-Expression, mit einem Maximum nach 2-4 h, erreichen. Die Expression fiel [Seite 89↓]dann kontinuierlich wieder ab. Der Verlauf der Transkription spiegelt sich in etwa im Verlauf der TNF-α-Freisetzung wider. So konnten wir zeigen, dass die maximale
TNF-α-Konzentration im Überstand unter den gewählten Reaktionsbedingungen in-vitro nach ca. 8 h erreicht wird und danach wieder abfällt [Freyer et al., 1999]. Der Rückgang des biologisch aktiven TNF-Proteins wird unter anderem durch die Bindung an den löslichen TNF-Rezeptor erklärt. In der Literatur findet man als Erklärung häufig, dass es mit der Synthese von TNF-α auch zur Synthese von löslichem TNF-Rezeptor kommt [Aloisi, 1995; Bebo & Linthicum, 1995]. Jedoch erlaubt dieses keinen Rückschluss auf den Rückgang der Höhe des TNF-mRNA-Signals. Es muss zumindest zu einem Teil auch auf eine Herabregulierung („Downregulation“) der Transkription geschlossen werden.

Wie CGRP zusätzlich auf die Regulation der mRNA-Expression Einfluss nimmt, ist bisher völlig unklar. Einen Schlüssel zum Verständnis der Prozesse könnten folgende Beobachtungen sein. Bei Endothelzellen haben de Martin et al. [1993] gefunden, dass durch LPS, TNF-α und IL-1β neben NFκB (Nuclear Factor κB) auch IκB induziert wird. Während NFκB ein transkriptioneller Aktivator ist, wird diese transkriptionelle Aktivierung durch IκB verhindert. Durch eine Assoziation von NFκB mit IκB ist keine Bindung an die DNA mehr möglich. Außerdem vermuten sie auf Grund ihrer Untersuchungen, dass NFκB selbst den Inhibitor IκB im Sinne eines negativen Feedbacks induziert. Drei wesentliche Erkenntnisse über die Signaltransduktion von grampositiven bakteriellen Bestandteilen sind erst kürzlich gemacht worden. So konnten Yoshimura et al. [1999] zeigen, dass grampositive Bestandteile über den Toll-like-Rezeptor 2 erkannt werden und dass durch die Rezeptorinteraktion eine Signaltransduktion erfolgt. Kurz zuvor war von Schumann et al. [1998] gezeigt worden, dass sowohl LPS als auch PCW bei Astrozyten zu einer abhängigen Aktivierung von
MAP-Kinasen führen. Eine Blockierung der MAP-Kinasen Erk-1/-2 oder p38 führte zu einer signifikanten Verminderung der TNF-Produktion, was für einen möglichen Zusammenhang zwischen MAP-Kinase-Aktivierung und TNF-Transkription spricht. Eine mögliche Verbindung zwischen Toll-like-Rezeptoren und MAP-Kinase-Aktivierung über MEKK1 (und NFκB Aktivierung) konnte erst vor kurzem als ECSIT-Protein („ evolutionarily conserved signaling intermdiate in Toll pathways“) von Kopp et al. [1999] identifiziert werden.

Bezüglich der Signaltransduktion von CGRP in zerebralen, isolierten Arteriolen konnte von Edwards et al. [1991] gezeigt werden, dass CGRP zu einer dosisabhängigen
[Seite 90↓]cAMP-Akkumulation führt. Durch Zugabe des Antagonisten hCGRP8-37 konnte die
cAMP-Produktion gehemmt werden. Weiterführende kürzliche Untersuchungen haben ergeben, dass CGRP in „human embryonic kidney“ (HEK) 293 Zellen über den CGRP-1 (CRLR)-Rezeptor zur Aktivierung der cAMP-abhängigen Kasakade >Proteinkinase A (PKA)> MAP-Kinasen, (erk1/2) und p38 zeit- und dosisabhängig führte [Parameswaran et al., 2000]. Das CGRP auch in der Lage ist, auf die Aktivierung bzw. Inhibition des NFκB-Faktors einzuwirken, ist erst kürzlich in Thymozyten von Millet et al. [2000] nachgewiesen worden. Eine Regulation des NFκB-Faktors durch CGRP in den zerebralen Endothelzellen würde erklären, warum es durch zusätzliche Applikation von CGRP zu PCW zunächst zu einer schnellen und verstärkten mRNA-Expression der Zytokine TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2 gegenüber alleiniger Stimulation mit PCW kommt und anschließend zu einer Reduktion, insbesondere der Konzentration an bioaktiven TNF-α im Überstand nach 8 h Inkubation, führt. Es wäre auch eine Erklärung für die nicht-selektive Wirkung von CGRP auf einzelne Zytokine, da für alle untersuchten Zytokine ähnliche „upstream“ liegende regulatorische Sequenzen (z.B. Bindungsstellen für NFκB) beschrieben worden sind [Thompson, 1994]. Es wäre auch vorstellbar, dass bei einem bestimmten Pathomechanismus eine gleichzeitige Induktion verschiedener Gene vorkommt und diese dann gleichzeitig von CGRP durch Änderung des Aktivierungzustandes von NFκB reguliert werden könnten.

Eine andere Erklärung wäre, dass CGRP den löslichen Rezeptor hochreguliert und damit das bioaktive TNF abnimmt.

In weiteren Untersuchungen konnte ich erstmals feststellen, dass die CGRP-1 (CRLR)- Rezeptor mRNA-Expression durch PCW nach 2 h um das 1,8-fache gegenüber der Kontrolle hochreguliert wird, aber um das 2-fache bereits nach 4 h und sogar um das 4-fache nach 6 h im Vergleich zur Kontrolle niedriger lag. Das zeigte zudem, dass die Regulation des CRLR durch PCW zeitlich mit der Induktion der Zytokine zusammenfiel. CGRP stabilisierte in meinen Experimenten die CRLR-Transkription im Vergleich zur Stimulation mit PCW auf einem höherem Niveau.

Auf Grund meiner Ergebnisse scheint CGRP unterschiedliche Rollen in der Entzündungskaskade zu spielen. CGRP wirkt proinflammatorisch in der Frühphase der endothelialen Entzündungsreaktion, später hingegen überwiegt eine immunmodulatorische Aktivität. Da CGRP auch die IL-10-mRNA-Expression und -Freisetzung verstärkt, besteht auch die Möglichkeit, dass durch IL-10 wiederum verstärkt die Freisetzung von TNF-α[Seite 91↓]gehemmt wird. Von IL-10 ist bekannt, dass es in humanen Monozyten über die Inhibition von NFκB die TNF-α-Produktion hemmt [Wang et al., 1995].

Insgesamt gibt es bisher nur wenige Arbeiten, die den Einfluss von CGRP hinsichtlich der Expression und Freisetzung von Zytokinen untersucht haben. In den meisten Arbeiten wurde vor allem die Wirkung von CGRP auf die Freisetzung zu einem Zeitpunkt untersucht, sodass oft kein direkter Vergleich mit meinen Ergebnissen sinnvoll ist.

Ähnlich konnte ein inhibitorischer Effekt von CGRP auf die TNF-α-Freisetzung bei Stimulation mit LPS an kultivierten fetalen Osteoblasten der Ratte bereits nach 3 h, bei kultivierten Peritonialmakrophagen der Maus und bei humanen Vollblutzellen nach 24 h beobachtet werden. Dabei war die TNF-α-Proteinkonzentration zwischen 50 % und 24 % gegenüber alleiniger LPS-Stimulation reduziert. In allen untersuchten Zellsystemen konnte der inhibitorische Effekt durch hCGRP8-37 wieder aufgehoben werden. Einen alleinigen Effekt von CGRP auf die Freisetzung von TNF-α aus Peritonialmakrophagen und Vollblutzellen konnte - ähnlich zu meinen Experimenten - nicht beobachtet werden [Millet & Vignery, 1997; Feng et al., 1997; Monneret et al., 2000].

In keiner Veröffentlichung fand sich bisher ein Hinweis, der eine zunächst erhöhte Freisetzung von TNF-α durch CGRP in Anwesenheit eines inflammatorischen Stimulus beschreibt. Dies steht nicht im Widerspruch zu meinen Ergebnissen, da durch Ermittlung nur eines Zeitpunktes in den meisten Arbeiten dieser Effekt von CGRP möglicherweise nicht erfasst wurde. Wichtig wäre eine Dosis-Zeitkurve zu ermitteln, um die Wirkungsweise von CGRP besser verstehen zu können. Eine wichtige Rolle könnten auch die löslichen
TNF-Rezeptoren dabei spielen. Zielgerichtet wäre daher die Messung dieser freien Rezeptoren sowie die Expression der mRNA ,ergänzt durch die Messung von biologisch und immunologisch aktiven TNF-α.

Einen verstärkenden Effekt von CGRP auf die IL-6-mRNA-Expression [Sakuta et al., 1995] sowie die IL-6-Freisetzung bei LPS-Stimulation konnte auch bei humanen Glioblastom A172 Zellen [Kiriyama et al., 1997], Peritonialmakrophagen der Maus [Tang et al., 1998], der Swiss 3T3 Fibroblast-Zell-Linie [Sakuta et al., 1995], kultivierten fetalen Osteoblasten und bei glatten intestinalen Muskelzellen der Ratte [van Assche et al., 1999] beobachtet werden. Übereinstimmend konnte von Torii et al. [1997] bei Peritonalmakrophagen und der Langerhans Zell-Linie XS52 gezeigt werden, dass die LPS-induzierte IL-10-mRNA-Expression nach 6 h und die IL-10-Freisetzung nach 24 h durch 100 nM CGRP verstärkt [Seite 92↓]wird. Widersprüchlich zu meinen Ergebnissen dagegen ist, dass an den gleichen Zellen unter gleichen Bedingungen ein inhibitorischer Effekt von CGRP auf
IL-1β-mRNA-Expression und IL-1β-Freisetzung beobachtet wurde.

Bei LPS-stimulierten humanen Vollblutzellen scheint nur der inhibitorische Effekt von CGRP auf die TNF-α-Freisetzung nach 24 h relevant zu sein, da CGRP in dem gleichen System keinen Einfluss auf die IL-1β-, IL-6- und IL-8-Protein-Bildung hatte [Monneret et al., 2000]. Dabei ist aber zu berücksichtigen, dass zu diesem Zeitpunkt oft schon die Wirkung von CGRP in einem in-vitro System aufgehoben war, wenn CGRP den Zellen nur einmal zugegeben wurde.

Eine direkte Induktion der untersuchten Zytokine durch CGRP fand sich vorwiegend bei Zell-Linien und Linien immunkompetenter Zellen sowie bei neuroendokrinen Zellen. So z.B. beobachteten Veronesi et al. [1999] an der (BEAS-2B) SV-40/Adenovirus transformierten humanen Bronchialepithelzelllinie eine Induktion der TNF-α-, IL-6- und IL-8-mRNA-Expression bei Stimulation mit 10 und 100 nM CGRP nach 2 h und die Freisetzung nach 6 h sowie Levite [1998] die Sekretion von TNF-α und IL-10 in einer T-Helferzelle-Typ 2 -(Th 2)-Zellkultur. Zell-Linien sind problematisch, da sie im Vergleich zu Primärzellkulturen ihre Eigenschaften nach mehreren Passagen verändern können.

In der Literatur fand sich bezüglich einer direkten Induktion durch CGRP eine Ausnahme. So beschrieb Tran et al. [2000], dass CGRP in verhältnismäßig geringer Dosis von 0,1 nM eine direkte Induktion der IL-8-Synthese in humanen Epithelzellen der Kornea mit einem Maximum nach 1 h bewirkte. Dabei wurde eine direkte Verbindung zwischen dem
CGRP-Rezeptor zur Bindungstelle des Transkriptionsfaktor AP-1 an der Promotorregion für die IL-8-Genexpression diskutiert. Allerdings konnten sie keine Veränderung der MCP-1 und RANTES-Synthese finden. Wir fanden hingegen, dass in zerebralen Endothelzellen CGRP weder die Transkription noch die Freisetzung von MIP-2 stimuliert, hingegen aber der Effekt von PCW in Bezug auf MIP-2-Transkription und -Freisetzung verstärkt wird. Diese könnte in der Schadenskaskade der bakteriellen Meningitis eine Bedeutung haben, da erhöhte
IL-8-Spiegel im Liquor von Patienten gemessen wurden [Spanaus et al., 1997].


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4.2  Einfluss von SP und SR140333 auf die mRNA-Expression und Proteinfreisetzung der Zytokine TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 und MIP-2

Zum ersten Mal wurde mit dieser Arbeit der Einfluss von SP1-11 und SP1-4 auf die Zytokin-Expression bei Stimulation mit PCW von zerebralen Endothelzellen untersucht.

Der Einfluss von SP auf die mRNA-Expression war geringfügig. So führte SP nur zu einer Erhöhung der IL-1β-, IL-6- und MIP-2-mRNA-Expression um ca. 25 % gegenüber der mit PCW-stimulierten Gruppe.

Die zusätzliche Gabe von 1 µM des NK-1-Antagonisten SR140333 zu 10 nM SP führte zu einer Inhibition der IL-10-mRNA-Expression. Dagegen wirkte sich die Zugabe von 10 µM SR140333 zu PCW differenzierter aus. sie führte zu einer Erhöhung der
TNF-α-mRNA-Expression um ca. 80 % sowie zur einer Inhibition der IL-6- und
IL-10-mRNA-Expression um ca. 50-60 %.

Auf der Ebene der Proteinfreisetzung führte die Zugabe von 10 und 100 nM SP nach 8 h nur zu einem erhöhten Gehalt an MIP-2 im Zellkulturüberstand. Die Konzentration an bioaktiven TNF-α in Anwesenheit von 10 nM SP im Überstand dagegen war sogar nach 4 h um ca. 40 % gegenüber der mit PCW-stimulierten Gruppe reduziert.

Während bei Zugabe von 10 µM SR140333 die mRNA-Expression von TNF-α um 80 % erhöht war, war deren Freisetzung um 80 % nach 4 h und noch um 70 % nach 8 h gehemmt. Auf die Freisetzung von IL-6 und IL-10 wirkten sich 10 µM SR140333 ähnlich hemmend wie auf die mRNA-Expression aus. Dagegen wirkte sich die zusätzliche Gabe von 1 µM SR140333 zur Stimulation mit 10 nM SP nur auf die TNF-α-Freisetzung nach 8 h Inkubation hemmend aus. Der TNF-α-Wert war dabei um 40 % gegenüber der Gruppe mit
PCW-Stimulation und 10 nM SP reduziert.

Alleinige Stimulation der Zellen mit 10 und 100 nM SP führten nur zu einer geringfügigen Induktion der IL-6-Synthese. Die IL-6-Synthese war um ca. 5 % höher gegenüber den Zellen, die nicht stimuliert worden sind. Die Synthese der anderen Zytokine blieb durch die alleinige Gabe von SP unbeeinflusst.

Der Einfluss von SP auf die LPS-, TNF-α- oder IL-1β-induzierte Zytokin-Expression ist zahlreich in verschiedenen Zellsystemen untersucht worden. Allen bisher veröffentlichten Beobachtungen ist gemein, dass SP, wenn es Wirkung zeigte, immer verstärkend auf die [Seite 94↓]Stimulanzien-induzierte Zytokin-Synthese wirkte. In der Literatur fanden sich bisher keine Hinweise dafür, dass SP beispielsweise auch vorübergehende inhibitorische Eigenschaften besitzt, so wie ich sie in meinen Experimenten bei der PCW-induzierten TNF-α-Freisetzung nach 4 h festgestellt habe.

SP hat einen verstärkenden Effekt auf die LPS induzierte TNF-α-Sekretion von humanen Monozyten und Makrophagen nach 24 h [Ho et al., 1996; Lee et al., 1994] sowie von Astrozyten in Abhängigkeit von IL-1 nach 6 h [Luber-Narod et al., 1994].

Die Beobachtungen von Marriott & Bost [1998] stimmen mit meinen Ergebnissen insofern überein, dass auch sie keinen Effekt von SP bei der Freisetzung von TNF-α und IL-6 aus kultivierten murinen Makrophagen nach 24 h bzw. 48 h finden konnten.

Ein additiver Effekt von SP auf die IL-6-mRNA-Expression konnte ebenfalls von Lieb et al. [1996] und Palma et al. [1995, 1997] in humanen Monozyten nach 4 h, bei embryonalen Astrozyten sowie in der humanen Astrozytomzellliene U373MG beschrieben werden. Dagegen fanden Derocq et al. [1996] in humanen Monozyten nach 18 h bzw. 24 h durch SP keine verstärkte IL-6-Sekretion.

Ebenfalls zeigte SP keinen Einfluss bei der LPS-induzierten IL-1-Freisetzung aus murinen Makrophagen [Cook et al., 1991].

Eineerhöhte IL-10-Freisetzung, mit einem Maximum nach 24 h,zeigte sich bei Makrophagen und Monozyten, die mit 0,1 nM SP stimuliert worden sind [Ho et al., 1996].

In polymorphkernigen Leukozyten wirkte sich SP bereits nach einer 1 h Inkubation verstärkend auf die TNF-α-induzierte IL-8-Freisetzung aus [Serra et al., 1994].

Die Wirkungsweise von SP scheint in den untersuchten Zellsystemen nicht gleich zu sein, wobei hinsichtlich der Beobachtungszeiträume und der unterschiedlich applizierten SP-Mengen ein Vergleich zwischen den Beobachtungen erschwert wird.

Der NK-1-Antagonist SR140333 ist bezüglich seiner inhibitorischen Fähigkeiten mehrfach geprüft worden.

So haben Dickerson et al. [1998] die Kinetik der Gen-Transkription von TNF-α, IL-1β und IL-6 in der Leber und Milz von Mäusen, die zuvor mit LPS und SR140333 behandelt worden, sind untersucht. Dabei wies SR140333 einen maximalen Hemmungseffekt auf die TNF-α-Transkription in beiden Geweben bereits nach 30 min auf. Nach 2 h jedoch war zwischen der [Seite 95↓]behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe die Genexpression wieder ungefähr gleich. Auch die TNF-α-Konzentration im Serum war entsprechend der Genexpression nach 30 min maximal reduziert. Weitere Beobachtungen der Arbeitsgruppe zeigten einen „Rebound“ der TNF-α-Expression nach 2 h, dieser schlug sich in einen erhöhten TNF-α-Gehalt im Serum nieder. Der TNF-α-Gehalt im Serum, der zwar nach 2 h deutlich höher war als nach 30 min, war dennoch gegenüber der LPS-stimulierten Kontrolle geringer. Keine Wirkung dagegen zeigte SR140333 auf die Kinetik der IL-6 und IL-1β-Gen-Transkription bzw. -Sekretion im gleichen Zeitintervall. Obwohl meine Ergebnisse hinsichtlich des Effektes von SR140333 auf die TNF-α-mRNA-Expression widersprüchlich wirken, denke ich, dass ich mit meinem gewählten Zeitpunkt nach 4 h zur Bestimmung der Genexpression deutlich in der von Dickerson et al. beschriebenen „Rebound-Phase“ lag. Begründet sehe ich meine Annahme durch eine deutlich geringere Konzentration an bioaktiven TNF-α im Zellkulturüberstand nach 4 h und 8 h bei Gabe von 10 µM SR140333 im Vergleich zur TNF-α-Konzentration der PCW-stimulierten Gruppe, wobei die TNF-α-Konzentration nach 8 h wieder geringfügig höher war.

Übereinstimmend mit Dickerson et al. fand auch ich keine Wirkung des NK-1-Antagonisten auf die IL-1β-Synthese. Eine mögliche Erklärung dafür geben Song et al.[2000], da sie zeigen konnten, dass die SP-induzierte IL-1-Synthese von PAM 212 Keratinozyten NK-2-vermittelt ist. Die spezifische Hemmung des NK-2-Rezeptors führte in diesem Fall zur Inhibition von SP-induzierter IL-1-Produktion.

Bei der Astrozytom-Zell-Linie U373MG konnte durch SR140333 eine Inhibition des additiven Effektes von SP bei IL-1β-induzierter IL-6-Synthese beobachtet werden. Dagegen war eine alleinige Hemmung der IL-1β-induzierten IL-6 Synthese durch den NK-1-Blocker nicht möglich [Derocq et al., 1996]. Da stellt sich die Frage, warum in meinen Untersuchungen eine direkte Inhibition der PCW-induzierten IL-6-Synthese durch den NK-1-Blocker möglich war. Eine mögliche Erklärung bieten die Beobachtungen von Cioni et al. [1998]. Sie haben zeigen können, dass Stimulation zerebraler Endothelzellen der Ratte mit je 100 IU/ml TNF-α oder IL-1β zu einer verstärkten Expression und Sekretion von SP führte. Weiterhin konnten sie zeigen, dass eine Vorbehandlung mit Spantide die TNF-α- und
IL-1β-induzierte SP-Detektion an der Oberfläche von Endothelzellen dosisabhängig auf ein Niveau reduzierte, dass unterhalb der unstimulierten Zellen lag. Nicht zur Erklärung passt, dass das Maximum der SP-Sekretion bei 24-48 h lag. Möglich ist, dass PCW ein wesentlich [Seite 96↓]stärkerer Induktor der SP-Sekretion ist, sodass durch die Zugabe von SR140333 endogen produziertes SP am Rezeptor gehemmt wurde. Oder aber es spielt das Alter oder der Rattenstamm eine Rolle: während wir die zerebralen Endothelzellen von 3 Wochen alten Tieren gewannen, benutzte die Arbeitsgruppe Cioni et al. für ihre Experimente die Zellen von 3-5 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten.

In meinen Experimenten fand sich durch alleinige Gabe von SP auf die zerebralen Endothelzellen nur eine geringfügige Induktion der IL-6-Synthese, während die Bildung der anderen untersuchten Zytokine davon unbeeinflusst blieb. In einer viel zitierten, in der Zeitschrift „Science“ veröffentlichten Arbeit, wurde von Lotz et al. [1988] erstmals beschrieben, dass SP allein in der Lage ist, die Synthese von TNF-α, IL-1β und IL-6 in Monozyten anzuregen. Allerdings konnten die Ergebnisse für die IL-1β- und IL-6-Bildung in Monozyten durch wiederholte Experimente von Lieb et al. [1996] nicht bestätigt werden. Als Erklärung für die Unterschiede der Ergebnisse wurde eine Kontamination mit Endotoxin in den von Lotz et al. durchgeführten Experimenten vermutet. Wiederum ist eine direkte Induktion durch SP von IL-1 in Astrozyten [Martin et al., 1992] sowie von IL-6 in der Zell-Linie U373MG [Gitter et al., 1994; Palma et al., 1995; Derocq et al. und Lieb et al., 1996] bisher nicht widerlegt worden.

Entgegen meinen Ergebnissen konnte Viac et al. [1996] einen direkten Einfluss von SP auf die IL-8-Synthese bei einer humanen Keratinozytenkultur mit einen Maximum nach 12 h finden. Allerdings erreichte die IL-8-Sekretion bereits nach 24-48 h wieder den Basalwert. Möglicherweise habe ich in meinen Experimenten eine vorübergehende Wirkung zeitlich nicht erfasst.

Die Inhibition der IL-8-Synthese durch SR140333 wurde bisher nur an der U373MG Zell-Linie mehrfach beobachtet [Derocq et al., 1996; Lieb et al., 1997; Palma & Manzini, 1998].

LPS induziert in den Zellen des proximalen Tubulus der Ratte über den Transkriptionsfaktor Nuclear Factor κappa B (NFκB) die Expression von IL-10 [Rangan et al., 1999]. Auch SP ist über Bindung am NK-1-Rezeptor in der humanen Astrozytom-Zell-Linie U373MG fähig eine Aktivierung von NFκB auszulösen, was u.a. zur Aktivierung der IL-8-Expression führt [Lieb et al., 1997]. Sollte dieser Weg der Signaltransduktion auch für die Expression von IL-10 in zerebralen Endothelzellen gelten, wäre die Inhibition der IL-10-Synthese durch die Gabe von SR140333 in meinen Experimenten erklärbar.


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Übereinstimmend mit meinen Resultaten wurde eine direkte Induktion der IL-10-Synthese in der Literatur bisher nicht beschrieben.

SP 1-4

Der Einfluss des N-terminalen SP1-4-Fragmentes auf die IL-6-Freisetzung aus der humanen Bronchial-Epithel-Zell-Linie (BEAS-2) ist von Veronesi et al. [1999] untersucht worden. Übereinstimmend mit meinen Ergebnissen konnten sie keine Wirkung von SP1-4 auf die IL-6-Freisetzung finden, während sie diese Wirkung wohl aber bei Stimulation mit SP1-11 beobachteten. Die meisten stimulatorischen Effekte von SP auf die Synthese der Zytokine konnten mittels eines NK-Blockers wieder aufgehoben werden, was darauf hindeutet, dass vor allem das C-terminale Ende von SP für die stimulatorischen Signale verantwortlich ist. Meine Ergebnisse zeigen einmal mehr, dass Goetzl et al. [1985]; Pegelow et al. [1989];Werner et al. [1987]; Oehme et al. [1987] & Oehme [1985]; Nieber & Oehme [1987] in ihren Beobachtungen richtig lagen, indem sie behaupteten, dass das N-terminale Ende von SP für die Ausschüttung von Mediatoren und Transmittern verantwortlich ist. Da zerebrale Endothelzellen primär keine Mediatoren oder Transmitter ausschütten, war hier kein anderes Ergebnis zu erwarten.

4.3 Regulation des „Calcitonin Related-Like Receptor“ (CRLR)

Dass PCW die CRLR mRNA-Expression von zerebralen Endothelzellen im zeitlichen Verlauf reguliert, konnte mit dieser Arbeit zum ersten Mal demonstriert werden. Dabei zeigte sich zunächst eine Hochregulierung der CRLR-mRNA um das 1,8-fache gegenüber der Kontrolle nach 2 h, später dann nach 4 und 6 h fällt die mRNA-Expression bis auf ein Viertel der mRNA-Expression im Vergleich zur Expression der Kontrolle. Die Ursache der Reduktion zu späteren Zeitpunkten können wir mit den vorliegenden Ergebnissen nicht erklären. Eine frühe Hochregulation des Rezeptors würde aber gut den frühen proinflammatorischen Effekt von CGRP bei gleichzeitiger Stimulation mit PCW erklären.

Ähnliche Beobachtungen konnten Ono et al. [2000] an einem Maus-LPS-Sepsis-Modell machen, als sie 30 min nach Gabe von LPS die CRLR-mRNA-Expression auf das 2,5-fache gegenüber der Kontrolle hochreguliert sahen, diese danach aber allmählich auf 50 % abfiel, mit dem niedrigsten Level nach 4 h, der dann bis zu 12 h anhielt.


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Meine Ergebnisse werden durch Moreno et al. [1999] in anderen Systemen bestätigt, die gezeigt haben, dass in allen humanen zerebralen Gefäßen - so auch in den Endothelzellen und Kapillargefäßen - der CRLR-Rezeptor exprimiert wird.

Der CRLR-Rezeptor zusammen mit RAMP-1-Protein dient CGRP als funktioneller,
cAMP-gekoppelter Rezeptor in Aortenendothelzellen [Muff et al., 1998], während der RAMP-2/CRLR-Komplex den funktionellen AM-Rezeptor in humanen Endothel- und glatten Muskelzellen bildet [Kamitani et al., 1999]. Dass RDC-1 und L1-Rezeptoren dagegen keine wesentlichen Bindungsstellen für CGRP und AM darstellen [Chakravarty et al., 2000], ist möglich, da beide Rezeptoren zwar in den zerebralen Endothelzellen exprimiert waren, jedoch deren Transkription durch PCW nicht beeinflusst worden ist.

4.4 Adrenomedullin (AM)-mRNA-Expression und Freisetzung

In allen zerebralen Endothelzellproben konnte AM-mRNA-Expression nachgewiesen werden. Die Stimulation mit PCW führte zu einer Erhöhung der AM-Transkription nach 2, 4, 6 h mit einem Maximum um das 1,8-fache gegenüber der Kontrolle nach 2 h.

Bei zusätzlicher Stimulation mit 10nM CGRP zu PCW kam es zu einer weiteren Erhöhung der AM-mRNA-Expression mit einem Maximum nach 4 h auf das 1,8-fache gegenüber der PCW-Gruppe. Nach 6 h fiel die AM-Transkription wieder ab.

Der Rezeptor-Antagonist hCGRP8-37 ist in Kombination mit PCW oder zusätzlicher Stimulation mit CGRP in der Lage, die AM-Transkription gegenüber PCW bzw. PCW mit
10 nM CGRP-Stimulation signifikant zu hemmen.

CGRP allein bewirkte eine gering gesteigerte AM-mRNA-Expression auf das 1,2-fache gegenüber der Kontrolle.

Da die Überstände von den Proben, in denen auch die AM mRNA-Expression bestimmt wurde, bereits durch ELISA- und RIA-Bestimmungen aufgebraucht waren, konnte somit kein AM(1-50) gemessen werden. Demzufolge ist ein direkter Vergleich mit der
AM-mRNA-Expression nicht möglich.

Mit Hilfe eines EIA konnte in Überständen bei den Kontrollen kein AM(1-50) nach 0, 4, 8 und 12 h gemessen werden. Bis zu 8 h nach Stimulation mit CGRP, PCW sowie PCW und CGRP konnte kein AM(1-50) gemessen werden. Erst nach 12 h war AM (1-50) in den zuvor genannten Proben messbar. Dabei waren die AM(1-50)-Konzentrationen um das 3-fache bei [Seite 99↓]Stimulation mit PCW und CGRP im Vergleich zu den PCW-stimulierten Proben erhöht. Die AM(1-50)-Konzentration der PCW-Proben war wiederum um das ca. 2-fache gegenüber der nur mit CGRP stimulierten Proben erhöht.

Gut korrelieren die Ergebnisse mit denen von Serrano et al. [2000], die in zerebralen Blutgefäßen nur eine schwache AM-Immunreaktivität fanden und dabei vermutet haben, dass die AM-Immunreaktivität von perivaskulären Gliazellen stammt. Anders dagegen konnten Isumi et al. [1998a] AM in Aortenendothelzellen messen. Eine Erklärung, warum ich in meinen Kontrollen kein AM gemessen habe, könnte in der Methode liegen. Isumi et al. haben die Endothelzellen lysiert und gereinigt und mit einem RIA mit hoher Empfindlichkeit (unterer fmol Bereich) gemessen, während ich AM(1-50) nur in den Überständen mit einem EIA gemessen habe, dessen linearer Messbereich zwischen 0,1-10 ng/ml lag. Umso erstaunlicher ist, dass die AM(1-50)-Konzentrationen im Überstand der PCW- bzw. PCW und. CGRP-stimulierten zerebralen Endothelzellen im Verhältnis deutlich höher lagen, als bei den von Isumi et al. mit LPS-stimulierten Aortenendothelzellen. Stimulation mit LPS bewirkte nur eine geringfügige Steigerung der AM-Konzentration von aortalen Endothelzellen um das 1,5-fache gegenüber der Kontrolle nach 12 h Inkubation. In der Arbeit von Isumi et al. wurde eine kombinierte Applikation von LPS und CGRP nicht untersucht.

Während in meinem Experimenten AM(1-50) im Zellkulturüberstand nach Stimulation mit
10 nM CGRP messbar war, zeigte sich bei Isumi et al. bei Stimulation mit 1 µM CGRP eine Reduzierung der AM-Konzentration auf 85 % im Vergleich zu den unstimulierten Endothelzellen der Aorta. Vermutlich führte der hohe Konzentrationsunterschied von CGRP zu diesen unterschiedlichem Ergebnissen.

4.4.1 AM (1-50) - TNF-α

Ein möglicher Zusammenhang besteht zwischen der TNF-α-Sekretion und
AM-Konzentration im Überstand von zerebralen Endothelzellen. Im dem von mir durchgeführten Experiment zeigte sich, dass bei Stimulation mit PCW und CGRP die
AM-Konzentration um das 3-fache im Vergleich zu den PCW-stimulierten Proben erhöht war und dies wiederum mit einer Reduzierung des TNF-α-Gehaltes um ca. 20 % einher ging.

Die Ergebnisse stimmen gut mit denen von Kubo et al. [1998] überein, die an der Makrophagenzellliene RAW 267.7 eine Suppression der TNF-α- und IL-6-Sekretion durch AM nach LPS-Stimulation beobachteten. Auch Beobachtungen von Isumi et al. [1999] an der [Seite 100↓]Fibroblasten-Zell-Linie Swiss 3T3 weisen darauf hin, dass AM die Sekretion von TNF-α gegenüber der LPS-Kontrolle um ca. 20 % hemmt.

4.5 SP1-11 und SP1-7 Konzentrationen in Zellkulturüberständen

Cioni et al. haben beschrieben, dass in Primärkulturen von zerebralen Endothelzellen nach Stimulation mit TNF-αund IL-1β es zu einer vermehrten Synthese von SP1-11 kommt. In meinen Untersuchungen dagegen konnte ich nach Stimulation mit PCW keine Bildung von SP erkennen; weder unter Kontrollbedingungen noch nach Stimulation mit PCW war es mir mit Hilfe des RIA möglich, SP1-11 in den Überständen zu detektieren. Es konnte nur dann SP in den Überständen gemessen werden, wenn die Proben mit SP1-11 stimuliert worden waren. Die Stimulation mit PCW und zusätzlicher Gabe von SP führte zu durchschnittlich 70 % höheren Konzentrationen an SP1-11 undSP1-7 in den Überständen - im Verhältnis zu den Proben, die nur mit gleicher Konzentration an SP stimuliert worden sind.

Die Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, dass sich die Dichte der NK-1-Rezeptoren unter dem Einfluss von PCW und SP verändern könnten.

In der Literatur finden sich bisher nur wenige Angaben darüber, wie sich die Dichte der
NK-1-Rezeptoren nach SP oder inflammatorischen Stimulus verändert. Bowden et al. [1994] konnten an Endothelzellen, sowohl in einem in-vivo als auch in einem in-vitro Modell zeigen, dass nach Stimulation mit SP es vorübergehend zu einer Internalisation der oberflächlichen NK-1-Rezeptoren kommt. So fanden sie in Endothelzellen von Venen, 3 min nach Stimulation mit SP, einen maximalen Anstieg, von 107 immunoreaktiven NK-1-Rezeptoren, in den Endosomen je Endothelzellen. Der Basiszustand, ohne Stimulation mit SP, von nur 15 immunoreaktiven NK-1 Rezeptoren in den Endosomen je Endothelzelle, wurde bereits nach
2 h wieder erreicht.

Aller Wahrscheinlichkeit nach bewirkte auch die Stimulation mit PCW eine Niederregulierung der NK-1-Rezeptoren an der Oberfläche der zerebralen Endothelzellen, sodass weniger SP gebunden werden konnte. Einen Hinweis darauf, dass PCW tatsächlich zur Niederregulierung der NK-1-Rezeptoren führen könnte, gibt die Studie von Johnson & Johnson [1991]. Sie haben den Einfluss von TNF-α und IL-1β auf die Dichte der
NK-1-(Subtyp)-Rezeptoren bei der humanen Astrozytom-Zell-Linie UC11 untersucht. Dabei haben sie festgestellt, dass sowohl TNF-α als auch IL-1β eine Niederregulierung der
NK-Rezeptoren bewirkte.


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Diese Effekte waren nach dem Auswaschen der Zytokine reversibel. Ähnliche Beobachtungen wurden auch von Seybold & Abrahams [1995] an Primärkulturen von Neuronen gemacht. Nachdem sie die Neuronen mit 10 nM SP stimuliert hatten, reduzierte sich die Bindungsaffinität für SP um 47 % nach 24 h, die sich wiederum in eine 2fach verstärkte Bindungsaffinität nach 48 h umwandelte. Des Weiteren konnten sie feststellen, dass SP1-7 nicht fähig ist, auf die SP-Rezeptorbindung Einfluss zunehmen.

Die Stimulation mit PCW in meinen Experimenten hatte vermutlich keinen direkten Einfluss auf die Fragmentierung von SP1-11, da die Konzentration an SP1-7 immer ca. einem Drittel der gemessenen SP1-11-Konzentration im Überstand entsprach, egal ob mit PCW und SP oder nur mit SP stimuliert worden war.

Inwiefern der NK-1-Rezeptorantagonist SR140333 durch Blockade der Rezeptoren auf die Regulation der NK-1-Dichte an der Zelloberfäche Einfluss nimmt, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht klar. Lediglich war festzustellen, dass sich durch Gabe von SR140333 das Verhältnis der Konzentrationen von SP1-11 zu SP1-7 veränderte. So war die Konzentration von SP1-11 bei Stimulation mit 10 nM SP und 1 µM SR140333 nur um ca. 43 % gegenüber der Konzentration von SP1-7 erhöht, während bei zusätzlicher Gabe von PCW (PCW+ 10 nM SP + 1 µM SR140333) die SP1-11-Konzentration gegenüber der SP1-7 Konzentration um
ca. 300 % erhöht war.

Es bleibt weiterhin ungeklärt, in welcher Art und Weise SP-Endopeptidase (SPE) und/oder Endopeptidase-24,11 die Spaltung von SP1-11 nach der 7. Aminosäure (Phenylalanin) bewirken. Die Frage, die sich hierbei für mich stellt ist, ob nur gebundenes SP gespalten werden kann oder ungebundenes SP.

Die Rolle von SP1-7 bei der Induktion der Zytokine von zerebralen Endothelzellen kann nur vermutet werden. Wahrscheinlich ist die Rolle ähnlich der von SP1-4, da SP1-7, wie SP1-4 ein N- terminales SP-Fragment ist und dieses wiederum keinen Einfluss auf die Expression der untersuchten Zytokine hatte.


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02.09.2004