Darstellung und Charakterisierung neuartiger, chiraler, basischer Benzilsäureester mit anticholinerger Wirkung

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Pharmazie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Jana Selent

geboren am 2. Juli 1973 in Treuenbrietzen

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Berthold Göber
2. PD Dr. habil. Wolfgang Brandt

Tag der mündlichen Prüfung: 19. November 2004

Zusammenfassung

Basische Benzilsäureester stellen mit ihrer ausgeprägten anticholinergen Wirksamkeit potenzielle Arzneistoffe zur Behandlung der Harninkontinenz, der Ulkuserkrankung und des Morbus Parkinson dar. Von besonderem Interesse sind Benzilsäurevertreter, die neben anticholinergen auch dopaminerge Effekte aufweisen. Wegen ihrer dualistischen Wirkung könnte sie eine neue Klasse von Antiparkinsonica begründen. Aufgrund der vielfältigen Funktionen von Muscarinrezeptoren treten bei wenig selektiv wirksamen Arzneistoffen atropinartige Nebenwirkungen auf. Mit der Entwicklung von Verbindungen, die eine erhöhte muscarinerge Subtypenselektivität besitzen, lassen sich Nebenwirkungen reduzieren.

Ziel der Arbeit war eine Wirkungsoptimierung chiraler N-Methyl-4-piperidyl benzilate durch Variation von stereochemischen Parametern und Einführen elektronisch verschiedenartiger Substituenten in die aromatischen Ringe. In Radioligand-Bindungsstudien an M1- bis M3-Rezeptoren wurden die Auswirkungen der sterischen und strukturellen Variationen untersucht. Die Ergebnisse der Bindungsstudien zeigen, dass sich Affinität und Subtypenselektivität durch die absolute Konfiguration des stereogenen Zentrums und die Art der Kernsubstitution modifizieren lassen.

Mit Hilfe von Molecular Modelling ist es gelungen, auf Basis der experimentellen Bindungsdaten ein aussagekräftiges Rezeptormodell für N-Methyl-4-piperidyl benzilate zu entwickeln. Sowohl die Affinitätsunterschiede enantiomerer Benzilate als auch die Unterschiede der Rezeptorsubtypenselektivität werden durch das Rezeptormodell umfassend erklärt.

Eigene Schlagwörter: chirale Benzilsäurederivate, Muscarin-Antagonisten, Muscarin-Rezeptoren (M1, M2, M3), Molecular Modelling

Abstract

Basic substituted benzilic esters with distinctive anticholinergic effects are potential drugs for the treatment of urinary incontinence, duodenal and gastric ulcers and Parkinson disease. Derivatives of benzilic esters, exhibiting a combination of anticholinergic and dopaminergic effects, are of special interest because, as a consequence of their dualistic effect, they are in a position to form a new class of Antiparkinson drugs. As muscarinic receptor subtypes possess a large variety of functional properties, drugs which show less selectivity on muscarinic receptors exhibit atropine-like side effects. A reduction of these side effects may be achieved by the development of more selective anticholinergic compounds.

The objective was to optimise the effect of N-Methyl-4-piperidyl benzilates through a variation of sterical parameters and the introduction of electronically differentiated substituents within the aromatic rings. The effect of sterical and structural variations was investigated in radioligand binding studies on muscarinic receptors (M1 – M3). The results of these binding studies reveal that a modification of affinity and selectivity can be achieved by varying the absolute configuration of the stereogenic center and the properties of the substitution of the aromatic system.

The development of a relevant model of the receptor ligand complex for N-Methyl-4-piperidyl benzilates was achieved by molecular modelling on the basis of experimental binding studies. Both the diverse affinity of enantiomeric benzilic esters and the subtype selectivity on muscarinic receptors are comprehensively explained by this model.

Keywords: chiral benzilic acid derivatives, muscarinic antagonists, muscarinic receptors (M1, M2, M3), molecular modelling

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung und Problemstellung
• 2.  Theoretischer Teil
  • 2.1. Die Leitstruktur N-Methyl-4-piperidyl benzilat und verwandte Verbindungen mit anticholinerger Wirkung
  • 2.2.  Stereoselektive Darstellung chiraler α-Hydroxyester – eine Literaturübersicht
    • 2.2.1. Allgemein
    • 2.2.2.  Prelog-Regel
    • 2.2.3. Chirale α-Ketooxazoline
    • 2.2.4. Vicinale cis-Aminoindanole
    • 2.2.5. (-)-Menthyl phenylglyoxylate
    • 2.2.6. (-)-8-Phenylmenthol als chirales Auxiliar
    • 2.2.7. Derivate des (-)-8-Phenylmenthol
    • 2.2.8. Zusammenfassung
• 3.  Untersuchungen und Ergebnisse
  • 3.1. Systematische Untersuchung der Darstellung von optisch aktiven Benzilsäureestern
    • 3.1.1. Einleitung
    • 3.1.2. Untersuchungen zur Synthese
      • 3.1.2.1. Synthese der Vorstufen
      • 3.1.2.2. Stereoselektive Addition des Grignard-Reagenzes
      • 3.1.2.3.  Darstellung der enantiomeren Zielstrukturen
      • 3.1.2.4. Darstellung racemischer N-Methyl-4-piperidyl benzilate
      • 3.1.2.5. Diskussion
    • 3.1.3. Kristallisationsmethoden
      • 3.1.3.1. Trennung der Enantiomere durch physikalische Methoden
      • 3.1.3.2. Chemische Trennung der Enantiomere über Diastereomere
      • 3.1.3.3. Diskussion
    • 3.1.4. Chromatographische Methoden
      • 3.1.4.1.  Direkte Racemattrennung an chiralen stationären Phasen
      • 3.1.4.2. Indirekte Racemattrennung an achiraler stationärer Phase
      • 3.1.4.3. Diskussion
    • 3.1.5.  Enzymatische Umsetzung
      • 3.1.5.1. Vorversuche - Enzymscreening
      • 3.1.5.2. Enantioselektivität der enzymatischen Reaktion
      • 3.1.5.3. Diskussion
  • 3.2.  Analytische Charakterisierung
    • 3.2.1. Polarimetrie
    • 3.2.2.  Circulardichroismus (CD) und Optische Rotationsdispersion (ORD)
    • 3.2.3.  Kernresonanzspektroskopie
    • 3.2.4. Kapillarelektrophorese
    • 3.2.5. Röntgenkristallstrukturanalyse
    • 3.2.6.  Diskussion
  • 3.3. Stabilitätsuntersuchungen: Racemisierung/Epimerisierung
    • 3.3.1. Stabilität in wässriger Lösung
    • 3.3.2. Stabilität von N-Methyl-4-piperidyl-, (-)-Menthyl- und (-)-8-Phenylmenthyl benzilaten im schwefelsauren Milieu
    • 3.3.3. Diskussion
  • 3.4.  Radioligand-Bindungsstudien an Muscarinrezeptorsubtypen
    • 3.4.1. Untersuchungen
    • 3.4.2. Diskussion
  • 3.5.  Molecular Modelling
    • 3.5.1. Einleitung
    • 3.5.2.  Methoden
      • 3.5.2.1. Modelling der Rezeptoren
      • 3.5.2.2.  Dockingstudien
      • 3.5.2.3. Energieoptimierung des Rezeptor-Ligand-Komplexes
    • 3.5.3.  _Ergebnisse
      • 3.5.3.1.  _{Qualitative Auswertung}
      • 3.5.3.2. Quantitative Auswertung
    • 3.5.4. Diskussion
• 4.  Experimenteller Teil
  • 4.1. Allgemeine Bemerkungen
    • 4.1.1. Geräte
    • 4.1.2.  Lösungsmittel und Chemikalien
  • 4.2.  Vergleichssubstanzen
  • 4.3.  Allgemeine Synthesevorschriften und dargestellte Verbindungen
    • 4.3.1. Darstellung enantiomerenreiner substituierter N-Methyl-4-piperidyl benzilate
      • 4.3.1.1. Darstellung substituierter Phenylglyoxylsäuren
      • 4.3.1.2.  Darstellung der (-)-8-Phenylmenthylester der unsubstituierten/substituierten Phenylglyoxylsäure
      • 4.3.1.3.  Darstellung der (-)-8-Phenylmenthyl benzilate
      • 4.3.1.4. Darstellung der substituierten (R)-/(S)-Benzilsäure
      • 4.3.1.5.  Darstellung der (R)- und (S)-Methyl benzilate
      • 4.3.1.6.  Darstellung der enantiomeren Zielstrukturen: (R)-/(S)-N-Methyl-4-piperidyl benzilate
    • 4.3.2. Darstellung der Racemate substituierter N-Methyl-4-piperidyl benzilate
      • 4.3.2.1. Darstellung racemischer Methyl benzilate
      • 4.3.2.2. Darstellung racemischer N-Methyl-4-piperidyl benzilate
      • 4.3.2.3.  Darstellung substituierter (-)-Menthyl (R,S)-benzilate
    • 4.3.3. Kristallisationsmethoden
      • 4.3.3.1. Fraktionierte Kristallisation
      • 4.3.3.2. Vorzugskristallisation
  • 4.4. Analytische Methoden
    • 4.4.1. UV-spektroskopische Untersuchungen
    • 4.4.2. Kernresonanzspektroskopische Untersuchungen
    • 4.4.3. Massenspektrometrische Untersuchungen
    • 4.4.4. Chromatographische Methoden
      • 4.4.4.1. Analytische Dünnschichtchromatographie
      • 4.4.4.2.  Analytische HPLC
      • 4.4.4.3. Semipräparative HPLC
      • 4.4.4.4. Präparative Säulenchromatographie
    • 4.4.5. Polarimetrie
    • 4.4.6. Circulardichroismus (CD) und Optische Rotationsdispersion (ORD)
    • 4.4.7. Kapillarelektrophorese
  • 4.5. Enzymatische Untersuchungen
  • 4.6.  Radioligand-Bindungsstudien an Muscarinrezeptoren
• 5.  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
  • Verzeichnis der verwendeten Substanzbezeichnungen (Teil 1)
  • Verzeichnis der verwendeten Substanzbezeichnungen (Teil 2)
  • Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
• Danksagung
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Enantiomere Zielstrukturen der N-Methyl-4-piperidyl benzilate
• Tab. 2: Synthese substituierter Phenylglyoxylsäuren Ib
• Tab. 3: (-)-8-Phenylmenthyl glyoxylate
• Tab. 4: HPLC-Chromatogramme zur Bestimmung der enantiomeren Reinheit von (S)-Methyl 3-methoxybenzilat (61) (Methode A)
• Tab. 5: Resultate der asymmetrischen Induktion für ausgewählte Vertreter
• Tab. 6: Schmelzpunkte der Racemate und Enantiomere von N-Methyl-4-piperidyl benzilaten
• Tab. 7: Racemattrennung mittels Substanzfamilien
• Tab. 8: Fraktionierte Kristallisation mit Weinsäurederivaten (O,O´-Dibenzoylweinsäure/ O,O´-Di-p-toluoylweinsäure 1:10)
• Tab. 9: Analytische Trennung strukturverwandter Verbindungen
• Tab. 10: Direkte Racemattrennung von 3-Methoxybenzilsäure (52), Methyl 3-methoxy-benzilat (69), N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (79)
• Tab. 11: Retentionszeiten und chromatographische Auflösung R_S von enantiomeren N-Methyl-4-piperidyl benzilaten
• Tab. 12: Elutionsreihenfolge strukturell verwandter Benzilate
• Tab. 13: Diastereomerentrennung durch RP-HPLC
• Tab. 14: Enzymatische Umsetzung von racemischen Benzilsäurederivaten
• Tab. 15: Resultate der enzymatischen Hydrolyse
• Tab. 16: Spezifische Drehung enantiomerer Benzilate
• Tab. 17: Chemische Verschiebungen relevanter Substituentenprotonen von (-)-8-Phenyl-menthyl benzilaten
• Tab. 18: Chemische Verschiebungen relevanter Substituentenprotonen von (-)-Menthyl benzilaten
• Tab. 19: Konformationen der N-Methyl-4-piperidyl benzilate
• Tab. 20: Untersuchungen zur Racemisierung von (R)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxy-benzilat (15) im pH-Bereich von 2 bis 9 bei einer Temperatur von 80°C
• Tab. 21: Verlauf der Racemisierung von (R)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxy- benzilat (15) im schwefelsauren Milieu
• Tab. 22: Verlauf der Epimerisierung von (-)-Menthyl 3,4-dimethoxybenzilat (Peak 1)* A und (-)-8-Phenylmenthyl (S)-3-methoxybenzilat B im schwefelsauren Milieu
• Tab. 23: pKi-Werte an den Muscarinrezeptorsubtypen
• Tab. 24: Aminosäuren der Bindungstasche des M1-, M2- und M3-Rezeptors
• Tab. 25: Berechnete Wechselwirkungsenergien (WWE) der Rezeptor-Ligand-Komplexe
• Tab. 26: Bezifferung der Phenylglyoxylsäuren
• Tab. 27: Bezifferung der (-)-8-Phenylmenthyl phenylglyoxylate
• Tab. 28: Bezifferung der S-konfigurierten* (-)-8-Phenylmenthyl benzilate
• Tab. 29: Bezifferung der R-konfigurierten* (-)-8-Phenylmenthyl benzilate
• Tab. 30: Bezifferung der (R)-/(S)-Benzilsäure
• Tab. 31: Bezifferung der (R)-/(S)-Methyl benzilate
• Tab. 32: Bezifferung der (R)-/(S)-N-Methyl-4-piperidyl benzilate
• Tab. 33: Bezifferung der racemischen (R,S)-Methyl benzilate
• Tab. 34: Bezifferung der racemischen (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl benzilate
• Tab. 35: Synthetisierte (-)-Menthyl (R,S)-benzilate
• Tab. 36: Fließmittelgemische der Dünnschichtchromatographie
• Tab. 37: Detektionsmittel der Dünnschichtchromatographie

Bilder

• Abb. 1: Anticholinerg wirksame Verbindungen
• Abb. 2: α-Hydroxyester mit stereogenem Zentrum
• Schema 1: Angriff des Nucleophils an das Carbonyl-C-Atom des Phenylglyoxylates
• Schema 2: Chirale Information im Ester
• Schema 3: Prelog-Regel, S: small, M: medium, L: large
• Schema 4: Addition von Grignard- und Organolithium-Reagenzien an α-Ketooxazoline
• Schema 5: Reaktionsmechanismus von Aryllithium an α-Ketooxazoline und daraus resultierende absolute Konfiguration
• Abb. 3: Chirale Oxazoline
• Schema 6: Stereoselektive Addition an vicinalen cis-Aminoindanolen [19]
• Schema 7: Symmetrische und unsymme-trische Organozinkverbindung
• Diagramm 1: Einfluss des Grignard-Reagenzes und des ZnX₂-Zusatzes auf den Diastereomerenüberschuss (de) der Additionsreaktion an (-)-Menthyl phenylglyoxylat in Tetrahydrofuran bei -78°C [20] (s. Schema 8)
• Schema 8: Übergangszustand - Angriff des organischen Restes des unsymmetrischen Zinkorganyls von der si-Seite (R: Alkyl)
• Abb. 4: Chirale Auxiliare
• Abb. 5: Chirale Phenylmenthyl glyoxylate
• Abb. 6: Diastereomerenzusammensetzung in Abhängigkeit von modifizierten Menthyl-derivaten bei der En-Reaktion an Glyoxylaten
• Abb. 7: Konformationen des (-)-8-Phenylmenthols
• Schema 9: Darstellung von R- und S-konfigurierten Benzilsäureestern am Beispiel des 3-Methoxybenzilsäuresters IIIa und IIIb
• Schema 10: Mögliche Abbauwege von Phenyl-glyoxylsäuren
• Schema 11: α,α-Dichlormethyl methyl ether zur Darstellung von Säurechloriden der α-Ketosäuren
• Abb. 8: (-)-Menthyl- und (-)-8-Phenylmenthyl benzilate
• Abb. 9: Reaktionsmechanismus zur Darstellung der S-konfigurierten Benzilsäureester IIIa(Methode A, Schema 9)
• Schema 12: Nachfolgende Syntheseschritte zum N-Methyl-4-piperidyl benzilat am Beispiel der 3-Methoxy-Verbindung
• Abb. 10: Binäres Phasendiagramm eines Konglomerates (A) und racemischer Verbindungen (B) und (C)
• Abb. 11: Modifikationsmöglichkeiten chiraler Benzilate
• Abb. 12: HPLC-Chromatogramme nach ein- (A), zwei- (B) und dreimaliger (C) fraktionierter Kristallisation von (+)-(R)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (15) mit einer Mischung aus Weinsäurederivaten
• Abb. 13: Chirale Oxazoline
• Abb. 14: HPLC-Chromatogramm von (-)-Menthyl  (R,S)-3,4-dimeth-oxy benzilat (85)
• Schema 13: Enzymatische Hydrolyse von Benzilsäureestern
• Schema 14: Enzymatische Umsetzung von Benzilsäurederivaten
• Abb. 15: Enantioselektivität der PLE in Abhängigkeit vom Substrat
• Abb. 16: CD-Spektren von (R)- und (S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-tert-butyl-benzilat (1/2)
• Abb. 17: CD- und ORD-Kurven von (S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-butoxybenzilat (6), [θ] und [φ] (Grad⋅cm2⋅decimol-1)
• Abb. 18: Anisotropie-Effekt als Ursache der Hochfeldverschiebung für R-konfigurierte Benzilate am Beispiel des (-)-8-Phenylmenthyl (R)-4-tert-butylbenzilates
• Abb. 19: Enantiomerentrennung von (+)-(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat mittels CE
• Schema 15: syn- und anti-Konformere
• Schema 16: Übersicht zu den Konformationen des N-Methyl-4-piperidylrings
• Abb. 20: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 4-tert-butylbenzilat (72)
• Abb. 21: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 4-trifluormethylbenzilat (77)
• Abb. 22: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 4-trifluormethoxybenzilat (76)
• Abb. 23: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 3-methoxybenzilat (79)
• Abb. 24: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 3,5-dimethoxybenzilat (78)
• Abb. 25: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 4-methylsulfonylbenzilat (80)
• Schema 17: Säurekatalysierte Racemisierung über ein Carbokation
• Diagramm 2: Racemisierung von Benzilaten nach 1 h Schütteln (Raumtemperatur) und zehnminütigem Erwärmen (70°C)
• Diagramm 3: pKi-Werte der R- und S-Enantiomere an den muscarinergen Rezeptor- subtypen
• Diagramm 4: M3/M1-Affinitätsverhältnisse enantiomerer Benzilate
• Diagramm 5: M3/M2-Affinitätsverhält-nisse enantiomerer Benzilate
• Abb. 26: pKi-Werte der Race-mate 77 und 79
• Abb. 27: M₂- und M₃-Präferenz basischer Benzilsäure-ester
• Abb. 28: M1-Rezeptor mit bindungsrelevanten Aminosäuren (modifiziert nach [98])
• Abb. 29: Extrazelluläre Sicht auf M1-Rezeptor mit Ligand (H: Helix)
• Abb. 30: Modellierter M1-Rezeptor mit dargestellter Bindungstasche
• Abb. 31: Bindung von (S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-methylsulfonylbenzilat an den M1-Rezeptor. Rot markiert sind die Aminosäuren, die innerhalb der Rezeptorsubtypen (M1, M2 und M3) nicht konserviert vorliegen. Die Wasserstoffbrücken sind durch punktierte Linien dargestellt.
• Abb. 32: Bindung von (R)-N-Methyl-4-piperidyl 4-methylsulfonylbenzilat an den M1-Rezeptor
• Abb. 33: Wechselwirkungsenergien (WWE) für S- und R-enantiomere Benzilate an M₁-, M₂- und M₃-Rezeptoren
• Diagramm 6: Korrelation zwischen experimentellen pKi-Werten (pKi(exp)) und berechneten Wechselwirkungssenergien (WWE)