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3.  Untersuchungen und Ergebnisse

3.1. Systematische Untersuchung der Darstellung von optisch aktiven Benzilsäureestern

3.1.1. Einleitung

Die Darstellung racemischerkernsubstituierter Benzilate sowie deren Strukturoptimierung wurde aufgrund ihres interessanten pharmakologischen Profils ausführlich untersucht [3]. Eine weitere Optimierung und Modifizierung der Wirkqualität sowie neue Erkenntnisse zum Bindungsmechanismus könnten durch Einsatz der Enantiomere erhalten werden. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, chirale N-Methyl-4-piperidyl benzilate mit unterschiedlichem Substitutionsmuster (Tab. 1, Kap. 1) in hoher enantiomerer Reinheit darzustellen.

Um diese Verbindungen in der angestrebten Qualität zu erhalten, wurden verschiedene Verfahren systematisch untersucht:

3.1.2. Untersuchungen zur Synthese

Stereoselektive Synthesen von enantiomeren Benzilsäureestern gelingen bisher ausschließlich über Addition von Metallorganylen an chiralen α-Ketoestern. Den größten Einfluss auf die Selektivität der diastereofacialen Addition hat die chirale Information im alkoholischen Rest. Zahlreiche chirale Auxiliare wurden in der Vergangenheit erprobt. Als universelles und effizientes Auxiliar kann (-)-8-Phenylmenthol eingesetzt werden (Kap. 2.2.6). Für chirale Benzilsäuren etablierte Kiesewetter eine stereoselektive Synthese unter Verwendung von (-)-8-Phenylmenthol [6, 26]. Diese soll Gegenstand weiterer Untersuchungen zur Synthese der Zielstrukturen sein (Schema 9). Durch stereoselektive Grignard-Addition von substituiertem bzw. unsubstituiertem Phenylmagnesiumbromid an Phenylglyoxylsäureester (Ia, Ib) werden die diastereomeren Benzilsäureverbindungen (IIIa, IIIb) erhalten (Schema 9).


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Schema 9: Darstellung von R- und S-konfigurierten Benzilsäureestern am Beispiel des 3-Methoxybenzilsäuresters IIIa und IIIb

3.1.2.1. Synthese der Vorstufen

Die substituierte Phenylglyoxylsäure Ib ist über zwei Synthesewege zugänglich. Die Verfügbarkeit der im Handel erhältlichen Ausgangsstoffe bestimmt dabei den Synthese-weg. Durch Acylierungsreaktion (Weg I)des substituierten Aromaten oder Oxidations-reaktion (Weg II) des kernsubstituierten Acetophenons kann Ib dargestellt werden.

Friedel - Crafts -Acylierungsreaktion (Weg I). Diese Acylierungsreaktion ist eine häufig genutzte Synthesemethode zur Darstellung von Aryl alkyl ketonen. Unter Verwendung von Ethoxalylchlorid lassen sich α-Ketoester darstellen. Die Synthesevorstufen Ib (20, 21, 22, 23, 24, Tab. 2) konnten auf diesem herkömmlichen Weg hergestellt werden. Die Acylierungsreaktionen wurden in Dichlormethan oder Dichlorethan durchgeführt. Als Lewis-Säure wurde Aluminiumchlorid eingesetzt, welches mit dem Carbonylsauerstoff von Ethoxalylchlorid einen hinreichend elektrophilen Komplex bildet. Da Aluminiumchlorid die entstehende Carbonylverbindung gleichfalls komplexiert, wurden [Seite 34↓]äquimolare Mengen bzw. ein leichter Überschuss Lewis-Säure eingesetzt. Aufgrund der Substituenteneinflüsse (+M- oder +I-Effekte) werden vor allem die ortho- und para-Position des aromatischen Systems für den elektrophilen Angriff aktiviert. Aufgrund sterischer Effekte erhält man bei der Acylierung des aromatischen Systems vorwiegend das para-Substitutionsprodukt. Isomere Verbindungen wurden bei den entstandenen Ethyl glyoxylaten beobachtet.

Tab. 2: Synthese substituierter Phenylglyoxylsäuren Ib

Verbindung Ib

R

Weg

19

II

20

I

21

I

22

I

23

I

24

I

Problematisch gestaltete sich die Reinigung der Ethyl phenylglyoxylate wegen isomerer Verunreinigungen. Durch Säulenchromatographie konnte in einigen Fällen eine Trennung erzielt werden. Alternativ wurde der Ethylester verseift und die Reinigung durch Kristallisation über die sehr gut kristallisierenden Phenylglyoxylsäuren vollzogen. Es wurden überwiegend moderate Ausbeuten von 50 bis 70 % der Theorie (2 Stufen: Acylierung und Esterhydrolyse) erzielt. Geringe Ausbeuten von 20 % wurden z. B. bei 4-[Seite 35↓]Trifluormethoxyphenylglyoxylsäure (24) gefunden, was sich folgendermaßen erklären lässt: Zum einen deaktiviert der Trifluormethoxy-Substituent (-I-Effekt > +M-Effekt) die para-Position für das angreifende elektrophile Reagenz [27, 28]. Zum anderen weist das

erhaltene Endprodukt 24 im Vergleich zum Ethylester erheb-liche Stabilitätsprobleme auf. Carbonsäuren, die in α-Stellung eine elektronenziehende Gruppe (Carbonylgruppe) besitzen, neigen zur Decarboxylierung (A, Schema 10). Der Trifluormethoxy-Subs-tituent in para-Stellung von 24 verstärkt diesen Effekt mit seinen elektronenziehenden Eigenschaften und könnte eine Erklärung für die gesteigerte Instabilität sein.

Schema 10: Mögliche Abbauwege von Phenyl-glyoxylsäuren

Oxidationsreaktion (Weg II, Tab. 2). Durch Oxidation der in Nachbarschaft zur Carbonylgruppe befindlichen Methylgruppe des Acetophenons mit Kaliumpermanganat konnte Verbindung 19 erhalten werden. Entsprechend den Reaktionsbedingungen von Pelzer [29] wurde ein Produkt mit einem Schmelzpunkt von 169°C erhalten. Dünn-schichtchromatographische Untersuchungen ergaben eine einheitliche Zusammensetzung des Produktes. Durch seinen Schmelzpunkt wurde es als tert-Butylbenzoesäure identifiziert. Vermutlich geht dieses Produkt durch oxidative Decarboxylierung aus dem entsprechenden α-Ketoester hervor (A und C, Schema 10). Der entstandene Benzaldehyd wird sofort durch Kaliumpermanganat weiter zur Benzoesäure oxidiert. Die Reaktionsbedingungen wurden deshalb modifiziert. Statt 5 Moläquivalenten wurden 2 Moläquivalente der oxidierenden alkalischen Kaliumpermanganat-Lösung pro Moläquivalent Acetophenon verwendet und die Reaktionszeit verlängert. Unter diesen Reaktionsbedingungen wurden 48 % 4-tert-Butylphenylglyoxylsäure mit einem Schmelzpunkt von 69-71°C erhalten. Saure organische Verunreinigungen konnten zuvor durch fraktionierte Extraktion der wässrigen Phase bei schwach saurem pH-Wert entfernt werden.


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Zur Darstellung des jeweiligen (-)-8-Phenylmenthyl-/(-)-Menthyl glyoxylates (IIa/IIb, Schema 9, Tab. 3) wird zunächst das Phenylglyoxylsäurechlorid gebildet. Ottenheijm nutzte α,α-Dichlor-methyl methyl ether zur Darstellung von Säurechloriden der α-Ketosäuren. Die gebräuchlichen Reagenzien wie Phos-phortrichlorid, Thionylchlorid, Oxalyl-chlorid erwiesen sich als nicht zweckmäßig und lieferten keine bis niedrige Ausbeuten der α-Ketosäure-chloride [30]. Die Verbindungen 25 bis 29 konnten gewonnen werden, indem die entsprechend substituierte/unsubstituierte Phenylglyoxylsäure zuerst mit einem Moläquivalent α,α-Dichlormethyl methyl ether versetzt wurde (Schema 11).

Tab. 3: (-)-8-Phenylmenthyl glyoxylate

Verbindungen IIa/IIb

R

25

H

26

27

28

29

Nach Abschluss der Reaktion wurde ohne Berücksichtigung des entstandenen Methyl formiats das so erhaltene Säurechlorid zu einer Lösung von (-)-8-Phenylmenthol bei 0°C zugetropft. Nach der Aufarbeitung des Reaktionsgemisches konnte der nicht umgesetzte Alkohol und die durch Hydrolyse aus dem Säurechlorid entstandene Phenylglyoxylsäure problemlos durch Säulenchromatographie entfernt werden.

Schema 11: α,α-Dichlormethyl methyl ether zur Darstellung von Säurechloriden der α-Ketosäuren


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Die Phenylmenthyl glyoxylate (IIa/IIb) wurden in Abhängigkeit von der Qualität des Ausgangsstoffes in guten Ausbeuten bis zu 80 % der Theorie erhalten. Große Mengen an nicht umgesetztem Ausgangsstoff und ein Gemisch aus nicht identifizierbaren Produkten wurden bei dem Versuch der Umsetzung von 4-Dimethylaminophenylglyoxylsäure (23) mit α,α-Dichlormethyl methyl ether beobachtet. Es ist anzunehmen, dass sich eventuell das Hydrochlorid der 4-Dimethylaminophenylglyoxylsäure gebildet hat, welches aufgrund seiner schlechten Löslichkeit in Dichlormethan nicht zur Reaktion kam und/oder das entstandene Säurechlorid nicht stabil ist. Die Verwendung von Thionylchlorid in Dichlormethan, eine Methode, nach der Ying [31] aus Dimethylaminobenzoesäure das Säurechlorid erhielt, führte ebenfalls nicht zum Erfolg. Bei beiden Methoden wurde durch dünnschichtchromatographische Untersuchungen ein ähnliches Produktspektrum gefunden. Eine mögliche Erklärung ist die Instabilität von α-Ketoestern im sauren Milieu, welche unter diesen Bedingungen zur Decarbonylierung neigen können (B, Schema 10).

4-Trifluormethoxyphenylglyoxylsäure (24) zeigte keine Reaktion zum Phenyl-menthylester. Durch die bereits bei der Synthese festgestellte Instabilität von Verbindung 24, war die Qualität des Ausgangsstoffes gemindert. Unter den gegebenen Reaktions-bedingungen wurde eine weiterer Abbau von 24 beobachtet (B, Schema 10).

3.1.2.2. Stereoselektive Addition des Grignard-Reagenzes

Die absolute Konfiguration des im Verlauf der Reaktion neu entstehenden stereogenen Zentrums von IIIa/IIIb (Abb. 8, Schema 9) kann durch Wahl der entsprechenden Ausgangsstoffe kontrolliert werden. Die S-Konfiguration wird durch Zugabe des substituierten Grignard-Reagenzes zum unsubstitu-ierten Phenylglyoxylsäureester (IIa) (Methode A, Schema 9), die R-Konfiguration dagegen durch Zugabe des unsubstituierten Grignard-Reagenzes zum substituierten Phenylglyoxylsäureester (IIb) erhalten (Methode B, Schema 9) [26].

Abb. 8: (-)-Menthyl- und (-)-8-Phenylmenthyl benzilate

Whitesell zeigte, dass das Grignard-Reagenz von der si-Seite [Seite 38↓]des (-)-8-Phenyl menthyl phenylglyoxylates (IIa/IIb) angreift [21]. Für die Addition von 3-Methoxyphenylmagnesiumbromid an (-)-8-Phenylmenthyl phenylglyoxylat (IIa) (Methode A, Schema 9) findet die si-Seiten-Addition unter der Voraussetzung statt, dass beide Carbonylgruppen sich in syn-coplanarer Stellung zueinander befinden. Durch koordinative Bindung des Magnesiums mit beiden Carbonylgruppen kann diese syn-coplanare Stellung vermutlich stabilisiert werden. Der Angriff des Nucleophils von der si-Seite unter Verwendung eines chiralen Alkohols, der in α-Stellung R-konfiguriert ist, und einer syn-coplanaren Stellung der Carbonylgruppen entspricht der Prelog-Regel (Kap. 2.2.2 und Abb. 9).

Abb. 9: Reaktionsmechanismus zur Darstellung der S-konfigurierten Benzilsäureester IIIa(Methode A, Schema 9)

Die absolute Konfiguration wird einzig durch die Priorität der Phenylringe (nach CIP) entschieden. Demnach wird die R-Konfiguration erhalten, wenn von der substituierten Phenylglyoxylsäure (Ib) ausgegangen wird (Methode B, Schema 9).

Zunächst wurden der (-)-8-Phenylmenthylester und der (-)-Menthylester der jeweiligen Phenylglyoxylsäuren (IIa) eingesetzt und vergleichend ihr Einfluss auf die Stereoselektivität der Addition von 3-Methoxyphenylmagnesiumbromid bestimmt. Sämtliche stereoselektiven Additionen wurden in Tetrahydrofuran bei –78°C durchgeführt. Nachfolgend waren die Verseifung des Diastereomers (III), die Methylierung der Benzilsäure (IV) sowie die Umesterung des Methylesters (V) zum N-Methyl-4-piperidylester (VI) erforderlich (vgl. Schema 12, Kap. 3.1.2.3), um den Enantiomerenüberschuss (ee) auf der Stufe des Methylesters oder des N-Methyl-4-piperidylesters durch HPLC zu ermitteln. Die Ergebnisse der stereoselektiven Addition der 3-Methoxy-Verbindung nach Methode A (Schema 9) sind Tab. 4 zu entnehmen. Wird der (-)-Menthylester der Phenylglyoxylsäure eingesetzt, ist die Stereoselektivität und die [Seite 39↓]enantiomere Reinheit von 42 % ee nur gering und reiht sich damit in die Resultate von Boireau und Whitesell ein. Erwartungsgemäß höher ist die enantiomere Reinheit > 98 % ee, wenn der (-)-8-Phenylmenthylester verwendet wird.

Tab. 4: HPLC-Chromatogramme zur Bestimmung der enantiomeren Reinheit von (S)-Methyl 3-methoxybenzilat (61) (Methode A)

HPLC-Chromatogramme

A

B

C

Chirales Auxiliar

-

(-)-Menthol

(-)-8-Phenylmenthol

Enantiomeren-verhältnis [%]

50:50

71:29

98,5:1,5

Enantiomeren-überschuss ee [%]

0

42

97

Weitere diastereomere Verbindungen (Tab. 5) wurden mit (-)-8-Phenylmenthol als chiralem Hilfsmittel synthetisiert. Das Ausmaß der chiralen Induktion wurde nicht anhand der Diastereomerenverhältnisses der (-)-8-Phenylmenthyl benzilate (IIIa/IIIb) ermittelt, da die Bestimmung des Diastereomerenverhältnisses mittels HPLC nur für einige Diastereomere gelang. Dagegen konnte für alle enantiomeren Zielstrukturen der basischen N-Methyl-4-piperidyl benzilate eine geeignete HPLC-Methode für die Bestimmung der Enantiomerenüberschüsse gefunden werden (Kap. 3.1.4.1). Auf Grundlage dieser Enantiomerenüberschüsse wurde die Stereoselektivität der nucleophilen Addition bewertet. Hierzu wurden die diastereomeren Phenylmenthylester (IIIa/IIIb) verseift, zum Methylester (V) umgesetzt und anschließend zum 4-Piperidylester (VI) umgeestert (vgl. Schema 12, Kap. 3.1.2.3). Eine Racemisierung und somit Verfälschung der Resultate der chiralen Induktion wurde in vorangegangenen Experimenten untersucht (Kap. 3.3) und kann unter diesen Reaktionsbedingungen ausgeschlossen werden.


[Seite 40↓]

Tab. 5: Resultate der asymmetrischen Induktion für ausgewählte Vertreter

R 1

R 2

R 3

S -Konfiguration (IIIa)*

ee [%] **

R - Konfiguration(IIIb)*

ee [%] **

H

H

30

>99,0 (85)

40

98,4 (78)

H

H

31

>99,0 (88)

41

>99,0 (79)

H

H

32

96,0 (63)

42

96,0 (67)

H

H

33

94,6 (72)

43

94,0 (81)

H

H

34

98,0 (86)

-

-

H

H

35

97,6 (52)

-

-

H

H

36

96,8 (65)

-

-

H

37

96,4 (82)

-

-

H

H

38

97,0 (74)

-

-

Die diastereomeren (-)-8-Phenylmenthyl (R)-/(S)-4-methylsulfonylbenzilate 39/44 sind in der Tabelle nicht aufgeführt, da sie durch Oxidation aus den Diastereomeren 31/41 hervorgehen.
* die absolute Konfiguration bezieht sich auf das zentrale C-Atom im Benzilsäuremolekül
* * in Klammern: Ausbeute in %

Die Resultate der asymmetrischen Synthese sind in Tab. 5 aufgeführt. Die S-konfigurierten Zielstrukturen, die aus Verbindungen 34 bis 38 hervorgehen und die dazu korrespondierenden R-Enantiomere, wurden auf alternativen Wegen (Kristallisation, chromatographische Methoden) gewonnen. Deshalb wurden an dieser Stelle nur die S-konfigurierten Diastereomere 34 bis 38 (IIa)dargestellt, um später unter Zuhilfenahme [Seite 41↓]dieser Referenzsubstanzen die absolute Konfiguration den Zielstrukturen eindeutig zuordnen zu können. Die nucleophilen Additionen verliefen vorwiegend in guten (72 bis 88 %) und selten in moderaten Ausbeuten (52 bis 67 %). Als nucleophile Reagenzien wurden die entsprechend substituierten Grignard-Reagenzien verwendet, welche aus ihren analogen Arylbromiden und Magnesium in Tetrahydrofuran hergestellt wurden. Nur für die 3,5-Dimethoxy-Verbindung (37) wurde, da 1-Brom-3,5-dimethoxybenzen im Handel nicht erhältlich war, 3,5-Dimethoxyphenylmagnesiumchlorid als Grignard-Reagenz eingesetzt. Nach Zugabe des Phenylmagnesiumbromids (Methode A, Schema 9) bzw. des substituierten Arylmagnesiumbromids (Methode B, Schema 9) zum α-Ketoester wird noch 2 h bei –78°C und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung der Reaktionsmischung wird anstelle halbkonzentrierter Salzsäure 10 %ige Ammoniumchlorid-Lösung verwendet. Ansonsten ist unter diesen Bedingungen bei tertiären Alkoholen mit Dehydratisierung zu rechnen, was eine Racemisierung zur Folge hätte. Über Säulenchromatographie ließen sich die Ausgangsstoffe Säure und Phenylmenthol und geringfügige Mengen an Nebenprodukten ausnahmslos sehr gut von den Produkten (30 bis 43) trennen. Die gefundenen Nebenprodukte sind hauptsächlich auf unerwünschte Produkte, die bei der Bildung des Grignard-Reagenzes entstehen, zurückzuführen. Bei der Darstellung von Verbindung 34 konnte die Entstehung von Nebenprodukten des Grignard-Ansatzes verfolgt werden. Eine Zunahme der grünlichen Verfärbung deutete auf eine vermehrte Bildung von Kristallviolett aus 1-Brom-4-dimethylaminobenzen bzw. dessen Grignard-Reagenz hin. Verstärkt wurde diese Annahme durch einen auftretenden Farbwechsel von grün nach gelb in Abhängigkeit vom pH-Wert beim Aufarbeiten des Reaktionsgemisches. Weitere Nebenprodukte können unter anderem durch Reaktion des entstandenen tertiären Alkohols mit dem Grignard-Reagenz auftreten. Der Angriff des Grignard-Reagenz an die Carbonylfunktion des Esters ist von geringerer Bedeutung, da die Esterfunktion von α-Ketoestern überwiegend resistent gegenüber nucleophilen Angriffen ist.


[Seite 42↓]

3.1.2.3.  Darstellung der enantiomeren Zielstrukturen

Zur Synthese der gewünschten N-Methyl-4-piperidyl benzilate schließen sich nachfolgende Syntheseschritte an (Schema 12):

Schema 12: Nachfolgende Syntheseschritte zum N-Methyl-4-piperidyl benzilat am Beispiel der 3-Methoxy-Verbindung

Die Hydrolyse der (-)-8-Phenylmenthyl benzilate (III) wurde mit Kaliumhydroxid-Lösung durchgeführt [6]. Nach zwei- bis dreistündiger Reaktion war die Hydrolyse des Esters für gewöhnlich abgeschlossen. Dagegen benötigten die tert-Butyl-Verbindungen 30 und 40, sowie die n-Butyl-Verbindungen 32 und 42 15 Stunden bis zur vollständigen Hydrolyse. Die Benzilsäuren (IV) 45 bis 53 wurden in Ausbeuten von 56 bis 87 % der Theorie erhalten.

Die Methoden zur Darstellung der Methylester (V) aus der Benzilsäure (IV) und die Umesterung zum N-Methyl-4-piperidylester (VI) wurden in der Dissertation von Vorwerk [5] detailliert untersucht. Die Darstellung des Methylesters (V) gelingt in Anlehnung an eine Methode von Pailer und Bergthaller [32] durch Behandlung der Benzilsäure (IV) mit Dimethylsulfat in Dimethylformamid. Die synthetisierten Methylester 54 bis 62 fielen in Ausbeuten von 63 bis 90 % der Theorie an. Die anschließende Umesterung des Methylesters (V) zum Piperidylester (VI) wird in Petroleumbenzin und einem leichten Überschuss N-Methyl-4-piperidol durchgeführt [33]. Die isolierten enantiomeren N-Methyl-4-piperidylester 1 bis 18 besitzen meist gute [Seite 43↓]Kristallisationseigenschaften und gehen oft beim Verreiben mit Diethylether in den festen Zustand über. Auffällig waren jedoch die Kristallisationsunterschiede zwischen reinen Enantiomeren und Racemat. Häufig kristallisieren die Enantiomere schlechter als das Racemat. So wurden die Enantiomeren von der n-Butyl-Verbindung 3 und 4 nur als Öl erhalten, hingegen fiel das Racemat in kristalliner Form an. Die Reinigung der basischen Ester konnte aufgrund ihrer guten Kristallisationseigenschaften vorwiegend durch Kristallisation erfolgen. War eine Reinigung durch Kristallisation nicht möglich, wurden die basischen Ester über Säulenchromatographie mit n-Hexan/Ethylacetat unter 10 %igem Zusatz von ammoniakalisch gesättigtem Methanol gereinigt. Die Ausbeuten variierten von 64 bis 80 % der Theorie. Entstehende Nebenprodukte, die für eine Minderung der Ausbeute verantwortlich sind, konnten dünnschichtchromatographisch identifiziert werden und decken sich mit den Beobachtungen von Vorwerk [5]. Zum einen handelt es sich um die Benzilsäure, welche aus dem Methylester hervorgeht und durch gleiche Färbungen beim Besprühen mit Schwefelsäure gekennzeichnet ist. Zum anderen entsteht durch oxidative Decarboxylierung Benzophenon.

3.1.2.4. Darstellung racemischer N-Methyl-4-piperidyl benzilate

Neben den enantiomeren Zielstrukturen (Tab. 1) wurden die Racemate der substituierten N-Methyl-4-piperidyl benzilate synthetisiert. Eine schnelle, kostengünstige und vielseitig einsetzbare Methode ist die Grignard-Addition an den Methylester der Phenylglyoxylsäure, welche das racemische Methyl benzilat 72 bis 80 lieferte. Die Reaktionen wurden in Tetrahydrofuran durchgeführt. Nach dem Zutropfen des Grignard-Reagenzes wurde noch 1,5 bis 2 h erhitzt. Die Ausbeuten lagen zwischen 52 und 85 % der Theorie. Ausnahme bildet hier die Dimethylamino-Verbindung (66) mit nur 21 % Ausbeute. Um die vermehrte Bildung von Farbstoff zu verhindern, wird das Grignard-Reagenz bei 0°C zugegeben, eine Stunde bei Eiskühlung und dann 0,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Vorsicht unterliegen Reaktionen mit Grignard-Reagenzien, die aus 4-Trifluormethylphenylbromid hergestellt werden, da hier mit Explosionsgefahr zu rechnen ist [34]. Die Reaktionen sollten daher mit kleinen Mengen und bei guter Eiskühlung durchgeführt werden.

Die Reinigung der racemischen Methyl benzilate wurde überwiegend durch Säulenchromatographie vollzogen, in seltenen Fällen, wie bei Verbindung 66, über [Seite 44↓]Kristallisation. Die darauf folgende Umesterung zum racemischen N-Methyl-4-piperidyl benzilat entspricht der Vorschrift und den Beobachtungen aus Kap. 3.1.2.3.

3.1.2.5. Diskussion

Die stereoselektive Synthese bietet einen verlässlichen Zugang zu den Zielstrukturen in guter bis hoher enantiomerer Reinheit. Zudem werden Schwierigkeiten bei der Bestimmung der absoluten Konfiguration vermieden, da aus dem Syntheseweg (Methode A oder B, Schema 10) die absolute Konfiguration der synthetisierten Verbindung hervorgeht. Enantiomere Verunreinigungen von bis zu 2 % müssen einkalkuliert werden.

Durchführbarkeit. Die Anwendbarkeit der stereoselektiven Synthese entsprechend der Methoden A und B (Schema 9, Kap. 3.1.2) auf verschiedene Substitutionsmuster der N-Methyl-4-piperidyl benzilate wird eingeschränkt durch:

Die substituierten Phenylglyoxylsäuren sind Vorstufen für die Darstellung der R-konfigurierten Benzilsäure (Methode B) und wurden überwiegend durch Friedel-Crafts-Acylierung dargestellt. Die Grenzen der stereoselektiven Synthese zeichnen sich bereits hier ab. Der Einfluss des Erstsubstituenten des aromatischen Systems lässt sich weitgehend durch elektronische Effekte begründen. Darüber hinaus spielen sterische Faktoren eine Rolle, die sich nur auf die ortho-Position auswirken. Elektronenziehende Substituenten wie Trifluormethoxy-Gruppen deaktivieren das aromatische System für das angreifende elektrophile Reagenz. Neben den verzeichneten geringen Ausbeuten, führen elektronenziehende Substituenten zu Stabilitätsproblemen der Phenylglyoxylsäure, was sich nachhaltig auf anschließende Reaktionen auswirkt. Stark deaktivierende, meta-dirigierende Substituenten (Trifluormethyl-, Nitrogruppen) können nach Friedel-Crafts nicht acyliert werden. Sollte die Darstellung der substituierten Phenylglyoxylsäure nicht gelingen und damit die R-Enantiomere (Methode B) nicht zugänglich sein, kann auf eine Variation der stereoselektiven Synthese ausgewichen werden. Wird das chirale Reagenz [Seite 45↓](+)-8-Phenylmenthol verwendet, kann nach Methode A das R-Enantiomer erhalten werden, jedoch nur unter der Voraussetzung, dass sich das Grignard-Reagenz aus dem substituierten Arylhalogenid erzeugen lässt.

Im Syntheseschritt der stereoselektiven nucleophilen Addition hängen die Durchführbarkeit und der Ausbeuten entscheidend von den verwendeten Grignard-Reagenzien ab. Die Erzeugung der Grignard-Reagenzien sowie die Reaktivität der Reagenzien werden durch die Substituenten maßgeblich beeinflusst. Die eingesetzten Substituenten wie Alkoxy-, Amino-, Methylmercapto- und Alkyl- sind in der Lage, den aromatischen Ring für den nucleophilen Angriff stark bis mäßig zu aktivieren. Dagegen machen sich die elektronenziehenden und somit deaktivierenden Eigenschaften von den Trifluormethyl- und Trifluormethoxy-Substituenten bei der Bildung des Grignard-Reagenzes und den Ausbeuten der Grignard-Reaktion mit 52 % und 65 % bemerkbar. Ein limitierender Faktor für das gewünschte Substituentenmuster in den Zielstrukturen ist somit die Bildung des Grignard-Reagenzes (Methode A) bzw. eine Reaktionsträgheit der Substituenten gegenüber Grignard-Reagenzien (Methode B). Sind diese Voraussetzungen nicht erfüllt, müssen entsprechende Ausgangsverbindungen gefunden werden, die in weiteren Syntheseschritten zum gewünschten Substituenten umgewandelt werden. So wurden die Methylsulfonyl-Verbindungen 39 und 44 aus den entsprechenden Methylmercapto-Verbindungen durch Oxidation in 86 %iger Ausbeute erhalten.

Stereoselektivität.In orientierenden Untersuchungen zur stereoselektiven Grignard-Addition sollte die Notwendigkeit des (-)-8-Phenylmenthols als chirales Auxiliar überprüft werden. Die Resultate der asymmetrischen Induktion (Tab. 4) zeigen deutlich die Unentbehrlichkeit des (-)-8-Phenylmenthols und bestätigen die vorliegenden Erfahrungen [20, 22, 23, 25]. Die in Tab. 5 beschriebenen Ergebnisse der asymmetrischen Induktion belegen, dass hohe enantiomere Reinheiten (94,0 bis 99,0 % ee) erreicht werden können. Der positive Einfluss voluminöser Grignard-Reagenzien auf die asymmetrische Induktion wurde in Kap. 2.2 beschrieben. Dahingehend lässt sich vermuten, dass arylsubstituierte Grignard-Reagenzien angesichts der größeren räumlichen Ausdehnung selektiver von der si-Seite angreifen als das unsubstituierte Phenylmagnesiumbromid. Infolgedessen müsste Methode A (S-Enantiomere) höhere ee als Methode B (R-Enantiomere) erwarten lassen. Dies lässt sich jedoch nicht bestätigen. Lediglich eine Tendenz, die sich in zwei Werten (40 und 43, Tab. 5) widerspiegelt, wurde beobachtet. In den durchgeführten Experimenten wurde nur Tetrahydrofuran als Lösungsmittel [Seite 46↓]eingesetzt. Obwohl der Einfluss des Lösungsmittels eine untergeordnete Rolle für die chirale Induktion spielt, birgt Tetrahydrofuran als Lösungsmittel der Theorie nach gegenüber Diethylether Vorteile. Das nucleophile Lösungsmittel wird selbst komplex an das Magnesiumatom gebunden. Im stärker basischen Tetrahydrofuran wird die Assoziatbildung von Grignard-Molekülen vermehrt zurückgedrängt. Ashby und Meyers zeigten, dass sich monomere Grignard-Reagenzien, komplexiert mit Lösungsmittel oder anderen Coreaktanten, positiv auf die Selektivität auswirken [17, 18].

Die Reaktionen: Hydrolyse des Phenylmenthylesters (III), Umsetzung der Benzilsäure (IV) zum Methylester (V) und anschließende Umesterung des Methylesters zu den enantiomeren Zielstrukturen des N-Methyl-4-piperidylester (VI) sind gebräuchliche Methoden für derartige Reaktionsschritte. Die Anwendbarkeit dieser Methoden ist jedoch erst dadurch gegeben, dass eine Racemisierung des zentralen asymmetrischen C-Atoms des Benzilsäuremoleküls unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen nicht stattfindet.

3.1.3. Kristallisationsmethoden

Kristallisationsmethoden können zu einer Racematspaltung, d. h. Trennung des Racemates in seine zwei Enantiomere, führen. Die Racematspaltung kann durch rein physikalische Methoden oder chemische Reaktionen vollzogen werden.

3.1.3.1. Trennung der Enantiomere durch physikalische Methoden

Enantiomere lassen sich unter bestimmten Bedingungen aus einer racemischen Lösung durch Kristallisation ohne chirale Trennungsreagenzien gewinnen. Eine unabdingbare Voraussetzung dafür ist, dass das Racemat ein Konglomerat unter den Bedingungen der Kristallisation darstellt [35]. Handelt es sich bei der Racemform hingegen um eine racemische Verbindung oder ein Pseudoracemat, lässt sich eine derartige Kristallisationsmethode nicht durchführen.

Bestimmung der Racemform. Ein Konglomerat liegt vor, wenn beide Enantiomere getrennt auskristallisieren. Jeder Kristall ist aus homochiralen Molekülen aufgebaut. Ein eutektischer Punkt wird bei einer Enantiomerenzusammensetzung von 1:1 (Racemat) beobachtet. Häufiger anzutreffen sind racemische Verbindungen. Jeder Kristall enthält in [Seite 47↓]der Elementarzelle beide Enantiomere im Verhältnis 1:1. Eine racemische Verbindung kann einen höheren, tieferen oder gleichen Schmelzpunkt im Vergleich zum reinen Enantiomer aufweisen. Als eigenständige Verbindung unterscheiden sich racemische Verbindungen in vielen physikalischen Eigenschaften von den reinen Enantiomeren. Besteht das Racemat aus einer einzigen homogenen festen Phase, in der beide Enantiomere in einem Verhältnis von 1:1 in ungeordneter Form in Mischkristallen vorliegen, spricht man von Pseudoracematen [36].

Ein Vergleich der Schmelzpunkte der Racemate und der Enantiomere der N-Methyl-4-piperidyl benzilate gibt einen ersten Anhaltspunkt darüber, welche Racemform vorliegen könnte. Liegt der Schmelzpunkt der Enantiomere 25°C über dem Schmelzpunkt des Racemates [37], ist die Wahrscheinlichkeit einer Konglomeratformation hoch. Unterschiede von 20°C und weniger sind ebenfalls anzutreffen. Ist der Schmelzpunkt des Racemates höher als der Schmelzpunkt der Enantiomere kann ein Konglomerat ausgeschlossen werden.

Einen Überblick über die Schmelzpunkte von Racemat und Enantiomeren gibt Tab. 6. Aufgrund der guten Kristallisationseigenschaften der N-Methyl-4-piperidyl benzilate in Diethylether, wurden alle Verbindungen aus Tab. 6 aus Diethylether auskristallisiert.

Von den untersuchten Verbindungen zeigen drei Racemate einen niedrigeren Schmelzpunkt als ihre Enantiomere und stellen somit potenzielle Konglomerate dar (Tab. 6, fett hervorgehoben). Eine Methode, um die Racemform eindeutig zu bestimmen, ist ein binäres Phasendiagramm. Darin wird die Abhängigkeit der Schmelztemperatur von der enantiomeren Zusammensetzung dargestellt. Für verschiedene Vertreter wurden binäre Phasendiagramme aufgenommen (Abb. 10). Hierzu wurden acht Lösungen mit unterschiedlichen Anteilen von R- und S- Enantiomer im Bereich von 100/0 bis 50/50 (R-Enantiomer/S-Enantiomer) in Diethylether hergestellt. Bei Raumtemperatur kristallisierten die Verbindungen, bestehend aus verschiedenen Anteilen an R- und S-Enantiomeren, aus den etherischen Lösungen aus. Die Schmelzpunkte wurden ermittelt. Mit Zunahme des S-Enantiomerenanteils (erhöhte enantiomere Verunreinigung) vergrößerte sich der Schmelzpunktbereich. An dieser Stelle wurde der Mittelwert des Schmelzpunktbereiches für die Datenauswertung verwendet. Die exakten prozentualen Anteile der Enantiomere wurden anschließend mittels HPLC bestimmt und gegen den Schmelzpunkt grafisch aufgetragen. Da Enantiomere gleiche physikalisch-chemische Eigenschaften mit [Seite 48↓]Ausnahme der optischen Aktivität aufweisen, wurden identische Schmelztemperaturen für eine Enantiomerenzusammensetzung von beispielsweise 60/40 (R/S) und 40/60 (R/S) angenommen.

Tab. 6: Schmelzpunkte der Racemate und Enantiomere von N-Methyl-4-piperidyl benzilaten

Substitution R

Schmelzpunkt in °C*

Racemform

 

Racemat

Enantiomer

 

4- tert -Butyl-

124

144

Racemische Verbindung

4-Methylsulfonyl-

141-143

135

Racemische Verbindung

4-Trifluormethoxy-

113

100

Racemische Verbindung

4-Trifluormethyl-

115-119

(HCl: 195-198)

135

(HCl: 182-190)

Racemische Verbindung

3-Methoxy-

100-101

118-120

Konglomerat

3,5-Dimethoxy-

136-137

85

Racemische Verbindung

4-n-Butyl-

88 (Aceton)

helles Öl

Racemische Verbindung

4-Butoxy-

125

85-86

Racemische Verbindung

4-Dimethylamino-

129-132

120

Racemische Verbindung

* aus Diethylether auskristallisiert

Bei der Auswertung der Phasendiagramme erwies sich überraschend (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (79)als Konglomerat (Abb. 10, Diagramm A). Der Verlauf des binären Phasendiagramms für 79 (Diagramm A, Abb. 10) lässt sich wie folgt interpretieren: Die Kurve beginnt bei 0 % S-Enantiomer, 100 % R-Enantiomer und einer Schmelztemperatur von 119°C. Mit Zunahme der S-enantiomeren Verunreinigung sinkt der Schmelzpunkt. Ein Minimum der Schmelztemperatur (100,5°C), die so genannte eutektische Temperatur, ist bei einer Zusammensetzung der Enantiomere von 50/50 (R/S) erreicht. Durch eine zunehmende S-enantiomere Verunreinigung wird die Gitterstruktur gestört. Die Gitterordnung (Zunahme der Entropie) und die Bindungskräfte zwischen den

Abb. 10: Binäres Phasendiagramm eines Konglomerates (A) und racemischer Verbindungen (B) und (C)

Gitterbausteinen nehmen ab. Wird die eutektische Temperatur überschritten, kommt es erneut zu einem Anstieg der Schmelztemperatur bis auf 119°C. Die R-enantiomere Verunreinigung nimmt ab, die Bindungskräfte nehmen zu, die Gitterbausteine werden effizienter gepackt. Zusätzlich wurde die Konglomeratformation bestätigt, indem kleinste Mengen eines Enantiomers zum Racemat zugemischt wurden. Dabei wurde eine sofortige Schmelzpunkterhöhung im Vergleich zum Racemat beobachtet, was ein Charakteristikum für Konglomerate ist.

Das Diagramm des N-Methyl-4-piperidyl 4-tert-butylbenzilats (72) lässt wie bei 79 zunächst ebenfalls ein Konglomerat erwarten, da der Wert des enantiomeren Schmelzpunktes (144°C) gegenüber dem des Racemates (124°C) um 20°C höher lag (Diagramm B). Wird dem reinen R-Enantiomer (144°C) das S-Enantiomer beigemengt, wird zunächst eine Schmelzpunkterniedrigung bis auf 123,5°C bei ca. 30 % S-Enantiomerenanteil beobachtet (Verunreinigung des Enantiomers mit racemischer Verbindung). Bei weiterem Zumischen des S-Enantiomers (Anteil > 30 %) wird wieder ein Anstieg der Schmelztemperatur auf 124°C verzeichnet (Abnahme der enantiomeren Verunreinigung der racemischen Verbindung). Dieser Hinweis auf eine racemische Verbindung erhärtet sich, wenn kleinste zugemischte Mengen eines Enantiomers zum Racemat eine sofortige Schmelzpunkterniedrigung bewirken. Im Diagramm B sind zwei eutektische Punkte zu finden, wie sie bei racemischen Verbindungen anzutreffen sind.

Für die Verbindung N-Methyl-4-piperidyl 4-trifluormethylbenzilat (77) wurde auf die Aufnahme eines binären Phasendiagramms verzichtet. Trotz der bei einer Konglomeratformation vorhandenen großen Differenz zwischen den Schmelztemperaturen von Enantiomer (135°C) und Racemat (105 bis 119°C) wurde bei dem Versuch, kleinste [Seite 50↓]Mengen Enantiomer zum Racemat zu zumischen, eine Schmelzpunkterniedrigung beobachtet. Damit handelt es sich um eine racemische Verbindung, bei der der Schmelzpunkt der reinen Enantiomere höher ist als der des Racemates. Auch die Bildung des Hydrochlorids der Base von 77 führte nicht zum Konglomerat. Anhand des Schmelzpunktes von Racemat und Enantiomer des Hydrochlorids lässt sich sofort ein Konglomerat ausschließen.

Ein typisches binäres Phasendiagramm für eine racemische Verbindung, in welchem dem Racemat ein höherer Schmelzpunkt als den reinen Enantiomeren zukommt, ist in Diagramm C für N-Methyl-4-piperidyl 4-butoxybenzilat (74) abgebildet.

Die Verbindungen 4-Methylsulfonyl- (80), 4-Trifluormethoxy- (76), 3,5-Dimethoxy- (78), 4-n-Butyl- (73), 4-Butoxy- (74) und 4-Dimethylamino- (75) zeigen von vornherein für die Racemate höhere Schmelztemperaturen (Tab. 6). Somit sind Konglomeratformationen ausgeschlossen und demzufolge wurden keine Phasendiagramme aufgenommen. Bei diesen Verbindungen kann es sich um Pseudoracemate oder racemische Verbindungen handeln. Da Pseudoracemate keine große Differenz der Schmelztemperaturen zwischen Racemat und Enantiomer aufzeigen, sind bei den oben genannten Verbindungen ebenfalls racemische Verbindungen anzunehmen.

Racemattrennung. Die Voraussetzung eines Konglomerates für eine physikalische Trennung ohne chirale Trennreagenzien (manuelle Trennung, Vorzugskristallisation) ist bei (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (79) gegeben. Aus einer etherischen Lösung kristallisiert das Konglomerat von 79 langsam bei Raumtemperatur aus. Jedoch konnte keine genaue Aussage darüber getroffen werden, ob enantiomorphe Kristalle mit erkennbaren Unterschieden in der Kristallform vorliegen. Somit war eine manuelle Trennung durch Auslese der enantiomorphen Kristalle aufgrund verschiedener Kristallformen nicht möglich.

Durch Vorzugskristallisation konnte die Racematspaltung vollzogen werden. Dazu wurde ein Impfkristall des synthetisierten S-Enantiomers für (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat(79) in Diethylether herangezogen. Es wird eine gesättigte Lösung des Racemates (79) in Diethylether hergestellt. Der Impfkristall (S-Enantiomers) wird zur gesättigten Lösung hinzugegeben. Nach Beendigung des Kristallwachstums wird der Kristall manuell entfernt und der Enantiomerenüberschuss der Lösung mittels HPLC ermittelt. Der verbliebene Anteil des S-Enantiomers in der Lösung betrug 5 %, der des [Seite 51↓]Kristalls > 98 %. Durch Verwendung eines enantiomorphen Kristalls des R-Enantiomers als Impfkristall, kann aus der mit 95 % R-Enantiomer angereicherten Lösung das R-Enantiomer bevorzugt auskristallisiert werden. Somit gelingt die stufenweise Trennung des Racemates (79).

3.1.3.2. Chemische Trennung der Enantiomere über Diastereomere

Durch Überführung der Racemate in Diastereomerengemische können die unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften der Diastereomere zur indirekten Racematspaltung ausgenutzt werden. Im Fall der fraktionierten Kristallisation beruht die Trennung auf unterschiedlichen Löslichkeiten der entsprechenden Feststoffe in einem bestimmten Lösungsmittel.

Abb. 11: Modifikationsmöglichkeiten chiraler Benzilate

Für eine Diastereomerenbildung ergeben sich folgende Ansatzpunkte:

 

  • basische Piperidyl benzilate mit sauren Spaltreagenzien

 

  • Benzilsäure mit basischen Spaltreagenzien


[Seite 52↓]

 

  • Veresterung mit Phthalsäure und anschließende Trennung mit basischen Spaltreagenzien

  • Veresterung mit optisch aktiven Säuren

 

  • Darstellung von Acetalen mit optisch aktiven Aldehyden.

Die Derivatbildung an der tertiären Alkoholgruppe mit chiralen Auxiliaren wird für die Untersuchungen nicht in Betracht gezogen. Die tertiäre Alkoholgruppe ist aufgrund ihrer sterisch anspruchsvollen Gruppen und zugleich geringen Reaktivität für Reaktionen nur bedingt geeignet. Die direkte Veresterung der Säure mit tertiären Alkoholen gelingt nur mit sehr niedrigen Ausbeuten. Nach einer erfolgten Diastereomerentrennung wäre die Wiederherstellung des tertiären Alkohols durch Verseifen im gleichen Maße erschwert. Wesentlich aussichtsreicher ist die Modifikation der Alkoholkomponente des Esterrestes. In diesem Zusammenhang wurden die (-)-Menthyl- und (-)-8-Phenylmenthylester der Benzilate genauer betrachtet. Allerdings zeigten diese keine guten Kristallisations-eigenschaften und sind deshalb für die fraktionierte Kristallisation ungeeignet. Demzufolge wurde der Schwerpunkt der Racematspaltung auf die diastereomere Salzbildung gelegt. Am Beispiel von (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (79) wurden verschiedene chirale Trennreagenzien für Basen wie Campher-10-sulfonsäure, Äpfelsäure, Mandelsäure, 1,1´-Binaphthyl-2,2´-diyl hydrogenphosphat, Weinsäure und Derivate der Weinsäure (O,O´-Di-p-toluoylweinsäure, O,O´-Di-p-anisoylweinsäure [38]) getestet. Hierbei wurde zur Lösung der racemischen Base ein Moläquivalent der chiralen Säure in einem geeigneten Lösungsmittel hinzugegeben. Nach der Aufarbeitung des diastereomeren Salzes wurde der Enantiomerenüberschuss via HPLC bestimmt. Eine Racemattrennung von (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat gelingt nur mit O,O´-Di-p-toluoylweinsäure in Methanol. (+)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (15) bildete dabei bevorzugt mit (+)-O,O´-Di-p-toluoylweinsäure ein Salz und entsprechend (-)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (16) mit (-)-O,O´-Di-p-toluoylweinsäure. Durch Verwendung von Substanzfamilien, d. h. einer Mischung aus verschiedenen Weinsäurederivaten, konnte das Verfahren effizienter gestaltet werden. Vries et al. erzielten gute Erfolge durch gleichzeitige Zugabe mehrerer Spaltreagenzien einer Familie (im Allgemeinen strukturell ähnlich aufgebaut) zum Racemat [39]. Verschiedene Gemische aus Dibenzoylweinsäure (T1), Di-p-toluoylweinsäure (T2), Di-p-anisoylweinsäure (T3) wurden zur Racemattrennung untersucht.


[Seite 53↓]

Tab. 7: Racemattrennung mittels Substanzfamilien

Verhältnis der Weinsäuren* T1/T2/T3

Anzahl der Umkristallisationen

Enantiomerenverhältnis [%]

1:3:1,5

6

10:90

1:7:3

10

4:96

1:10:4

7

1:99

1:10:0

3

1:99

* Dibenzoylweinsäure (T1), Di-p-toluoylweinsäure (T2), Di-p-anisoylweinsäure (T3)

Das Optimum wurde bei einer Mischung aus nur zwei Weinsäurederivaten (O,O´-Dibenzoylweinsäure/O,O´-Di-p-toluoylweinsäure 1:10) gefunden. Das häufige Um-kristallisieren des Salzes (7-8mal) gemäß der klassischen Methode nach Pasteur konnte mit der Verwendung von einer Weinsäuremischung auf 2-3maliges Umkristallisieren reduziert werden (Abb. 12). Das gebildete diastereomere Salz setzte sich aus der Base und beiden Weinsäurederivaten (T1 und T2) zusammen, was auch nach mehrmaligem Umkristallisieren erhalten blieb (NMR-spetroskopisch ermittelt).

Abb. 12: HPLC-Chromatogramme nach ein- (A), zwei- (B) und dreimaliger (C) fraktionierter Kristallisation von (+)-(R)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (15) mit einer Mischung aus Weinsäurederivaten

Weitere Racemate der N-Methyl-4-piperidyl benzilate wurden wie in der oben beschriebenen Methode in folgenden Lösungsmitteln untersucht: Methanol, Ethanol, Isopropanol,Ethylacetat,Aceton,Ethylmethylketon,Isobutylmethylketon.Eine Übersicht zu den untersuchten Verbindungen gibt Tab. 8. Die Zuordnung der absoluten Konfiguration erfolgte mittels HPLC (Kap. 3.1.4.1) durch das adäquate S-Enantiomer, dessen Konfiguration durch die stereoselektive Synthese nach Methode A festgelegt ist.


[Seite 54↓]

Für die Racematspaltung der Benzilsäuren wurde die nachstehende Auswahl von Trennreagenzien geprüft: Ephedrin, D-Glucosamin, Brucin, (S)-α-Methylbenzylamin, Cinchonidin/Cinchonin und Chinidin/Chinin, mit dem Cohen [40] die Racemattrennung von 4-Nitrobenzilsäure gelang. Zur Lösung der racemischen Säure wurde ein Moläquivalent der chiralen Base in den oben genannten Lösungsmittel hinzugegeben. Vielfache Kristallisationsversuche führten nicht zum Erfolg. Die Trennungen scheiterten bereits an einer nicht erfolgten Salzbildung.

Tab. 8: Fraktionierte Kristallisation mit Weinsäurederivaten (O,O´-Dibenzoylweinsäure/ O,O´-Di-p-toluoylweinsäure 1:10)

Substitution R

Lösungsmittel

ee [%]

 

 

 

R-Enantiomer

S-Enantiomer

 

4-Trifluormethyl-

Diethylether/Methanol

98

98

(2-3)*

3-Methoxy-

Methanol

95

95

(3)*

3,5-Dimethoxy-

Isobutylethylketon

95

99

(4)*

4-tert-Butyl-

Isopropanol

Salzbildung ohne Enantiomerenanreicherung

 

4-Methylsulfonyl-

Ethanol

 

4-Trifluormethoxy-

Aceton

 

4-Dimethylamino-

-

keine Salzbildung

* Anzahl der Umkristallisationen

3.1.3.3. Diskussion

In seltenen Fällen kristallisieren die Enantiomere eines Racemates in enantiomorphen Kristallen getrennt voneinander aus und lassen auf diese Weise eine Racematspaltung ohne chirale Trennreagenzien zu. Dieses Phänomen wurde bereits von Pasteur beobachtet. Ihm gelang durch Auslese enantiomorpher Kristalle die Trennung von Weinsäuresalzen [41]. Bisher wurden nur einige Hunderte Konglomerate in der Literatur beschrieben [42]. Es wird vermutet, dass mehr als 90 % der chiralen Feststoffe in heterochiralen Packungen auftreten.


[Seite 55↓]

Racemform und Aussagen zu intermolekularen Bindungskräften. Durch Bestimmung der Racemform mittels binärem Phasendiagramm (Diagramm A, Abb. 10) konnte die Verbindung 79 eindeutig den Konglomeraten zugeordnet werden. Die restlichen untersuchten Verbindungen sind racemische Verbindungen. Pseudoracemate befinden sich vermutlich nicht darunter.

Durch den Verlauf des binären Phasendiagramms sind Aussagen über die Kräfte zwischen den Gitterbausteinen im Kristallgitter möglich. Die Wärme, die beim Schmelzen (Schmelzenthalpie) zugeführt wird, korreliert mit den Bindungskräften zwischen den einzelnen Gitterbausteinen. Je stabiler die Koordinationsgitterstruktur (hohe Gitterenergie), desto höher ist die Schmelztemperatur. Der Schmelzvorgang ist ein endothermer Vorgang. Erst bei genügend hohen Temperaturen überwiegt der Entropieterm (-TΔS) und ein positiver ΔH-Wert wird kompensiert. Ein endothermer Vorgang verläuft dann exergonisch (Gibbs-Helmholtz-Gleichung: ΔG = ΔH –TΔS). Übertragen auf (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (79)muss dies zwangsläufig bedeuten, dass zwischen gleichen Enantiomeren eine bevorzugte Anziehung besteht. Dies führt zu einer stabileren Gitterstruktur gleicher Enantiomere gegenüber gegensätzlichen Enantiomeren. Dies spiegelt sich in einem höheren enantiomeren Schmelzpunkt gegenüber dem racemischen Schmelzpunkt wider. Bevorzugte Wechselwirkungen gegensätzlicher Enantiomere finden wir beispielsweise bei (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-butoxybenzilat (65). Das Racemat ist im Vergleich zum Enantiomer durch einen höheren Schmelzpunkt gekennzeichnet. Hingegen würden bei Pseudoracematen nur geringe Affinitätsunterschiede zwischen gleichen und entgegengesetzten Molekülen anzutreffen sein. Der Schmelzpunkt des Pseudoracemates entspricht mit möglicher geringer Abweichung dem der reinen Enantiomere und ist innerhalb der untersuchten Substanzen nicht anzutreffen.

Racemische Verbindungen der N-Methyl-4-piperidyl benzilate können im Vergleich zu den Enantiomeren als eigenständige Verbindungen aufgefasst werden. Der Einfluss der enantiomeren Verunreinigung auf physikalisch-chemische Eigenschaften der racemischen Verbindungen wie dem Schmelzpunkt wurde für die Klasse der N-Methyl-4-piperidyl benzilate nachgewiesen. Desweiteren wurden in orientierenden Untersuchungen Löslichkeitsunterschiede zwischen racemischer Verbindung und Enantiomer beobachtet, welche jedoch nicht Gegenstand weiterer Untersuchungen waren. In Hinsicht auf einen möglichen therapeutischen Einsatz der Substanzklasse wird deutlich, dass enantiomere oder racemische Verunreinigungen einen Einfluss nicht nur auf die pharmakodynamischen, [Seite 56↓]sondern auch auf pharmakokinetische Prozesse haben können. Die Prüfung auf enantiomere Verunreinigungen im Rahmen der Reinheitsprüfung offizinieller Arzneistoffe sollte daher nicht nur Arzneistoffe, bei denen ein Enantiomer eingesetzt wird, einschließen, sondern auch auf racemische Verbindungen ausgeweitet werden. In der Literatur werden solche Phänomene auch für andere Verbindungen beschrieben. Beispielsweise bewirkt eine geringe enantiomere Verunreinigung des racemischen Ephedrin 2-naphthalensulfonats eine 27 %ige Steigerung der intrinsischen Lösungsrate (intrinsic dissolution rate) [43].

Physikalische Trennmethoden. Die Voraussetzung eines Konglomerates für eine physikalische Trennung (manuelle Trennung, Vorzugskristallisation) ist bei (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat gegeben. Eine Kristallisation des Racemates unter Gleichgewichtsbedingungen, d. h. beide Enantiomere kristallisieren in enantiomorphen Kristallen nebeneinander aus, führte zu keiner durchführbaren manuellen Trennung. Erst durch Animpfen der racemischen Lösung mit einem homochiralen Kristall des S-Enantiomers, konnte durch kontinuierliches Kristallwachstum das S-Enantiomer bevorzugt aus der Lösung entfernt werden. Unter den gewählten Bedingungen wurde die spontane Kristallisation des R-Enantiomers verhindert, welches sich dann in der Mutterlauge anreicherte. Durch HPLC-Kontrolle kann indirekt das Abscheiden des S-Enantiomers und direkt die Anreicherung des R-Enantiomers in der Mutterlauge verfolgt werden. Die Vorzugskristallisation lässt sich auch im großen Maßstab durchführen, indem aus der gesättigten racemischen Lösung zunächst das S-Enantiomer auskristallisiert wird. Anschließend wird aus der Mutterlauge (mit R-Enantiomer angereichert) mittels Impfkristall das R-Enantiomer auskristallisiert. In mehreren Zyklen lassen sich größere Mengen der getrennten Enantiomere gewinnen. Industriell wird diese Methode beispielsweise für eine Synthesevorstufe des Antibiotikums Chloramphenicol genutzt. Um weitere N-Methyl-4-piperidyl benzilate mittels Vorzugskristallisation trennen zu können, müssten zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden. Bekannt ist, dass racemische Verbindungen durch Derivatbildung (Salzbildung) in Konglomerate übergeführt werden können [44]. Obwohl beispielsweise (+)-Weinsäure racemisch kristallisiert, konnte das racemische Natriumammoniumtartrat unterhalb von 28°C als Konglomerat durch Pasteur erhalten werden. Eine Veränderung der intermolekularen Bindungskräfte durch Derivatisierung wurde für N-Methyl-4-piperidyl 4-trifluormethylbenzilat (77) nachgewiesen (Tab. 6). Die Base 77 ist durch eine größere Affinität zwischen gleichen Enantiomere charakterisiert (FpEnantiomer > FpRacemat). Dagegen wird durch [Seite 57↓]Hydrochloridbildung der Verbindung 77 die Affinität zwischen entgegengesetzen Enantiomeren erhöht (FpRacemat > FpEnantiomer). Die Derivatisierung von 77 führte somit zwar zu veränderten intermolekularen Bindungsverhältnissen, aber nicht zu einer gewünschten Konglomeratformation.

Weiterhin müssen Temperatureinflüsse auf die Racemform genauer untersucht werden. In der Literatur werden einige Fälle beschrieben, bei denen oberhalb oder unterhalb einer bestimmten Temperatur Konglomerate anstelle ihrer racemischen Verbindung erhalten werden [42].

Chemische Trennung. Die meisten Racematspaltungen verlaufen indirekt über eine Diastereomerentrennung. Die Diastereomerenbildung über kovalente Bindung der untersuchten chiralen Auxiliare durch Variation des Esterrestes führte zu nicht kristallisierenden Derivaten, die damit keiner fraktionierten Kristallisation unterworfen werden konnten. Untersucht wurden hierbei (-)-Menthyl- und (-)-8-Phenylmenthylester der substituierten Benzilsäure. Der Versuch der Diastereomerenbildung durch Umsetzungen des tertiären Alkohols wurde aufgrund von Reaktivitätsproblemen tertiärer Alkohole verworfen. Die Racemattrennung gelang schließlich durch Bildung diastereomerer Salze des Piperidyl benzilates mit Weinsäurederivaten. Von sieben untersuchten Racematen (72, 75 bis 80)wurden bei sechs Vertretern Salzbildung beobachtet. Die Anreicherung eines Enantiomers durch fraktionierte Kristallisation gelang bei den Verbindungen 77, 78 und 79. Weinsäure selbst stellte sich als nicht geeignetes Spaltreagenz heraus. Entweder bildeten sich keine Salze oder es wurde keine Diskriminierung eines Diastereomers beobachtet. Die Schwierigkeiten der Salzbildung mit Weinsäure lassen sich eventuell auf die zu geringe Acidität der Weinsäure bzw. zu geringe Basizität des Racemates zurückführen. Dagegen konnten erste Erfolge mit Acylderivaten wie Dibenzoyl- und Di-p-toluoylweinsäure verzeichnet werden. Durch die höhere Acidität der Acylderivate ist vermutlich die verbesserte Salzbildung zu erklären. Zudem könnten die Aroylfunktionen für eine verbesserte Diasteromerendiskriminierung mitverantwortlich sein [36].

Wesentlich effizienter (geringere Anzahl von Umkristallisationen) wird die Racematspaltung durch Verwendung einer Mischung aus Weinsäurederivaten (Dibenzoyl- und Di-p-toluoylweinsäure) als Spaltreagenz. Vries et al. vermuteten zunächst, dass die am schwersten löslichen diastereomeren Salze ausfallen würden. In den Experimenten konnten immer mehrere Komponenten des Spaltreagenzes in den Salzen nachgewiesen [Seite 58↓]werden [39]. NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Zusammensetzung des Weinsäuresalzes von Verbindung 79 bestätigen die Beobachtung von Vries.

Ist eine geeignete Methode für die fraktionierte Kristallisation von N–Methyl-4-piperidyl benzilaten gefunden, ist die Darstellung von großen Mengen (Gramm-Bereich) auf wirtschaftlichem Wege möglich. Zugleich kann hohe enantiomere Reinheit mit geringem finanziellem Aufwand erreicht werden. Trotz intensiver Bemühungen mit computergestützten Modellen [45] und Untersuchungen der Kristallstrukturdaten diastereomerer Salze [46] gelang es bisher nicht, eine Theorie zu entwickeln, die als allgemeine Grundlage für die Racematspaltungen dienen könnte. Somit lassen sich die Kristallisationsmethoden auch nicht auf alle Derivate der N-Methyl-4-piperidyl benzilate übertragen. Durch systematische Variation der Trennreagenzien und des Lösungsmittels muss empirisch für jede Verbindung individuell nach einer zweckmäßigen Methode gesucht werden.

3.1.4. Chromatographische Methoden

Chiralität spielt in biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle. Mit der Entwicklung der chromatographischen Möglichkeiten (analytische und präparative Racemattrennung) in den letzten beiden Jahrzehnten konnten neue Erkenntnisse auf diesem Gebiet gewonnen werden [47]. Im Folgenden soll die Anwendbarkeit chromatographischer Trennverfahren auf racemische Benzilsäurederivate überprüft werden.

Die untersuchten chromatographischen Methoden lassen sich gliedern in:

Für die direkte Racematspaltung werden heute am häufigsten chirale Adsorbentien wie Polysaccharide (Celluloseester und Phenylcarbamate von Cellulose und Amylose) verwendet [48]. Chemisch modifizierte Umkehrphasen (Reverse Phase, RP) lassen sich für die indirekte Trennung einsetzen.


[Seite 59↓]

3.1.4.1.  Direkte Racemattrennung an chiralen stationären Phasen

Es wurde eine Auswahl geeigneter chiraler stationärer Phasen für die Trennung von Benzilsäurederivaten getroffen [49]. An Säulenmaterialien auf Cellulose- und Amylosegrundlage wurden strukturell verwandte Verbindungen wie Atropin, Homatropin und Mandelsäurederivate erfolgreich getrennt (Tab. 9).

Tab. 9: Analytische Trennung strukturverwandter Verbindungen

Verbindung

Strukturmerkmale

Beispiele

Säulenmaterial*

Basische Benzilsäureester

aromatisch

Carbonylfunktion

alkoholische Gruppe

stickstoffhaltig

Atropin

Homatropin

Oxyphencyclimin

Chiralcel OD [50]

Chiralcel OD [50]

ChiralpakAD [51]

Benzilsäuren

Methyl benzilat

aromatisch

Carbonylfunktion

alkoholische Gruppe

Mandelsäure

Methyl mandelat

Chiralcel OD [52]

Chiralcel OJ [51]

* Chiralpak AD: Amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamat), 250-4,6 (10 μm)
Chiralcel OD: Cellulose tris (3,5-dimethylphenylcarbamat), 250-4,6 (10 μm)
Chiralcel OJ: Cellulose tris (4-methylbenzoat), 250-4,6 (10 μm)

Ergänzt wurde die Auswahl durch Chiraspher und β-Cyclodextrin. Chiraspher ist eine stationäre Phase auf Basis von Kieselgelpartikeln, die mit dem optisch aktiven Polymer Poly-(N-Acryloyl-S-phenylalaninethylester) beschichtet sind. Die stereoselektiven Wechselwirkungen mit den Enantiomeren vollziehen sich innerhalb chiraler Hohlräume der Polymerschicht über Wasserstoffbrücken und π-π-Wechselwirkungen. Blaschke et al. waren maßgeblich an der Entwicklung dieser polymeren chiralen stationären Phasen beteiligt [53]. An β-Cyclodextrin (Chiradex) wurden bereits erfolgreiche Trennungen von strukturell verwandten Verbindungen (Diphenylmethanderivaten [54, 55], Cyclohexyl-phenylglyoxylsäure [56, 57] beschrieben. Die Trennung basiert unter anderem auf Einlagerung eines Moleküls oder Molekülteils in den chiralen Sektor. Die entstehenden diastereomeren Komplexe dissoziieren verschieden schnell und tragen damit zu unterschiedlichen Retentionszeiten bei.

Vorversuche. Die Trennungen der racemischen 3-methoxysubstituierten Derivate der Benzilsäure (52), des Methylesters (69) und des Piperidylesters (79) wurden an den chiralen stationären Phasen untersucht (Tab. 10).


[Seite 60↓]

Tab. 10: Direkte Racemattrennung von 3-Methoxybenzilsäure (52), Methyl 3-methoxy-benzilat (69), N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (79)

Stationäre Phase*

 

Verbindung

Bemerkung**

Methode

Chiralcel OD

52

+

n-Hexan (75 bis 95)/2-Propanol (25 bis 5), Zusatz von Diethylamin 0,01-0,1 für Basen bzw. Essigsäure 0,01 bis 0,05 für Säuren

69

+

79

-

Chiralcel OJ

52

-

n-Hexan (90 bis 95)/2-Propanol (10 bis 5)

 

69

-

79

-

52

+

n-Hexan (95)/Ethanol (5)

Chiralpak AD

52

-

n-Hexan (50 bis 95)/2-Propanol (50 bis 5), Zusatz von Diethylamin 0,01-0,1 für Basen bzw. Essigsäure 0,01 bis 0,05 für Säuren

 

69

-

79

++

69

+

Methanol (100)

Chiraspher

52

-

n-Hexan (80 bis 93)/2-Propanol (20 bis 7), Zusatz von Diethylamin 0,01-0,1 für Basen bzw. Essigsäure 0,01 für Säuren

69

-

79

-

ChiraDex

52

-

Gemische aus Ethanol, Methanol und Acetonitril mit wässrigen Pufferlösungen (pH 3,0 bis 7,5)

 

69

-

79

-

 

 

 

* Chiralpak AD: Amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamat), 250-4,6 (10 μm)
Chiralcel OD: Cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamat), 250-4,6 (10 μm)
Chiralcel OJ: Cellulose tris(4-methylbenzoat), 250-4,6 (10 μm)
Chiraspher: Poly-(N-Acryloyl-S-phenylalaninethylester), 250-4 (5μm)
Chiradex: β-Cyclodextrin, 250-4 (5μm)
** - keine Trennung, + Trennung ohne Basislinientrennung, ++ sehr gute Trennung mit Basislinientrennung


[Seite 61↓]

Viel versprechend verliefen die Trennungen des N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilates (79) und des Methyl 3-methoxybenzilates (69) an Amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamat) (Chiralpak AD) als stationäre Phase. An den Cellulosederivaten Chiracel OJ und OD wurden ebenfalls Racemattrennungen, jedoch mit geringer chromatographischer Auflösung, verzeichnet. Dagegen erwiesen sich Chiraspher und Chiradex (β-Cyclodextrin) in jeder Beziehung als ungeeignet, um Derivate racemischer Benzilsäuren zu trennen.

Analytische HPLC-Trennungen an Chiralpak AD. Weitere Benzilatderivate wurden zur analytischen Charakterisierung der oben genannten Methode an Chiralpak AD (Tab. 10) unterzogen. Gute Trennungen zeigten Verbindungen der Piperidylester (Tab. 11). Dagegen erwies sich die Methode für verschieden substituierte Methylester als nicht zweckmäßig. Die Zuordnung der absoluten Konfiguration zu den jeweiligen Peaks im HPLC-Chromatogramm konnte über die S-Enantiomere, welche durch stereoselektive Synthese gewonnen wurden, realisiert werden. Die Güte der Trennung wird durch die chromatographische Auflösung RS beschrieben.

Die Auflösung wurde aus der Differenz der Gesamtretentionszeiten (t ges ) (Totzeit + Nettoretentionszeit (Zeit der Substanz in oder an der stationären Phase)) von Peak 1 und 2, sowie der Summe der Halbwertsbreite (HWB) von Peak 1 und 2 berechnet [58]. Da sich bei ungenügender Trennleistung die Basisbreite der Peaks nur unzureichend bestimmen ließ, wurde die Halbwertsbreite der Peaks verwendet, die durch den Faktor 1,18 berücksichtigt wird.

Optimierung der Trennleistung. Die Möglichkeiten der Optimierung einer Methode sind begrenzt. Ist die chromatographische Auflösung RS < 1,4, liegen zwei Peaks unvollständig getrennt im Chromatogramm vor. Eine Modifikation des Eluenten bzw. die Zusammensetzung des Eluentengemisches kann die Trennleistung verbessern. Allerdings werden für Chiralpak AD nur Gemische aus n-Hexan/2-Propanol und n-Hexan/Ethanol beschrieben. Neben n-Hexan/2-Propanol/Diethylamin (in verschiedenen Anteilen) wurde reines Methanol als Eluent verwendet. Die Mischung n-Hexan/Ethanol/Diethylamin erbrachte keine Vorteile. Methanol eignet sich nur für eine schnelle chromatographische


[Seite 62↓]

Tab. 11: Retentionszeiten und chromatographische Auflösung RS von enantiomeren N-Methyl-4-piperidyl benzilaten

 

Substitution R (Verbindungs-Nr.)

Retentionszeit t

(min)

Methode*:

Eluent**, Fluss, UV

Auflösung R S

 

4-tert-Butyl-

(1)

R

23,74

 

67/33/0,1

 

1,21

 

 

(2)

S

25,81

 

1 ml/min, 230 nm

   

4-Methylsulfonyl-

(17)

R

18,10

 

75/25/0,1

 

1,12

 

 

(18)

S

19,52

 

0,8 ml/min, 230 nm

   

4-Trifluormethoxy-

(9)

R

13,03

 

95/5/0,1

 

2,85

 

 

(10)

S

10,48

 

1 ml/min, 230 nm

   

4-Trifluormethyl-

(11)

R

15,28

 

95/5/0,1

 

8,92

 

 

(12)

S

11,41

 

1 ml/min, 230 nm

   

3-Methoxy-

(15)

R

11,28

 

85,5/14,5/0,1

 

2,13

 

 

(16)

S

13,13

 

0,9 ml/min, 230 nm

   

3,5-Dimethoxy-

(13)

R

9,62

 

81/19/0,1

 

2,73

 

 

(14)

S

11,87

 

1 ml/min, 281 nm

   

4-n-Butyl-

(3)

R

17,57

 

24/76/0,1

 

1,01

 

 

(4)

S

16,75

 

0,3 ml/min, 230 nm

   

4-Butoxy-

(5)

R

30,87

 

95/5/0,1

 

1,09

 

 

(6)

S

29,49

 

0,7 ml/min, 230 nm

   

4-Dimethylamino-

(7)

R

14,90

 

85,5/14,5/0,1

 

1,40

 

 

(8)

S

15,87

 

0,9 ml/min

   

4-Methoxy-

(94)

 

keine Trennung

  

3,4-Dihydroxy-

(93)

  

3,4-Dimethoxy-

(92)

  

3-Trifluormethoxy-

(81)

  

* Chiralpak AD, 250 nm x 4,6 mm
** Eluent: n-Hexan/2-Propanol/Diethylamin


[Seite 63↓]

Trennung mit kurzen Retentionszeiten an Chiralpak AD. Nachteile sind die geringe chromatographische Auflösung und ein peak-Tailing. Die Mehrzahl der erfolgreichen Trennungen wurde mit n-Hexan/2-Propanol/Diethylamin als mobiler Phase vollzogen. Eine Erhöhung der Trennstufenzahl und damit verbundene Optimierung der Trennleistung kann erreicht werden, indem die Wechselwirkung zwischen Benzilat und stationärer Phase erhöht wird. Dieses wurde durch eine Modifizierung der Polarität des Eluentengemisches (verschiedene Verhältnisse von n-Hexan/2-Propanol) realisiert. Häufig verlängerten sich dadurch jedoch die Retentionszeiten. Zu lange Retentionszeiten (> 20 min) machen sich durch eine inakzeptable Peakverbreiterung bemerkbar. Die Van-Deemter-Kurve beschreibt diesen Effekt in Abhängigkeit von der Strömungsgeschwindigkeit. Eine Gegenregulation durch Erhöhung der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase ist bis zum Erreichen eines Drucklimits möglich. Weitere Einschränkungen bestehen bezüglich der Verhältnisse von n-Hexan/2-Propanol. Die höhere Viskosität von 2-Propanol macht sich in einem Anstieg des Druckes bemerkbar und limitiert eine gegebenenfalls nötige Optimierung der Trennleistung. Für analytische Zwecke kann eine Gradientenmethode für die Trennleistung große Vorteile bringen. Da die analytische Methode nachfolgend auf semipräparativen Maßstab übertragen werden soll, wird eine isokratische Methode gegenüber einer Gradientenmethode bevorzugt.

Enantiomerendiskriminierung und Elutionsreihenfolge. Eine stereoselektive Diskriminierung sowie die Elutionsreihenfolge der R- und S-Enantiomere werden von der Substitution der Phenylringe bestimmt. Bei einer Änderung der Stellung der Methoxygruppe von Position 3 (79) nach 4 (94) des Piperidyl benzilates lässt sich unter denbeschriebenenHPLC-BedingungenkeineEnantiomerentrennungmehrerzielen (Tab. 12). Befindet sich dagegen in Position 4 eine Trifluormethoxygruppe (76), werden die Peaks hinsichtlich ihrer absoluten Konfiguration von 79 vertauscht. Das S-Enantiomer eluiert vor dem R-Enantiomer. Ein gleichartiger Effekt wird für Verbindungen mit identischer Kernsubstitution, jedoch mit unterschiedlichen Alkoholresten in der Esterkomponente, beobachtet. Im Vergleich zum Piperidylester 79 (R vor S) eluiert beim Methylester der 3-Methoxyverbindung (69) das S-Enantiomer vor dem R-Enantiomer (Tab. 12). Ein Zusammenhang zwischen der Art der Substitution des Benzilatmoleküls und deren Einfluss auf die Reihenfolge der eluierenden Enantiomere (S vor R oder R vor S) konnte nicht festgestellt werden.


[Seite 64↓]

Tab. 12: Elutionsreihenfolge strukturell verwandter Benzilate

Verbindung

Elutionsreihenfolge

Methyl 3-methoxybenzilat (69)

S vor R

N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (79)

R vor S

N-Methyl-4-piperidyl 4-methoxybenzilat (94)

keine Trennung

N-Methyl-4-piperidyl 4-trifluormethoxybenzilat (76)

S vor R

Semipräparative Methode. Für ein erstes pharmakologisches Screening der Enantiomere wurden von (R)- bzw. (S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-dimethylaminobenzilat (7/8) und (R)-bzw. (S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-trifluormethoxybenzilat (9/10) kleine Mengen im Bereich von 8 bis 10 mg pro Enantiomer gewonnen. 0,5 mg Racemat können pro Zyklus (Injektion) an Chiralpak AD getrennt werden, d. h. nach 40 Zyklen werden ca. 8 bis 10 mg pro Enantiomer gewonnen. Dabei muss die Detektorempfindlichkeit so weit verringert werden, dass der höchste Punkt des Peaks noch erkannt und der Verlauf des Peaks vollständig verfolgt werden kann. Der Beginn des Fraktionensammelns kann andernfalls nicht eindeutig festgelegt werden.

3.1.4.2. Indirekte Racemattrennung an achiraler stationärer Phase

Bei der indirekten Racemattrennung verläuft die Trennung des Racemates über Diastereomere, die aufgrund ihrer unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften in einer achiralen Umgebung vollzogen werden kann. Dazu müssen

geeignete Diastereomere aus den Enantiomeren gebildet werden. Beispielsweise verwendet Meyers chirale Oxazoline, um α-substituierte Mandelsäure chromatographisch zu trennen (Abb. 13) [59].

Abb. 13: Chirale Oxazoline

Eine Alternative zu den chiralen Oxazolinen und (-)-8-Phenylmenthyl-derivaten stellen einfache (-)-Menthylester der racemischen Benzilsäure dar. Die Synthese der (-)-Menthyl benzilate gelingt durch Umesterung der adäquaten racemischen Methylester, welche eine Synthesevorstufe zu den enantiomeren und racemischen Zielstrukturen darstellen. Aufgrund der schlechten Kristallisationsneigung der (-)-Menthyl benzilate ist eine Trennung durch fraktionierte [Seite 65↓]Kristallisation nicht möglich. Daher sollten die Möglichkeiten einer chromatographischen Trennung an einer achiralen stationären Phase untersucht werden. An modifiziertem Kieselgel (RP-18) gelingt bis auf (-)-Menthyl 4-trifluormethoxybenzilat (83) die Trennung aller Verbindungen unter den in Tab. 13 angegebenen Bedingungen.

Tab. 13: Diastereomerentrennung durch RP-HPLC

Substitution R (Verbindungs-Nr.)

Retentionszeit t (min)

Methode

Auflösung R S

4-Dimethylamino-

(82)

t1 :

27,33

LiChrospher RP-18 250-4 (5 μm),

Acetonitril/Wasser 70/30

Fluss: 1,5 ml/min

Detektion: λ = 230 nm und 281 nm

 

1,35

 

 

t2 :

29,22

  

4-Trifluormethoxy-

(83)

t1 :

37,58

 

-

  

t2 :

-

  

3-Methoxy-

(84)

t1 :

18,94

 

0,92

 

 

t2 :

19,81

  

3,4-Dimethoxy-

(85)

t1 :

12,09

 

1,73 (Abb. 14)

 

 

t2 :

13,45

  

4-Methylsulfonyl-

(86)

t1 :

7,66

 

1,58

 

 

t2 :

8,25

  

Am Beispiel der 3,4-Dimethoxyverbindung (85) konnte die analytische Methode (Abb. 14) erfolgreich auf eine semi-präparative Säule übertragen werden (LiChrospher RP-18, 250-10, 7 mm). Für die semipräparative Arbeit erwies sich ein Gemisch von Acetonitril/Wasser 50:50 bei einem Fluss von 3 ml/min als Optimum.

Abb. 14: HPLC-Chromatogramm von (-)-Menthyl  (R,S)-3,4-dimeth-oxy benzilat (85)


[Seite 66↓]

20 mg (-)-Menthyl 3,4-dimethoxybenzilat wurden dabei pro Zyklus injiziert und getrennt. Nach 10 Zyklen konnten 90 bis 100 mg pro Diastereomer erhalten werden.

3.1.4.3. Diskussion

Untersuchungen zur chromatographischen Trennung zeigen, dass sich racemische Benzilsäurederivate durch direkte und indirekte Methoden trennen lassen. Generell sind chromatographische Trennungen durch hohe ee- und de-Werte der gewonnenen Enantiomere/Diastereomere gekennzeichnet, da auftretende Mischfraktionen verworfen werden können.

Direkte Racemattrennung an chiraler Phase. Aus dem Pool von β-Cyclodextrin (Chiradex), Poly-(N-Acryloyl-S-phenylalaninethylester (Chiraspher), Celluloseestern (Chiralcel OJ), -carbamaten (Chiralcel OD) und Amylosecarbamaten (Chiralpak AD) stellte sich Amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamat) als geeignete stationäre Phase heraus. Ein Vergleich mit Cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamat), welches durch eine identische Substitution der Phenylringe gekennzeichnet ist, belegt, dass das Biopolymer Amylose für die verbesserte Selektivität verantwortlich ist. Das ist insofern bemerkenswert, als Cellulose wie auch Amylose unverzweigte, aus D-Glucose aufgebaute Ketten sind. Der einzige Unterschied besteht in der 1,4-glykosidischen Bindung: Amylose ist α-glykosidisch, Cellulose ist β-glykosidisch verknüpft. Die in Vorversuchen entwickelte und optimierte Methode für N-Methyl-4-piperiyl 3-methoxybenzilat (79) konnte in den meisten Fällen auf andere N-Methyl-4-piperidyl benzilate übertragen werden. Eine Basislinientrennung wurde für die Verbindung 75, 76, 78, 79 und 80 erreicht (RS> 1,4), was Voraussetzung für eine genaue quantitative Bestimmung der Enantiomerenzusammensetzung ist. Verbindungen mit schlechter Auflösung wie N-Methyl-4-piperidyl 4-n-butylbenzilat (73) (RS = 1,01) und N-Methyl-4-piperidyl 4-butoxybenzilat (74) (RS = 1,09) lassen zwar eine Zuordnung der Enantiomere zu, jedoch sind exakte quantitative Bestimmungen nicht möglich. Eine Aussage darüber, nach welchen Gesetzmäßigkeiten eine stereoselektive Diskriminierung enantiomerer Benzilate an Amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamat) verläuft, kann nicht getroffen werden. Beispielsweise kann N-Methyl-4-piperidyl 4-trifluormethoxybenzilat (77) mit einer großen Auflösung (RS = 8,92) getrennt werden, hingegen zeigt das Stellungsisomer 3-Trifluormethoxybenzilat (81) nicht einmal ansatzweise eine Racemattrennung. Auffällig [Seite 67↓]ist eine Änderung der Elutionsreihenfolge von R- und S-konfigurierten Benzilaten in Abhängigkeit geringer struktureller Veränderungen, z. B. Abwandlung der Substitution am Aromaten oder des Esterrestes. So eluiert das R-Enantiomer der 4-tert-Butylverbindung (1) gegenüber dem S-Enantiomer zuerst. Handelt es sich dagegen um eine n-Butylgruppe in 4-Position, wird das S-Enantiomer (4) zuerst eluiert. Das Herleiten der absoluten Konfiguration einer Substanz von einer strukturell verwandten Verbindung mit bekannter Konfiguration, basierend auf der Elutionsreihenfolge, ist somit ausgeschlossen. Die Zuordnung der absoluten Konfiguration zu den einzelnen Peaks muss in jedem Fall sorgfältig durch synthetisierte, enantiomere Vergleichssubstanz erfolgen.

Die Racemattrennungen der Synthesevorstufen der Zielstrukturen (Benzilsäuren, Methyl benzilate) gelingen nur vereinzelt. An Chiracel OD und OJ konnten ansatzweise racemische 3-Methoxybenzilsäuren (89) getrennt werden. Für Methyl 3-methoxybenzilat (69) wurde eine Methode an Chiracel AD entwickelt. Jedoch lassen sich diese Methoden nicht mit gleichem Erfolg (geringere chromatographische Auflösung RS) auf andere Derivate (Benzilsäuren und Methyl benzilate) übertragen, wie es bei den N-Methyl-4-piperidyl benzilaten möglich war.

Indirekte Racemattrennung an achiraler stationärer Phase. Wenn die direkte Racemattrennung versagt (z. B. N-Methyl-4-piperidyl 3,4-dimethoxybenzilat (92)), lässt sich eine indirekte Trennung über Diastereomerengemische durchführen. Durch Bildung von (-)-Menthyl benzilaten wurden geeignete Diastereomerengemische erhalten. Die Trennung der diastereomeren Menthylester 82, 84, 85 und 86 gelingt durch RP-Chromatographie mit Ausnahme des Menthylesters der 3-Trifluormethoxyverbindung (83). Für Verbindung 85 wurde diese Methode mit einer chromatographischen Auflösung von Rs=1,76 erfolgreich auf den semipräparativen Maßstab übertragen. Mengen von 100 mg bis 200 mg lassen sich durch semipräparative HPLC gewinnen. Ein weiteres Up-Scaling auf eine präparative Methode zur Gewinnung größerer Mengen (500 mg bis 1 g) sollte möglich sein. Ein Nachteil der indirekten Methode ist ein zusätzlicher Syntheseaufwand zur Herstellung der Diastereomere sowie eine anschließende Regeneration der Enantiomere.


[Seite 68↓]

3.1.5.  Enzymatische Umsetzung

Enzyme sind chirale Makromoleküle. Als solche können sie Reaktionen hochselektiv (enantio- und regioselektiv) katalysieren. Enzymreaktionen verlaufen meist unter relativ milden Bedingungen, d. h. bei Raumtemperatur und bei pH-Werten um den Neutralpunkt. Das ist eine wichtige Voraussetzung für Verbindungen, die zu Instabilitäten und Racemisierung neigen. In Untersuchungen zur Metabolisierung von N-Methyl-4-piperidyl benzilaten an der Ratte wurden unter anderem Benzilsäuren als Metabolite gefunden [60, 61, 62]. Durch enzymatischen Abbau sind diese aus ihren Estern hervorgegangen. Somit stellen Benzilsäureester potenzielle Substrate für Enzyme dar. Die enantiomere Reinheit des Produktes ist im Wesentlichen von der Enantioselektivität des Enzyms abhängig. Im Folgenden soll untersucht werden, ob sich enantiomere Benzilate durch enzymkatalytische Umsetzung darstellen bzw. anreichern lassen (Schema 13).

Schema 13: Enzymatische Hydrolyse von Benzilsäureestern

Da Enzyme unter Umständen eine geringe Substratbreite besitzen, wurde nach geeigneten Enzymen gesucht, die Substrate mit strukturellen Ähnlichkeiten zu den Benzilsäuren katalytisch umsetzen:

3.1.5.1. Vorversuche - Enzymscreening

In Vorversuchen sollte festgestellt werden, ob Umsetzungen verschiedener Benzilsäurederivate durch CCL, PCL, PLE und PPL katalysiert werden. Folgende enzymkatalysierte Reaktionen wurden getestet:

a)

Veresterung der Benzilsäure mit n-Butanol

b)

Esterhydrolyse von Methyl benzilaten

c)

Esterhydrolyse von 4-Piperidyl benzilaten

d)

Esterhydrolyse von 3-Piperidyl benzilaten

e)

Esterhydrolyse der acetylierten tertiären alkoholischen Gruppe

f)

Veresterung der tertiären alkoholischen Gruppe mit Acetanhydrid

Die Esterhydrolysen (b, c, d, e) wurden in Phosphatpuffer pH 7,4 durchgeführt. Die untersuchten Cosolventien Aceton und Acetonitril (bis 20 %) erbrachten keinen Vorteil. Für die Veresterungen (a, f) wurde Toluol als organisches Lösungsmittel eingesetzt. Sämtliche Enzymreaktionen wurden bei einer Temperatur von 37°C ausgeführt. Eine Blindprobe (Substrat ohne Enzymzusatz) wurde zu jeder Zeit mitgeführt. Die enzymatischen Umsetzungen wurden dünnschichtchromatographisch s. Kap. 4.: FM I oder FM II, Detektion: Schwefelsäure verfolgt. Eine Übersicht der enzymatischen Umsetzungen ist in Schema 14 dargestellt. Die Stärke der Pfeile entspricht der quantitativen Umsetzung der Substrate. Neben den 3-Methoxyderivaten (Schema 14) wurden weitere Verbindungen als Substrate eingesetzt. Allein durch dünnschichtchromatographische Auswertung der Substratumsetzung konnte eine Abhängigkeit der Hydrolysegeschwindigkeit vom Substitutionsmuster beobachtet werden (Tab. 14). Die Blindproben zeigten zu keiner Zeit dünnschichtchromatographisch sichtbare Hydrolyseprodukte.


[Seite 70↓]

Tab. 14: Enzymatische Umsetzung von racemischen Benzilsäurederivaten

Substitution R

Keine enzymatische Umsetzung:

3-CH3O-, 5-CH3O-

 

4-tert-C4H9-

 

3-CH3O-

3-CH3O-

3-CH3O-

 

4-CH3SO2-

   

Enzymatische Umsetzung:

 

4-CH3SO2-

3-CH3O-, 5-CH3O-

3-CH3O-

  

3-CH3O-

4-(CH3 ) 2 N-

3-CH3O-,5-CH3O-

  

3-CH3O-,5-CH3O-

4-C4H9O-

   

4-F3C-

4-n-C4H9-

   
 

4-F3C-

   
 

4-F3CO-

   
 

3-CH3O-

   

Zunahme der Hydrolysegeschwindigkeit

Schema 14: Enzymatische Umsetzung von Benzilsäurederivaten


[Seite 71↓]

Auf fortführende quantitative Untersuchungen zu den Hydrolysegeschwindigkeiten wurde an dieser Stelle verzichtet. Vielmehr sollte eine eventuell vorhandene Enantioselektivität, die für eine kinetische Racematspaltung zwingend erforderlich ist, geklärt werden.

3.1.5.2. Enantioselektivität der enzymatischen Reaktion

Basierend auf den in den Vorversuchen erzielten Erkenntnissen wurde speziell die Hydrolyse von substituierten N-Methyl-4-piperidyl benzilaten (c) und Methyl benzilaten (b) durch PLE genauer untersucht. Es wurden kontinuierlich Proben (100 μl) zu folgenden Zeiten entnommen: 1 h (Raumtemperatur, geschüttelt), 16 h (37°C), 20 h (37°C), 33 h (37°C), 65 h (37°C), 85 h (37°C), 100 h (37°C), 120 h (37°C). Die enantioselektive Hydrolyse wurde mittels HPLC durch Bestimmung der enantiomeren Zusammensetzung des Substrates verfolgt (Tab. 15). PLE zeigte an den Methyl benzilaten keine Enantioselektivität. Die Methyl benzilate sind daher nicht in der Tab. 15 aufgeführt.

Tab. 15: Resultate der enzymatischen Hydrolyse

Substitution R (Verbindungs-Nr.)

Enantiomerenverhältnis [%]*

Inkubationszeit bei 37°C(h)

3-CH3O-

(79)

61,2:38,8 (S)

65

3-CH3O-, 5-CH3O-

(78)

62,0:38,0 (S)

100

4-F3C-

(77)

43,7:55,7 (S)

16

4-CH3SO2-

(80)

45,0:55,0 (R)

74,5

4-CF3 O-

(76)

40,5:59,5 (S)

16

*in Klammern befindet sich das Enantiomer, welches bevorzugt durch PLE hydrolysiert wird

Innerhalb der 4-Piperidylestergruppe (c) konnte eine nur mäßige Enantioselektivität der PLE festgestellt werden. Das S-Enantiomer wurde als Substrat bevorzugt von PLE umgesetzt (Ausnahme: 4-Methylsulfonylverbindung (80)). Ist die enantiomere Reinheit [Seite 72↓]des Substrates oder des Produktes sowie die prozentuale Umsetzung bekannt, kann der E-Wert (biochemischer Stereoselektivitätsfaktor) bestimmt werden. Der E-Wert ist ein Maß für die Enantioselektivität eines Enzyms. Für N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (79) wurde mit Gleichung:

E: E-Wert (biochemischer Stereoselektivitätsfaktor)

eeSubstrat: Enantiomerenüberschuss des Substrates

c: Umsetzung

ein E-Wert von nur 1,4 berechnet. Für synthetische Zwecke sind enzymatische Umsetzungen erst ab einem E > 20 sinnvoll [69]. Daher wurden die Experimente an dieser Stelle abgebrochen.

3.1.5.3. Diskussion

Enzymatische Umsetzungen mit den favorisierten und untersuchten Enzymen (PLE, PCL, CCL, PPL) eignen sich nicht zur Darstellung von enantiomerenreinen Benzilaten. Lediglich eine Anreichung eines Enantiomers kann realisiert werden.

Die Untersuchungen zeigen, dass Benzilate Substrate für enzymatische Hydrolysen darstellen (b, c und d, Schema 14). Die Veresterung der freien Säure (a) und die Acylierung der tertiären OH-Gruppe (f) bzw. Hydrolyse der bereits acetylierten OH-Gruppe (e) gelangen nicht. Untersucht wurden vier verschiedene Enzyme PLE, PCL, PPL und CCL. Von denen weist nur PLE enzymatische Aktivität gegenüber den Benzilsäurestern auf. PLE hat neben der großen Substratbreite, die in diesen Experimenten bestätigt werden konnte, weitere Vorteile. PLE ist preiswert, stabil und benötigt keine Coenzyme. Die im Handel erhältliche PLE besteht aus einer Mischung von Isoenzymen, welche gleiche Stereospezifitäten aufweisen. Aufgrund dieser Eigenschaft wird PLE in der asymmetrischen Synthese als ein einheitliches Enzym eingesetzt [70].

Entscheidend für die Hydrolysegeschwindigkeit von Benzilaten unter Verwendung des Enzyms PLE ist die Alkoholkomponente des Esters. Die aromatischen Substituenten besitzen einen kleinen, aber messbaren Einfluss auf die Hydrolysegeschwindigkeit.

Alkoholkomponente. 3-Piperidyl- (d), 4-Piperidyl- (e) und Methyl benzilat (b) wurden enzymatisch hydrolysiert (Schema 14). Zur Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes greift PLE (Hydrolase vom Serintyp) mit der OH-Gruppe des Serinrestes den Carbonylsauerstoff [Seite 73↓]der Säure an [71]. Sterische Effekte oder eine herabgesetzte Reaktivität des Carbonylsauerstoffs können die Ursache für eine nicht erfolgte oder nur mäßige Umsetzung sein. Erfahrungsgemäß werden Ester primärer kurzkettiger Alkohole (z. B. Methanol) besonders gut durch PLE hydrolysiert. Der für das Enzym räumlich gut zugängliche Carbonylsauerstoff ist vielleicht eine Erklärung. Demnach müsste der Methylester (primärer Alkohol) die höchste Hydrolysegeschwindigkeit aufweisen. Erstaunlich ist, dass Methyl- wie auch 4-Piperidylester (sekundärer Alkohol) in etwa gleiche Hydrolysezeiten (3,8 d und 3,5 d) für die Umsetzung des gesamten Substrates zeigten. Eine weitere Steigerung der Hydrolysegeschwindigkeit wurde für den 3-Piperidylester (sekundärer Alkohol) mit einer vollständigen Hydrolyse des Substrates nach nur 0,6 d beobachtet. Dieser große Unterschied des 3-Piperidylesters gegenüber den anderen Estern könnte auf eine zusätzliche Bindungsstelle zwischen Substrat und Enzym hinweisen. Offensichtlich kommt der isomeren Stellung des Stickstoffatoms im 3-Piperidinol eine besondere Rolle zu, vergleicht man die Hydrolysegeschwindigkeit zwischen 3- und 4-Piperidylester (Schema 14). Möglicherweise werden über den Stickstoff in Position 3 zusätzliche stabilisierende Wasserstoffbrücken im Enzym-Substrat-Komplex aufgebaut. Sterische Effekte durch die in 3- oder 4-Stellung befindliche Methylgruppe kommen ebenfalls in Betracht.

Die beobachtete Resistenz der acylierten tertiären Alkoholstruktur gegenüber enzymatischer Hydrolyse (e) wie auch die nicht erfolgte enzymatische Acylierung der tertiären Alkoholgruppe (f) lassen sich ebenfalls auf sterische Effekte zurückführen. In der Literatur werden zwar Hydrolysen tertiärer Alkohole durch Lipasen wie CCL und PPL beschrieben, aber verlaufen diese aufgrund der räumlichen Abschirmung tertiärer Alkohole meist erschwert.

Aromatische Substitution. Die aromatischen Substituenten zeigen innerhalb einer Estergruppe (Methylester (b), 4-Piperidylester (c), Tab. 14) unterschiedliche Hydrolysegeschwindigkeiten. In der Methylestergruppe wurde beispielsweise die 3,5-Dimethoxyverbindung schneller als die 3-Methoxy- bzw. 4-Mehylsulfonylverbindung hydrolysiert. Gleiche Substituenten in der 4-Piperidylestergruppe (c) zeigten eine andere Reihenfolge der Hydrolysegeschwindigkeiten (3-Methoxy > 3,5-Dimethoxy > 4-Methylsulfonyl), so dass eine Korrelation der Hydrolysegeschwindigkeit in Abhängigkeit von der aromatischen Substitution nicht festzustellen war.


[Seite 74↓]

Veresterung. Die missglückte enzymatische Veresterung der Benzilsäure (a) muss z. T. auf eine sterische Abschirmung zurückgeführt werden. In der Literatur werden enzymatische Esterbildungen vorwiegend für Säuren mit tertiärem stereogenen Zentrum in α-Stellung beschrieben. Nur wenige Beispiele sind für quartäre stereogene Zentren in α-Stellung der Säure bekannt. Eine alleinige sterische Begründung ist jedoch abzulehnen, da die Umkehrreaktion (Hydrolyse der Benzilsäureester) möglich ist.

Enantioselektivität. PLE zeigte für alle enzymatischen Umsetzungen eine nur geringe Enantioselektivität. Bevorzugt wurde das S-Enantiomer umgesetzt. Eine Änderung der Temperatur und des pH-Wertes, Cosolventien, eine vorherige Reinigung der Enzyme oder eine Immobilisierung des Enzyms wie auch eine strukturelle Veränderung des Substrates können sowohl Aktivität als auch die Enantioselektivität drastisch verbessern.

Substratveränderung. Die Enantioselektivität von PLE gegenüber chiralen substituierten α-Hydroxysäureestern ist von der Art der Substituenten in α-Stellung enorm abhängig und wurde für Mandelsäureester untersucht [72]. Ein weitere Arylgruppe in α-Stellung, was

der Struktur von Benzilaten entspricht, scheint die Selektivität herabzusetzen (E = 1,4). Eine wesentliche höhere Selektivität von E = 30 konnte Moorlag bei der Hydrolyse von α-Allylmandelsäureester registrieren [72]. Der Austausch der α-Arylgruppe durch eine sterisch weniger anspruchsvolle Gruppe erhöht die Enantioselektivität immens.

Abb. 15: Enantioselektivität der PLE in Abhängigkeit vom Substrat

Offensichtlich besteht ein Zusammenhang zwischen der relativen Größe der α-Substituenten zueinander und der Enantioselektivität der PLE. Für lipasekatalysierte Reaktionen von sekundären Alkoholen und chiralen Carbonsäuren wurden derartige Zusammenhänge dokumentiert [69].

Weitere Enzyme. PCL, CCL und PPL zeigten keine Aktivität bei der Umsetzung von Benzilaten. Da diese Lipasen in der Praxis überwiegend für die Gewinnung von enantiomeren Alkoholen eingesetzt werden [73], wäre selbst bei einer vorhandenen Hydrolyseaktivität für chirale Benzilsäurederivate, eine geringe Enantioselektivität zu erwarten gewesen.


[Seite 75↓]

3.2.  Analytische Charakterisierung

Die Strukturaufklärung und -verifizierung der Synthesevorstufen und Zielstrukturen wurde vor allem durch NMR-spektroskopische und massenspektrometrische Untersuchungen realisiert. In einigen Fällen konnte die Röntgenkristallstrukturanalyse den Beweis für die Zielstrukturliefern.DieenantiomerenZielstrukturenwurdenzusätzlichdurchUV-,CD-/ORD-Spektren, optische Drehung und HPLC charakterisiert. Durch CHN-Analysen und HPLC-Untersuchungen konnte die Reinheit der Zielstrukturen bestätigt werden. Intensive Untersuchungen zur Kernresonanzspektroskopie und Massenspektrometrie racemischer chiraler und achiraler Benzilate wurden von Vorwerk [5] durchgeführt. HPLC-Untersuchungen enantiomerer und diastereomerer Benzilate wurden bereits im Kap. 3.1.4 besprochen. Im Rahmen dieser Arbeit sollen insbesondere die analytischen Methoden

zur Charakterisierung der Stereoisomeren diskutiert werden. Ferner werden die Ergebnisse der Röntgenkristallstrukturanalyse besprochen, da hierdurch Aussagen zu den bevorzugten Konformationen von N-Methyl-4-piperidyl benzilaten möglich sind.

3.2.1. Polarimetrie

Ein Beweis für das Vorliegen einer enantiomeren bzw. enantiomer angereicherten Verbindung ist das Auftreten optischer Aktivität. Hierzu wurdenpolarimetrische Untersuchungen in methanolischen oder ethanolischen Lösungen der enantiomeren Benzilate bei 589,3 nm (Na-D Linie) und 20°C durchgeführt. Die spezifische Drehung wurde aus dem gemessenen Drehwinkel α berechnet:

α: gemessener Drehwinkel [°]

c: Konzentration der Lösung [g/100 ml]

l: Schichtdicke [dm]

In Abhängigkeit von der Substitution des aromatischen Systems (3-Methoxy- und 3,5-Dimethoxy-) lässt sich eine Änderung des Vorzeichens der optischen Drehung konstatieren [Seite 76↓](Tab. 16). Dieser Effekt ist nicht außergewöhnlich, da der Drehsinn von Parametern wie Lösungsmittel, Temperatur und Wellenlänge beeinflusst werden kann. Selbst eine Konzentrationsänderung (z. B. Äpfelsäure) kann einen gegensätzlichen Drehsinn hervorrufen. Das Ableiten der absoluten Konfiguration in Anlehnung an den Drehsinn ist somit nicht möglich. Auffällig sind die kleinen optischen Drehwerte für chirale N-Methyl-4-piperidyl benzilate (Tab. 16). Die Enantiomere der tert-Butyl- und n-Butylverbindung zeigen sogar unter den beschriebenen Bedingungen keine optische Aktivität (cryptochiral). Das kann zum Teil auf die begrenzte Messgenauigkeit des Polarimeters zurückgeführt werden. Infolge einer nicht registrierten optischen Aktivität kann fälschlicherweise der Eindruck entstehen, dass ein Racemat vorliegt. Dieser Umstand erklärt die dokumentierten Schwierigkeiten der Racemattrennung von Benzilaten wie im Fall von 4-Methoxybenzilsäure (nur = +1,2° (c = 2,52, Dioxan) [74]. Verbindungen mit inhärenter Cryptochiralität können durch Aufnahme von CD-/ORD-Spektren als solche identifiziert werden.

Tab. 16: Spezifische Drehung enantiomerer Benzilate

Substitution R

Spezifische Drehung*

Vorzeichen der spezifischen Drehung

  

R**

S**

4-tert-Butyl-

keine opt. Drehung messbar

n. b.

(1)

n. b.

(2)

4-n-Butyl-

keine opt. Drehung messbar

n. b.

(3)

n. b.

(4)

4-Butoxy-

+ 1,2° (c = 0,82, Methanol)

(-)

(5)

(+)

(6)

4-Trifluormethoxy-

+ 8,3° (c = 0,84, Methanol)

(-)

(9)

(+)

(10)

4-Trifluormethyl-

+ 16,8° (c = 2, Ethanol)

(-)

(11)

(+)

(12)

3-Methoxy-

+4,5° (c = 5,2, Ethanol)

(+)

(15)

(-)

(16)

3,5-Dimethoxy-

+ 6,0° (c = 0,65, Methanol)

(+)

(13)

(-)

(14)

4-Methylsulfonyl-

+ 21,1° (c = 1,1, Methanol)

(-)

(17)

(+)

(18)

* Konzentration c [g/100 ml], Lösungsmittel in Klammer
** Verbindungs-Nr. in Klammer


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3.2.2.  Circulardichroismus (CD) und Optische Rotationsdispersion (ORD)

Zur näheren Charakterisierung und Identifizierung enantiomerer Benzilate mit geringen Drehwerten bzw. cryptochiralen Eigenschaften wurden CD-Spektren aufgenommen. Beim Circulardichroismus wird die Eigenschaft optisch aktiver Verbindungen ausgenutzt, rechts und links polarisiertes Licht unterschiedlich zu absorbieren [75, 76]. Voraussetzung für die Aufnahme von CD-Spektren sind daher chromophore Gruppen. Geeignete chromophore Gruppen der Benzilate sind die Phenylgruppen, die durch drei Absorptionsbanden (Absorptionsbanden des Benzens: 184 nm: β-Bande, 198 nm: p-Bande, 255 nm: α-Bande) charakterisiert sind.

Insbesondere wurden die enantiomeren Absorptionsunterschiede zwischen 250 und 300 nm betrachtet. Die Banden in diesem Bereich (α-Bande) sind auf π-Elektronenübergänge der Phenylsubstituenten zurückzuführen und durch eine feine Strukturierung gekennzeichnet. CD-Maxima oder -Minima korrelieren im Wellenlängenbereich in etwa mit den Absorptionsmaxima des UV-Spektrums. Sauerstoffhaltige Substituenten am Aromaten führen zu einer bathochromen Verschiebung, was deutlich in den CD-Spektren von 3-Methoxy- (15, 16) und 3,5-Dimethoxybenzilat (13, 14) zu erkennen ist. Alkyl-substituenten und 4-Trifluormethylsubstituenten zeigen ähnliche CD-Maxima wie die unsubstituierten Benzilsäureester (252, 258, 264 und 268 nm) im UV-Spektrum (Abb. 16).

Die Absorptionsunterschiede von R- und S-konfiguriertem, cryptochiralem N-Methyl-4-piperidyl 4-tert-butylbenzilat (1/2) resultieren in spiegelbildlichen CD-Spektren (Abb. 16). Dies beweist eindeutig das Vorhandensein optischer Aktivität und somit das Vorliegen zweier Enantiomere. Der Zusammenhang zwischen Molarer Elliptizität [θ] (Grad⋅cm2⋅decimol-1) und dem molaren Ab-sorptionskoeffizienten ε ist: [θ] = 3298,2 ⋅Δε, wobei Δε = εL - εR (εL, εR : molare Absorptionskoeffizienten für links- und rechtscircular polarisiertes Licht (lmol -1cm -1 )) darstellt.

Abb. 16: CD-Spektren von (R)- und (S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-tert-butyl-benzilat (1/2)


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Das Vorzeichen der CD-Kurve wird durch die absolute Konfiguration des Benzilates bestimmt. Hierbei wurde für die untersuchten Benzilate im Bereich von 250 bis 300 nm immer eine negative CD-Kurve für die R-konfigurierten Verbindungen (1, 11, 15, 17) erhalten, analog dazu eine positive für die S-Enantiomere (2, 6, 10, 14). Trotzdem ist ein Herleiten der absoluten Konfiguration von Benzilaten basierend auf dem Vorzeichen der CD-Kurve strikt abzulehnen. So belegen CD-Untersuchungen (230 bis 290 nm) von (R)-α-Phenylethylalkohol, dass bereits die Stellung eines Chlorsubstituenten (o-, m- oder p) das Vorzeichen der CD-Kurve verändert [77].

Stanchevs Bemühungen, die absolute Konfiguration von Benzhydrolderivaten auf Grundlage des längstwelligen Cotton-Effektes der α-aromatischen Bande abzuleiten, konnte auf Benzilate nicht übertragen werden [78].

Die Abhängigkeit der optischen Drehung von der Wellenlänge wird in ORD-Spektren dargestellt. Unter Anwendung der Kronig-Kramer-Gleichung (Beziehung zwischen Absorption und Refraktion) können aus den CD-Spektren die ORD-Spektren erhalten werden.

Abb. 17: CD- und ORD-Kurven von (S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-butoxybenzilat (6), [θ] und [φ] (Grad⋅cm2⋅decimol-1)

Der Verlauf der ORD-Kurve in Abb. 17 zeigt für das S-Enantiomer der 4-Butoxyverbindung (6) eindeutig, dass Betrag und Vorzeichen der optischen Drehung entscheidend von der Wellenlänge abhängen. Zu kleineren Wellenlängen nimmt der Betrag der optischen Drehung zu. Verbindungen mit keiner messbaren Drehung bei 589 nm (N-Methyl-4-piperidyl 4-tert-butylbenzilat) bzw. geringer optischen Aktivität (N-Methyl-4-piperidyl 4-butoxy-benzilat) sollten daher bei kürzeren Wellenlängen vermessen werden. Jedoch kann auch bei kürzeren Wellenlängen optische Inaktivität auftreten. Wenn die optische Drehung in Abhängigkeit von der Wellenlänge das Vorzeichen ändert, kommt es zu einem Nulldurchgang (optische Inaktivität). Beispielsweise ist für 6 ein positiver Cotton-Effekt mit einem Nulldurchgang (φ = 0) bei 241 nm zu verzeichnen (Abb. 17). Derartige Nulldurchgänge befinden sich nahe eines UV- bzw. CD-Maximums.


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3.2.3.  Kernresonanzspektroskopie

Neben der Struktursicherung der Syntheseprodukte wurden NMR-spektroskopische Methoden zur Unterscheidung diastereomerer Verbindungen herangezogen. Insbesondere wurde die Anwendbarkeit der NMR-Spektroskopie auf die Bestimmung der diastereomeren Zusammensetzung von (-)-8-Phenylmenthyl- und (-)-Menthyl benzilaten untersucht. In den 1H- und 13C-NMR-Spektren konnten unterschiedliche chemische Verschiebungen für diastereomere Benzilate registriert werden. Besser geeignet für quantitative Aussagen zur diastereomeren Zusammensetzung ist die 1H-NMR-Spektroskopie. Eine wichtige Voraussetzung dafür ist, dass die untersuchten Protonensignale von anderen nicht überlagert werden. Die Signale der Phenylprotonen des (-)-8-Phenylmenthyl benzilates (Ring A, B und C, Abb. 18) liegen im Bereich von 6,3 bis 8,1 ppm. Meist ist hier eine Interferenz der einzelnen Absorptionsbanden zu beobachten. Weiterhin ist der Bereich von 0,7 bis 2,0 ppm durch eine Anhäufung von überlagerten Protonensignalen des Phenylmenthylrestes wie CH2- (Cyclohexanrings) und CH3-Protonen gekennzeichnet. Die besten Voraussetzungen für eine quantitative Auswertung bringen die Signale der Substituenten am aromatischen System (Ring A und B, Abb. 18) mit sich, sofern diese Protonen enthalten (Bereich 2,34 bis 3,92 ppm). Die Differenz der chemischen Verschiebungen liegt bei ca. ΔδH = 0,1 ppm (Tab. 17). Alle Signale werden bis zur Basislinientrennung aufgelöst, so dass durch Integration der Signalflächen die diastereomere Zusammensetzung hervorragend ermittelt werden kann. Im Vergleich dazu betrugen die ΔδH -Werte der (-)-Menthylester nur 0,02 bis 0,04 ppm (Tab. 18). Eine Identifizierung der Stereoisomeren von (-)-Menthyl benzilaten ist möglich. Da die Signale jedoch nicht vollständig aufgelöst sind, können keine exakten quantitativen Aussagen zur Zusammensetzung des Diastereomerengemisches von (-)-Menthyl benzilaten getroffen werden.


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Tab. 17: Chemische Verschiebungen relevanter Substituentenprotonen von (-)-8-Phenyl-menthyl benzilaten

 

 

 

Substitution R (Verbindungs-Nr.)

Chemische Verschiebung der Protonen in R δ H [ppm]*

Art der Protonensignale in R

Differenz der chemischen Verschiebung Δ δ H [ppm] zwischen R und S*

4-tert-Butyl-

(40)

R

1,17

9H, 3 x CH3 (s)

0,1

 

(30)

S

1,27

  

4-Methylsulfonyl-

(44)

R

2,91

3H, CH3 (s)

0,1

 

(39)

S

3,01

  

4-Methylmercapto-

(41)

R

2,34

3H, CH3 (s)

0,1

 

(31)

S

2,44

  

3-Methoxy-

-

R

3,66**

3H, CH3 (s)

0,08

 

(38)

S

3,74

  

4-n-Butyl-

(42)

R

2,46

2H, CH2 (t)

0,1

 

(32)

S

2,56

  

4-Butoxy-

(43)

R

3,82

2H, CH2 (t)

0,1

 

(33)

S

3,92

  

4-Dimethylamino-

-

R

2,82**

6H, 2 x CH3 (s)

0,1

 

(34)

S

2,92

  

* R- und S-Konfiguration bezieht sich auf das asymmetrische C-Atom im Benzilsäureteil
** δH für (-)-8-Phenylmenthyl (R)-benzilat wurde dem 1H-NMR-Spektrum des Diastereomerenpaares (-)-8- Phenylmenthyl (R,S)-benzilat entnommen


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Tab. 18: Chemische Verschiebungen relevanter Substituentenprotonen von (-)-Menthyl benzilaten

Substitution R

(Verbindungs-Nr.*)

Chemische Verschiebung der Protonen in R δ H [ppm]**

Art der Protonensignale in R

Differenz der chemischen Verschiebung Δ δ H [ppm] zwischen R und S***

4-tert-Butyl-

(87)

1,22

9H, 3 x CH3 (s)

0,03

 

 

1,25

  

4-Methylsulfonyl-

(86)

2,97

3H, CH3 (s)

0,03

 

 

3,00

  

3-Methoxy-

(84)

3,68

3H, CH3 (s)

0,02

 

 

3,70

  

4-Dimethylamino-

(82)

2,85

6H, 2 x CH3 (s)

0,04

 

 

2,89

  

* Die Verbindungs-Nr. bezieht sich auf das Diastereomerengemisch
** eine Zuordnung der chemischen Verschiebung zur R- oder S-konfigurierten Benzilsäure ist bei den (-)- Menthylestern nicht erfolgt
*** R- und S-Konfiguration bezieht sich auf das asymmetrische C-Atom im Benzilsäureteil

Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass Aussagen zur absoluten Konfiguration des stereogenen Zentrums im Benzilsäuremolekül der (-)-8-Phenylmenthylester in Abhängigkeit von der chemischen Verschiebung δH möglich sind. Durch die R-Konfiguration werden im Vergleich zum S-Enantiomer die Protonensignale des Substituenten der (-)-8-Phenylmenthyl benzilate um ca. 0,1 ppm ins Hochfeld verschoben. Für die stereochemische Anordnung der Phenylringe des (-)-8-Phenylmenthyl benzilates bedeutet dies, dass der substituierte Ring B des Benzilsäurerestes sich im Abschirmungskegel (+Anisotropie-Effekt) des Phenylrings C (Phenylmenthylrest) befindet (Abb. 18).


[Seite 82↓]

Abb. 18: Anisotropie-Effekt als Ursache der Hochfeldverschiebung für R-konfigurierte Benzilate am Beispiel des (-)-8-Phenylmenthyl (R)-4-tert-butylbenzilates

Eine Bedingung dafür ist, dass die Carbonylgruppe und die tertiäre Alkoholgruppe syn zueinander stehen. Diese Konformation kann durch eine intramolekulare Wasserstoffbrücke von der OH-Gruppe zum Carbonylsauerstoff stabilisiert werden und wird auch im kristallinen Zustand von den Benzilaten bevorzugt (syn-/anti-Konformation, Schema 15). Derartige Anisotropie-Effekte werden zur Bestimmung der absoluten Konfiguration chiraler Alkohole in 1H-NMR-Anisotropie-Methoden angewendet. Harada setzte beispielsweise die 2-Methoxy-2-(1-naphthyl)propionsäure als chirales Reagenz ein, um diastereomere Ester aus den chiralen Alkoholen zu erhalten. Der starke Anisotropie-Effekt der Naphthylgruppe wird zur Unterscheidung der Diastereomere herangezogen [79]. Kosaka konnte die 1H-NMR-Anisotropie-Methode zur Konfigurationsbestimmung auf chirale substituierte Diphenylmethanole erfolgreich übertragen [80].

3.2.4. Kapillarelektrophorese

Die Kapillarelektrophorese (CE) stellt eine weitere Methode zur Bestimmung der optischen Reinheit dar. An sich handelt es sich bei der CE um eine achirale analytische Methode. Erst durch Zusatz chiraler Auxiliare kann eine Enantiomerendiskriminierung erfolgen [81, 82, 83, 84].


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Die Enantiomerentrennung von (R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxyben-zilat (79) wurde unter Verwendung verschiedener Cyclodextrine (CD), z. B. Hydroxypropyl-γ-CD [85], Methyl-β-CD [86, 87], Carboxymethyl-β-CD (Na-Salz) [88] untersucht. Eine Trennung in die Enantiomere konnte nur durch Carb-oxymethyl-β-CD (Na-Salz) erreicht werden (Abb. 19).

Abb. 19: Enantiomerentrennung von (+)-(R,S)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat mittels CE

3.2.5. Röntgenkristallstrukturanalyse

Für sechs Verbindungen der gewünschten Zielstrukturen konnte eine Röntgenkristall-strukturanalyse durchgeführt werden. Hierdurch wurden die Strukturen dieser Vertreter eindeutig bewiesen. Die Bestimmung der absoluten Konfiguration war in keinem Fall möglich. Die durch Röntgenkristallstrukturanalyse erhaltenen Konformationen der basischen Benzilate können folgendermaßen charakterisiert werden.

Stellung der Phenylringe. Für die Phenylringe wird in allen Beispielen eine Tendenz zur perpendikulären Anordnung beobachtet.

Stellung der tertiären OH-Gruppe zur Estercarbonylgruppe. Durch Rotation um eine Einfachbindung lassen sich die syn- und anti-Konformere ineinander überführen (Schema 15). Beide Konformationen können über Wasserstoffbrücken von der tertiären OH-Gruppe entweder zum Carbonylsauerstoff (syn) oder zum Ethersauerstoff (anti) stabilisiert werden. Die syn-Konformation wird von den N-Methyl-4-piperidyl benzilaten in kristallisierter Form bevorzugt (Tab. 19).

Schema 15: syn- und anti-Konformere


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Konformation des N-Methyl-4-piperidylrings. Bei den Strukturen A bis C (Schema 16)handelt es sich um Rotationskonformere. Die Sesselkonformation A gelangt über die Wannenform B wiederin eine stabilere Sesselkonformation C

Schema 16: Übersicht zu den Konformationen des N-Methyl-4-piperidylrings

Die Röntgenkristallstrukturen bestätigen, dass Konformation A und C gleichermaßen bei den N-Methyl-4-piperidyl benzilaten im kristallinen Zustand anzutreffen sind (Tab. 19).

Tab. 19: Konformationen der N-Methyl-4-piperidyl benzilate

Substitution R (Verbindungs-Nr.)

Stellung der OH-Gruppe*

Konformation des Piperidylrings**

Abbildung

4-tert-Butyl-

(72)

anti

A

20

4-Trifluormethyl-

(77)

anti

A

21

4-Trifluormethoxy-

(76)

syn

C

22

3-Methoxy-

(79)

syn

C

23

3,5-Dimethoxy-

(78)

syn

A

24

4-Methylsulfonyl-

(80)

syn

C

25

* Schema 15, ** Schema 16


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Abb. 20: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 4-tert-butylbenzilat (72)

Abb. 21: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 4-trifluormethylbenzilat (77)


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Abb. 22: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 4-trifluormethoxybenzilat (76)

Abb. 23: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 3-methoxybenzilat (79)


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Abb. 24: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 3,5-dimethoxybenzilat (78)

Abb. 25: Röntgenkristallstruktur von N-Methyl-4-pipridyl 4-methylsulfonylbenzilat (80)


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3.2.6.  Diskussion

Neue Erkenntnisse zu chiroptischen Eigenschaften und Konformationstendenzen von N-Methyl-4-piperidyl benzilaten konnten durch die untersuchten Methoden gewonnen werden. Besonders hervorzuheben ist, dass mit der NMR-Spektroskopie eine Methode für Benzilate gefunden wurde, die Aussagen zur absoluten Konfiguration unabhängig von enantiomeren Referenzsubstanzen zulässt.

Polarimetrie. Durch Messung der optischen Aktivität mittels Polarimetrie können enantiomere Benzilate charakterisiert werden. Bemerkenswert ist die für zwei Vertreter gefundene und selten auftretende Cryptochiralität. Aufgrund der kleinen Drehwerte und der mitunter bestehenden Cryptochiralität eignet sich die Polarimetrie jedoch nicht als alleinige Methode für die qualitative und quantitative Bestimmung enantiomerer Benzilate.

CD/ORD-Methoden. Die Aufnahme von CD-/ORD-Spektren ermöglicht es, enantiomere Benzilate mit cryptochiralen Eigenschaften bei 589 nm zu detektieren. Durch Messung des Drehsinns bei 589 nm wird die optische Aktivität von Benzilaten nicht immer erkannt. Die berechneten ORD-Kurven zeigen, dass die optische Drehung für Benzilate mit niedrigen oder nicht mehr bestimmbaren Drehwerten bei 589 nm bei kürzeren Wellenlängen vermessen werden sollte, um eine messbare optischen Drehung zu erhalten. Das Herleiten der absoluten Konfiguration in Anlehnung an das Vorzeichen der CD-Kurve ist nicht möglich, obwohl die untersuchten R-Enantiomere immer durch negative bzw. die S-Enantiomere durch positive CD-Kurven (250-300 nm) gekennzeichnet sind.

NMR-Spektroskopie. Die 1H-NMR-Spekroskopie eignet sich hervorragend zur Unterscheidung von diastereomeren Benzilaten (Phenylmenthyl- und Menthyl benzilate). Dagegen ist eine quantitative Auswertung der Diastereomerenzusammensetzung nur für (-)-8-Phenylmenthyl benzilate möglich, weil hier die Protonensignale der Substituenten optimal aufgelöst werden. Den größten Nutzen birgt die NMR-Spektroskopie für die Bestimmung der absoluten Konfiguration des asymmetrischen C-Atoms im Benzilsäurerest. Alle bisherigen untersuchten Methoden (direkte HPLC-Methoden, optische Drehung, CD/ORD, CE) eignen sich zwar zur Differenzierung von enantiomeren Benzilaten, aber nicht für das Ableiten der absoluten Konfiguration. Für die genannten Methoden ist eine Bestimmung der absoluten Konfiguration nur möglich, wenn eine enantiomere Referenzsubstanz mit bekannter Konfiguration eine eindeutige Zuordnung erlaubt. Im 1H-NMR-Spektrum gelingt die Zuordnung von R- und S-Konfiguration des [Seite 89↓]zentralen asymmetrischen C-Atoms im Diastereomerengemisch durch Vergleich der chemischen Verschiebungen der Protonen der Arylsubstituenten. Diastereomere (-)-8-Phenylmenthyl benzilate mit R-Konfiguration im Benzilsäurerest zeigen im Vergleich zur S-Konfiguration für die Protonen des Substituenten eine Hochfeldverschiebung (Tab. 17, Abb. 18)

Röntgenkristallstrukturanalyse. Aufgrund der guten Kristallisationsneigung von Benzilaten in Diethylether ist es gelungen, Kristalle für die Röntgenkristallstrukturanalyse zu züchten. Dadurch konnte die gesamte Molekülgeometrie der kristallinen Verbindungen aufgeklärt werden. Offensichtlich wird die syn-Konformation im kristallinen Zustand bevorzugt. Ein Indiz dafür, dass die syn-Konformation auch in Lösung begünstigt wird, ist das Modell für die Hochfeldverschiebung des R-konfigurierten Benzilsäurerestes in (-)-8-Phenylmenthyl benzilaten. Eine Hochfeldverschiebung ist nur unter der Voraussetzung der syn-Konformation von Estercarbonylsauerstoff und tertiärer OH-Gruppe plausibel.

3.3. Stabilitätsuntersuchungen: Racemisierung/Epimerisierung

Für die Entwicklung neuer potenzieller Arzneistoffe und ihre spätere therapeutische Anwendung sind Stabilitätsuntersuchungen unerlässlich. Abbaureaktionen von Arzneistoffen sind durch komplexe Vorgänge (chemisch, physikalisch und mikrobiell) gekennzeichnet. Stereochemische Veränderungen (Racemisierung/Epimerisierung) müssen speziell bei enantiomeren/diastereomeren Verbindungen geklärt werden. Daher soll in einigen Versuchen die Tendenz des zentralen asymmetrischen C-Atoms im Benzilatmolekül zur Konversion untersucht werden.

3.3.1. Stabilität in wässriger Lösung

Zur Untersuchung der Stabilität wurden Lösungen von (R)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat (15) in einem pH-Bereich von 2,02 bis 9,03 hergestellt und 15 h bei 80°C im Klimaschrank aufbewahrt. Anschließend wurden die Lösungen mittels HPLC auf den Grad ihrer Racemisierung untersucht. Racemisierungsprozesse wurden hierbei zunächst nicht festgestellt (Tab. 20).


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Tab. 20: Untersuchungen zur Racemisierung von (R)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxy-benzilat (15) im pH-Bereich von 2 bis 9 bei einer Temperatur von 80°C

Lösung

Phosphat-Pufferlösung

Gemessener pH-Wert der Pufferlösung

Cosolvens Acetonitril, Konzentration [%,V/V]

Enantiomeren-verhältnis [%]

S : R

I

pH 2,0 R, (EAB 2000)

2,02

0

0:100

II

pH 4,5 R, (DAB 1998)

4,25

0

0:100

III

pH 7,0 R, (EAB 2000)

7,01

50

0:100

IV

pH 9,0 R, (EAB 2000)

9,03

50

0:100

3.3.2. Stabilität von N-Methyl-4-piperidyl-, (-)-Menthyl- und (-)-8-Phenylmenthyl benzilaten im schwefelsauren Milieu

Racemisierung. Weitergehende Stabilitätstests von 15 wurden in verschiedenen Konzentrationen an Schwefelsäure durchgeführt. Die in Schwefelsäure gelöste Verbindung 15 wurde 1 h bei 20°C geschüttelt und anschließend weitere 10 min erwärmt (70°C) (Tab. 21). Eine fortgeschrittene Racemisierung (42:58) konnte bei 20°C erst unter Verwendung von 48 %iger Schwefelsäure nach 1 h Schütteln festgestellt werden. Nach zusätzlichem zehnminütigen Erwärmen (70°C) zeigten sich schon bei 24 %iger Schwefelsäure erste Racemisierungstendenzen (3:97).

Tab. 21: Verlauf der Racemisierung von (R)-N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxy- benzilat (15) im schwefelsauren Milieu

Zeit t

Konzentration der Schwefelsäure [%]

Enantiomerenverhältnis [%] S : R

60 min (20°C)

6

0:100

 

12

0:100

 

24

0:100

 

48

42:58

70 min

(60 min 20°C, 10 min 70°C)

6

0:100

12

0:100

24

3:97

48

48:52


[Seite 91↓]

Epimerisierung. Die Untersuchungen wurden auf jeweils ein Diastereomer von (-)-Menthyl 3,4-dimethoxybenzilat und (-)-8-Phenylmenthyl 3-methoxybenzilat aus-geweitet (Tab. 22). Ändert sich die Konfiguration eines von mehreren stereogenen Zentren im Molekül, wird der Vorgang als Epimerisierung bezeichnet [89].

Tab. 22: Verlauf der Epimerisierung von (-)-Menthyl 3,4-dimethoxybenzilat (Peak 1)* A und (-)-8-Phenylmenthyl (S)-3-methoxybenzilat B im schwefelsauren Milieu

Zeit t

Konzentration der Schwefelsäure [%]

Diastereomerenverhältnis [%]

A**

Peak 1 : Peak 2

B***

S : R

60 min (20°C)

6

100:0

100:0

 

12

100:0

100:0

 

24

100:0

100:0

 

48

80:20

100:0

70 min

(60 min 20°C, 10 min 70°C)

48

71:29

100:0

* da die Zuordnung der absoluten Konfiguration nicht erfolgt ist, wird entsprechend der Elutionsreihenfolge der HPLC-Methode (Kap. 3.1.4.2) Peak 1 und Peak 2 verwendet
** die Diastereomerenzusammensetzung wurde mittels HPLC bestimmt (Kap. 3.1.4.2)
*** die Diastereomerenzusammensetzung wurde mittels NMR bestimmt (Kap. 3.2.3)

Das Diastereomer des (-)-Menthylesters (Peak 1) zeigt im Vergleich zum N-Methyl-4-piperidylester (15) eine geringere Tendenz zur Konversion des asymmetrischen C-Atoms des Benzilsäuregerüstes. Erst in 48 %iger Schwefelsäure sind bei 20°C Konversions-tendenzen (80:20) sichtbar (A, Tab. 22). Wird der (-)-Menthylrest durch einen (-)-8-Phenylmenthylrest (38) im Benzilatmolekül ausgetauscht, lässt sich selbst nach weiteren 10 min Erwärmen (70°C) im stark schwefelsauren Milieu keine Konversion mehr registrieren (B, Tab. 22).

Gleichgewichtseinstellung. Die Konversion eines stereogenen Zentrums von Diastereomeren führt nicht, wie bei Enantiomeren, zu gleichen Anteilen R und S am asymmetrischen C-Atom. Das thermodynamisch stabilere Diastereomer überwiegt [90]. Wird bei den Epimerisierungsversuchen eines Diastereomers ein Verhältnis von beispielsweise 71:29 (Tab. 22) gefunden, kann ein solches Verhältnis auf eine Gleichgewichtseinstellung hindeuten, bei der sich das energetisch günstigere Diastereomer anreichert. Um eine derartige Gleichgewichtseinstellung als dominierende


[Seite 92↓]

Einflusskomponente für die vorgefundenen Diastereomerenverhältnisse auszuschließen, wurde jeweils das Diastereomerengemisch (-)-Menthyl (R)- und (S)-3,4-dimethoxybenzilat (1:1) und (-)-8-Phenylmenthyl (R)- und (S)-3-methoxybenzilat (1:1) den Versuchs-bedingungen (48 %ige Schwefelsäure, 60 min 20°C und weitere 10 min 70°C) unterworfen. Nach erfolgter Exposition wurden nahezu gleiche Anteile der Diastereomeren vorgefunden, d. h. bei einer vollständigen Epimerisierung nur eines Diastereomers sollten nahezu gleiche Anteile beider Diastereomere zu erwarten sein. Demzufolge kann für nachfolgende Betrachtungen der Konversion des stereogenen Zentrums im Benzilsäuremolekül eine Gleichgewichtseinstellung, die nicht zu gleichen Anteilen beider Diastereomere führt, vernachlässigt werden.

3.3.3. Diskussion

Die vorliegenden Untersuchungen belegen, dass die synthetisierten Benzilate Racemisierungs-/Epimerisierungsprozessen unterliegen. Die Racemisierung/ Epimerisierung vollzieht sich über säurekatalysierte Reaktionsmechanismen. Hierbei kommt es zur Protonierung der tertiären Alkoholstruktur und nachfolgender Abspaltung von Wasser. Als Zwischenprodukt entsteht ein planares Carbokation. Wassermoleküle können das achirale Carbokation gleichermaßen von beiden Seiten nucleophil angreifen (Schema 17). Die Generierung von α-Carbonylcarbokationen aus den alkoholischen Vorstufen unter stark sauren Bedingungen wurde von Dao beschrieben [91], die im Fall enantiomerer/diastereomerer Benzilate zur Racemisierung/Epimerisierung führt.

Schema 17: Säurekatalysierte Racemisierung über ein Carbokation


[Seite 93↓]

Aufgrund des säurekatalysierten Reaktionsmechanismus ist verständlich, weshalb keine Racemisierung im alkalischen Milieu beobachtet wurde. Im Übrigen legen die Untersuchungen dar, dass die Tendenz zur Konversion des stereogenen Zentrums in der Benzilsäurestruktur wesentlich von der Alkoholkomponente des Esters bestimmt wird (Diagramm 2). Im Vergleich zum N-Methyl-4-piperidylester 15 (A) ist beim Menthylester (Peak 1) (B) unter gleichen Reaktionsbedingungen eine deutliche Abnahme der Racemisierung/Epimerisierung des stereogenen Zentrums im Benzilatmolekül zu verzeichnen. Vermutlich wird durch die Isopropylseitenkette des Menthylrestes eine Protonierung der tertiären Alkoholfunktion erschwert, was sich in einer verringerten KonversionderBenzilat-Konfigurationauswirkt.Überraschenderweisewurdebeim (-)-8-Phenylmenthylester (C) unter den gewählten Bedingungen keine Epimerisierung des S-konfigurierten C-Atoms im Benzilsäureteil beobachtet. Eine Gleichgewichtseinstellung, bei der das thermodynamisch stabilere Diastereomer überwiegt oder sogar ausschließlich entsteht, kann hierbei ausgeschlossen werden.

Diagramm 2: Racemisierung von Benzilaten nach 1 h Schütteln (Raumtemperatur) und zehnminütigem Erwärmen (70°C)

Die beobachtete Epimerisierungsresistenz von 38 (c) lässt sich folgendermaßen erklären:

Das Fazit der experimentellen Untersuchungen ist, dass enantiomere Benzilate in einem pH-Bereich von 2,02 bis 9,03 stereochemisch stabil sind. Nur im stark saurem Milieu können Racemisierungs-/Epimerisierungsprozesse ablaufen. Dieses muss bei der Darstellung und Aufarbeitung von enantiomeren Benzilaten berücksichtigt werden, um Fehlinterpretationen der untersuchten Darstellungsmethoden zu vermeiden. Unter den Versuchsbedingungen der Radioligand-Bindungsstudien sollten ebenfalls keine Racemisierungsprozesse der enantiomeren Benzilate auftreten.


[Seite 95↓]

3.4.  Radioligand-Bindungsstudien an Muscarinrezeptorsubtypen

Es ist bekannt, dass basische Benzilsäureester, speziell N-Methyl-4-piperidyl benzilate, eine ausgeprägte anticholinerge Wirkung besitzen. Trotz anzunehmender Aktivitätsunterschiede von enantiomeren N-Methyl-4-piperidyl benzilaten wurden Affinität und Subtypenselektivität zu den Muscarinrezeptoren bislang nur für die racemischen Benzilate untersucht. In Radioligand-Bindungsstudien sollte daher der Einfluss der absoluten Konfiguration des asymmetrischen C-Atoms im Benzilsäuremolekül auf Affinität und Subtypenselektivtätzu den Muscarinrezeptoren von acht Enantiomeren (1, 2, 7, 8, 9, 10, 17, 18) untersucht werden.

3.4.1. Untersuchungen

Die Bestimmung der Affinitäten der Verbindungen erfolgte in Kompetitionsexperimenten an humanen Muscarinrezeptorsubtypen M1, M2 und M3. Verwendet wurden CHO-Zellen, die die jeweiligen humanen Subtypen exprimieren. Als Radioligand dient [3H]-N-Methylscopolamin bromid ([3H]-NMS). Die Testsubstanzen wurden in sieben aufsteigenden Konzentrationen im Abstand von einer halben log-Stufe entsprechend ihrer Affinität eingesetzt. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 10 μM Atropin bestimmt. Die gebundene Radioaktivität wurde mittels Flüssig-Scintillationszähler (Packard 1500 Tricarb liquid scintillation analyser) gemessen. Unter Verwendung der Chen- und Prusoff-Gleichung [93] wurden die Ki-Werte der untersuchten Verbindungen berechnet. Die Hill-Koeffizienten nH sämtlicher Kompetitionskurven lagen bei 1. Somit kann eine

ausgeschlossen werden [94].

Die KD -Werte für [3H]-NMS betrugen 0,27 nM (M1), 0,46 nM (M2) und 0,27 nM (M3). Die pKi-Werte (-log Ki) und Standardabweichungen der untersuchten Verbindungen sind in Tab. 23 zusammengefasst.


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Tab. 23: pKi-Werte an den Muscarinrezeptorsubtypen

Substitution R (Verbindungs-Nr.)

M1

M2

M3

M1/M2

M1/M3

M3/M2

(R) 4-tert-C4H9-

(1)

7,52 + 0,05

6,69 + 0,09

7,52 + 0,06

6,8

1

6,8

(S) 4-tert-C4H9-

(2)

8,29 + 0,04

7,48 + 0,07

7,84 + 0,05

6,5

2,8

2,3

( R ) 4-(CH 3 ) 2 N-

( 7 )

7,34 + 0,08

6,73 + 0,03

7,08 + 0,09

4,1

1,8

2,2

( S ) 4-(CH 3 ) 2 N-

( 8 )

8,98 + 0,10

7,28 + 0,07

7,46 + 0,02

50,1

33,1

1,5

( R ) 4-F 3 CO-

( 9 )

7,39 + 0,10

6,84 + 0,08

7,08 + 0,09

3,5

2,0

1,7

( S ) 4-F 3 CO-

( 10 )

8,91 + 0,06

8,61 + 0,04

8,40 + 0,06

2,0

3,2

0,6

( R ) 4-CH 3 SO 2 -

( 17 )

6,58 + 0,16

5,8 + 0,04

6,39 + 0,02

6,0

1,5

3,9

( S ) 4-CH 3 SO 2 -

( 18 )

8,37 + 0,08

7,15 + 0,17

7,77 + 0,04

16,6

4,0

4,2

Vergleichssubstanzen

      

Pirenzepin*

(M 1 -selektiv)

8,1

6,3

6,7

63

25

2,5

4-DAMP**

(M 3 -selektiv)

8,8

8,1

9,1

5,0

0,5

10

*

**

    

Aus Tab. 23 und der graphischen Darstellung der pKi-Werte (Diagramm 3) der R- und S-Enantiomere lässt sich entnehmen, dass die S-konfigurierten N-Methyl-4-piperidyl benzilate im Vergleich zu den R-Enantiomeren höhere Affinitäten an den muscarinergen Rezeptoren (M1, M2, M3) besitzen. Generell gilt eine Reihenfolge der Affinitäten für R- und S-Enantiomere an den muscarinergen Rezeptorsubtypen: pKi (M1) > pKi (M3) > pKi (M2). Eine Ausnahme bildet hierbei das ( S )-N-Methyl-4-piperidyl 4-trifluor-methoxybenzilat (10) mit pKi (M1) > pKi (M2) > pKi (M3).


[Seite 97↓]

Diagramm 3: pKi-Werte der R- und S-Enantiomere an den muscarinergen Rezeptor- subtypen

Um präzise Aussagen über den Einfluss der absoluten Konfiguration der N-Methyl-4-piperidiyl benzilate auf Affinität und Selektivität an den muscarinergen Rezeptoren machen zu können, wurden

Im Folgenden wird der Begriff Selektivität, bezogen auf einen Rezeptorsubtyp, nur verwendet, wenn der pKi-Wert um eine pK-Einheit (pK > 1) verschieden ist, d. h. eine mindestens 10fach höhere Affinität vorliegt. Eine Präferenz zu einem Rezeptorsubtyp ist vorhanden, wenn die pKi-Differenz < 1 ist.

Die Affinitätsverhältnisse von M1/M2 der untersuchten Verbindungen liegen zwischen Werten von 2 bis 50. Eine Korrelation der Affinitätsverhältnisse M1/M2 zur absoluten Konfiguration war nicht festzustellen und wurde deshalb grafisch nicht veranschaulicht. Insbesondere ist das (S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-dimethylaminobenzilat (8) mit 50facher M1/M2-Selektivität hervorzuheben. Daneben besitzt dieses Enantiomer eine 33fach höhere Affinität zum M1-Rezeptor als zum M3-Rezeptor. Somit ist 8 eine M1-selektive Verbindung.


[Seite 98↓]

Ein Vergleich der R- und S-Enantiomere hinsichtlich ihrer M3/M1- und M3/M2-Affinitätsverhältnisse zeigt, dass sich trotz immer vorhandener M1-Präferenz oder M1-Selektivität die Affinität zum M3-Rezeptor durch die jeweiligen R-konfigurierten Benzilate gefördert wird bzw. in Umkehr die S-Enantiomere die M1- und M2-Affinität gegenüber M3 protegieren.In Diagramm 4 ist das M3/M1-Verhältnis graphisch veranschaulicht. Da die M1-Affinitäten generell größer sind als die M3-Affinitäten, finden wir Werte < 1 vor. Je größer die Zahlenwerte sind, desto geringer ist der Affinitätsunterschied von M3 und M1, d. h. die Rezeptoraffinität verschiebt sich zu Gunsten des M3-Rezeptors. Ein Maximum wird für das R-Enantiomer der tert-Butyl-verbindung (1) mit 1 erreicht, welches gleiche pKi-Werte für M1 und M3

Diagramm 4: M3/M1-Affinitätsverhältnisse enantiomerer Benzilate

aufweist. Weiterhin werden die M1-selektiven Eigenschaften der (S)-Dimethyl-aminoverbindung (8) deutlich, was sich in einem sehr kleinen Wert widerspiegelt. Interessant ist, dass die Affinitätsunterschiede M3/M1 für alle R-Enantiomere geringer (größere Zahlenwerte) als für die S-Enantiomere (kleinere Zahlenwerte) sind (Diagramm 4). Offensichtlich kann mit R-konfigurierten Benzilaten die Affinität zu Gunsten des M3-Rezeptors verschoben werden. Neben den Verbindungen 1/2 ist dieser Effekt sehr deutlich bei 4-Dimethylaminobenzilat 7/8 ausgeprägt. Das S-Enantiomer der 4-Dimethyl-aminoverbindung (8) ist durch bemerkenswerte M1-Selektivität gekennzeichnet (M1/M3 33fach). Durch R-Konfiguration kommt es hingegen zu einem drastischen Rückgang der M1-Affinität (Verlust der M1-Selektivität). Trotz des gleichzeitigen leichten Rückgangs der M3-Affinität verschiebt sich die Rezeptoraffinität zu Gunsten des M3-Rezeptors. Diese neue Erkenntnis kann für die Entwicklung M3-selektiver Antagonisten von Bedeutung sein.

Ähnliche Tendenzen konnten für die M3/M2-Präferenz und -Selektivität registriert werden.


[Seite 99↓]

Da sämtliche M3-Affinitäten größer sind als die M2-Affinitäten, finden wir in Diagramm 5 Zahlenwerte > 1. Die M3/M2-Verhältnisse liegen zwischen 1 bis 7. Auch hier kann eine Zunahme der M3-Affinität in Abhängigkeit von der R-Konfiguration beobachtet werden. Einzige Ausnahme ist N-Methyl-4-piperidyl 4-trifluormethoxy-benzilat (9/10). Die größte Präferenz zum M3 -Rezeptor zeigt das (R)-N-Methyl-4-piperidyl tert-butylbenzilat (1) mit einer 7fach höheren Affinität gegenüber dem

Diagramm 5: M3/M2-Affinitätsverhält-nisse enantiomerer Benzilate

M2-Rezeptor. Das M3/M2-Verhältnis von 1 (7fach) ist mit der M3-selektiven Verbindung 4-DAMP (10fach) vergleichbar (Tab. 23). Das M3/M1-Verhältnis für 4-DAMP beträgt 2. Das (R)-N-Methyl-4-piperidyl tert-butylbenzilat (1) weist dagegen mit seinen identischen pKi-Werten für M1 und M3 nur ein M3/M1-Verhältnis von 1 auf.

3.4.2. Diskussion

Neue und interessante Erkenntnisse zur Affinität und Subtypenselektivität an muscarinergen Rezeptoren in Abhängigkeit von stereochemischen Eigenschaften der N-Methyl-4-piperidyl benzilate konnten mit Radioligand-Bindungsstudien gewonnen werden. Eine Modifikation der Affinität und Subtypenselektivität ist in Abhängigkeit von der Konfiguration der N-Methyl-4-piperidyl benzilate möglich.

Rezeptoraffinität in Abhängigkeit von der Benzilsäurekonfiguration. In Kompetitionsexperimenten an humanen Muscarinrezeptorsubtypen M1, M2 und M3 wurde nachgewiesen, dass die S-konfigurierten N-Methyl-4-piperidyl benzilate (Eutomer) generell höhere Affinitäten an muscarinergen Rezeptoren (M1, M2 und M3) als die R-Enantiomere (Distomer) besitzen.

Die Reihenfolge der Affinitäten an den muscarinergen Rezeptorsubtypen ist für R- und S-Enantiomere gleichermaßen: pKi (M1) > pKi (M3) > pKi (M2). Eine Ausnahme bildet (S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-trifluormethoxybenzilat (10).


[Seite 100↓]

Bereits in zurückliegenden Arbeiten wurden die pKi-Werte der Racemate von der 4-Trifluormethyl- (77) (pKi (M1) = 9,06) und 3-Methoxyverbindung (79) (pKi (M1) = 8,73) durch Radioligand-Bindungstudien an Muscarinrezeptoren bestimmt [5] (Abb. 26). Da aufgrund der neuen Erkenntnisse zu den enantiomeren Affinitätsunterschieden von der Annahme ausgegangen werden kann, dass das reine S-Enantiomer eine höhere Affinität als das Racemat besitzt, sind die S-Enantiomere dieser Verbindungen von großem Interesse. Der pKi (M1)-Wert des S-Enantiomers der 4-Trifluormethylverbindung (12) würde vermutlich weit über 9,0 liegen. Damit könnte

Abb. 26: pKi-Werte der Race-mate 77 und 79

12 der unsubstituierten Benzilsäure (pKi (M1): 9,52) in der Affinität gleichen oder sich sogar durch eine höhere Affinität auszeichnen. Die (S)-3-Methoxyverbindung (16) ist von besonderer Bedeutung, da hier das Racemat anticholinerge und indirekt dopaminerge Eigenschaften vereinigt. Diese Verbindung könnte eine neue Klasse von Antiparkinsonika darstellen.

Subtypenselektivität in Abhängigkeit von der Benzilsäurekonfiguration. Die Feststellung, dass R-konfigurierte Benzilsäure in basischen Benzilaten neben einer immer vorhandenen M1-Präferenz die Affinität zum M3-Rezeptor begünstigt bzw. in Umkehr das S-Enantiomer vor allem die M1-Affinität begünstigt, ist eine neue Erkenntnis. Dieses Ergebnis bestätigt nicht die Beobachtungen von Kiesewetter, der allerdings Stereoisomere von 3-Chinuclidinyl benzilaten untersuchte [6]. Kiesewetter stellte fest, dass R-konfigurierte Benzilsäure die M1-Selektivität fördert, während das S-Enantiomer möglicherweise die M2-Selektivität begünstigt. Für kernsubstituierte (R)-Chinuclidinyl (R)-benzilate wurde eine 9 bis 12fache M1-Selektivität über M2 von Kiesewetter gefunden. Dagegen konnte für substituierte (R)-Chinuclidinyl (S)-benzilate keine Subtypenselektivität mehr festgestellt werden. Eine Ausnahme bildet hierbei das R,S-Stereoisomer des Fluormethylsubstituierten Benzilates mit einer 6,8fachen M2/M1-Präferenz. Das ist für Kiesewetter ein Hinweis, dass S-konfigurierte Benzilsäuren möglicherweise eine M2-Selektivität fördern. Diese unterschiedlichen Beobachtungen lassen sich nur dadurch erklären, dass die basische Alkoholkomponente im Benzilatmolekül einen Einfluss auf die [Seite 101↓]Subtypenselektivität besitzen muss (s. u.).

Im Hinblick auf einen gezielten therapeutischen Einsatz kann in Abhängigkeit vom stereogenen Zentrum eine Modifikation der muscarinergen Subtypenselektivität erzielt und somit die Wirkqualität moduliert werden:

Einfluss der basischen Alkoholkomponente auf die Subtypenselektivität. Durch einen Vergleich der Affinitäten an den Rezeptorsubtypen von N-Methyl-4-piperidyl benzilaten und 3-Chinuclidinyl benzilaten können Aussagen über den Einfluss des basischen Alkoholrestes im Benzilsäureester gemacht werden. Kiesewetter et al. untersuchten die isolierten Stereoisomere von parasubstituierten Benzilaten des 3-Chinuclidinols [6]. Die

Stereoisomere zeigten neben Affinitätsunterschieden auch Subtypenselektivität. Die basische Alkohol-komponente, die einen essentiellen Bestandteil für die Wechselwirkung mit dem Rezeptor darstellt, ist für die Affinität von großer Bedeutung. Hier erwiesen sich die Verbindungen mit (R)-Chinuclidinol als diejenigen mit höherer Affinität und einem Beitrag zur M1-Selektivität. Keine der untersuchten Verbindungen, die (S)-Chinuclidinol enthielten, konnte eine Subtypen-selektivität aufweisen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Radioligand-Bindungsstudien lassen nun folgende Schlussfolgerung hinsichtlich der Subtypenselektivität zu. N-Methyl-4-piperidyl benzilate wie auch R-Chinuclidinyl benzilate sind durch eine ausgeprägte M1-Präferenz/-Selektivität gegenüber M2 und

Abb. 27: M2- und M3-Präferenz basischer Benzilsäure-ester

M3 gekennzeichnet. Die Unterschiede zwischen diesen basischen Benzilsäureestern werden erst bei Betrachtung der M2- und M3-Affinitäten sichtbar. Bei allen untersuchten [Seite 102↓]N-Methyl-4-piperidyl benzilaten lagen die Affinitäten für M3-Rezeptoren über denen der M2-Rezeptoren. Kiesewetters R-Chinuclidinyl benzilate besitzen ausnahmslos eine M2-Selektivität gegenüber M3. Somit fördert N-Methyl-4-piperidol als Alkoholkomponente im Benzilat neben der M1-Affinität hauptsächlich die M3-Rezeptoraffinität. Dagegen ist R-Chinuclidinol neben einer M1-Affinität für eine ausgeprägte M2-Rezeptoraffinität verantwortlich.

Der Einfluss der Substituenten des aromatischen Systems auf die Rezeptoraffinität wird im folgenden Kapitel anhand der Rezeptormodelle diskutiert.


[Seite 103↓]

3.5.  Molecular Modelling

3.5.1. Einleitung

Um die unterschiedliche Affinitätder S- und R-enantiomeren Benzilate sowie die vorhandene Subtypenselektivitätan Muscarinrezeptoren auf molekularer Ebene qualitativ und quantitativ zu erklären, soll mit Molecular Modelling Methoden [95, 96] anhand der experimentellen Bindungsdaten (Kap. 3.4) ein Rezeptormodell erarbeitet werden. Muscarinrezeptoren gehören zur Familie der G-proteingekoppelten Rezeptoren. Sie sind charakterisiert durch sieben hydrophobe transmembranäre Segmente, welche durch extra- und intrazelluläre Schleifen (Loops) miteinander verbunden sind (Abb. 28) [97].

Abb. 28: M1-Rezeptor mit bindungsrelevanten Aminosäuren (modifiziert nach [98])

Die einzige dreidimensionale Struktur eines sieben transmembranären G-proteingekoppelten Rezeptors wurde bisher nur für Rinder-Rhodopsin mit einer Auflösung von 2,8 Å aufgeklärt [99]. Basierend auf der dreidimensionalen Struktur des Rhodopsins können Muscarinrezeptoren modelliert werden. Aufgrund einer sehr großen Sequenzidentität innerhalb der Muscarinrezeptorsubtypen (> 70 %), ist die Entwicklung [Seite 104↓]von M1-, M2- oder M3-selektiven Arzneistoffen problematisch und stellt eine Herausforderung dar. Auf der Suche nach der richtigen Bindungsregion kann das Wissen der Subtypenselektivität von Agonisten und Antagonisten zur richtigen Bindungsstelle führen. Somit sollten Aminosäuren des Rezeptorproteins, die innerhalb der Muscarinrezeptoren nicht homolog (nicht konserviert) sind, an der Bildung des Ligand-Rezeptor-Komplexes direkt oder indirekt beteiligt sein. Dadurch erklären sich unterschiedliche Affinitäten des gleichen Liganden an den Rezeptorsubtypen (M1, M2, M3). Ist die wahrscheinliche Bindungsstelle identifiziert und gelingt es dadurch, wesentliche Aspekte der Struktur-Wirkungsbeziehungen der Liganden zu erklären, so kann versucht werden, auf dieser Basis neue selektive Liganden zu entwickeln.

Bindungsmechanismus. Die sieben transmembranären Segmente (Helix 1 bis 7) sind von der extrazellulären Seite betrachtet elliptisch angeordnet, wobei Helix 3 eine fast zentrale Lage einnimmt. Die extrazelluläre Seite wird durch flexible Loopbereiche (extrazellulärer Loop (E) 2 und 3) begrenzt (Abb. 29). Nur wenig ist bisher über die Bedeutung der extra-zellulären Loops bekannt. Vermutlich besitzt der E2 eine deckelartige Funktion [100], wodurch unter anderem das Eintreten des Liganden in die Bindungstasche moduliert wird.

Abb. 29: Extrazelluläre Sicht auf M1-Rezeptor mit Ligand (H: Helix)


[Seite 105↓]

Im ersten Schritt könnte es zu einer Wechselwirkung des Liganden mit dem Loopbereich kommen. Durch eine Konformationsänderung des extrazellulären Loopbereiches kann der Ligand dann im zweiten Schritt in den hydrophoben transmembranären Bereich des Rezeptors eindringen und zur eigentlichen Bindungsstelle gelangen. Ein Agonist überführt den Rezeptor aus der inaktiven Form in den aktiven Zustand, wodurch sich die Konformationen der intrazellulären Loops ändert, an welche die G-Proteine gekoppelt sind. Hingegen stabilisiert ein Antagonist die inaktive Konformation des Rezeptors. Interessante Ansätze, weshalb eine Substanz als Agonist oder Antagonist wirkt und welche Vorgänge bei der Rezeptoraktivierung ablaufen, werden unter anderem von Schwartz [101, 102] diskutiert. Möglicherweise kommt dem Trp378 (M1, Helix 6) und seiner eingenommenen Konformation eine besondere Bedeutung beim Initialschritt der Rezeptoraktivierung zu. Das Trp378 könnte damit eine wichtige Funktion bei der Liganderkennung (Agonist oder Antagonist) übernehmen.

Bindungsstelle für Agonisten und Antagonisten. Das Bindungsareal muscarinerger Agonisten und Antagonisten ist Gegenstand einer Vielzahl von Forschungsarbeiten [100, 103, 104]. Die Bedeutung einzelner Aminosäuren im Rezeptorprotein für die Ligandbindung kann durch Punktmutationen und deren Auswirkung auf die Bildung des Ligand-Rezeptor-Komplexes bewertet werden. Die Bindungstasche im M1-Rezeptor für den Antagonisten N-Methylscopolamin (NMS) wird insbesondere durch die Aminosäuren Asp105, Tyr106, Tyr381, Asn382, Tyr404, Cys407 und Tyr408 begrenzt. Der Phenylring von NMS wird nahe der Aminosäure Asn110 vermutet [100]. Durch Mutation von Asn382 und Tyr408 wurde die Affinität um das 1000-3000fache gesenkt. Eine 100fache Affinitätserniedrigung konnte für die Aminosäuren Asp105, Tyr106, Trp157 festgestellt werden. Etwas geringere Auswirkungen (10-20fache Reduzierung) zeigten unter anderem Asn110, Tyr404 [104]. Das als Agonist wirkende Acetylcholin bindet in ähnlicher Weise wie NMS. Essentiell für die Affinität des Acetylcholins ist die Ausbildung einer ionischen Bindung von der Carboxylatgruppe des Asp105 zur Ammoniumgruppe des Acetylcholins. Die Formierung einer derartigen Salzbrücke wird ebenso für Antagonisten diskutiert [103].


[Seite 106↓]

3.5.2.  Methoden

3.5.2.1. Modelling der Rezeptoren

Basierend auf der Röntgenkristallstruktur des Rinder-Rhodopsins (PDB 1F88) wurde mit MOE (Molecular operating environment) [105] ein Alignment für die Muscarinrezeptoren M1, M2 und M3 durchgeführt. Zwischen den Sequenzen des Rhodopsinproteins und der Muscarinrezeptoren besteht eine Sequenzidentität von ca. 25 %. Generell lässt sich sagen, dass die Homologie in den transmembranären Segmenten, welche die Bindungsstelle enthalten, sehr viel größer ist als in den Loopbereichen. Eine Aminosäuresequenz von 24 Aminosäuren vom N-Terminus und eine weitere Sequenz von 138 Aminosäuren vom dritten intrazellulären Loop wurden herausgeschnitten. Nachweislich besteht eine unveränderte Ligandbindungsaktivität [106]. Anschließend wurden für die Muscarinrezeptoren (M1, M2, M3) mit MOE jeweils zehn verschiedene Modelle automatisch generiert. Für weitere Optimierungen wurden die Modelle mit den wenigsten Aminosäuren in unerlaubten Bereichen eines Ramachandran-Plots (Rückgrattorsions-winkel Phi und Psi) verwendet. Zur Verfeinerung und Optimierung der mit MOE erhaltenen Strukturmodelle wurden zunächst die Seitenketten optimiert, d. h. die Rückgratatome der Aminosäuren fixiert und der Rezeptor durch ca. 5000 Minimierungsschritte bis zu einem Energie cut-off von 0,01 kcal/mol auf der Grundlage des Tripos-Kraftfeldes [107] mit Gasteiger-Partialladungen [108] und Distanz abhängiger Dielektrizitätskonstante energieminimiert, welches im Molecular Modelling Programmpaket Sybyl [109] implementiert ist. Danach wurde die gesamte Struktur vollständig optimiert und gegebenenfalls die Konformationen einzelner Aminosäurereste, welche in nicht erlaubten Bereichen eines Ramachandran-Plots lagen, in den Loopbereichen manuell verändert. Schließlich konnten Strukturmodelle für alle Rezeptorsubtypen erhalten werden, welche im Ramachandran-Plot mit Ausnahme von Glycin keine Aminosäure in unerlaubten Regionen aufwiesen.

Die Qualität der Rezeptormodelle wurde weiterhin mit procheck [110] auf Übereinstimmung von Bindungslängen, Bindungswinkel, Torsionswinkel, cis-Peptidbindung (nur für Prolin erlaubt) und Chiralität der Aminosäuren überprüft und gegebenenfalls korrigiert. Alle diese Werte liegen für die Modelle in erlaubten Bereichen.


[Seite 107↓]

3.5.2.2.  Dockingstudien

Unter Verwendung von GOLD (Genetic Optimized Ligand Docking) [111] wurden für acht enantiomere Benzilsäureester und einige achirale Strukturen jeweils 20 Dockinganordnungen für die modellierten Muscarinrezeptoren M1, M2 und M3 berechnet. Als Bindungsregion wurde ein Radius von 15 Å, ausgehend von der Carboxylatgruppe des für die Bindungsstelle essentiellen Aspartats (105 (M1), 103 (M2), 148 (M3)), verwendet. Die Liganden wurden in protonierter Form (protoniertes N-Atom im Piperidylring) für die Berechnungen eingesetzt. Die Ausgangskonformation des Liganden ist von untergeordneter Bedeutung, da mit Gold systematisch nach der pharmakophoren Ligandkonformation gesucht wird. Für jede durch Gold gefundene Dockinganordnung wurde mit score (bezieht Solvatationseffekte und teilweise Entropieeffekte mit ein) [112] der pKd-Wert ermittelt (welcher der experimentellen Bindungsaffinität (pKi) nahe kommen sollte bzw. theoretisch entspricht). Die Bindungsanordnung eines Liganden mit dem höchsten Fitness-Wert von Gold und dem besten errechneten pKd-Wert durch Score wurde energetisch optimiert.

3.5.2.3. Energieoptimierung des Rezeptor-Ligand-Komplexes

Jeder Rezeptor-Ligand-Komplex, der aus den Dockingstudien hervorging, wurde energetisch optimiert. Diese Prozedur simuliert ansatzweise die strukturelle Anpassung zwischen Rezeptor und Ligand (induced fit), wie sie in der Natur anzutreffen ist. Dabei wurden die Rückgratatome des Rezeptorproteins fixiert und die Seitenkettenatome bis zu einem Energie cut-off von 0,01 kcal/mol mittels Tripos-Kraftfeld energieminimiert.


[Seite 108↓]

3.5.3.  Ergebnisse

3.5.3.1.  Qualitative Auswertung

Charakteristisch für alle Dockinganordnungen der untersuchten Liganden und einheitlich für alle Rezeptorsubtypen (M 1 , M 2 , M 3 ) ist die Bindungstasche innerhalb der sieben Transmembranhelices (Abb. 30). Die Amino-säuren, die diese Bindungstasche bilden, sind in Tab. 24 aufgeführt. Fett hervorgehoben sind die Aminosäuren, die unmittelbar mit dem Ligan-den in Wechselwirkung treten und die inner-halb der Rezeptorsubtypen nicht konserviert vorliegen. Sie sind verantwortlich für die unterschiedliche Affinität eines Liganden zu den Rezeptorsubtypen (M 1 , M 2 , M 3 ).

Abb. 30: Modellierter M1-Rezeptor mit dargestellter Bindungstasche

In der nachfolgenden Beschreibung der Bindungsstelle wird zur Vereinfachung immer die Nomenklatur des M1-Rezeptors verwendet, vorausgesetzt, es ist nichts anderes vermerkt. Die korrespondierenden Aminosäuren können Tab. 24 entnommen werden.

Tab. 24: Aminosäuren der Bindungstasche des M1-, M2- und M3-Rezeptors

M 1

M 2

M 3

Bereich*

Kommentare

Asp105

Asp103

Asp148

H3

Salzbrücke

Tyr106

Tyr104

Tyr149

H3

S-Seite

Ser109

Ser107

Ser152

H3

S-Seite

Asn110

Asn108

Asn153

H3

S-Seite

Tyr179

Tyr177

Phe222

E2

Etherbrücke

Leu199

Leu197

Met242

H5

unspezifisch

Thr202

Ile200

Thr245

H5

S-Seite

Val203

Ile201

Ile246

H5

S-Seite

Leu207

Leu205

Leu249

H5

S-Seite

Trp378

Trp400

Trp504

H6

R-Seite

Tyr381

Tyr403

Tyr507

H6

R-Seite

Tyr404

Tyr426

Tyr529

H7

Piperidylring

Cys407

Cys429

Cys533

H7

Piperidylring

Tyr408

Tyr430

Tyr534

H7

N-Methyl

* H: Helix, E: Extrazellulärer Loop


[Seite 109↓]

Beschreibung der Bindungstasche und Art der Wechselwirkung mit den Liganden. Folgende Wechselwirkungen sind für sämtliche Liganden an den Rezeptorsubtypen M1, M2 und M3 identisch:

Abb. 31: Bindung von (S)-N-Methyl-4-piperidyl 4-methylsulfonylbenzilat an den M1-Rezeptor. Rot markiert sind die Aminosäuren, die innerhalb der Rezeptorsubtypen (M1, M2 und M3) nicht konserviert vorliegen. Die Wasserstoffbrücken sind durch punktierte Linien dargestellt.

Enantiomere Affinitätsunterschiede. Die höhere Affinität der S-Enantiomere im Vergleich zu den R-Enantiomeren lässt sich folgendermaßen erklären:

Abb. 32: Bindung von (R)-N-Methyl-4-piperidyl 4-methylsulfonylbenzilat an den M1-Rezeptor

Affinitätsunterschiede an den Rezeptorsubtypen. Unterschiedliche Affinitäten an den Rezeptorsubtypen (pKi (M1) > pKi (M3) > pKi (M2)) sind in den Auswirkungen der nicht konservierten Aminosäuren (Tab. 24 und Abb. 31) auf die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zu suchen:

Substituenteneinflüsse. Die Ursachen für Unterschiede der Rezeptoraffinität in Abhängigkeit von den Substituenten am aromatischen System sind in deren physikalisch-chemischen Eigenschaften und sterischen Effekten zu suchen:

Pharmakophore Konformation des Liganden. Durch intramolekulare Wasserstoffbrücken zwischen Esterfunktion und Hydroxylgruppe können zwei Konformationen des Benzilatmoleküls stabilisiert werden (Kap. 3.2.5, Schema 15). Einerseits besteht die Möglichkeit der Wechselwirkung mit dem esteratischen Ethersauerstoff (anti-Konformation), andererseits mit dem Carbonyl-O-Atom (syn-Konformation). Aus den Dockingstudien mit Gold ging das anti-Konformer als pharmakophore Konformation hervor. Interessanterweise zeigen experimentelle Untersuchungen Übereinstimmungen mit der berechneten anti-Konformation. Hierbei wurden rigide Analoga, bei denen eine kovalente Bindung die H-Brücke ersetzt (fixierte anti-Konformation), untersucht. Die Ergebnisse bestätigen, dass das anti-Konformer vom Muscarinrezeptor bevorzugt wird [113].

3.5.3.2. Quantitative Auswertung

Für die energetisch optimierten Rezeptor-Ligand-Komplexe wurden neben den berechneten pKd-Werten (Score-Werte) die Wechselwirkungsenergien (WWE) bestimmt. Die Score-Werte ließen nur ansatzweise eine Korrelation zu den experimentellen Daten zu. So wurden beispielsweise die hydrophoben Wechselwirkungen der tert-Butyl-Verbindung durch Score wesentlich höher bewertet als die hydrophilen Wechselwirkungen der Dimethylamino-Verbindung. Nachfolgende Untersuchungen konzentrierten sich daher auf die Wechselwirkungsenergien des Rezeptor-Ligand-Komplexes. Da alle untersuchten Strukturen ähnliche Entropiebeiträge (Zahl der rotierbaren Bindungen) und sehr ähnliche Solvatationsenergien aufweisen sollten, müsste eine Korrelation mit den berechneten Wechselwirkungsenergien bestehen. Entsprechend der Gibbs-Helmholtz-Gleichung ist eine lineare Abhängigkeit zu erwarten.

Um vergleichbare Wechselwirkungsenergien der Rezeptor-Ligand-Komplexe zu erhalten, [Seite 113↓]muss die Energie des Rezeptor-Ligand-Komplexes unter den absolut gleichen Voraussetzungen für jeden Liganden bestimmt werden. Die Wechselwirkungsenergie (WWE) wurde folgendermaßen berechnet:

WWE = ERL – (ER + EL).

ERL ist die Energie des Rezeptor-Ligand-Komplexes, ER entspricht der Energie des isolierten Rezeptorproteins und EL stellt die Energie des isolierten Liganden dar [95]. Die zur Berechnung der Wechselwirkungsenergie verwendeten Energien stammen von den optimierten Strukturen des Rezeptorproteins, des Liganden bzw. Rezeptor-Ligand-Komplexes. Die erhaltenen Energien ERL, ER und EL und die daraus resultierenden Wechselwirkungsenergien sind der Tab. 25 zu entnehmen. Je negativer die WWE, desto stabiler ist der Rezeptor-Ligand-Komplex, was in einer höheren Affinität des Liganden resultiert.


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Tab. 25: Berechnete Wechselwirkungsenergien (WWE) der Rezeptor-Ligand-Komplexe

Substitution R

pKi*

E RL [kcal/mol]

E R

[kcal/mol]

E L

[kcal/mol]

WWE [kcal/mol]

Rezeptor-subtyp

4-CH3-SO2-

S

8,37

-2214,5

-2160,5

22,1

-76,1

M1

 

R

6,58

-2200,5

-2160,5

22,1

-62,1

M1

4-F3CO-

S

8,91

-2220,4

-2160,5

23,9

-83,8

M1

 

R

7,39

-2211

-2160,5

23,9

-74,4

M1

4-tert-C4H9-

S

8,29

-2221,7

-2160,5

23,9

-85,1

M1

 

R

7,52

-2203,1

-2160,5

23,9

-66,5

M1

4-(CH3)2N-

S

8,98

-2209,9

-2160,5

43,9

-93,3

M1

 

R

7,34

-2181,2

-2160,5

43,9

-64,6

M1

H

-

9,94

-2230,8

-2160,5

22,6

-92,9

M1

Dioxolo-**

-

8,45

-2187,4

-2160,5

50,6

-77,5

M1

4,4´-bis(F3CO-)

-

8,77

-2219,1

-2160,5

22,9

-81,5

M1

4-CH3-SO2-

S

7,15

-2212,6

-2166,4

22,1

-68,3

M2

 

R

5,80

-2191,6

-2166,4

22,1

-47,3

M2

4-F3CO-

S

8,61

-2226,8

-2166,4

23,9

-84,3

M2

 

R

6,84

-2209,4

-2166,4

23,9

-66,9

M2

4-tert-C4H9-

S

7,48

-2219,2

-2166,4

23,9

-76,7

M2

 

R

6,69

-2207,1

-2166,4

23,9

-64,6

M2

4-(CH3)2N-

S

7,28

-2195,2

-2166,4

43,9

-72,7

M2

 

R

6,73

-2188,6

-2166,4

43,9

-66,1

M2

Dioxolo-**

-

8,18

-2198,8

-2166,4

50,6

-83,0

M2

4-CH3-SO2-

S

7,77

-2221,7

-2169,6

22,1

-74,2

M3

 

R

6,39

-2204,6

-2169,6

22,1

-57,1

M3

4-F3CO-

S

8,40

-2224,4

-2169,6

23,9

-78,7

M3

 

R

7,08

-2211,4

-2169,6

23,9

-65,7

M3

4-tert-C4H9-

S

7,84

-2216,8

-2169,6

23,9

-71,1

M3

 

R

7,52

-2211,3

-2169,6

23,9

-65,6

M3

4-(CH3)2N-

S

7,46

-2199,6

-2169,6

43,9

-73,9

M3

 

R

7,08

-2189,3

-2169,6

43,9

-63,6

M3

Dioxolo-**

-

8,22

-2192,6

-2169,6

50,6

-73,6

M3

4,4´-bis(F3CO-)

-

8,24

-2225,6

-2169,6

22,9

-78,9

M3

* experimentell durch Radioligand-Bindungsstudien ermittelter pKi-Wert (Kap. 3.4)

**

* experimentell durch Radioligand-Bindungsstudien ermittelter pKi-Wert (Kap. 3.4)


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Die generell höheren experimentellen Affinitäten der S-Enantiomere im Vergleich zu den R-Enantiomeren konnten an sämtlichen Rezeptorsubtypen (M1, M2, M3) mit den berechneten WWE bestätigt werden (Tab. 25, Abb. 33).

Abb. 33: Wechselwirkungsenergien (WWE) für S- und R-enantiomere Benzilate an M1-, M2- und M3-Rezeptoren

Die Affinitätsreihenfolge der Rezeptorsubtypen (M1 > M3 > M2) wird überwiegend durch die berechneten Wechselwirkungsenergien wiedergegeben. Eine Ausnahme stellt die S-konfigurierte tert-Butylverbindung mit einer negativeren WWE(M2) als WWE(M3) dar. Da der hydrophobe Charakter der S-Bindungsseite von M3 zu M2 zunimmt, ist verständlich, weshalb zunächst eine negativere WWE für M2 berechnet wurde. Jedoch wird mit Zunahme des hydrophoben Charakters der S-Bindungsseite gleichzeitig die Bindungstasche durch die raumfüllenden Aminosäurereste (Ile200, Ile201) enger. Dies führt zu einer vermehrten sterischen Hinderung, welche durch die berechnete WWE nicht exakt reflektiert wird. Die Möglichkeiten der qualitativen wie auch quantitativen Interpretation der experimentellen Bindungsdaten durch die erarbeiteten Rezeptormodelle wird durch eine eindrucks-volle Korrelation (R2 = 0,857) zwischen Wechselwirkungsenergie und den experimen-tellen pKi-Werten belegt (Diagramm 6).


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Diagramm 6: Korrelation zwischen experimentellen pKi-Werten (pKi(exp)) und berechneten Wechselwirkungssenergien (WWE)

3.5.4. Diskussion

Mit Molecular Modelling ist es gelungen, ein aussagekräftiges Rezeptormodell für die antagonistisch wirkenden Benzilate an Muscarinrezeptoren M1, M2 und M3 zu erarbeiten. Dabei gelang es, durch die gefundene und beschriebene Ligandbindungsstelle

qualitativ umfassend zu erklären. Die an der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung beteiligten Aminosäuren, insbesondere das konservierte Asp105, sowie das für die Rezeptoraktivierung diskutierte Trp378, stehen in Übereinstimmung mit den in der Literatur beschriebenen Aminosäuren und deren Wechselwirkung mit Agonisten und Antagonisten. Von der Lage der gefundenen Ligandbindungsstelle kann mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgegangen werden. Die Relevanz einzelner Aminosäuren für die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung in der vorgeschlagenen Bindungstasche wurde durch Mutationsstudien unter anderem durch Hulme et al. [100] für Antagonisten wie NMS oder Chinuclidinyl benzilat dokumentiert. Ein Nachteil der Mutationsstudien ist, dass keine Aussage über den Beitrag des Proteinrückgrats zur Ligandwechselwirkung möglich ist, sondern lediglich die Ligandwechselwirkungen mit den Seitenketten der Aminosäuren genauer betrachtet werden. Weiterhin können keine Aussagen darüber getroffen werden, welchen Einfluss die Mutation auf die Gesamtstruktur eines Proteins hat, wenn keine Röntgenstrukturanalyse vorliegt. So kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch [Seite 117↓]Mutationen, welche entfernt vom aktiven Zentrum liegen, zu essentiellen Strukturänderungen und damit zu einer veränderten Bindungsaffinität führen.

Die Berechnungen der Wechselwirkungsenergien und deren bemerkenswerte Korrelation zu den experimentellen Bindungsdaten unterstreichen, welche Aussagekraft die Rezeptormodelle in Hinsicht auf die Affinität enantiomerer Benzilate besitzen. Damit könnten die Modelle in Zukunft unterstützend bei der Entwicklung neuer Liganden eingesetzt werden und wertvolle Hinweise für deren strukturelle Voraussetzungen liefern.

Indirekt dopaminerge Wirkung. Dopaminrezeptoren gehören wie die Muscarinrezeptoren zur Familie der rhodopsinähnlichen G-proteingekoppelten Rezeptoren. In vorliegenden Arbeiten konnte in pharmakologischen Untersuchungen eine indirekt dopaminerge Wirkung für N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat nachgewiesen werden. Wie ist diese indirekt dopaminerge Wirkung zu erklären? Ein rein hypothetischer aber sehr interessanter Ansatz soll an dieser Stelle kurz diskutiert werden. Der Überlegung nach müssten N-Methyl-4-piperidyl benzilate vielmehr antidopaminerge Wirkungen besitzen, vorausgesetzt Dopaminrezeptoren verfügen über eine ähnliche Bindungsstelle wie Muscarinrezeptoren. Erste Modellingversuche an Dopaminrezeptoren zeigten eine Übereinstimmung relevanter Aminosäuren in der Bindungstasche, so dass auch hier eine antagonistische Wirkung zu erwarten wäre. Handelt es sich um nichtselektive Dopaminantagonisten, werden sämtliche Dopaminrezeptorsubtypen blockiert, unter anderem auch die präsynaptischen Dopaminautorezeptoren. Eine Blockade der präsynaptischen Dopaminautorezeptoren führt zu einer vermehrten Ausschüttung des Neurotransmitters Dopamin (indirekt dopaminerge Wirkung). Eine therapeutisch genutzte Verbindung mit prä- und postsynaptischem Dopaminantagonismus stellt Sulpirid dar. Die unterschiedlichen Wirkungen von dem atypischen Neuroleptikum Sulpirid in Abhängigkeit von der Dosierung werden dadurch erklärt, dass Sulpirid in niedriger Dosierung vor allem die präsynaptischen Dopaminrezeptoren blockiert (indirekt dopaminerg). In hoher Dosierung werden prä- und postsynaptische Rezeptoren gleichermaßen gehemmt (antidopaminerg) [114]. Die beobachtete indirekt dopaminerge Wirkung von N-Methyl-4-piperidyl 3-methoxybenzilat kann somit auf:

zurückgeführt werden.


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03.02.2005